CN1494382A - 从大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法，包括制备固含量为6－12％W/V的脱脂大豆粉含水浆状物，在pH7－8且温度为43±5℃的条件下用真菌蛋白酶水解所述的浆状物，至20－40％的水解程度(DH)，进一步在53±5℃和搅拌条件下用木瓜蛋白酶水解，直至水解程度达30－45％DH，用公知的方法使残余酶失活，分离固体并干燥上清液，得到蛋白质水解产物。

Description

从大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法

技术领域

本发明涉及一种使用真菌蛋白酶从大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法。特别是，本发明涉及一种采用由曲霉菌菌株(Aspergillus sp)获得的真菌蛋白酶从脱脂大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法。

背景技术

近来印度约出产680万吨大豆用于炼油，并且溶剂提取后的大豆粉作为出口饲料。通过在大豆的溶剂提取过程中提供一种额外的卫生处理方法，就有可能获得具有所需功能特性的、可食用级的脱脂大豆粉。在回收油之后，490万吨的大豆粉就可以在印度当地被利用。作为可食用油的副产品，含油种子蛋白质在全世界是人类膳食蛋白的潜在重要资源。在除去油之后，脱脂的大豆块状物中的蛋白质可加热变性并因此不能被直接提取。因此蛋白质水解是一种以可溶形式从大豆块状物中回收蛋白质的吸引人的方法，并提供了一种适于在各种食物中添加蛋白质的高蛋白制备方法。所生产的所有大豆中有少部分也可用于不同的可食用级别的大豆粉，单独的蛋白质以及结构化的产品。这些产品在世界各地已经非常受欢迎。大豆是蛋白质很好的来源，其含有40％的蛋白质。通过降低和破坏抗-营养型因素例如胰岛素抑制剂，已经发展了制备高品质大豆食物的新技术。

美国专利No.518057描述了所要求保护的一种生产具有提高口味的水解化蔬菜蛋白的方法，其中包括的单氯二羟基丙醇的含量检测不到。在上述文献中，采用原酶6(Prozyme 6)(一种真菌蛋白酶)在40-50℃的温度，pH为6.5-7.0下水解小麦麦麸，酶浓度为底物的0.1-2.0％，反应4小时。用气态HCl处理水解化的蛋白以脱酰胺，随后加入酸使酶失活。此种水解的缺点在于可能会导致氨基酸的外消旋作用，且添加酸会增加产物中的盐类含量。

请参照Emster，J.H.(1991)，US专利No.5077062，Excelpro Inc.，LosAngeles，CA，USA，其中描述了采用存在于水中的真菌蛋白酶，从大豆类物质，例如大豆粉，大豆粗粉或大豆粗粒中制备得到低钠、低谷氨酸单钠的大豆水解产物。水解在90℃，在无酸或碱的条件下进行2小时。在使酶失活并使混合物脱水之后，得到的水解产物中含有45-55wt％酶促水解化的大豆来源的蛋白，平均分子量为670,000±50,000。该文献中采用的真菌蛋白酶与本发明中所采用的酶不同。该类单一的酶***可能会导致肽发苦，且由于采用了高温(90℃)而导致能量加强。

文献Satoh et al.，(1988)美国专利No.4757007，Nishin Oil Mills，andTokyo，Japan中描述了使用一种来自大豆蛋白的蛋白酶制备两种水解产物的方法。在用酒精沉淀之后，采用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶对大豆蛋白进行水解。该方法的缺点是涉及水解产物的分离。采用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行水解。进行酸化时，使pH值降至2.5-5.0的范围内而分离出两种水解产物，该方法导致产物中盐含量的增加。

文献Cipollo，K.L.and Wagner，T.J.，(1987)欧洲专利No.0148600Bl，Ralston Purina Co.中描述了一种涉及从蛋白质分离物制备水解蛋白质的方法。利用喷射式蒸煮或在104℃动态加热蛋白质分离物几秒钟，接着在真空室中冷却，然后使用菠萝蛋白酶进行水解，从蛋白质分离物中制备得到水解蛋白质。在进行水解前，蛋白质在其等电点从水提取物中沉淀出来。该方法的缺点是起始原料蛋白分离物的价格较高。该方法是一种多步骤方法，能量密集。该方法还需要使用例如蒸汽加压锅或真空室等仪器。

文献Parker，D.M.and Pawlett，D.(1987)European Patent No.0223560A2，Imperial Biotechnology Ltd.，中描述了一种用肉类或干酪调味品分离蛋白质水解产物的方法，该肉类或干酪调味品来自于蛋白质的原料(例如包含大豆，明胶，乳清，酪蛋白，血色素，酵母，谷类或微生物蛋白质)，先用肽链内切酶水解，随后通过来自于Streptococcus lactus的氨基肽酶进行水解。该方法的缺点在于该方法是一个多步骤的方法。

文献Lee，(1986)European Patent No.0087246B1，Staffer Chemical Co.中描述了一种采用来自于曲霉菌的真菌蛋白酶以及胰液素(胰岛素、胰凝乳蛋白酶A、B、C，弹性蛋白酶以及羧肽酶A和B)水解大豆、小麦麦麸以及棉籽的方法。使用活性碳处理水解产物，其用于改善营养。该方法的缺点是涉及多个步骤。

文献Boyce，C.O.L.et al.，(1986)European Patent No.0187048 A2，NOVO Industries A/S描述了一种采用微生物凝乳酶(Mucor miehei)制备具有0.25到0.5％的水解程度(DH)的大豆蛋白水解产物的方法，该大豆蛋白水解产物用作蛋白的替代品。该方法使用了不同的酶，并且该酶涉及大豆蛋白的低水解程度。

文献Olsen，H.A.S(1981)，英国专利No.2053228A中描述了一种生产大豆蛋白质水解产物的方法，该产品为从部分脱脂的大豆材料出发，采用蛋白水解酶进行水解制得。该方法的缺点在于由于采用部分脱脂的大豆粉，使得残留的油和蛋白质相结合，其可能导致异味。

文献Olsen，H.S(1981)，美国专利No.4324805中描述了一种生产大豆蛋白质水解产物和油的方法，该产品为从部分脱脂的大豆物质出发，采用蛋白水解酶进行水解制得。在pH为3.5到4.5的范围内进行水洗，使大豆粉部分脱脂，然后用水和碱进行水解增加pH。水解程度(DH)的范围在8-12％之间。从洗涤的水中回收油。所用的酶是碱性蛋白酶(Alcalase)。该方法的缺点是包括了多个步骤，且由于采用部分脱脂的大豆粉，残余的油与蛋白质相结合，可能会导致异味。通过加入酸使酶失活，这可能导致产物中盐成分的增加。

Sherba and Steiger(1972)，美国专利No.3640725中描述了一种用于生产大豆蛋白质水解产物的酶促水解法。大豆种子被粉碎并在90到140℃之间进行加热。在25到75℃之间加入蛋白酶(真菌或细菌蛋白酶)。分离出纤维质，浆状物中存在两相：油相和水相。调节水相的pH至4.5，沉淀出蛋白质，然后对其进行浓缩。起始原料没有经过脱脂，因此残留的油可能和水相结合，从而导致异味。

Gunther，R.C.(1972)Canadian Patent No.905742中描述了一种用胃蛋白酶改性大豆水解产物而生产产品的方法，其中在水和糖的存在下，进行快速搅打以产生低密度的充气产品。

文献Tsumura，K.et al.，(1997)European Patent No.0797928 A1描述了一种制备大豆蛋白质水解产物的方法，采用蛋白酶选择性地在pH1.5-2.5之间降解大豆球蛋白。该方法采用的pH相当低，因此和本发明中所采用的pH范围不同。此外，该方法的目的在于获得低含量的大豆球蛋白，这也不同于本发明的情况。

出版论文“Industrial production and application of soluble enzymatichydrolysate of soy protein”，Olsen，H.S.，Adler Nissen，J.(1979)，ProcessBiochemistry，14(7)，6，8，10-11描述了一种从大豆薄片制备大豆蛋白质水解产物的方法：在pH4.5下洗涤大豆薄片，然后采用碱性蛋白酶(alcalase)进行水解。底物在酸性pH条件下的溶解性低，这可能会导致低产率。该方法中采用的酶与本发明中所采用的酶不同。

发明目的

本发明的主要目的在于提供一种采用微生物蛋白酶从大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法。

本发明的另一个目的是提供一种采用曲霉菌菌株(Aspergillus sp)从脱脂大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法。

本发明的再一个目的是提供一种采用蛋白质水解酶进行双酶水解而制备蛋白质水解产物的方法。

本发明的再一个目的在于将水解产物中的苦味降低至苦味识别阈值为大于2g％。

本发明的又一个目的在于提供一种制备低矿物含量的蛋白质水解产物的方法。

本发明的又一个目的在于提供一种制备高产率蛋白质水解产物的方法，其从所用的原材料中获得了特定的水解度。

发明概述

因此，本发明提供了一种从大豆粉制备蛋白质水解产物的方法，其包括制备固含量为6-12％w/v的脱脂大豆粉的含水浆状物；在pH7-8且温度为43±5℃的条件下用真菌蛋白酶水解所述的浆状物，至水解度(DH)达20-40％；然后在53±5℃，搅拌条件下用木瓜蛋白酶进一步水解，直至水解度DH达30-45％；用公知的方法使残余酶失活，分离固体并干燥上清液，得到蛋白质水解产物。

发明详述

因此，本发明提供了一种用真菌蛋白酶从大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法，该方法包括：制备固含量为6-12％w/v的脱脂大豆粉的含水浆状物；在pH7-8且温度为43±5℃的条件下用真菌蛋白酶水解所述的浆状物，至水解度达20-40％(DH)；然后在53±5℃，搅拌条件下用木瓜蛋白酶进一步水解，直至水解度达30-45％DH；用公知的方法使残余酶失活，分离固体并干燥上清液，得到蛋白质水解产物。

在本发明的一个实施方式中，浆状物的固含量为8-12％w/v。

在本发明的另一个实施方式中，真菌蛋白酶来自于曲霉菌菌株(Aspergillus sp)。

在本发明的再一个实施方式中，Aspergillus选自于A.flavus，A.japanicus，A.niger 以及A.awamori。

在本发明的又一个实施方式中，通过双酶水解得到蛋白质水解产物。

在本发明的又一个实施方式中，通过用蛋白水解酶对浆状物进行水解，得到蛋白质水解产物。

在本发明的又一个实施方式中，真菌蛋白酶的使用量占大豆粉的0.4到0.5％w/w。

在本发明的一个实施方式中，蛋白质水解在pH为7.2到7.6的范围内进行。

在本发明的另一个实施方式中，木瓜蛋白酶的使用量占大豆粉的0.4到0.5％w/w。

在本发明的再一个实施方式中，所获得的水解产物的苦味降低。

在本发明的又一个实施方式中，苦味识别阈值大于2g％。

在本发明的又一个实施方式中，得到的蛋白水解产物的矿物含量低。

在本发明的又一个实施方式中，从所用的原材料中获得了高产率的蛋白质水解产物，水解程度为35到45％。

在本发明的一个实施方式中，得到的大豆蛋白质水解产物具有奶油色，产率为60-67.0％(基于蛋白质)。

在本发明的另一个实施方式中，大豆蛋白质水解产物的含水量为9.4％，含氮量为10.5-11.0％，水解程度为35-45％。

在本发明的又一个实施方式中，得到的大豆蛋白质水解产物具有20-23胰岛素抑制剂units/mg的活性，氮溶指数(Nitrogen Solubility Index)为95-98％，盐含量为0.6-1.0％，以及苦味识别阈值为2到2.2％。

在本发明的又一个实施方式中，未检测到蛋白质水解产物的脂肪氧合酶和脲酶活性。

在本发明的又一种实施方式中，蛋白质水解产物中氨基酸组成与起始物质中的氨基酸组成相似。

在本发明的又一种实施方式中，蛋白质水解产物为奶油颜色。

本发明还提供了一种蛋白质水解产物，它相对于蛋白质具有60-67％的蛋白质水解产物。

在本发明的另一个实施方式中，蛋白质水解产物的含水量为9.4％，含氮量为10.5-11％，水解程度为35-45％。

在本发明的再一个实施方式中，蛋白质水解产物具有20-23胰岛素抑制剂units/mg的活性，氮溶指数(Nitrogen Solubility Index)为95-98％，盐含量为0.6-1.0％，以及苦味识别阈值为2到2.2％。

在本发明的又一种实施方式中，未检测到蛋白质水解产物的脂肪氧合酶和脲酶活性。

在本发明的又一种实施方式中，蛋白质水解产物中氨基酸组成与起始物质中的氨基酸组成相似。

制备蛋白质水解产物的方法如下所述：

(1)脱脂大豆粉：从清洁的圆形豆出发制备得到大豆粉。将清洁的豆压裂之后，在筛子和抽吸***进行分级。清洁的，压裂的豆肉通过调节蒸煮器(conditioner cooker)并制成薄片。经溶剂提取过程。去除提取出的薄片中的溶剂，将其碾碎到100目。大豆粉的规格包括(a)含水量％(质量百分数)，最大为9％；(b)蛋白质按干燥质计算的质量％，最小为48％；(c)总灰份按干燥质计算的质量％，最大7.2％；(d)不溶于酸的灰份按干燥质计算的质量％，最大0.4％；(e)脂肪按干燥质计算的质量％，1.5％；(f)粗纤维按干燥质计算的质量％，最大4.2％；(g)黄曲霉毒素，最大30ppb；(h)残余溶剂，170ppm；(i)每克中的总细菌数，50,000；(i)大肠菌/g＞10；(k)沙门氏菌，0。

(2)真菌酶：商业途径可得的食品级酶类蛋白酶P“amino”6，产于M/s Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，2-7，1-Chome，Nishiki，Nak-ku，Nagoya，460，Japan，蛋白水解活性不低于60,000U/g。植物硫醇蛋白酶木瓜蛋白酶的规格为商业途径可得到的食品级，蛋白水解活性不低于2，000酪氨酸单位(TU)/mg的蛋白水解活性。

(3)水解程度(DH)的测定：三硝基苯磺酸(TNBS)方法是一种测定食物蛋白质水解产物水解程度的精确、可重复以及普遍适用的方法。蛋白质水解产物溶解/分散在1％的热十二烷基硫酸钠中，浓度达0.25-2.5×10^-3氨当量/L。将样品溶液(0.25ml)与2ml的0.2125M的磷酸钠缓冲液(pH8.2)以及2ml的0.1％TNBS溶液相混合，然后在50℃下于黑暗中保存60分钟。加入4ml的0.1N的盐酸溶液(HCl)猝灭反应，在340nm时读取吸收。采用1.5mM的L-亮氨酸溶液为标准。以每种特定蛋白质底物作为标准曲线，可将所测定的亮氨酸的氨基当量转化为水解程度(Adler-Nissen，J.(1979)J.Agr.Food Chem.27，6，1256-1262)。以合适的溶剂与溶质的比率使脱脂大豆豆粉分散于水中，采用6N氢氧化钠或6N盐酸调节分散系的pH值。进行机械搅拌几分钟后升温至40到45℃。在此阶段加入0.4到0.5％的基于大豆粉的真菌酶，继续搅拌2小时。在规定时段的最后，使浆状物的温度升至50到55℃。至此，加入0.4到0.5％基于大豆粉的木瓜蛋白酶，搅拌持续1到2小时。在上述时间间隔的末期，使浆状物升温至90到95℃，维持5到10分钟。浆状物冷却到室温，离心除去未溶解的富含碳水化合物的部分。澄清的蛋白质水解产物进行喷雾干躁后，得到了蛋白质水解产物。

以下的实施例用于阐释本发明而并非用于限定本发明的保护范围。

实施例1

在250ml水中分散25g脱脂大豆粉，用6N的氢氧化钠溶液调节分散系的pH至7.2。机械搅拌达20分钟，加热升温至40℃。在此阶段，加入125mg真菌蛋白酶，持续搅拌2小时。在2小时末期，加热升温至50℃，加入第二种酶，木瓜蛋白酶125mg，持续搅拌1小时。水解后，将得到的溶液煮沸10分钟，使酶失活。采用框式离心过滤机对浆状物进行离心。冻干澄清的溶液。蛋白质的产率为65％，用TNBS方法测定的水解程度为43％。

实施例2

在500ml水中分散50g脱脂大豆粉，调节分散系的pH至7.3。机械搅拌达20分钟，加热升温至43℃。在此阶段，加入250mg真菌蛋白酶，持续搅拌达1.5小时。在2小时末期，加热升温至53℃，加入第二种酶，木瓜蛋白酶250mg，持续搅拌1小时。水解后，将得到的溶液煮沸15分钟，使酶失活，并进行离心分离。冻干澄清的溶液。蛋白质的产率为68.0％，用TNBS方法测定的水解程度为39％。

实施例3

在1L水中分散100g脱脂大豆粉，调节分散系的pH至7.6。机械搅拌达20分钟，加热升温至45℃。在此阶段，加入500mg真菌蛋白酶，持续搅拌达2小时。在2小时末期，加热升温至55℃，加入第二种酶，木瓜蛋白酶500mg，持续搅拌1.5小时。水解后，将得到的溶液煮沸10分钟，使酶失活，并进行离心分离。对澄清的溶液进行喷雾干燥。蛋白质的产率为70％，用TNBS方法测定的水解程度为38％。

实施例4

在10L水中分散1kg脱脂大豆粉，调节分散系的pH至7.6。机械搅拌达15分钟，温度升至45℃。在此阶段，加入5g真菌蛋白酶，持续搅拌2小时。在2小时末期，浆状物温度升至55℃，加入第二种酶，木瓜蛋白酶5g，持续搅拌1.5小时。水解后，将得到的溶液煮沸15分钟，使酶失活，并采用框式离心机进行离心分离。对澄清的溶液进行喷雾干燥。水解度为38％，蛋白质的产率为70％。

大豆粉的颗粒大小，酶与底物的比例，温度，pH以及时间间隔控制酶水解的结束，使得水解产物的苦味最小化。

获得的大豆蛋白质水解产物为奶油色，产率为60-67.0％(在蛋白质基础上)。产物的含水量为9.4％，含氮量为10.5-11.0％，水解程度为35-45％(TNBS方法)。

得到的大豆蛋白质水解产物具有20-23胰岛素抑制剂units/mg活性(TIU)，氮溶解指数为95-98％，盐含量为0.6-1.0％(以Cl^-离子测定)，苦味识别阈值为2-2.2％。检测不到脂肪氧合酶和脲酶的活性。大豆蛋白质水解产物中的氨基酸组成与起始原料中的氨基酸组成相似，因此保留了营养价值。与从酪蛋白获取的蛋白质水解产物相比，本发明的蛋白质水解产物苦味更低，且吸湿性更小。

本发明的主要优点为：

本方法提供了特定水解程度DH，且粉末形式中氮含量为10.5-11.0％的蛋白质水解产物。

1.采用该方法，该产品具有了良好的添加剂性质，它能添加于最终产物中而不产生任何不需要的古怪香味。

2.该方法产生了一种高品质的水解产物，其溶解性与pH无关，既适合于用作酸性pH值下的添加剂，又适合用作碱性pH值下的添加剂。

3.大豆粉的氮回收率为95-98％，高于任何现有商业化生产方法。

4.蛋白质水解产物的产率为大豆蛋白质的65-70％。

5.水解时间为2.5到4小时，较短的时间对成本投入和能量消耗都较为有利。联合使用两种酶，使盐含量最低达到0.6-1％。

6.所采用的酶为商业途径可获得的食品级植物酶/真菌酶，其具有较宽的特异性。

7.由于基本氨基酸损失非常小，使得起始原料的营养价值得到了保留。

8.获得的蛋白质水解产物含有可接受水平的胰岛素抑制剂活性，无脂肪氧合酶活性和脲酶活性，NSI为98％。

Claims (22)

1.采用真菌蛋白酶从大豆粉中制备蛋白质水解产物的方法，该方法包括：制备固含量为6-12％w/v的脱脂大豆粉的含水浆状物；在pH7-8且温度为43±5℃的条件下用真菌蛋白酶水解所述的浆状物达1-3小时，至水解程度为20-40％；然后在53±5℃，搅拌条件下用木瓜蛋白酶进一步水解0.5-1.5小时，直至水解程度达30-45％DH；用公知的方法使残余的酶失活；分离固体并干燥澄清的上清液，得到蛋白质水解产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，浆状物的固含量为8-12％w/v。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，真菌蛋白酶来自于Aspergillus sp。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Aspergillus选白于A.flavus，A.japanicus，A.niger以及A.awamori。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质水解产物通过双酶水解得到。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质水解产物是通过用蛋白水解酶对浆状物进行水解得到。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，真菌蛋白酶的使用量占大豆粉的0.4-0.5％w/w。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质水解在pH为7.2-7.6的范围内进行。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，木瓜蛋白酶的使用量占大豆粉的0.4-0.5％w/w。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所获得水解产物的苦味降低。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，苦味识别阈值大于2g％。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所获得水解产物的矿物含量低。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以高产率从原材料中获得了蛋白质水解产物，水解程度为35-45％。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，得到的蛋白质水解产物具有奶油色，蛋白质产率为60-67.0％。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质水解产物的含水量为9.4％，含氮量为10.5-11.0％，水解程度为35-45％。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，得到的蛋白质水解产物具有20-23胰岛素抑制剂units/mg的活性，氮溶指数为95-98％，盐含量为0.6-1.0％，以及苦味识别阈值为2到2.2％。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，未检测到蛋白质水解产物的脂肪氧合酶和脲酶活性。

18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质水解产物中氨基酸组成与起始物质中的氨基酸组成相似。

19.一种从大豆粉获得的蛋白质水解产物，具有20-23胰岛素抑制剂units/mg的活性，95-98％的氮溶指数，0.6-1.0％的盐含量以及2-2.2％的苦味识别阈值，9.4％的含水量，含氮量为10.5-11％，水解程度为35-45％。

20.根据权利要求19所述的蛋白质水解产物，其特征在于，产物中检测不到脂肪氧合酶和脲酶活性。

21.根据权利要求19所述的蛋白质水解产物，其特征在于，蛋白质水解产物中氨基酸组成与起始物质中的氨基酸组成相似。

22.根据权利要求19所述的蛋白质水解产物，其特征在于，该蛋白质水解产物为奶油色。