CN1488646A - Sars病毒s蛋白与n蛋白的融合蛋白及其制备、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明SARS病毒S蛋白与N蛋白的融合蛋白及其制备、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。通过计算机分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，筛选出含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，即第162个氨基酸至第460个氨基酸，共299个氨基酸，和含强抗原表位的SARS病毒的N蛋白片段，即第1个氨基酸至258氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的基因序列，将两个基因片段串联，利用基因工程技术表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，两蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接，在N蛋白片段的第一个氨基酸蛋氨酸后***一个甘氨酸，融合蛋白全长560个氨基酸。表达的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗体或抗原的检测，及用于免疫制备抗SARS病毒单抗和多抗等。
Description
技术领域
本发明是将化学合成的SARS病毒S蛋白的全新基因片段与N蛋白的基因片段连接，利用基因工程技术，制备SARS病毒S蛋白与N蛋白的融合蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白和N蛋白片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的S基因序列和N基因序列，利用基因工程技术表达两者的融合蛋白，表达的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
背景技术
严重急性呼吸综合症，也称SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)，是一种烈性病毒性传染病。2003年11月16日，在我国广州出现了第一例SARS病人，此后几个月内波及世界30多个国家，8000多人感染，死亡800多人。据WHO(WorldHealth Organization)统计SARS的死亡率可高达15％左右，感染该疾病的老年人死亡率可达40％至50％。人在感染SARS病毒后，有10至14天的潜伏期，发病时出现高热、咳嗽、全身不适及头痛、腹泻，发病后的一周内重症者可发生呼吸窘迫综合症，以至丧失呼吸功能。
SARS病毒是一种新型的冠状病毒，由于这种病毒以前未曾感染过人类，所以人群对该病毒普遍易感，SARS病毒是一种单股正链RNA病毒，目前对其全基因序列已经测定，Genebank内已公布了10个左右的全长病毒基因序列，为利用基因工程技术研究诊断试剂、疫苗及筛选抗病毒药物奠定了基础。
SARS病毒用Vero-E6可以体外培养，所以利用培养的SARS病毒建立了检测SARS病毒抗体的免疫荧光方法和酶联免疫检测法，但是用培养的SARS病毒作抗原检测抗体，难以大量生产，亦会产生假阳性，研制特异的基因重组抗原是建立SARS病毒特异抗体检测试剂的发展方向。预防SARS感染的最理想途径是注射疫苗，但目前没有预防SARS的疫苗，国内外均在积极开展疫苗的研制，尤其对灭活疫苗的研究进展较快，基因工程疫苗是最终的发展方向。
发明内容
SARS感染人体后会刺激机体产生多种抗体，但有时血清内只有针对部分SARS病毒蛋白的抗体，可能与各种抗体产生的时间或与机体的免疫状态有关，所以在检测血清内的SARS病毒抗体时要用多种抗原，以提高抗体检出率。
SARS病毒最外层的S蛋白，是介导病毒和宿主细胞结合的主要蛋白，封闭该蛋白的结合位点可阻止病毒感染细胞，所以SARS病毒的S蛋白是研制疫苗的首选蛋白。SARS病毒的N蛋白具有较高的保守性，在各株SARS病毒之间变异很小，所以是用作抗原研制SARS病毒抗体检测试剂的理想蛋白。通过计算机分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，我们筛选出含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的S蛋白片段和N蛋白片段的基因序列，将两个基因片段串联，利用基因工程技术表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，表达的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗体或抗原的检测等。
本发明是将化学合成的SARS病毒S蛋白和N蛋白的基因片段连接，利用基因工程技术，制备SARS病毒S蛋白片段与N蛋白片段的融合蛋白。通过计算机分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，筛选出含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，即第162个氨基酸至第460个氨基酸，共299个氨基酸，和含强抗原表位的SARS病毒的N蛋白片段，即第1个氨基酸至258氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的基因序列，将两个基因片段串联，利用基因工程技术表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，两蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接，在N蛋白片段的第一个氨基酸蛋氨酸后***一个甘氨酸，融合蛋白全长560个氨基酸。表达的融合蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗体或抗原的检测，及用于免疫制备抗SARS病毒单抗和多抗等。
SARS病毒S蛋白与N蛋白的融合蛋白及其制备、应用是采取以下步骤实施的：
1.SARS病毒S蛋白和N蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，发现S蛋白的N端第162个氨基酸至第460个氨基酸含有较强的抗原决定簇，N蛋白的N端第1个氨基酸至第258个氨基酸含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，分别化学合成包含上述抗原决定簇的S蛋白和N蛋白的基因序列。在合成的N蛋白基因片段的5’端增加了NcoI酶切位点(下画线部分)及8个保护碱基(GCGAGTCACC)，并在起始密码子ATG之后***了一个密码子GGA，在3’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及3个保护碱基(GCG)。在合成的S蛋白基因片段的5’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GT)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和EcoRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(AC)。使合成的两个基因片段易于串联克隆至质粒pET28a(+)内的NcoI和EcoRI酶切位点内。
筛选的SARS病毒N蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第1个aa-第258个aa)：Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr Phe GlyGly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg ProLys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala LeuThr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile AsnThr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg ValArg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr LeuGly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr GlyAla Asn Lys Glu Gly Ile Val TrpVal Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn ProAsn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys GlyPhe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser ArgSer Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro AlaArg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg LeuAsn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr ValThr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys
筛选的SARS病毒S蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第162个aa-第460个aa)：Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Glv TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn TyrAsn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
化学合成的含SARS病毒N蛋白抗原表位基因的DNA序列(796 bp)：GCG AGT CA
C CAT GGG ATC TGA TAA CGG TCC GCA GTC AAA CCA ACG TAG TGC CCC CCGCAT TAC ATT TGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGG ACG CAATGG GGC AAG GCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TAC TGC GTC TTGGTT CAC AGC TCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCC TCG AGG CCA GGGCGT TCC AAT CAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGG CTA CTA CCG AAG AGCTAC CCG ACG AGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGA GCT CAG CCC CAG ATG GTACTT CTA TTA CCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACT TCC CTA CGG CGC TAA CAA AGAAGG CAT CGT ATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTT GAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGGCAC CCG CAA TCC TAA TAA CAA TGC TGC CAC CGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AACATT GCC AAA AGG CTT CTA CGC AGA GGG AAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCGCTC CTC ATC ACG TAG TCG CGG TAA TTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGGAAA TTC TCC TGC TCG AAT GGC TAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCTGCT AGA CAG ATT GAA CCA GCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA ACA ACAAGG CCA AAC TGT CAC TAA GAA ATC TGC TGC TGA GGC ATC TAA AAA G
GG ATC CGC G
化学合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916 bp)：GT
GGATCC GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA
GAATTCAC
2.表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。用Nco I和BamH I双酶切化学合成的SARS病毒N蛋白基因片段，用BamH I和EcoR I双酶切化学合成的SARS病毒S蛋白基因片段，分别电泳回收后，溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述三种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段经BamH I酶连接后，***到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间，表达一个SARS病毒S蛋白片段与N蛋白片段的融合蛋白。
3.重组质粒的筛选与鉴定：
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg/ml)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和个对照菌(质粒pET28a转化菌)，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，用N蛋白基因片段5’端的引物(5’-GCGAGTCACCATGGGATCTGATAACGGTCCGCAGTCAAACCAACG-3’)和S蛋白基因片段3’端的引物(5’-GTGAATTCTTAGAAAGGCACATTAGATATGT-3’)组成引物对，PCR扩增连接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段，含串联两个基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约1701bp的串联基因片段。将含有串联基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有连接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段，序列完全正确：ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CAA CGT AGT GCC CCC CGC ATT ACA TTTGGT GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AAC CAG AAT GGA GGA CGC AAT GGG GCA AGGCCA AAA CAG CGC CGA CCC CAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGG TTC ACA GCTCTC ACT CAG CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAG GGC GTT CCA ATCAAC ACC AAT AGT GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TAC CGA AGA GCT ACC CGA CGAGTT CGT GGT GGT GAC GGC AAA ATG AAA GAG CTC AGC CCC AGA TGG TAC TTC TAT TACCTA GGA ACT GGC CCA GAA GCT TCA CTT CCC TAC GGC GCT AAC AAA GAA GGC ATC GTATGG GTT GCA ACT GAG GGA GCC TTG AAT ACA CCC AAA GAC CAC ATT GGC ACC CGC AATCCT AAT AAC AAT GCT GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT CAA GGA ACA ACA TTG CCA AAAGGC TTC TAC GCA GAG GGA AGC AGA GGC GGC AGT CAA GCC TCT TCT CGC TCC TCA TCACGT AGT CGC GGT AAT TCA AGA AAT TCA ACT CCT GGC AGC AGT AGG GGA AAT TCT CCTGCT CGA ATG GCT AGC GGA GGT GGT GAA ACT GCC CTC GCG CTA TTG CTG CTA GAC AGATTG AAC CAG CTT GAG AGC AAA GTT TCT GGT AAA GGC CAA CAA CAA CAA GGC CAA ACTGTC ACT AAG AAA TCT GCT GCT GAG GCA TCT AAA AAG
GGA TCC GAA TAC ATC TCT GACGCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTCGTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GACGTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCGCTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAGGAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACCTTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAGAAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATTTAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AACATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTCTAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TACAAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTACGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCTACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTCGAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA
构建的重组质粒表达SARS的病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，全长560个氨基酸，在其N端为N蛋白片段，长259个氨基酸，C端为S蛋白片段，长299个氨基酸，两者之间由氨酸和丝氨酸两个氨基酸连接，其氨基酸序列如下：Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr PheGly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala ArgPro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr AlaLeu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro IleAsn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg ArgVal Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr TyrLeu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile ValTrp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg AsnPro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro LysGly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser SerArg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser ProAla Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp ArgLeu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln ThrVal Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser AspAla Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu PheVal Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile AspVal Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu ProLeu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala GlnAsp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr ThrPhe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser GlnAsn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly IleTyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro AsnIle Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser ValTyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu TyrAsn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu AsnAsp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp ValArg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr SerThr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro PheGlu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
4.表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为60kD的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带。
5.表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的纯化：
1)表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液l/10体积的细菌裂解液(20mmol/L PB pH7.4、10mmol/L EDTA、1mmol/LDTT、5％甘油)内，冰浴超声破菌，离心收集上清。
2)表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的硫酸胺分级沉淀
精确量出上清体积，向上清内加入适量饱和硫酸胺溶液，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为30％，置冰浴内过夜。离心收集上清，加入适量固体硫酸胺粉末，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为50％，置冰浴内过夜。次日离心收集沉淀。用l00ml平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)悬浮沉淀，装入透析袋内，对500ml平衡液透析过夜，换液1次。离心收集上清，直接上S-Sepearse FF阳离子柱纯化纯化
3)S-Sepearse FF阳离子柱纯化
用平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将上步透析好的上清直接上柱，上样流速1.5ml/min。上样结束后用平衡液液充分洗柱，再依次用含50、100、200、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％SDS-PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。100mmol/L NaCl洗脱蛋白峰即为SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。
6.纯化的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用作抗原检测SARS病毒抗体：
将复性的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用50mmol/L的碳酸盐(pH9.6)倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗SARS病毒阳性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白能与抗SARS病毒阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明表达的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白有较好抗原性和特异性。
7.用辣根过氧化物酶(HRP)标记SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用扑获法或夹心法检测抗SARS病毒IgM或IgG抗体。SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋用作抗原，用金标法检测抗SARS病毒抗体。
8.将表达的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用于疫苗、SARS病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗SARS病毒单抗和多抗等。
9.将SARS病毒S蛋白基因片段与N基因片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。
10.通过基因重组技术，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。英文缩写说明：SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)：严重急性呼吸综合症；EDTA：四甲基乙二胺；IPTG：异丙基硫代半乳糖苷；DTT：二硫苏糖醇；SDS：十二烷基磺酸纳；PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳；SKL：肌苷酸纳；PB：磷酸盐缓冲液；DNA：脱氧核糖核酸；RNA：核糖核酸；kD：千道尔顿；Triton：曲拉通。
本发明与现有技术相比具有的优点
我们表达的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，有较多优点：
1.现在应用的SARS病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，其使用的抗原是全病毒抗原，生产较危险、成本高、与其它冠状病毒有交叉反应等缺点。表达的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白用作抗原可克服上述缺点。
2.表达的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白以可溶性形式存在，易于纯化，且不需要复性处理。
3.将SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段融合表达，比分别使用两个单独的蛋白片段更方便、经济。用这两个蛋白作抗原检测抗SARS病毒抗体时，不再需要分别制备这两种蛋白，也不需要调整两个抗原的使用比例，因此应用方便且成本较低。用捕获法或夹心法检测抗SARS病毒抗体时，只需酶标记这一种融合蛋白，不再需要分别标记两个蛋白。
4.目前没有SARS病毒疫苗。灭活疫苗的研究取得了较大进展，但是生产成本高、危险大。SARS病毒最外层的S蛋白，是介导病毒和宿主细胞结合的主要蛋白，封闭该蛋白的结合位点可阻止病毒感染细胞，所以SARS病毒的S蛋白是研制疫苗的首选蛋白。N蛋白可刺激机体产生较强的细胞免疫。我们利用基因工程技术表达制备SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗具有安全、成本低的优点。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明：
图1是分子生物学软件对SARS病毒N蛋白的抗原表位进行分析结果。结果显示，在SARS病毒的N蛋白N端从第1个氨基酸到第258个氨基酸，含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。
图2是分子生物学软件对SARS病毒S蛋白的抗原表位进行分析结果。结果显示，在SARS病毒的S蛋白N端从第162个氨基酸到第460个氨基酸，含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。
图3是表达SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白的重组质粒构建流程图。
图4是用1.2％的Agarose凝胶检测8个转化子的PCR扩增产物。M：低分子量DNA标准(TaKaRa，DL2000)；2、3、4、5、6：第2、3、4、5、6号5个转化子扩增出1701bp的目的基因片段，即图内箭头标示的位置，1、7、8、：第1、7、8号3个转化子未扩增出1701bp的目的基因片段。
图5是表达SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌的SDS-PAGE分析结果。M：低分子量蛋白标准(Pharmacia)；2、4、5、6、：第2、4、5、6号4个重组子均表达相对分子量约为60000的目的融合蛋白，即图内箭头标示的位置。1、3、7、8、：第1、3、7、8号4个转化子未表达目的蛋白。
图6是表达SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白纯化前后的SDS-PAGE分析结果。M：低分子量蛋白标准(Pharmacia)；1：对照菌BL21(DE3)；2：表达SARS病毒的N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白的工程菌；3：S-Sepharose FF阳离子柱纯化后的的SARS病毒的S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。
具体实施方式
本发明实施方式的详细说明：
SARS病毒的S蛋白和N蛋白抗原表位的分析、基因合成及表达
通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列，筛选出含强抗原表位的SARS病毒的N蛋白片段，即第1个氨基酸至258氨基酸，和含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，即第162个氨基酸至第460个氨基酸，共299个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列，利用基因工程技术将两个基因片段串联，克隆至质粒pET28a(+)内的NcoI/EcoRI位点，表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌，表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的30％左右。
材料与方法
1.菌种与质粒：宿主菌BL21(DE3)及表达载体pET28a(+)为美国Novagen公司产品。
2.分子生物学试剂：限制性内切酶NcoI、BamHI、EcoRI、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为TaKaRa公司产品。DTT及IPTG为TaKaRa公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。
3.基因片段的合成：由大连TaKaRa公司帮助合成。
4.基因克隆方法：DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。
5.DNA序列分析：用TaKaRa公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。
结果
1.SARS病毒S蛋白和N蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列(GeneBank，接通号：AY278488)，发现N蛋白的N端第1个氨基酸至第258个氨基酸含有较强的抗原决定簇(图1)，S蛋白的N端第162个氨基酸至第460个氨基酸含有较强的抗原决定簇(图2)。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，分别化学合成包含上述抗原决定簇的S蛋白和N蛋白的基因序列。在合成的N蛋白基因片段的5’端增加了NcoI酶切位点(下画线部分)及8个保护碱基(GCGAGTCACC)，并在起始密码子ATG之后***了一个密码子GGA，在3’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及3个保护碱基(GCG)。在合成的S蛋白基因片段的5’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GT)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和EcoRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(AC)。使合成的两个基因片段易于串联克隆至质粒pET28a(+)内的NcoI和EcoRI酶切位点内。
筛选的SARS病毒N蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第1个aa-第258个aa)：Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr Phe GlyGly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg ProLys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala LeuThr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile AsnThr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg ValArg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr LeuGly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile Val TrpVal Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn ProAsn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys GlyPhe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser ArgSer Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro AlaArg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg LeuAsn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr ValThr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys
筛选的SARS病毒S蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第162个aa-第460个aa)：Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
化学合成的含SARS病毒N蛋白抗原表位基因的DNA序列(796 bp)：GCG AGT CA
C CAT GGG ATC TGA TAA CGG TCC GCA GTC AAA CCA ACG TAG TGC CCC CCGCAT TAC ATT TGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGG ACG CAATGG GGC AAG GCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TAC TGC GTC TTGGTT CAC AGC TCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCC TCG AGG CCA GGGCGT TCC AAT CAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGG CTA CTA CCG AAG AGCTAC CCG ACG AGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGA GCT CAG CCC CAG ATG GTACTT CTA TTA CCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACT TCC CTA CGG CGC TAA CAA AGAAGG CAT CGT ATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTT GAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGGCAC CCG CAA TCC TAA TAA CAA TGC TGC CAC CGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AACATT GCC AAA AGG CTT CTA CGC AGA GGG AAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCGCTC CTC ATC ACG TAG TCG CGG TAA TTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGGAAA TTC TCC TGC TCG AAT GGC TAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCTGCT AGA CAG ATT GAA CCA GCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA ACA ACAAGG CCA AAC TGT CAC TAA GAA ATC TGC TGC TGA GGC ATC TAA AAA G
GG ATC CGC G
化学合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)：GT
GGATCC GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA
GAATTCAC
2.表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。用Nco I和BamH I双酶切化学合成的SARS病毒N蛋白基因片段，用BamH I和EcoR I双酶切化学合成的SARS病毒S蛋白基因片段，分别电泳回收后，溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述三种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段经BamH I酶连接后，***到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间，表达一个SARS病毒S蛋白片段与N蛋白片段的融合蛋白。构建流程见图3。
3.重组质粒的筛选与鉴定：
将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，将转化产物涂布含卡那霉素(60μg/ml)的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选8个转化子菌落(分别标记为1-8号)，分别接种到含4ml液体LB培养基(含卡那霉素60μg/ml)的试管内，置37℃振荡培养6h，取菌液1ml，离心收菌。分别用50μl去离子水悬浮菌体，沸水煮5min，离心(4℃，12000rpm)5min，取上清(内有质粒)1μl用作PCR模板，用N蛋白基因片段5’端的引物(5’-GCGAGTCACCATGGGATCTGATAACGGTCCGCAGTCAAACCAACG-3’)和S蛋白基因片段3’端的引物(5’-GTGAATTCTTAGAAAGGCACATTAGATATGT-3’)组成引物对，PCR扩增连接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段，含串联两个基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约1701bp的串联基因片段。PCR反应浓度为：质粒模板1μl、上下游引物各1μl、10x Buffer 5.0μl、2.5 mmol/L dNTP 4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去离子水37.5μl，总体积50μl。扩增条件为：94℃30秒、60℃30秒、72℃60秒，30个循环；最后72℃延伸7分钟。取PCR扩增产物5μl，用1.2％的Agarose凝胶检测，结果，8个转化子中，第2、3、4、5、6号5个转化子扩增出1701bp的目的基因片段(见图4)，而第1、7、8号3个转化子没有扩增出该基因片段。初步证实，有5个转化子含有SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段的串联基因。
提取5号重组子的质粒，测定质粒内的SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段的串联基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有串联的SARS病毒S蛋白基因片段和N蛋白基因片段，序列完全正确：ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CA ACG TAG TGC CCC CCG CAT TAC ATTTGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGG ACG CAA TGG GGC AAGGCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TAC TGC GTC TTG GTT CAC AGCTCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCC TCG AGG CCA GGG CGT TCC AATCAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGG CTA CTA CCG AAG AGC TAC CCG ACGAGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGA GCT CAG CCC CAG ATG GTA CTT CTA TTACCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACT TCC CTA CGG CGC TAA CAA AGA AGG CAT CGTATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTT GAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGG CAC CCG CAATCC TAA TAA CAA TGC TGC CAC CGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AAC ATT GCC AAAAGG CTT CTA CGC AGA GGG AAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCG CTC CTC ATCACG TAG TCG CGG TAA TTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGG AAA TTC TCCTGC TCG AAT GGC TAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCT GCT AGA CAGATT GAA CCA GCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA A CAA CAA GGC CAA ACTGTC ACT AAG AAA TCT GCT GCT GAG GCA TCT AAA AAG
GGA TCC GAA TAC ATC TCT GACGCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTCGTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GACGTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCGCTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAGGAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACCTTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAGAAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATTTAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AACATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTCTAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TACAAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTACGT GAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCTACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTCGAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA
构建的重组质粒表达SARS的病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，全长560个氨基酸，在其N端为N蛋白片段，长259个氨基酸，C端为S蛋白片段，长299个氨基酸，两者之间由氨酸和丝氨酸两个氨基酸连接，其氨基酸序列如下：Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr PheGly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala ArgPro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr AlaLeu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro IleAsn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg ArgVal Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr TyrLeu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile ValTrp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg AsnPro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro LysGly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser SerArg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser ProAla Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp ArgLeu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln ThrVal Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser AspAla Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu PheVal Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile AspVal Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu ProLeu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala GlnAsp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr ThrPhe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser GlnAsn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly IleTyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro AsnIle Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser ValTyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu TyrAsn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu AsnAsp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp ValArg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr SerThr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro PheGlu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
4.表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将上述8个转化子接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，第2、4、5、6号4个转化子表达相对分子量约为60kD的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，而第1、3、7、8号4个转化子无此蛋白带(图5)。
表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的纯化
根据表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。经计算机分析，表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的等电点pH9.7，因此我们决定在pH为7.4的磷酸盐缓冲液内，用S-SepharoseFF阳离子纯化。具体步骤如下：
材料和方法
1.主要试剂：
S-SepharoseFF阳离子凝胶为Pharmacia公司产品，IPTG、DTT为TaTaRa公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。
2.表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白工程菌的诱导表达及超声裂解
从接种有5号工程菌的LB平板上，用牙签挑单菌落，接种到含200ml LB液体培养基的三角烧瓶内，加卡那霉素至终浓度60μg/ml，置37℃摇床内培养过夜。次日，将菌液接种到4个分别含200ml LB液体培养基的三角烧瓶，每瓶接种菌液50ml，置37℃摇床内振荡培养1小时，然后加IPTG至终浓度0.1mmol/L，诱导表达4小时。
将诱导表达融合蛋白的1000ml工程菌离心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌体重悬于l00ml的细菌裂解液(20mmol/L PB pH7.4、10mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5％甘油)内，冰浴超声破菌10min，离心(12000rpm、30min、4℃)收集上清。
3.表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的硫酸胺分级沉淀
精确量出上清体积，向上清内加入适量饱和硫酸胺溶液，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为30％，置冰浴内过夜。次日离心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，加入适量固体硫酸胺粉末，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为50％，置冰浴内过夜。次日离心(12000rpm、20min、4℃)收集沉淀。用100ml平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)悬浮沉淀，装入透析袋内，对500ml平衡液透析过夜，换液1次。离心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，直接上S-Sepearse FF阳离子柱纯化纯化
4.S-Sepearse FF阳离子柱纯化
用平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将上步透析好的上清直接上柱，上样流速1.5ml/min。上样结束后用平衡液充分洗柱，再依次用含50、100、200、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％SDS-PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白。
结果
将不同浓度NaCl从S-Sepharose FF柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示(见图6)，电泳结果显示，100mmol/L NaCl洗脱蛋白峰即为SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，显色一条很浓的SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白(约60kD处)，其它洗脱峰内无明显SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白带。
纯化SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的鉴定及应用
将纯化的重组SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用作抗原，通过间接ELISA试验方法，检测抗SARS病毒抗体(IgM或IgG)阳性及阴性血清，以鉴定表达的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的抗原性和特异性。实验结果显示，该重组融合蛋白有很好的抗原性和特异性，可用作抗原检测抗SARS病毒抗体等。
材料和方法
1.抗SARS病毒抗体阳性血清及正常人血清：GBI公司生产的抗SARS病毒抗体ELISA试剂盒内的阳性对照，及2份灭活的抗SARS病毒抗体阳性血清。正常人血清由本实验室保存。
2.酶联反应材料：酶联板为深圳产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人μ链单克隆抗体购自Sigma公司。其它材料为酶联反应的常规材料。
3.ELISA试验：采用间接ELISA检测血清中的抗SARS病毒抗体(IgG或IgM)。基本步骤为：用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)稀释SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白，包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。次日用封闭液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.05％硫硫汞，5％蔗糖)封闭，每孔130μl，37℃ 1h(或4℃过夜)。将待测的抗SARS病毒抗体(IgG或IgM)阴、阳性血清，用样本稀释液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.05％硫硫汞，0.5mmol/L NaCl)稀释后(IgG 1∶20稀释，IgM 1∶100稀释)，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100μl，每个样本加2孔，37℃反应30min，用PBST洗液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，0.5％吐温-20)洗5遍后，加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG或抗人μ链单抗，每孔100μl，37℃反应30min，PBST洗5遍，加底物四甲基联苯氨(TMB)溶液100μl，37℃避光显色10min，加50μl 4N硫酸混匀终止反应，用酶联仪测定A450值。
结果
1.间接ELISA检测血清中抗SARS病毒抗体(IgG或IgM)
将纯化的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白与已知不同浓度的牛血清白蛋白(第五部分)共同电泳、显色后比较，确定纯化的SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白浓度约为0.5mg/ml。用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)1∶500稀释后包被酶联板，检测已知2份抗SARS病毒IgG抗体阳性血清和1份抗SARS病毒IgM抗体阳性血清。结果显示，2份抗SARS病毒抗体阳性血清均出现显色反应，A450值分别为1.335和1.098。1份抗SARS病毒抗体(IgM)阳性血清也出现显色反应，A450值为0.872。同时检测了180份正常人血清，它们的A450值均小于0.05，说明SARS病毒的S蛋白和N蛋白的融合蛋白具有较好的抗原性和特异性。
SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白序列表<110>李越希<120>SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白及其制备、应用<160>2<210>1<211>560<212>PRT<213>SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白<220><223>SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，即SARS病毒的S蛋白的第162个氨基酸至第460个氨基酸片段和SARS病毒的N蛋白的第1个氨基酸至258氨基酸片段的融合蛋白，N蛋白片段在融合蛋白的N端，S蛋白片段在融合蛋白的C端，两蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接，在N蛋白片段的第一个氨基酸蛋氨酸后***一个甘氨酸，融合蛋白全长560个氨基酸。<400>lMet Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg1 5 10 15Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly
20 25 30Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro
35 40 45Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu
50 55 60Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser65 70 75 80Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val
85 90 95Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe
100 105 110Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn
115 120 125Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu ASn Thr Pro
130 135 140Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val145 150 155 160Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu
165 170 175Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser
180 185 190Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser
195 200 205Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu
210 215 220Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly225 230 235 240Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala
245 250 255Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val
260 265 270Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
275 280 285Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp
290 295 300Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe305 310 315 320Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr
325 330 335Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr
340 345 350Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu
355 360 365Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala
370 375 380Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr385 390 395 400Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe
405 410 415Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
420 425 430Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys
435 440 445Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe
450 455 460Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser465 470 475 480Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln
485 490 495Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
500 505 510Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile
515 520 525Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg
530 535 540His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe545 550 555 560<210>2<211>1683<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)…(1683)<223>人工合成的基因片段，编码SARS病毒S蛋白片段与N蛋白片段的融合蛋白。<220><221>mis-feature<222>(1)…(777)<223>人工合成的基因片段，编码SARS病毒N蛋白的第1个氨基酸至258氨基酸片段，在N蛋白第一个氨基酸密码子ATG后***一个甘氨酸密码子GGA。<220><221>mis-feature<222>(778)…(783)<223>连接SARS病毒S蛋白基因片段与N蛋白基因片段的BamHI酶切位点。<220><221>mis-feature<222>(784)…(1680)<223>人工合成的基因片段，编码SARS病毒S蛋白的第162个氨基酸至460个氨基酸片段。<220><221>mis-feature<222>(1681)…(1683)<223>合成基因时增加的终止密码子。<400>2ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CAA CGT AGT GCC CCC CGC ATT ACA TTT GGT 60Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly1 5 10 15 20GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AAC CAG AAT GGA GGA CGC AAT GGG GCA AGG CCA AAA 120Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys
25 30 35 40CAG CGC CGA CCC CAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGG TTC ACA GCT CTC ACT CAG 180Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln
45 50 55 60CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAG GGC GTT CCA ATC AAC ACC AAT AGT 240His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln GIy Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser
65 70 75 80GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TAC CGA AGA GCT ACC CGA CGA GTT CGT GGT GGT GAC 300Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp
85 90 95 100GGC AAA ATG AAA GAG CTC AGC CCC AGA TGG TAC TTC TAT TAC CTA GGA ACT GGC CCA GAA 360Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu
105 110 115 120GCT TCA CTT CCC TAC GGC GCT AAC AAA GAA GGC ATC GTA TGG GTT GCA ACT GAG GGA GCC 420Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala
125 130 135 140TTG AAT ACA CCC AAA GAC CAC ATT GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GCT GCC ACC GTG 480Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val
145 150 155 160CTA CAA CTT CCT CAA GGA ACA ACA TTG CCA AAA GGC TTC TAC GCA GAG GGA AGC AGA GGC 540Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly
165 170 175 180GGC AGT CAA GCC TCT TCT CGC TCC TCA TCA CGT AGT CGC GGT AAT TCA AGA AAT TCA ACT 600Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr
185 190 195 200CCT GGC AGC AGT AGG GGA AAT TCT CCT GCT CGA ATG GCT AGC GGA GGT GGT GAA ACT GCC 660Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala
205 210 215 220CTC GCG CTA TTG CTG CTA GAC AGA TTG AAC CAG CTT GAG AGC AAA GTT TCT GGT AAA GGC 720Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Ash Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly
225 230 235 240CAA CAA CAA CAA GGC CAA ACT GTC ACT AAG AAA TCT GCT GCT GAG GCA TCT AAA AAG GGA 780Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Gly
245 250 255 260TCC GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA 840Ser Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Ash Phe Lys
265 270 275 280CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC 900His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr
285 290 295 300CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC 960Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe
305 310 315 320AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG 1020Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
325 330 335 340GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT 1080Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr
345 350 355 360ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG 1140Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln
365 370 375 380AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC 1200Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr
385 390 395 400CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT 1260Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
405 410 415 420AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG 1320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp
425 430 435 440GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT 1380Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe
445 450 455 460TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC 1440Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser
465 470 475 480AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT 1500Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
485 490 495 500CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT 1560Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val
505 510 515 520CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT 1620Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr
525 530 535 540CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC 1680Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
545 550 555 560TAA 1683
Claims (5)
1.一种SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，即SARS病毒的S蛋白的第162个氨基酸至第460个氨基酸片段和SARS病毒的N蛋白的第1个氨基酸至258氨基酸片段的融合蛋白，N蛋白片段在融合蛋白的N端，S蛋白片段在融合蛋白的C端，两蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接，在N蛋白片段的第一个氨基酸蛋氨酸后***一个甘氨酸，融合蛋白全长560个氨基酸，氨基酸序列如下：
Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg
1 5 10 15
Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly
20 25 30
Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro
35 40 45
Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu
50 55 60
Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser
65 70 75 80
Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val
85 90 95
Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe
100 105 110
Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn
115 120 125
Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro
130 135 140
Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val
145 150 155 160
Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu
165 170 175
Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser
180 185 190
Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser
195 200 205
Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu
210 215 220
Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly
225 230 235 240
Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala
245 250 255
Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val
260 265 270
Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
275 280 285
Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp
290 295 300
Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe
305 310 315 320
Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr
325 330 335
Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr
340 345 350
Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu
355 360 365
Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala
370 375 380
Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr
385 390 395 400
Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe
405 410 415
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
420 425 430
Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys
435 440 445
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe
450 455 460
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser
465 470 475 480
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln
485 490 495
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
500 505 510
Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile
515 520 525
Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg
530 535 540
His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
2.权利要求1所述的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，利用基因工程技术表达、制备该蛋白，具体方法如下：
SARS病毒S蛋白和N蛋白抗原表位的筛选：
通过计算机分析SARS病毒S蛋白和N蛋白的氨基酸序列，发现S蛋白的N端第162个氨基酸至第460个氨基酸含有较强的抗原决定簇，N蛋白的第1个氨基酸至258氨基酸含有较强的抗原决定簇，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，分别化学合成包含上述抗原决定簇的S蛋白和N蛋白的基因序列。在合成的N蛋白基因片段的5’端增加了NcoI酶切位点及8个保护碱基，并在起始密码子ATG之后***了一个甘氨酸密码子GGA，在3’端增加了BamHI酶切位点及3个保护碱基，在合成的S蛋白基因片段的5’端增加了BamHI酶切位点及两个保护碱基，在3’端增加了终止密码子TAA和EcoRI酶切位点及两个保护碱基，使合成的两个基因片段易于串联克隆至质粒pET28a(+)内的NcoI和EcoRI酶切位点内；
筛选的SARS病毒N蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第1个aa-第258个aa)：Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr PheGly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly AlaArg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp PheThr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln GlyVal Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg ArgAla Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro ArgTrp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly AlaAsn Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro LysAsp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln LeuPro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly GlySer Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn SerThr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly GlyGlu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser LysVal Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser AlaAla Glu Ala Ser Lys Lys
筛选的SARS病毒S蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第162个aa-第460个aa)：Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn PheLys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val TyrLys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn ThrLeu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg AlaIle Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala AlaTyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu AsnGly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu LysCys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn PheArg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu CysPro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp GluArg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser ThrPhe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp LeuCys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val ArgGln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu ArgPro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe
化学合成的含SARS病毒N蛋白抗原表位基因的DNA序列(796bp)：GCG AGT CA
C CAT GGG ATC TGA TAA CGG TCC GCA GTC AAA CCA ACG TAG TGC CCCCCG CAT TAC ATT TGG TGG ACC CAC AGA TTC AAC TGA CAA TAA CCA GAA TGG AGGACG CAA TGG GGC AAG GCC AAA ACA GCG CCG ACC CCA AGG TTT ACC CAA TAA TACTGC GTC TTG GTT CAC AGC TCT CAC TCA GCA TGG CAA GGA GGA ACT TAG ATT CCCTCG AGG CCA GGG CGT TCC AAT CAA CAC CAA TAG TGG TCC AGA TGA CCA AAT TGGCTA CTA CCG AAG AGC TAC CCG ACG AGT TCG TGG TGG TGA CGG CAA AAT GAA AGAGCT CAG CCC CAG ATG GTA CTT CTA TTA CCT AGG AAC TGG CCC AGA AGC TTC ACTTCC CTA CGG CGC TAA CAA AGA AGG CAT CGT ATG GGT TGC AAC TGA GGG AGC CTTGAA TAC ACC CAA AGA CCA CAT TGG CAC CCG CAA TCC TAA TAA CAA TGC TGC CACCGT GCT ACA ACT TCC TCA AGG AAC AAC ATT GCC AAA AGG CTT CTA CGC AGA GGGAAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCG CTC CTC ATC ACG TAG TCG CGG TAATTC AAG AAA TTC AAC TCC TGG CAG CAG TAG GGG AAA TTC TCC TGC TCG AAT GGCTAG CGG AGG TGG TGA AAC TGC CCT CGC GCT ATT GCT GCT AGA CAG ATT GAA CCAGCT TGA GAG CAA AGT TTC TGG TAA AGG CCA ACA ACA ACA AGG CCA AAC TGT CACTAA GAA ATC TGC TGC TGA GGC ATC TAA AAA G
GG ATC CGC G
化学合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)：GT
GGATCC GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGTAAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TACGTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTTAAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTCCGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCTGCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GACGAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAACTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCTAAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AACCTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCATGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AACTCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GACGTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAACTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GACGCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAACTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA
GAATTCAC表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET28a(+)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，用Nco I和BamH I双酶切化学合成的SARS病毒N蛋白基因片段，用BamHI和EcoR I双酶切化学合成的SARS病毒S蛋白基因片段，分别电泳回收后，溶于去离子水内；
取等摩尔浓度的上述三种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段经BamH I酶连接后，***到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间，表达一个SARS病毒S蛋白片段与N蛋白片段的融合蛋白；
重组质粒的筛选与鉴定：
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含60μg/ml卡那霉素的LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和含pET28a(+)质粒的对照菌，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，用N蛋白基因片段5’端的引物(5’-GCGAGTCACCATGGGATCTGATAACGGTCCGCAGTCAAACCAACG-3’)和S蛋白基因片段3’端的引物(5’-GTGAATTCTTAGAAAGGCACATTAGATATGT-3’)组成引物对，PCR扩增连接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段，含串联两个基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约1701bp的串联基因片段，将含有串联基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有连接在一起的SARS病毒N蛋白基因片段与S蛋白基因片段，序列完全正确：ATG GGA TCT GAT AAC GGT CCG CAG TCA AAC CAA CGT AGT GCC CCC CGC ATT ACATTT GGT GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AAC CAG AAT GGA GGA CGC AAT GGGGCA AGG CCA AAA CAG CGC CGA CCC CAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGGTTC ACA GCT CTC ACT CAG CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAGGGC GTT CCA ATC AAC ACC AAT AGT GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TAC CGAAGA GCT ACC CGA CGA GTT CGT GGT GGT GAC GGC AAA ATG AAA GAG CTC AGC CCCAGA TGG TAC TTC TAT TAC CTA GGA ACT GGC CCA GAA GCT TCA CTT CCC TAC GGCGCT AAC AAA GAA GGC ATC GTA TGG GTT GCA ACT GAG GGA GCC TTG AAT ACA CCCAAA GAC CAC ATT GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GCT GCC ACC GTG CTA CAACTT CCT CAA GGA ACA ACA TTG CCA AAA GGC TTC TAC GCA GAG GGA AGC AGA GGCGGC AGT CAA GCC TCT TCT CGC TCC TCA TCA CGT AGT CGC GGT AAT TCA AGA AATTCA ACT CCT GGC AGC AGT AGG GGA AAT TCT CCT GCT CGA ATG GCT AGC GGA GGTGGT GAA ACT GCC CTC GCG CTA TTG CTG CTA GAC AGA TTG AAC CAG CTT GAG AGCAAA GTT TCT GGT AAA GGC CAA CAA CAA CAA GGC CAA ACT GTC ACT AAG AAA TCTGCT GCT GAG GCA TCT AAA AAG
GGA TCC GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTGGAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAAAAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTTCGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTGGGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAGGAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACTACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGCTCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GACAAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTGCGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACTAAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCTGAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCTTTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTTATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCTTGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TATCGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTGCCG TTC TAA
构建的重组质粒表达SARS的病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，全长560个氨基酸，在其N端为N蛋白片段，长259个氨基酸，C端为S蛋白片段，长299个氨基酸，两者之间由氨酸和丝氨酸两个氨基酸连接，其氨基酸序列如下：Met Gly Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile ThrPhe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn GlyAla Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser TrpPhe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly GlnGly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gin Ile Gly Tyr Tyr ArgArg Ala Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser ProArg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr GlyAla Asn Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr ProLys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu GlnLeu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg GlyGly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg AsnSer Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly GlyGlv Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu SerLys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys SerAla Ala Glu Ala Ser Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser LeuAsp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe LysAsn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val ValArg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro LeuGly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala GlnAsp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro ThrThr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp CysSer Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile AspLys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val ValArg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val AlaAsp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr GlyVal Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp SerPhe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly ValIle Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu AlaTrp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys TyrArg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn ValPro Phe
表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含卡那毒素60μg/ml的LB液体培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为60kD的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的纯化：
1)表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的细菌裂解液(20mmol/L PB pH7.4、10mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5％甘油)内，冰浴超声破菌，离心收集上清；
2)表达SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白的硫酸胺分级沉淀
精确量出上清体积，向上清内加入适量饱和硫酸胺溶液，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为30％，置冰浴内过夜，离心收集上清，测量体积，加入适量固体硫酸胺粉末，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为50％，置冰浴内过夜，次日离心收集沉淀，用平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2mmol/L DTT)悬浮沉淀，装入透析袋内，对平衡液透析过夜，换液1次，离心收集上清，直接上S-Sepearse FF阳离子柱纯化纯化；
3)S-Sepearse FF阳离子柱纯化
用平衡液(20mmol/L PB pH7.4、0.5mmol/L EDTA、0.2 mmol/L DTT)冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将上步透析好的上清直接上柱，上样结束后用平衡液液充分洗柱，再依次用含梯度浓度NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用SDS-PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，100mmol/L NaCl洗脱蛋白峰即为SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白；纯化的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白用作抗原检测SARS病毒抗体：
将复性的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用50mmol/L的碳酸盐缓冲液倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗SARS病毒阳性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白能与抗SARS病毒阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明表达的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白有较好抗原性和特异性。
3.权利要求1所述的SARS病毒S蛋白和N蛋白的融合蛋白，用于疫苗、SARS病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗SARS病毒单抗和多抗。
4.权利要求1所述的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，通过基因重组技术，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
5.权利要求1所述的SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白，融合蛋白中SARS病毒S蛋白片段与N蛋白片段的任意连接，N蛋白片段在融合蛋白的N端或C端，以融合蛋白的形式进行表达、制备。
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