CN1483738A - 具有促进小鼠nih/3t3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类新的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多核苷酸的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及新的编码具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多核苷酸,以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术
人基因组学研究目前是国际上的热点,除人染色体DNA大规模测序,表达序列测序(EST)的方法外,还缺少从功能开始的筛选具有功能基因的高通量的方法。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤,目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此,本领域迫切需要开发研究与癌细胞生长相关的人蛋白及其激动剂/抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类新的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面,提供新颖的分离出的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽,它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30;或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地,该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30。
在本发明的第二方面,提供了一种分离的多核苷酸,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85%相同性:(a)编码上述的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽的多核苷酸;(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地,该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30。更佳地,该多核苷酸的序列选自下组:SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的载体,以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面,提供了制备具有促进3T3细胞转化功能的蛋白活性的多肽的制备方法,该方法包含:(a)在适合表达具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞;(b)从培养物中分离出具有促进3T3细胞转化功能的蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面,提供了与上述的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子,它含有上述的多核苷酸中连续10个核苷酸至全长核苷酸,较佳地它含有连续的约15-1000个核苷酸。
在本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可用于促进细胞的生长。本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的针对本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽的拮抗剂(如抗体)以及药学上可接受的载体。该药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
3T3细胞是一种小鼠成纤维细胞(J.Cell.Biol.,17:299,1963)(也称为NIH/3T3细胞)。在癌症研究领域中,常将外源基因(尤其是人基因)引入3T3细胞,观察其对3T3细胞生长的影响情况。通常认为,对3T3细胞生长(或恶性转化或转染)有影响的基因是癌症相关基因,其中对3T3细胞生长或转化有抑制作用的基因大多是抑癌基因,而对3T3细胞生长或转化有促进作用的基因大多是(原)癌基因。
本发明采用大规模cDNA克隆转染小鼠胚胎成纤维细胞3T3,在获得具有促进生长作用的基础上,经测序证明为新的基因,进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明,本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白对3T3细胞具有促进克隆形成的作用,其促进率≥50%。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白或多肽”是指具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化具有促进3T3细胞转化功能的蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以FP18315蛋白(在本申请中,蛋白质的命名采用其克隆编号)为例,编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”对于FP18315而言是指编码具有SEQ ID NO:3的蛋白质,但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。再以LP2209蛋白为例,编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:5所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”对于LP2209而言是指编码具有SEQ ID NO:6的蛋白质,但与SEQ ID NO:5所示的编码区序列有差别的核酸序列。对于本发明其他具有促进3T3细胞转化功能的蛋白,依此类推。
编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95%以上,更好是97%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO:3所示的成熟多肽(以FP18315蛋白为例)有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如,用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于:1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列,和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得:1)从基因组DNA分离双链DNA序列;2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时,DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时,DNA序列的直接化学合成是不可能的,选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录,形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术,试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory.New York,1989)。还可得到商业供应的cDNA文库,如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时,即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于):(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(2)标志基因的功能出现或丧失;(3)测定具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的转录本的水平;(4)通过免疫学技术或测定生物学活性,来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用,也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中,杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源,其长度至少15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸。此外,探针的长度通常在2kb之内,较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素,荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中,检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法,放射免疫沉淀法,酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因,或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列,测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列,才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或具有促进3T3细胞转化功能的蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431),可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于):直接做为药物治疗具有促进3T3细胞转化功能的蛋白功能低下或丧失所致的疾病,和用于筛选促进或对抗具有促进3T3细胞转化功能的蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如,该抗体可用于治疗癌症或细胞异常增殖。用重组表达的本发明蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的药剂的方法。激动剂提高具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白刺激细胞增殖等生物功能,面拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。
具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的拮抗剂可以与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白结合并消除其功能,或是抑制具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的产生,或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时,可以将具有促进3T3细胞转化功能的蛋白加入生物分析测定中,通过测定化合物影响具有促进3T3细胞转化功能的蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法,可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明蛋白的拮抗剂可直接用于疾病治疗,例如,各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽,及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术,三瘤技术,人B-细胞杂交瘤技术,EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒,容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起,可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示,该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外,本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药,如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。具有促进3T3细胞转化功能的蛋白或其特异性抗体,可按有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素,如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的无表达或异常/无活性的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的表达所致的细胞发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白,以抑制内源性的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白活性。例如,一种变异的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白,虽可与下游的底物结合,但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗具有促进3T3细胞转化功能的蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因转移至细胞内。构建携带具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子,其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得,如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其进行修饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多聚核苷酸直接注入到体内组织中;或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中,再将细胞移植到体内等。由于本发明蛋白具有促进3T3细胞转化的功能,因此本发明蛋白编码序列的反义序列,可被引入细胞以抑制细胞的异常增殖(如癌变)。
本发明还提供了针对具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于):多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白。
与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记,注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以阻断具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的产生或活性,从而抑制癌细胞的生长和/或细胞的异常增殖。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP,攻击抗体的氨基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗体上,这种杂交抗体可用于杀灭有关的阳性细胞(如癌细胞)。
多克隆抗体的生产可用具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白或多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler andMilstein.Nature,1975,256:495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的单链抗体。
能与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时,必须对具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白水平的诊断试验方法。这些试验为本领域所熟知,且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白水平,可以用作解释具有促进3T3细胞转化功能的蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有促进3T3细胞转化功能的蛋白起作用的疾病。
具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的多聚核苷酸可用于具有促进3T3细胞转化功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面,具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的多聚核苷酸可用于检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的表达与否或在疾病状态下具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的异常表达。如具有促进3T3细胞转化功能的蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(即基因芯片)上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用具有促进3T3细胞转化功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的转录产物。
检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有促进3T3细胞转化功能的蛋白相关的疾病。具有促进3T3细胞转化功能的蛋白突变的形式包括与正常野生型具有促进3T3细胞转化功能的蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。这些序列会特异性地针对某条人染色体具***置且并可以与其杂交。目前,需要鉴定染色体上的各基因的具***点。然而现在只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色***置。为了将这些序列与疾病相关基因相关联。第一步就是将本发明DNA序列定位于染色体上。
简而言之,根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp),可以将序列定位于染色体上。然后,将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法,是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物,通过类似方法,可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选,从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH),可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述,参见Verma等,Human Chromosomes:a Manual of BasicTechniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色***置,此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着,需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变,而该突变在任何正常个体中未观察到,则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体,通常涉及首先寻找染色体中结构的变化,如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。
本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
由于本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,与来源于其他物种的同族蛋白相比,预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。注意,在核苷酸和氨基酸组合序列中,(1)给出的是起始和终止编码子第一个核苷酸的位置,(2)分子量单位是道尔顿。
实施例1:cDNA基因的获得及对小鼠NIH/3T3细胞克隆形成的促进作用
FP18315来自于用常规方法构建的人胎儿cDNA文库;LP2209,LP2570,LP3317,LP3428,LP4947,LP5553,LP6347,LP8067和LP8151来自于用常规方法构建的正常肝cDNA文库。取胎儿组织(FP克隆)或正常肝组织(LP克隆),用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA,用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXRcDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL),反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞,获得了1×106cfu/μg滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆,其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑制癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针,杂交筛选cDNA文库,挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒,按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染小鼠NIH/3T3细胞。100ng DNA酒精沉淀干燥后,加6μl H2O溶解,待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液,混匀后,室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液,均分加入3孔生长于96孔板的小鼠NIH/3T3细胞中,37℃放置2小时,每孔再加50μl无血清培液,37℃24小时。每孔换100μl全培液,37℃ 24小时,换含G418的全培液100μl,37℃ 24-48小时,边观察,边换G418浓度不等的培液。约2-3次后,直到镜检细胞有克隆形成,计数。发现上述克隆有促进细胞克隆形成作用,结果如下表所示。
cDNA克隆转染细胞(3T3)克隆形成情况
cDNA克隆名称 | cDNA克隆数(三个重复) | 空载体克隆数(三个重复) | ||||
FP18315 | 84 | 88 | 78 | 39 | 41 | 38 |
LP2209 | 62 | 68 | 63 | 4 | 9 | 13 |
LP2570 | 68 | 76 | 83 | 22 | 25 | 29 |
LP3317 | 61 | 56 | 52 | 35 | 32 | 38 |
LP3428 | 68 | 60 | 63 | 37 | 35 | 30 |
LP4947 | 50 | 51 | 40 | 29 | 36 | 31 |
LP5553 | 45 | 48 | 50 | 20 | 15 | 17 |
LP6347 | 48 | 53 | 50 | 27 | 30 | 34 |
LP8067 | 66 | 62 | 65 | 41 | 36 | 30 |
LP8151 | 61 | 63 | 60 | 30 | 45 | 40 |
对cDNA克隆采用双脱氧终止法,在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后,确定为新基因克隆,进行另一端测序,仍未获得全长cDNA序列,设计引物,再次进行测序,直到获得全长序列(SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28)。
实施例2:从胎盘或正常肝cDNA中PCR获得全长基因:
取胎儿组织(FP克隆)或正常肝组织(LP克隆),用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA,用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL),反转录酶在42℃进行反转录反应,获得胎盘或胎儿cDNA。利用各个基因的特异引物(如下表所示),按97℃ 3’1个循环。94℃ 30″60℃ 30″72℃ 1’35个循环,72℃ 10’1个循环进行PCR扩增,获得含有完整开放阅读框序列的各蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证,与实施例1测得的序列相符,随后用常规技术将扩增产物转入宿主细胞,获得重组蛋白(SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30)。
基因特异引物
克隆名称 | 特异引物1(5’→3’) | SEQID NO | 特异引物2(3’→5’) | SEQID NO |
FP18315 | (73)GGCCAGCTCATGGTATCTCC | 31 | ATGAACCCTCTGACTCCGTCC(1884) | 32 |
LP2209 | (101)CAGAAACCTGGGGTAAGCAA | 33 | TACAAATCACGGGAAAAGTACG(812) | 34 |
LP2570 | (33)GATGATGCTGCCAAGTTATTCA | 35 | ATCCCCATAGACATCCTTACCG(1729) | 36 |
LP3317 | (57)CTGGAGGGAGATCACAAAACA | 37 | ATGAAGCACTGGTGGGTGATAC(1102) | 38 |
LP3428 | (33)CCCGTCTGGGATGTGAGG | 39 | GCTCTTTGTGGGTTCTTACTAG(1222) | 40 |
LP4947 | (22)TTCATACTTGGTGCGCTGTG | 41 | GAGGGAACAAAGCTAACGG(2058) | 42 |
LP5553 | (94)GATTCTGCCCATGTGCTCC | 43 | TCCTTTATTTCGTCTTCCTTGC(1901) | 44 |
LP6347 | (138)TAGCTGGTTGCTAGAGTTACGG | 45 | TTTCCTTTATTCGGCACGTT(1899) | 46 |
LP8067 | (19)CGGCAGACTGGGGTTGGT | 47 | TTTATTTCGCGGTCGCGT(1548) | 48 |
LP8151 | (27)GGGTGTTGCTGTCATCTCCA | 49 | TTCTCCAAACCTCCCTCACC(1629) | 50 |
注:括号内为引物在各基因DNA序列中的对应位置。
实施例3:cDNA克隆序列分析
1.FP18315
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:1)长度:2032个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:3)长度:117个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:2)克隆号和蛋白名称:FP18315起始编码子:898 ATG终止编码子:1249 TAG蛋白质分子量:12585.84
2.LP2209
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:4)长度:926个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:6)长度:70个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:5)克隆号和蛋白名称:LP2209起始编码子:430 ATG终止编码子:640 TGA蛋白质分子量:7837.38
3.LP2570
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:7)长度:1814个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:9)长度:117个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:8)克隆号和蛋白名称:LP2570起始编码子:1001 ATG终止编码子:1352 TAA蛋白质分子量:12882.88
4.LP3317
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:10)长度:1199个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:12)长度:103个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:11)克隆号和蛋白名称:LP3317起始编码子:217 ATG终止编码子:526 TAA蛋白质分子量:11308.46
5.LP3428
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:13)长度:1269个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:15)长度:80个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:14)克隆号和蛋白名称:LP3428起始编码子:978 ATG终止编码子:1218 TGA蛋白质分子量:8987.08
6.LP4947
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:16)长度:2471个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:18)长度:146个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:17)克隆号和蛋白名称:LP4947起始编码子:108 ATG终止编码子:546 TGA蛋白质分子量:16017.98
7.LP5553
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:19)长度:1934个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:21)长度:96个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:20)克隆号和蛋白名称:LP5553起始编码子:837 ATG终止编码子:1125 TAG蛋白质分子量:10235.89
8.LP6347
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:22)长度:1915个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:24)长度:91个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:23)克隆号和蛋白名称:LP6347起始编码子:343 ATG终止编码子:616 TGA蛋白质分子量:9540.07
9.LP8067
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:25)长度:1575个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:27)长度:200个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:26)克隆号和蛋白名称:LP8067起始编码子:754 ATG终止编码子:1354 TGA蛋白质分子量:20839.38
10.LP8151
A:核苷酸序列(SEQ ID NO:28)长度:1800个碱基
B:氨基酸序列(SEQ ID NO:30)长度:168个氨基酸
C.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:29)克隆号和蛋白名称:LP8151起始编码子:409 ATG终止编码子:913 TGA蛋白质分子量:18356.29
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新世界基因技术开发有限公司<120>具有促进小鼠NIH/3T3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列<130>025304<160>50<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2032<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gctgagttaa tgttgagcca ctccatgtga cacagaagcc tcttgtcact gtgttgttca 60ttggggtgcc gaggccagct catggtatct cctgagagcc agtcgttcac tttccagtat 120ttttttttgc gggggcgtgg ggggacggat gttcactctt gttgcccagg ctggaacaca 180atggcacgat ctcggttcac cacgacctcc acctcctgag gcaggagagt cgcttgaacc 240caggaggcgg aggtcgtggt aagccaagat cacgccattg cactccagcc tggcaacaag 300gagcaaaact ccgtctgaaa aaaaaaaaaa aaattagcca ggcctggtgg tgcacgcttg 360taatcccagc tacttgagag gctgaggcag gagaattgct tgaacccagg aggtggaggt 420tgcagtgagc cgagatcgtg ccactgccct ccagtctggg tgacagagtg agattacatc 480tcaaaaaaaa aaaaagggtg ggaggaataa gttttacacc ctcctcccca ccccacatgg 540aaatcatcct taaccactag agcggtgttg tcctgaagcg ctctctgtgg tgacggatgg 600ttttccacct gcactgagtt ggttgtcagc agccacacgt gccttccgcg cacttgaaac 660atggctaatg tgactggcta cctgagtctt tatttttctt taacgtacac gtggacagct 720cagcgtgggt agtgaggcgc ggcctgagcc ccctgtggct ctgcacgcca gcctctgccg 780tgttatgatc agctgcaaag ttggtaacca tgccatagta gtggaggctt tggggagggg 840agagtaaggt ggtttgtagg actagatgga ccagataatg catacccggt aaaataaatg 900cttgtgtggt ttgcagaatc gtcagtagtg gggcgacaga gaccagggtg gcgctttcca 960gtggggtcac tggtcctgag cccccatggc atagaggtac cgcggccggc tgtgtccgca 1020tctgctggcc tctattctcc ctgtgttatt tacaaagatg tttgtctcct agcaggtgcg 1080ccacgtgagg cccagagccg cactcgctca ccctgtgcgc tctcccccaa ccgccccgca 1140ccgtccccgt ccctggcacg gcgcttcgtg ccttccacag gcttcataac tgctttgttt 1200ctaaagtccc gttctgacaa cgccatcgag agccacctgt ctctgattta gatcctaact 1260caggaaggac ccatttcccc agcagctgca gcctctgttg atgtaatgag cacggtatgg 1320tatggagaca gtaactcctt actgcagccc tgcgagggct cctgtcccca cttgaccctc 1380gtagcaaccc cctgaggtcg caacagtctt tgtcttatcc actgctcttg ggagggtctg 1440tggctcttgg ttgagcgtct tcaccgcacc ctcatcctgg tgatgccgcg atgctccaac 1500cccagagcgg acacttggcg tcggaattgc agggagtccc tccgctgtag aaagggctcc 1560tcctcttcct tcccccatgc catcccagga gaaaggcctg ccgtggagtg ccgcttcctt 1620tgtctccaga cagtccagcc tgggcgacag agcaggactc tttctttgtc tcaaaaaaaa 1680aaaaaagtac atgtttagcc aggcatggtg gctcatgcct gtaatcccag cactttggga 1740ggccgaggca ggtggatcaa aaggtcaaga gatggagacc atctggccaa catggtgaaa 1800ccccatctct actaaaaata aaaaaatcag ctgggcgtgg tggtgcacgc ctgtagtccc 1860atctacttgg gagactgagg caggagaatc tcttgaaccg gggaggcaga ggttgcagtg 1920agccgagatt gcgccactgc actccagcct ggcaacagag agagactcca tctctaaaaa 1980aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2032<210>2<211>2032<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(898)..(1248)<223><400>2gctgagttaa tgttgagcca ctccatgtga cacagaagcc tcttgtcact gtgttgttca 60ttggggtgcc gaggccagct catggtatct cctgagagcc agtcgttcac tttccagtat 120ttttttttgc gggggcgtgg ggggacggat gttcactctt gttgcccagg ctggaacaca 180atggcacgat ctcggttcac cacgacctcc acctcctgag gcaggagagt cgcttgaacc 240caggaggcgg aggtcgtggt aagccaagat cacgccattg cactccagcc tggcaacaag 300gagcaaaact ccgtctgaaa aaaaaaaaaa aaattagcca ggcctggtgg tgcacgcttg 360taatcccagc tacttgagag gctgaggcag gagaattgct tgaacccagg aggtggaggt 420tgcagtgagc cgagatcgtg ccactgccct ccagtctggg tgacagagtg agattacatc 480tcaaaaaaaa aaaaagggtg ggaggaataa gttttacacc ctcctcccca ccccacatgg 540aaatcatcct taaccactag agcggtgttg tcctgaagcg ctctctgtgg tgacggatgg 600ttttccacct gcactgagtt ggttgtcagc agccacacgt gccttccgcg cacttgaaac 660atggctaatg tgactggcta cctgagtctt tatttttctt taacgtacac gtggacagct 720cagcgtgggt agtgaggcgc ggcctgagcc ccctgtggct ctgcacgcca gcctctgccg 780tgttatgatc agctgcaaag ttggtaacca tgccatagta gtggaggctt tggggagggg 840agagtaaggt ggtttgtagg actagatgga ccagataatg catacccggt aaaataa 897atg ctt gtg tgg ttt gca gaa tcg tca gta gtg ggg cga cag aga cca 945Met Leu Val Trp Phe Ala Glu Ser Ser Val Val Gly Arg Gln Arg Pro1 5 10 15ggg tgg cgc ttt cca gtg ggg tca ctg gtc ctg agc ccc cat ggc ata 993Gly Trp Arg Phe Pro Val Gly Ser Leu Val Leu Ser Pro His Gly Ile
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35 40 45gta ggc ggc aca aaa gtc tgc tca gtt agg tca cat gct cca gag gca 615Val Gly Gly Thr Lys Val Cys Ser Val Arg Ser His Ala Pro Glu Ala
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20 25 30Arg Glu Thr Glu Trp Asp Leu Arg Arg Ala Ala Gln His Thr Val Gly
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35 40 45Gln Ile Ala Val Thr Gly Tyr Asp Leu Thr Ser Leu Ala Arg Ser Arg
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85 90 95ggt cca ttt cag act ctc ggg ttc aat tct gag ttt atg cca gtt att 452Gly Pro Phe Gln Thr Leu Gly Phe Asn Ser Glu Phe Met Pro Val Ile100 105 110 115cag aca gaa agt gaa cac aag cct cct ggt aaa tgg aag tta ctt tgc 500Gln Thr Glu Ser Glu His Lys Pro Pro Gly Lys Trp Lys Leu Leu Cys
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135 140 145tgagaaatgt catgattttc agtgtgcatt actggctaat ctttttgcca gtgaaggcca 605acctggcaag gtaattgagg tgaaagccaa aagaagaact ggaccactta actttgtgac 665ttgtatgaga gagaccctgg aaaaacatta tggaaataag cctataggaa tgggaggtac 725tttcataatt cagaagggaa aagtgaagtc tcacattatg cctgcagaat tttcttcctg 785ccccttgaac tctgatgaag aagtgaataa atggttgcat ttttatgaaa tgaaagctcc 845tttggtttgt ctaccagttt ttgtctccag agacccaggg tttgatttgc gactggagca 905cactcatttt tttagtcgtc atggagaagg tggacactac cattatgaca ctactccaga 965tatagtggaa tatcttggat acttcttacc tgcagagttt ctctatcgca ttgatcaacc 1025aaaagagacg cattcaattg ggcgagatta aatcagctga tacttattta gaaaaagaaa 1085taattaaggt taattaattg attgacttat taattaatac tgatataaaa ccaatagaaa 1145tgatcccaca ggccaggcac aatggctcat gcctatatcc cagcactttg ggaggctgag 1205gcaggaagca cactggagcc caggagtttg agaccagctt gggcaacata gcaagaccct 1265gtctattttt ttaaaaaagt aaaaaataga aattatctca ctacttaaat cccatttttt 1325tcacttcata tgaaagaaca tattgatagt atattctata ttatttcata gatctgtctg 1385aaagagattg ggaacaaaaa tatctaattg agatattctt taatttttta catagcagct 1445ttattttttt tattctgtag tatcagcgaa atcagtcatg tttatacctt gaatataaat 1505atcaggaatc atgcaattat ttctactatg tatttagtag tatcttatat ttgtataaca 1565ttattacatt ttgcaaatta gtatcacaac tgctaagtag atgtttctga gtattagaaa 1625aatcagtgtt attacctgca ggatattaaa aaacatttga aaaagagaaa aagaaaaatc 1685agtgtttaga aatgttgata gttattgaat ctttgaattg aattttaaaa atccattcta 1745gtaatcagag tatacttttt ttatagaaca aggtggcagg tggggagccc tttacccttc 1805tggtgaagtt aaaccataga agtttacaat ttgcctttca caaacattag cagtccgggc 1865atggtggctg aagcctgtga tcccagcatg ttgggaggcc gagtgggagg attgcctgag 1925cctaggagtt taaaccagcc tgggcaccat ggtgagaccc catctctatt atttaaaatg 1985tttcttaaat aaaaaaaaca caaacattag caactagttg gctagccata attcctccct 2045tgtttcgatt gccagttaga agcaattttt atttcactgg ttatttgcaa gagaaggggt 2105aaaaaaacag catcagagtg caacactgaa gtgagcttac tttaatttgt aagtgaagct 2165gttgctgaac atgaccacta tcgttgctga aatataaaat tatactcact gattgtaatg 2225gttgaaattt tcctgaataa tcattagcca aagatcaact ctctaatggt gctaatggca 2285atctagctaa tgtgcaaatt taggaagtct tcagtactaa gtacataatt ttcaaataat 2345attttttaat tgtctacttt ggatgttagc tatgtcttgt gagtataaat tccaatttta 2405agcactattt tgatgcaaaa aaatgaataa aaaatttaat ttatgaaaaa aaaaaaaaaa 2465aaaaaa 2471<210>18<211>146<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Met Ala Cys Ala Glu Phc Ser Phe His Val Pro Ser Leu Glu Glu Leu1 5 10 15Ala Gly Val Met Gln Lys Gly Leu Lys Asp Asn Phe Ala Asp Val Gln
20 25 30Val Ser Val Val Asp Cys Pro Asp Leu Thr Lys Glu Pro Phe Thr Phe
35 40 45Pro Val Lys Gly Ile Cys Gly Lys Thr Arg Ile Ala Glu Val Gly Gly
50 55 60Val Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Val Asn Gln Lys Lys Val Tyr Asp Leu65 70 75 80Asn Lys Ile Ala Lys Glu Ile Lys Leu Pro Gly Ala Phe Ile Leu Gly
85 90 95Ala Gly Ala Gly Pro Phe Gln Thr Leu Gly Phe Asn Ser Glu Phe Met
100 105 110Pro Val Ile Gln Thr Glu Ser Glu His Lys Pro Pro Gly Lys Trp Lys
115 120 125Leu Leu Cys Pro Cys Glu Pro Cys Arg Trp Arg Val Pro Thr Gly Glu
130 135 140Ile Gln145<210>19<211>1934<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19gcccttgtgg gggcgctgca ctggggatcc tcatggtctt cggcctggca cccgcccagg 60ggctgagaca gtggctgccc tagagggacg cccgattctg cccatgtgct ccgctgtctc 120ttgggggtct gagtagtggg gggttccctg ggtagaagag tcaagctggg gagcacgctg 180gaggggaggc cttctctatc ctggtgccca gccagtgggc tggcctccca aggagggttg 240actttgtgtg tgtctgggag gctgtgccag ccgggaggct gtgcctctgt cctctagggg 300agctgggaaa acactggggc tggaagcatc agatgcataa gatagagtta ggtttaaaat 360gattgcctgg taactgtgaa cagcagatgg gagggtggcc aagactggag gaggcagccc 420cccttaggag cctgtgtcag ctgtgcaggg ggtggaggtt ggcctggtct agggggtaac 480aaagcagacg ggaaagcagc acgggggtcc tcctggcaga ctgtggggaa tggttgcgct 540agccacaggg actatttaag taaaattaaa aattgaatgg caatatttcc cttcctttta 600aaactacctt gttcggttga tacttagtaa ctccgtggcc agttgaagcg ctggatgttt 660cctagaacaa gaaccaccaa agcctgttcg cacagaaggg cgaccttgca gggactcgcc 720gccgcgacct cagtgtggct tttacaggac tccccccgag catcagcagg gaccccggcg 780gacgtgggcg ggcgcgcgtg agctcgggct gcccggccgg gcgtgcgggc ggggacatgg 840taacctggtc cacggagggc ggccgccacc ctcgcgtagc tttcctgtgg ttttccagga 900ctgtccggta cagcccgggc tccgcgtgcc ccgcccgctg gagcacacct gccaccgagg 960cgcgcgtggg gccactgccg tggcggcggc tgccctcctc acactcggct ccgcgccgcc 1020tccggccacc gtgcgctccc gcgtggggcg cctcggacgg gcccgggagg gctgggggct 1080cttccccgga ggaagcggcc tccgcttcgc tggcgccgcc tttttagctt ggacttcagt 1140cctccctcgg ggactcacct ccggagtaaa cggctcttca ttagcttgga gtggccgcag 1200gtcccgtgac cagcacccgc gagaccctgt gcgacagctg ggctgatgct ccgtttctct 1260gggaattggt gattttttac tgtgaagatg aaattaccct aatagcatga agatcgtggg 1320tctgtgtgtc cgtgaagtga gtcccgtctg ccaggagctg acgaaccacg aatgcttctg 1380cctgtgctgt gcattcccgg gcccgcagct cccggtcgag gggactccga tgtgaatttg 1440ttgtgaattt gttgtgccac aatagcagtt ctggaatgaa gctaggaaac tcgagtgtgc 1500tttttgttta atgagcgttc accaagctga gccggagcca tcctttcggt ggtagttggg 1560gaaggctatg cagatttgct ctgttgtgac gcgttggtga cggtgcccag cctgcggttc 1620cccacagcat cgcaggcgct cggaaatcct ctcccgtgcc tttagaggaa ggagaggatt 1680cctcaggaat gcagggacgc ctgtttctgt cctcacacca cagaaaaaaa cctgagggaa 1740aaatgagacg tgaggttcct gatttaagaa gcctgggttt ttttcatggt ggggggccat 1800ttggaatgac agcctcactt ccttttgatg gctacatctg gatacttttc ctccctgtgt 1860ttaatgtttc cctagggaga ggaaataaag cagaaggaac gtgttaaaaa aaaaaaaaaa 1920aaaaaaaaaa aaaa 1934<210>20<211>1934<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(837)..(1124)<223><400>20gcccttgtgg gggcgctgca ctggggatcc tcatggtctt cggcctggca cccgcccagg 60ggctgagaca gtggctgccc tagagggacg cccgattctg cccatgtgct ccgctgtctc 120ttgggggtct gagtagtggg gggttccctg ggtagaagag tcaagctggg gagcacgctg 180gaggggaggc cttctctatc ctggtgccca gccagtgggc tggcctccca aggagggttg 240actttgtgtg tgtctgggag gctgtgccag ccgggaggct gtgcctctgt cctctagggg 300agctgggaaa acactggggc tggaagcatc agatgcataa gatagagtta ggtttaaaat 360gattgcctgg taactgtgaa cagcagatgg gagggtggcc aagactggag gaggcagccc 420cccttaggag cctgtgtcag ctgtgcaggg ggtggaggtt ggcctggtct agggggtaac 480aaagcagacg ggaaagcagc acgggggtcc tcctggcaga ctgtggggaa tggttgcgct 540agccacaggg actatttaag taaaattaaa aattgaatgg caatatttcc cttcctttta 600aaactacctt gttcggttga tacttagtaa ctccgtggcc agttgaagcg ctggatgttt 660cctagaacaa gaaccaccaa agcctgttcg cacagaaggg cgaccttgca gggactcgcc 720gccgcgacct cagtgtggct tttacaggac tccccccgag catcagcagg gaccccggcg 780gacgtgggcg ggcgcgcgtg agctcgggct gcccggccgg gcgtgcgggc ggggac atg 839
Met
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20 25 30cgc tgg agc aca cct gcc acc gag gcg cgc gtg ggg cca ctg ccg tgg 983Arg Trp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ala Arg Val Gly Pro Leu Pro Trp
35 40 45cgg cgg ctg ccc tcc tca cac tcg gct ccg cgc cgc ctc cgg cca ccg 1031Arg Arg Leu Pro Ser Ser His Ser Ala Pro Arg Arg Leu Arg Pro Pro50 55 60 65tgc gct ccc gcg tgg ggc gcc tcg gac ggg ccc ggg agg gct ggg ggc 1079Cys Ala Pro Ala Trp Gly Ala Ser Asp Gly Pro Gly Arg Ala Gly Gly
70 75 80tct tcc ccg gag gaa gcg gcc tcc gct tcg ctg gcg ccg cct ttt 1124Ser Ser Pro Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ser Leu Ala Pro Pro Phe
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20 25 30Ala Arg Trp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ala Arg Val Gly Pro Leu Pro
35 40 45Trp Arg Arg Leu Pro Ser Ser His Ser Ala Pro Arg Arg Leu Arg Pro
50 55 60Pro Cys Ala Pro Ala Trp Gly Ala Ser Asp Gly Pro Gly Arg Ala Gly65 70 75 80Gly Ser Ser Pro Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ser Leu Ala Pro Pro Phe
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25 30 35ggg cca ggg agg ttg ggg gtg gga gtg aat gct aaa agc aga tcg tcc 498Gly Pro Gly Arg Leu Gly Val Gly Val Asn Ala Lys Ser Arg Ser Ser
40 45 50agt gcc ctt ttc agt gct acc ggc ctc tca cca agc agt cct cca tgt 546Ser Ala Leu Phe Ser Ala Thr Gly Leu Ser Pro Ser Ser Pro Pro Cys
55 60 65gag caa ccc cga gac aaa aat gct aag tgg gat caa gag agc agc act 594Glu Gln Pro Arg Asp Lys Asn Ala Lys Trp Asp Gln Glu Ser Ser Thr
70 75 80cgg aga ggg tgt ttg cca gtc tgagtgtccc gcggtgcccg ccaacccgct 645Arg Arg Gly Cys Leu Pro Val85 90tcctgactga cctgagcaag gtcttactaa gcagtcccat ctctgtggga ggcatgcaac 705gcgtgcaggg agttcaggtg ccggtcggcg tagccaggcc tggaggcccc ccaggcagga 765ggccgcccaa aggcggggcc ggcgtctcgc agactagggg ctgggggcgg ccacagacgg 825cctcgaaacc acagccctta ccccaatccc acgagccccg ccaacgaacc acaggtgctg 885ggctttagag aacatgggaa ggcggcccca gacctggcgg gaacgccttt ccctcagagc 945caggccccgg ccccgtctgg gaagctcatc ttgcgaagct gagggagctc agggcaaagg 1005ccaggctagc gcggaccgga aggggccgag gctgcacggg cctctgccag aacgctcagg 1065acatcccggc ctgggtttac aacgctgtta ggaaaattaa ccaatgaata aagcaacgtt 1125cagtgcgcag ggagtgaaat tcaatgccca ccgctaggct cctcgctgcc tctcactcaa 1185gaggcccaaa ctcagacggc gtcagggacc cggacccagc agccgtttca cgccaataga 1245tagggcgcat gcgcagaaat cctcctcggc tctctagcgt gagctttccc aaggggccac 1305gcccagcttg ccttctgatt ggtccagctg gtggggttgt cttccgccat ctttgatcag 1365ggcactaagg atgctcccca cggccttcac agtgacggcg gagaccctgc cccgccagct 1425gctcagtacg tgccgcgtag cccgtgcgag ccaagtgtga gtccgggcga gcgcctgcgg 1485agctagcact gggcccagaa tgagagggag gcggaggagc agcgatcacg tggttttagg 1545gactgtctaa taattccacg ccagcattgc cggtgtttca gggggtggga accgctgcgt 1605tccccatcaa cttttctccc acccaccacc ctccccaacc tacaagccca gctcagcttg 1665aggtaactgc tgaccggact gtcctataca gccctacaag acagacggcg cctagggctg 1725aaagcggggg cctccgtagg gagccagcgg gggcctcaat agttactcat tttctctacc 1785tttgatgaaa ataagagcta attcttaata aggctaccgg gtatcacgca aaaaccctgt 1845gcttactatt acactttggg ttgttgcaaa gattaaagga aataagccgt gcaaaaaaaa 1905aaaaaaaaaa 1915<210>24<211>91<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>24Met Ile Val Ser Asp Ser Glu Leu Pro Gly Thr Ser Gly Thr His Pro1 5 10 15Leu Phe Ser Met Gln Thr Lys Arg Gln Gly Asn Asp Pro Gln Gly Ser
20 25 30Gln Leu Gln Gly Gly Pro Gly Arg Leu Gly Val Gly Val Asn Ala Lys
35 40 45Ser Arg Ser Ser Ser Ala Leu Phe Ser Ala Thr Gly Leu Ser Pro Ser
50 55 60Ser Pro Pro Cys Glu Gln Pro Arg Asp Lys Asn Ala Lys Trp Asp Gln65 70 75 80Glu Ser Ser Thr Arg Arg Gly Cys Leu Pro Val
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Met Asp Leu Leu Arg Pro His
1 5tgg ctg gag gtg tcc agg gac atc acc gga ccg cag gca gcc ccc tct 822Trp Leu Glu Val Ser Arg Asp Ile Thr Gly Pro Gln Ala Ala Pro Ser
10 15 20gcc ttc cca cac cag gag ctg ccc cgg gct ctg ccg gca gct gca gcc 870Ala Phe Pro His Gln Glu Leu Pro Arg Ala Leu Pro Ala Ala Ala Ala
25 30 35acc gca ggg tgc gct ggc ctc gag gcc acc tat tcc aac gtg ggg ctg 918Thr Ala Gly Cys Ala Gly Leu Glu Ala Thr Tyr Ser Asn Val Gly Leu40 45 50 55gcg gcc ctt ccc ggg gtc agc ctg gcg gcc agc cct gtg gtg gcc gag 966Ala Ala Leu Pro Gly Val Ser Leu Ala Ala Ser Pro Val Val Ala Glu
60 65 70tat gcc cgc gtc cag aag cgc aaa ggg acc cat cgc agt ccc caa gag 1014Tyr Ala Arg Val Gln Lys Arg Lys Gly Thr His Arg Ser Pro Gln Glu
75 80 85cca cag cag ggg aag act gag gtg acc ccg gcc gct cag gtg gac gtc 1062Pro Gln Gln Gly Lys Thr Glu Val Thr Pro Ala Ala Gln Val Asp Val
90 95 100ctg tac tcc agg gtc tgc aag cct aaa agg agg gac cca gga ccc acc 1110Leu Tyr Ser Arg Val Cys Lys Pro Lys Arg Arg Asp Pro Gly Pro Thr
105 110 115aca gac ccg ctg gac ccc aag ggc cag gga gcg att ctg gcc ctg gcg 1158Thr Asp Pro Leu Asp Pro Lys Gly Gln Gly Ala Ile Leu Ala Leu Ala120 125 130 135ggt gac ctg gcc tac cag acc ctc ccg ctc agg gcc ctg gat gtg gac 1206Gly Asp Leu Ala Tyr Gln Thr Leu Pro Leu Arg Ala Leu Asp Val Asp
140 145 150agc ggc ccc ctg gaa aac gtg tat gag agc atc cgg gag ctg ggg gac 1254Ser Gly Pro Leu Glu Asn Val Tyr Glu Ser Ile Arg Glu Leu Gly Asp
155 160 165cct gct ggc agg agc agc acg tgc ggg gct ggg acg ccc cct gct tcc 1302Pro Ala Gly Arg Ser Ser Thr Cys Gly Ala Gly Thr Pro Pro Ala Ser
170 175 180agc tgc ccc agc cta ggg agg ggc tgg aga ccc ctc cct gcc tcc ctg 1350Ser Cys Pro Ser Leu Gly Arg Gly Trp Arg Pro Leu Pro Ala Ser Leu
185 190 195ccc tgaacactca aggacctgtg ctccttcctc cagagtgagg cccgtccccc 1403Pro200gccccgcccc gcctcacagc tgacagcgcc agtcccaggt ccccgggccg ccagcccgtg 1463aggtccgtga ggtcctggcc gctctgacag ccgcggcctc cccgggctcc agagaaggcc 1523cgcgtctaaa taaagcgcca gcgcaggatg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1575<210>27<211>200<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>27Met Asp Leu Leu Arg Pro His Trp Leu Glu Val Ser Arg Asp Ile Thr1 5 10 15Gly Pro Gln Ala Ala Pro Ser Ala Phe Pro His Gln Glu Leu Pro Arg
20 25 30Ala Leu Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Gly Leu Glu Ala
35 40 45Thr Tyr Ser Asn Val Gly Leu Ala Ala Leu Pro Gly Val Ser Leu Ala
50 55 60Ala Ser Pro Val Val Ala Glu Tyr Ala Arg Val Gln Lys Arg Lys Gly65 70 75 80Thr His Arg Ser Pro Gln Glu Pro Gln Gln Gly Lys Thr Glu Val Thr
85 90 95Pro Ala Ala Gln Val Asp Val Leu Tyr Ser Arg Val Cys Lys Pro Lys
100 105 110Arg Arg Asp Pro Gly Pro Thr Thr Asp Pro Leu Asp Pro Lys Gly Gln
115 120 125Gly Ala Ile Leu Ala Leu Ala Gly Asp Leu Ala Tyr Gln Thr Leu Pro
130 135 140Leu Arg Ala Leu Asp Val Asp Ser Gly Pro Leu Glu Asn Val Tyr Glu145 150 155 160Ser Ile Arg Glu Leu Gly Asp Pro Ala Gly Arg Ser Ser Thr Cys Gly
165 170 175Ala Gly Thr Pro Pro Ala Ser Ser Cys Pro Ser Leu Gly Arg Gly Trp
180 185 190Arg Pro Leu Pro Ala Ser Leu Pro
195 200<210>28<211>1800<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>28ggaatcctcg ggccgccttg tgaggggggt gttgctgtca tctccagggc taggtgacag 60cttgttgcag gccccacagc cagggcctca gggatgggga tctggccatg tctgttttaa 120gccgaacagg ctgttcttcc atgtggagtc tccctccgtg atcccctggg gtcaagtcct 180gacggctggg ttcgctccct cagtgactcc gacagctctt gtctcagagg tgctggggtg 240aaggctgtgt ggggccaggc ccctggggtc agacttcttg ccccttctgc ccgggggacg 300ctctgggctc agggtggggc cagacagcta catcacaggg acacttgtta tgggtcgggg 360tccagggagc acccagccag tggagtgttg gaggccactg agagggacat gactgcggtg 420tccgagcagc gtcgtggcca ccctgtgtgc ccactccctg gtggacagac ctacgtcacc 480tggggattgc agagcaaaag gagtgctgtt ggggtgtgtg aggtttgggg ttctgtttct 540tgctgtgaat tgggtcatga cctgtgtcgg agcgttctct ggcctccact tgcccctgca 600gaccagggtg tctggagggt tgtcgggggc ttgatggagg aattgctgac cacaccatgc 660aggaagaggt gggtcccagg gacacaggaa ctttggggtc agccggttcc agattcagtt 720gcagaggagc atcccccttg cttagccagg gaggggaagc cctcttctca cacccggcct 780gggtatgttg tgggagagtc atttcccagg aggaaatggg gactgttacc gggggagggg 840gtgctgtccc caggcagcag caagcgtccc ttacgcttgg gctgtccgag accctgctgc 900tctaggcggt tgtgatgggg gagccccaca gggcacagag agccagctga aggcggcagc 960tctgggtggg atcacatgga aaggggaggc gagccgagcc tccctcttgc caatcttggt 1020ctccccacag ggtcatagct cctgggcccc tcacttgtca gaccctccat tcaccaaatt 1080aaggataagt ttcacgattt cgcactccag cctggtgacg aagtgagact ccatctcaaa 1140aaataaataa ataaataaaa ataaacctca ctgtttgttt taacaataac aagcgtggta 1200agggtggtgt cagtccataa gttagatagg cagttgctag gcagatgtcg ttgcagatgt 1260gtgtgtgtgt gtgtgttgtg tttaaggttg tggtggcctt tgtgcaggtt gtaaattttt 1320gtagtctttt gatagttctt gttatcaacc atatgtacat gagaaccctt cccccttcat 1380ggcgtttcct ggctccgttt gccagggttt taatacgagt gactccattt tgaatctgac 1440aactttcaca tttccccttt tgatcaaggt ctttctcaaa agcatcactg atcaatcatc 1500ctgtatttag gttttgatat ctcttggtgc cagtctgccc tcatgttgaa gggagtcact 1560ggtaactagg aattagcatc aaaacccttt agccacattt gaacaacaaa agaggtttgg 1620agggagtgga tctcaggcta agtctacctg gagtccactg ttaagttcaa ttctgtctgt 1680tccataggca ctgtctatca tctcaaagtg ctgggagagc attattctct taggagttgc 1740atttctatgc aaatttgaca agaaacaggt ataaagttct taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800<210>29<211>1800<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(409)..(912)<223><400>29ggaatcctcg ggccgccttg tgaggggggt gttgctgtca tctccagggc taggtgacag 60cttgttgcag gccccacagc cagggcctca gggatgggga tctggccatg tctgttttaa 120gccgaacagg ctgttcttcc atgtggagtc tccctccgtg atcccctggg gtcaagtcct 180gacggctggg ttcgctccct cagtgactcc gacagctctt gtctcagagg tgctggggtg 240aaggctgtgt ggggccaggc ccctggggtc agacttcttg ccccttctgc ccgggggacg 300ctctgggctc agggtggggc cagacagcta catcacaggg acacttgtta tgggtcgggg 360tccagggagc acccagccag tggagtgttg gaggccactg agagggac atg act gcg 417
Met Thr Ala
1gtg tcc gag cag cgt cgt ggc cac cct gtg tgc cca ctc cct ggt gga 465Val Ser Glu Gln Arg Arg Gly His Pro Val Cys Pro Leu Pro Gly Gly
5 10 15cag acc tac gtc acc tgg gga ttg cag agc aaa agg agt gct gtt ggg 513Gln Thr Tyr Val Thr Trp Gly Leu Gln Ser Lys Arg Ser Ala Val Gly20 25 30 35gtg tgt gag gtt tgg ggt tct gtt tct tgc tgt gaa ttg ggt cat gac 561Val Cys Glu Val Trp Gly Ser Val Ser Cys Cys Glu Leu Gly His Asp
40 45 50ctg tgt cgg agc gtt ctc tgg cct cca ctt gcc cct gca gac cag ggt 609Leu Cys Arg Ser Val Leu Trp Pro Pro Leu Ala Pro Ala Asp Gln Gly
55 60 65gtc tgg agg gtt gtc ggg ggc ttg atg gag gaa ttg ctg acc aca cca 657Val Trp Arg Val Val Gly Gly Leu Met Glu Glu Leu Leu Thr Thr Pro
70 75 80tgc agg aag agg tgg gtc cca ggg aca cag gaa ctt tgg ggt cag ccg 705Cys Arg Lys Arg Trp Val Pro Gly Thr Gln Glu Leu Trp Gly Gln Pro
85 90 95gtt cca gat tca gtt gca gag gag cat ccc cct tgc tta gcc agg gag 753Val Pro Asp Ser Val Ala Glu Glu His Pro Pro Cys Leu Ala Arg Glu100 105 110 115ggg aag ccc tct tct cac acc cgg cct ggg tat gtt gtg gga gag tca 801Gly Lys Pro Ser Ser His Thr Arg Pro Gly Tyr Val Val Gly Glu Ser
120 125 130ttt ccc agg agg aaa tgg gga ctg tta ccg ggg gag ggg gtg ctg tcc 849Phe Pro Arg Arg Lys Trp Gly Leu Leu Pro Gly Glu Gly Val Leu Ser
135 140 145cca ggc agc agc aag cgt ccc tta cgc ttg ggc tgt ccg aga ccc tgc 897Pro Gly Ser Ser Lys Arg Pro Leu Arg Leu Gly Cys Pro Arg Pro Cys
150 155 160tgc tct agg cgg ttg tgatggggga gccccacagg gcacagagag ccagctgaag 952Cys Ser Arg Arg Leu
165gcggcagctc tgggtgggat cacatggaaa ggggaggcga gccgagcctc cctcttgcca 1012atcttggtct ccccacaggg tcatagctcc tgggcccctc acttgtcaga ccctccattc 1072accaaattaa ggataagttt cacgatttcg cactccagcc tggtgacgaa gtgagactcc 1132atctcaaaaa ataaataaat aaataaaaat aaacctcact gtttgtttta acaataacaa 1192gcgtggtaag ggtggtgtca gtccataagt tagataggca gttgctaggc agatgtcgtt 1252gcagatgtgt gtgtgtgtgt gtgttgtgtt taaggttgtg gtggcctttg tgcaggttgt 1312aaatttttgt agtcttttga tagttcttgt tatcaaccat atgtacatga gaacccttcc 1372cccttcatgg cgtttcctgg ctccgtttgc cagggtttta atacgagtga ctccattttg 1432aatctgacaa ctttcacatt tccccttttg atcaaggtct ttctcaaaag catcactgat 1492caatcatcct gtatttaggt tttgatatct cttggtgcca gtctgccctc atgttgaagg 1552gagtcactgg taactaggaa ttagcatcaa aaccctttag ccacatttga acaacaaaag 1612aggtttggag ggagtggatc tcaggctaag tctacctgga gtccactgtt aagttcaatt 1672ctgtctgttc cataggcact gtctatcatc tcaaagtgct gggagagcat tattctctta 1732ggagttgcat ttctatgcaa atttgacaag aaacaggtat aaagttctta aaaaaaaaaa 1792aaaaaaaa 1800<210>30<211>168<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>30Met Thr Ala Val Ser Glu Gln Arg Arg Gly His Pro Val Cys Pro Leu1 5 10 15Pro Gly Gly Gln Thr Tyr Val Thr Trp Gly Leu Gln Ser Lys Arg Ser
20 25 30Ala Val Gly Val Cys Glu Val Trp Gly Ser Val Ser Cys Cys Glu Leu
35 40 45Gly His Asp Leu Cys Arg Ser Val Leu Trp Pro Pro Leu Ala Pro Ala
50 55 60Asp Gln Gly Val Trp Arg Val Val Gly Gly Leu Met Glu Glu Leu Leu65 70 75 80Thr Thr Pro Cys Arg Lys Arg Trp Val Pro Gly Thr Gln Glu Leu Trp
85 90 95Gly Gln Pro Val Pro Asp Ser Val Ala Glu Glu His Pro Pro Cys Leu
100 105 110Ala Arg Glu Gly Lys Pro Ser Ser His Thr Arg Pro Gly Tyr Val Val
115 120 125Gly Glu Ser Phe Pro Arg Arg Lys Trp Gly Leu Leu Pro Gly Glu Gly
130 135 140Val Leu Ser Pro Gly Ser Ser Lys Arg Pro Leu Arg Leu Gly Cys Pro145 150 155 160Arg Pro Cys Cys Ser Arg Arg Leu
165<210>31<211>20<212>DNA<213>引物<400>31ggccagctca tggtatctcc 20<210>32<211>21<212>DNA<213>引物<400>32atgaaccctc tgactccgtc c 21<210>33<211>20<212>DNA<213>引物<400>33cagaaacctg gggtaagcaa 20<210>34<211>22<212>DNA<213>引物<400>34tacaaatcac gggaaaagta cg 22<210>35<211>22<212>DNA<213>引物<400>35gatgatgctg ccaagttatt ca 22<210>36<211>22<212>DNA<213>引物<400>36atccccatag acatccttac cg 22<210>37<211>21<212>DNA<213>引物<400>37ctggagggag atcacaaaac a 21<210>38<211>22<212>DNA<213>引物<400>38atgaagcact ggtgggtgat ac 22<210>39<211>18<212>DNA<213>引物<400>39cccgtctggg atgtgagg 18<210>40<211>22<212>DNA<213>引物<400>40gctctttgtg ggttcttact ag 22<210>41<211>20<212>DNA<213>引物<400>41ttcatacttg gtgcgctgtg 20<210>42<211>19<212>DNA<213>引物<400>42gagggaacaa agctaacgg 19<210>43<211>19<212>DNA<213>引物<400>43gattctgccc atgtgctcc 19<210>44<211>22<212>DNA<213>引物<400>44tcctttattt cgtcttcctt gc 22<210>45<211>22<212>DNA<213>引物<400>45tagctggttg ctagagttac gg 22<210>46<211>20<212>DNA<213>引物tttcctttat tcggcacgtt 20<210>47<211>18<212>DNA<213>引物<400>47cggcagactg gggttggt 18<210>48<211>18<212>DNA<213>引物<400>48tttatttcgc ggtcgcgt 18<210>49<211>20<212>DNA<213>引物<400>49gggtgttgct gtcatctcca 20<210>50<211>20<212>DNA<213>引物<400>50ttctccaaac ctccctcacc 20
Claims (10)
1.一种分离的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白,其特征在于,它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30;
或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30。
3.一种分离的多核苷酸,其特征在于,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85%相同性:
(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸;
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30。
5.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸的序列选自下组:
SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29的编码区序列或全长序列。
6.一种载体,其特征在于,它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它是选自下组的一种宿主细胞:
(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞;
(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白活性的多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a)在适合表达具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的条件下,培养权利要求7所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白特异性结合的抗体。
10.一种核酸分子,它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的15-1000个核苷酸。
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