CN1451666A - 一种重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及基因重组抗肿瘤侵袭转移新药，具体涉及重组尿激酶片段与纤溶酶原激活物抑制物－2型突变体融合蛋白。本发明应用PCR方法扩增融合蛋白基因cDNA，将其克隆到表达载体获得融合基因表达质粒后转化宿主菌，甲醇或温度诱导融合蛋白表达。经纯化得表达产物，纯度达95％。实验证实本发明融合蛋白具有PAI－2与uPA的免疫原性，既能抑制uPA的丝氨酸蛋白酶活性，又能与uPA竞争结合uPAR，体外侵袭模型和裸鼠肿瘤转移模型试验证明具有明显抑制肿瘤细胞的生长和侵袭转移作用。

Description

一种重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及基因重组抗肿瘤侵袭转移新药，具体涉及重组尿激酶片段与纤溶酶原激活物抑制物-2型突变体融合蛋白。

技术背景

肿瘤细胞侵袭转移是恶性肿瘤病人死亡的主要原因，至今尚未有特异、有效的抗肿瘤细胞侵袭转移的药物。已知尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体(uPA/uPAR)***在肿瘤侵袭转移中起着关键作用。许多恶性肿瘤细胞中高表达uPA和uPAR，且高表达uPA/uPAR的肿瘤病人其预后差、生存期短。而u-PA的生理性抑制物纤溶酶原激活物抑制物-2型(PAI-2)在大多数高侵袭和转移肿瘤中表达水平低，PAI-2表达高时其预后良好。由于uPA/uPAR***在肿瘤侵袭转移中的重要作用，u-PA与u-PAR结合后其活性大大增加(可能增加20倍以上)，而且通过u-PAR将u-PA的活性局限于肿瘤细胞表面，特别是侵袭前沿，富集在肿瘤细胞表面这种增强的蛋白酶水解活性，水解细胞外基质，赋予肿瘤细胞强大的侵袭转移能力。因此，普遍认为uPA/uPAR是抗肿瘤侵袭、转移的重要靶标蛋白***。通过干扰uPA/uPAR的相互作用和抑制uPA活性来抑制肿瘤细胞侵袭转移，成为抗肿瘤侵袭转移治疗的一种新思路。目前针对uPA***进行的抗肿瘤治疗研究主要有以下几个方面：a，利用反义核酸来抑制uPA、uPAR的表达。uPAR反义核酸表达质粒转染肺癌和乳腺癌细胞株后，转染细胞的uPAR mRNA水平明显下降，细胞的侵袭能力也明显降低，并且其纤溶活性与对照组相比，也有明显的下降；b.利用uPA的抑制剂来抑制uPA的蛋白酶活性c.利用uPAR的抗体或无uPA酶活性的uPA片段类似物竞争细胞表面uPAR。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时具有干扰u-PA与u-PAR之间相互作用和抑制u-PA活性的双功能融合蛋白，用于抗肿瘤细胞侵袭转移治疗。本发明具体涉及重组尿激酶片段与纤溶酶原激活物抑制物-2型突变体融合蛋白。

本发明由多肽连接纤溶酶原激活物与纤溶酶原激活物抑制物构成融合蛋白。更具体地，本发明用蛋白质工程技术利用与u-PAR结合的u-PA氨基端，干扰u-PA与u-PAR的结合，同时利用PAI-2对u-PA活性的抑制双重作用，抑制肿瘤细胞表面的丝氨酸蛋白酶激活剂u-PA的活性，从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力，达到抗侵袭转移作用。

本发明还提供重组尿激酶片段与纤溶酶原激活物抑制物2-型突变体融合蛋白的制备方法及其应用。

本发明融合蛋白ATF-PAl2CD是由u-PA氨基端与PAl-2突变体和连接这两部分的一个9肽构成的融合蛋白，有526个氨基酸残基。其具有序列1的eDNA编码序列和氨基酸排列序列。所述u-PA氨基端保留了与u-PAR结合的能力，而失去了u-PA活性，与u-PA竞争结合u-PAR，所述PAI-2突变体是野生型PAI-2(上海医科大学学报.1998，25(3))通过缺失突变缺失螺旋C、D间33个氨基酸残基肽段，保留抑制u-PA活性，失去了抑制细胞凋亡的作用。ATF-PAl2CD融合蛋白既具有与肿瘤细胞表面u-PAR结合，又具有抑制u-PA活性的双重作用，从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：

1、  用RT-PCR扩增u-PA氨基端(ATF)编码序列：

从高转移肺癌细胞株95D(购白中国人民解放军总医院)抽提分离总mRNA，根据己知的u-PA cDNA序列，设计引物，正向引物P1，5’GAG

ATG AGC AAC GAA CTT CAC CAA 3’；反向引物P2 3’-CTG ACG CGT CTA CCTCCA CCA CCA AGA CCA AGG-5’，在3’-端增加一个5肽(GGGSG)的编码序列。

2、PCR扩增PAI-2突变体cDNA：以质粒pZT-PAI2CD(生物化学与生物物理学报，2000，32)为模板，用正向引物P3，5’-AA

GGT GGT TCC GGTGAG GAT CTT TGT GTG 3’，芹口反向引物P2，3’-TCT AAA AGG AGT GGG ATT

GG-5’进行PCR扩增PAI-2突变体cDNA。在5’端增加一个4肽(GGSG)编码序列

3、构建融合蛋白编码基因  将编码ATF和PAI2CD序列通过Kpn I位按常规方法连接成ATF-PAI2CD融和基因。经内切酶谱分析和DNA序列分析证实序列正确，融合区为框架内融合，与原核表达载体pLY4重组成表达质粒pZWE ATF-PAI2CD。

4、pZWE ATF-PAI2CD转化大肠杆菌DH5α，用温度诱导ATF-PAI2CD融合蛋白表达。融合蛋白以包含体形式存在于工程菌内，表达水平达20％。SDS-PAGE、Western blot，纤维蛋白酶谱法测定，流式细胞仪等分析，表达产物分子量为62kD，具有u-PA和PAI-2的免疫原性。能与细胞表面的uPAR特异结合，能抑制u-PA活性。

5、通过发酵技术扩增工程菌，经M9CA培液30℃培养，42℃温度诱导表达。发酵后用高压匀桨泵破碎细菌，离心收集包涵体、经缓冲溶液冼涤，盐酸胍或尿素溶解与复性。再用离子交换纯化融合蛋白。

6、用高转移肺癌细胞株95D细胞接种Balb/C Nu/Nu裸小鼠，治疗组腹腔注射ATF-PAI2CD融合蛋白，对照组腹腔注射生理盐水，结果表明对照组小鼠均有肺部转移灶。治疗组肿瘤的生长和肺转移明显受到抑制。证实ATF-PAI2CD融合蛋白有显著的抑制肿瘤细胞的侵袭转移。

附图说明

图1是牛奶板法检测融合蛋白的纤溶抑制活性

其中1为PAI-2CD；2、3、4为纯化的融合蛋白；5为阴性对照

图2是融合蛋白与肿瘤细胞结合能力的检测结果

    其中-■-ATF-PAI2CD

        -●-PAI-2CD

        -▲-pro-uPA

具体实施方式

实施例1  在大肠杆菌中表达1、构建重组pGEM-ATF-PAI2CD融合蛋白基因克隆

1)用PCR扩增PAI2CD基因：以质粒pZT-PAI2CD为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃30s，65℃30s，72℃1mim，30个循环，72℃5mim。取PCR反应液2μl，用琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察到1.1kb单一条带，符合完整PAI-2CD基因的长度。回收扩增产物(长约1100bp)，并经KpnI、BamHI双酶切后***pGEM3zf(+)中的KpnI、BamHI位点，获得重组质粒pGEM-PAI2CD，经限制性内切核酸酶酶谱分析具有PAI-2CD特征性酶切位点，核苷酸序列分析阅读框架正确。

2)用RT-PCR扩增ATF编码序列

从高转移肺癌细胞株95D抽提分离总mRNA，根据文献报道的u-PA cDNA序列，设计引物，扩增第一链，再用引物P3和P4进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃45s，65℃45s，72℃45s，30个循环，72℃5mim。取PCR反应液2μl，用琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察到0.42kb单一条带，符合完整ATF编码序列的长度。回收扩增产物，得到长约420bp扩增产物。

3)ATF-PAI2CD融合基因的构建和DNA序列测定

将ATF扩增产物与pGEM-PAI2CD同时经EcoRI、KpnI双酶解后回收目的片段，经T4连接酶连接，获得pGEM-ATF-PAI2CD，核苷酸序列分析，没有发生移码突变，证实构建的融合基因正确。

2.构建重组融合蛋白基因表达质粒

将重组质粒pGEM-ATF-PAI2CD用EcoRI、BamHI酶解，获得ATF-PAI2CD cDNA片段，***表达载体pLY-4的EcoRI、BamHI位点。得到重组表达质粒pZWE-ATF-PAI2CD。表达质粒经限制性内切酶分析正确。3、重组ATF-PAI2CD融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达：

将重组表达质粒pZWE-ATF-PAI2CD转化大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选和限制性内切核酸酶分析，获得含pZWE-ATF-PAI2CD单菌落，此为表达ATF-PAI2CD融合蛋白的工程菌，命名为ZWE-1。

挑取ZWE-1单个菌落，接种于LB培养液中，30℃振荡培养过夜，以1∶50接种于M9CA培养液中，30℃培养至OD6000.6，升温至42℃，诱导表达3～4小时，收集细菌，湿菌用PB缓冲液悬浮，以高压匀浆泵压榨，离心收集包含体，SDS-PAGE分析目的蛋白的存在状态。压榨离心所得沉淀经洗涤离心后，以0.1mol/LPB、6mol/L尿素(或盐酸胍)、0.5％巯基乙醇溶解，室温作用1h，至澄清透明。超离心后弃沉淀，取上清稀释复性。4、Q-Sepharose FF柱层析

以10倍柱体积PB缓冲液平衡色谱柱，稀释复性后溶液直接上柱，Waters色谱仪控制流速和检测蛋白峰。上样结束后，以PB缓冲液洗至基线，01mol/LNaCl梯度洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，并以Bradford法测定蛋白质浓度。5、鉴定表达产物

1)质粒pZWE-ATF-PAI2CD转化大肠杆菌DH5α，经温度诱导表达后，SDS-PAGE分析表达产物。可见诱导后细菌裂解液在分子量62KD处有一浓集的条带，经扫描，重组蛋白约占全菌总蛋白的15％；菌体经压榨离心后，62KD条带主要位于沉淀中，而上清中几乎未见此条带，说明表达产物是以包涵体形式存在。

2)分别用抗u-PA和PAI-2抗体进行Western blot实验，结果显示，融合蛋白在分子量62KD处均出现特异性条带，说明融合蛋白具有PAI-2和uPA的抗原性。

3)以1L表达菌的菌液为原料，尿素变性后，上清进行稀释复性处理，经离子交换层析纯化获得总活性约为600,000U的融合蛋白，得率为50％，纯度达90％。溶圈抑制法测定所述融合蛋白具有纤溶抑制活性；发色底物法检测，纤溶抑制活性达12000U/mg。

4)培养的高转移肺癌细胞株95D细胞与1nmol/L¹²⁵I标记的融合蛋白ATF-PAI2CD孵育的同时，分别加入不同浓度未标记¹²⁵I的pro-uPA和PAI-2CD，放射活性测定。结果表明，PAI-2CD不影响融合蛋白与95D细胞的结合；而随着pro-uPA浓度的增加，融合蛋白与95D细胞的结合能力明显下降。经放射竞争实验测定，证实重组融合蛋白能与肿瘤细胞特异性结合

5)用体外侵袭模型Transwell分析所述重组融合蛋白对高转移肺癌细胞株95D细胞侵袭转移能力的作用，结果显示，融合蛋白对高转移肺癌细胞株95D细胞侵袭转移能力有明显的抑制作用。

6)接种95D肺癌细胞于2组5周龄Balb/C Nu/Nu雌性裸小鼠，对照组腹腔内注射生理盐水100μl/只，实验组腹腔内注射50μg的融合蛋白，50天后处死。切下原位肿瘤并称重。并检查***转移情况。结果为：裸小鼠在2周后于接种部位皮下长出肿瘤，对照组大于实验组。对照组小鼠有***转移，实验组小鼠未见***转移，证实融合蛋白具有体内抑制肿瘤细胞转移和生长的作用

实施例2在酵母菌中的表达1、构建重组pGEM-ATF-PAI2CD融合蛋白基因克隆

方法同实施例1。2、构建重组融合蛋白基因表达质粒

将重组质粒pGEM-ATF-PAI2CD，以BamHI酶切，klenow补平切口，再用EcoRI酶切，回收1.6kb的ATF-PAI2CD cDNA目的片段。将该片段连接pPIC9K载体，所述pPIC9K载体经NotI酶切，klenow补平切口，和EcoRI酶切，获得重组表达质粒pZWY-ATF-PAI2CD。3、pZWY-ATF-PAI2CD转化GS115及筛选阳性转化子

用SalI线性化的重组表达质粒pZWY-ATF-PAI2CD电转化GS115，菌液涂布于MD/His^-选择平板，30℃培养2天，筛选出His-Mut⁺表型转化子。在MM和MD选择平板上，筛选出表达株，命名为ZWY-ATF-PAI2CD工程菌。4、重组酵母菌pZWY-ATF-PAI2CD发酵培养和表达产物纯化

挑选上述工程菌接种于BMGY培养基，培养至OD₆₀₀为4.0，离心收集菌体，用BNNY悬浮培养，加甲醇至终浓度为0.5％，诱导表达后，离心收集上清，经SDS-PAGE鉴定，在68KD处显示目标产物条带。发酵上清经硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换层析分离纯化，SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色，CS-910扫描分析纯度达95％。5.鉴定目标表达产物

将融合蛋白行SDS-PAGE后电转移至PVDF膜，利用兔抗人PAI-2多抗和鼠抗人uPA多抗作Western blot。结果显示，融合蛋白能与PAI-2多抗和uPA多抗发生特异性反应。

牛奶板法检测融合蛋白，结果表明融合蛋白具有与PAI-2CD相似的纤溶抑制活性，发色底物法测定结果与溶圈抑制法一致。纤溶抑制活性达10000U/mg。

将融合蛋白(PAI-2CD、pro-uPA)与酸处理的95D细胞孵育后，经流式细胞仪检测，融合蛋白与pro-uPA以剂量依赖方式与95D细胞结合。

本发明利用基因工程技术将uPA的ATF与PAI-2CD通过9个柔性较强的氨基酸残基连接，在大肠杆菌中表达出了既能与uPA竞争结合细胞表面的uPAR，又能直接抑制uPA的丝氨酸蛋白酶活性的双功能重组融合蛋白，所述融合蛋白能够抑制肿瘤的侵袭转移，可作为抗肿瘤侵袭转移治疗药物，为抗肿瘤治疗提供了新途径。

                          UNTITL^-1.TXTOrganization Applicant----------------------

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                           (第1页)

                      UNTITL^-1.TXT540tcgtccacca tggccatggt ctacatgggc tccaggggca gcaccgaaga ccagatggcc600aaggtgcttc agtttaatga agtgggagcc aatgcagata aaatccattc atccttccgc660tctctcagct ctgcaatcaa tgcatccaca gggaattatt tactggaaag tgtcaataag720ctgtttggtg agaagtctgc gagcttccgg gaagaatata ttcgactctg tcagaaatat780tactcctcag aaccccaggc agtagacttc ctagaatgtg cagaagaagc tagaaaaaag840attaattcct gggtcaagac tcaaaccaaa ggcaaaatcc caaacttgtt acctgaaggt900tctgtagatg gggataccag gatggtcctg gtgaatgctg tctacttcaa aggaaagtgg960aaaactccat ttgagaagaa actaaatggg ctttatcctt tccgtgtaaa ctcggctcag1020cgcacacctg tacagatgat gtacttgcgt gaaaagctaa acattggata catagaagac1080ctaaaggctc agattctaga actcccatat gctggagatg ttagcatgtt cttgttgctt1140ccagatgaaa ttgccgatgt gtccactggc ttggagctgc tggaaagtga aataacctat1200gacaaactca acaagtggac cagcaaagac aaaatggctg aagatgaagt tgaggtatac1260ataccccagt tcaaattaga agagcattat gaactcagat ccattctgag aagcatgggc1320atggaggacg ccttcaacaa gggacgggcc aatttctcag ggatgtcgga gaggaatgac1380ctgtttcttt ctgaagtgtt ccaccaagcc atggtggatg tgaatgagga gggcactgaagcagccgctg gcacaggagg tgttatgaca gggagaactg gacatggagg cccacagttt

                           (第2页)

                        UNTITL^-1.TXT1500gtggcagatc atccttttct ttttcttatt atgcataaga taaccaactg cattttattt1560ttcggcagat tttcctcacc ctaa1584<212>Type：DNA<211>Length：1584

 SequenceName：Fusion protein cDNA sequence

 SequenceDescription：Custom Codon------------Sequence Name：Fusion protein cDNA sequence

                           (第3页)

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                           (第1页)

                        UNTITL^-2.TXT526<212>Type：PRT<211>Length：526

 SequenceName：Amino acid sequence of fusion protein

 SequenceDescription：

                           (第2页)

Claims (13)

1、一种重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白，其特征在于由多肽连接纤溶酶原激活物与纤溶酶原激活物抑制物构成重组融合蛋白。

2、按权利要求1所述的重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白，其特征在于所述的重组融合蛋白由9肽连接尿激酶氨基端与纤溶酶原激活物抑制物-2突变体，具有序列1的cDNA编码序列和氨基酸序列。

3、根据权利要求2所述的重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白，其特征在于所述氨基酸序列中含有尿激酶氨基端和缺失螺旋C、D间33个氨基酸残基的纤溶酶原激活物抑制物-2序列

4、根据权利要求2所述的重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的蛋白质结构为第1至第134位氨基酸残基为尿激酶的生长因子结构域和Kringle结构域，第135至第145位氨基酸残基为连接肽GGGSGGGSG，第146至526位为缺失螺旋C、D间第33至第98位氨基酸残基的纤溶酶原激活物抑制物-2突变体。

5、一种制备重组抗肿瘤侵袭转移融合蛋白的方法，其特征在于采用下列步骤：

(1)用PCR扩增尿激酶氨基端片段和纤溶酶原激活物抑制物-2型突变体基因片段，并将其连接成融合蛋白编码基因；

(2)在表达载体中克隆重组尿激酶氨基端片段与纤溶酶原激活物抑制物-2型突变体融合蛋白基因；

(3)用重组载体转化或转染表达宿主细胞；

(4)发酵培养宿主细胞，纯化产物融合蛋白。

6、根据权利要求5的方法，其中所述的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述DNA片段重组，形成适宜表达的质粒。

7、根据权利要求6的方法，其中所述的表达载体是原核表达载体pLY-4和真核表达载体pPIC9K。

8、根据权利要求5的方法，其中所述的表达载体是原核表达载体pLY-4。

9、根据权利要求5的方法，其中所述的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。

10、根据权利要求9的方法，其中所述的宿主细胞是温度诱导菌株JF1125和甲醇营养型酵母菌株GS115。

11、根据权利要求5的方法，其中所述的发酵培养宿主细胞为用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液补料，用含微量元素的甲醇溶液诱导表达，发酵参数为：温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。

12、根据权利要求5的方法，其中所述的纯化重组融合蛋白是工程菌发酵后经超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换三步法。

13、根据权利要求1-5所述的重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白，在制备***侵袭转移的药物中的应用。

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