CN102796758A

CN102796758A - 重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用

Info

Publication number: CN102796758A
Application number: CN2012102843686A
Authority: CN
Inventors: 李犹平; 刘宗秀; ***; 房春林; 陈元坤
Original assignee: Chengdu Qiankun Veterinary Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chengdu Qiankun Veterinary Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2012-08-06
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明公开了一种重组猪α干扰素，通过以下方法制备：A1：人工修饰后的猪a干扰素基因的合成；A2：构建重组真核表达载体pGAPZα-IFNα；A3：真核细胞酵母表达***高效表达IFNα。将工程菌大量培养并表达的猪a干扰素，取上清液用层析柱纯化后，收集目标蛋白洗脱液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，采用细胞病变抑制法测定活性，按50％病变计算效价单位。测定用的细胞为牛肾细胞MDBK，攻击病毒采用水泡性口炎病毒VSV。本发明将纯化获得的猪a干扰素应用于防治猪巨嗜细胞病毒病，实验证明对猪巨嗜细胞病毒感染细胞具有明显的保护作用。其用药途径通过注射给药或粘膜给药，剂型为注射剂或滴鼻剂。

Description

重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及重组猪α干扰素的一种新用途，具体的说是重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗增殖及免疫调节作用的分泌型糖蛋白，是机体防御***的重要组成部分。依据干扰素对酸的敏感性通常分为I型干扰素(酸敏感型)和II型干扰素(耐酸型)两类，几乎所有脊椎动物均可产生这两类干扰素。I型干扰素主要起抗病毒和抗肿瘤作用，至今已发现INF-α、β、ω、κ、τ、δ以及干扰素样细胞因子limitin、IL28、IL29等；II型又称免疫干扰素，迄今为止仅发现INF-γ一种。由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫***起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研究最为活跃的领域之一。目前有5种猪干扰素I型干扰素α、β、ω、δ和II型干扰素γ被发现。猪INF-α、ω分别是由12个和5个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族，这两种干扰素的各亚型之间同源性很高，天然INF-α常常是INF-α、ω功能基因表达产物的混合体，而INF-β、δ和INF-γ仅由单一基因编码。现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括INF-α、β、ω和INF-γ。

猪a干扰素(PolFN a)在兽医临床上可作为广谱抗病毒药用于猪病毒性疾病的防治。如对猪的流行性腹泻、轮状病毒腹泻、传染性胃肠炎等多种病毒性疾病有较好的防治作用，但目前国内用猪a干扰素治疗猪巨嗜细胞病毒感染的研究几乎空白，尚无相关报道。

本发明中的猪巨嗜细胞病毒病(porcine cytomegalovirus，PCMV)亦称细胞包涵体病毒。PCMV属于疱疹病毒科，β疱疹病毒亚科，巨嗜细胞病毒属的成员。PCMV分布相当广泛，该病至报道以来，在英国、日本、德国、美国和澳大利亚先后报道了该病的存在，其血清抗体阳性率达90％以上，全世界98％以上的猪受到过本病毒的感染，感染猪群98％以上的血清抗体均呈阳性。对3-5周龄仔猪的肺巨噬细胞高度敏感，感染后3-14天可看到巨嗜细胞形成和核包涵体，最高峰出现在接种后11-14天。感染猪后，感染细胞体积是正常细胞的6倍。患猪特征性临诊症状为食欲废绝，母猪繁殖障碍，表现为流产、死产、木乃伊胎、产弱仔等；仔猪有明显的眼炎、鼻炎和肺炎症状，生长发育不良，增重差，给猪场造成了严重的损失。

迄今尚未研制出有效的PCMV疫苗，在化学类治疗药物中，也尚未研制出特效药物来预防和治疗本病。

发明内容

本发明针对现有技术的不足提供一种重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用。

提供一种重组后的毕赤酵母表达载体pGAPZα-IFNα的阅读框序列。

本发明所述的猪a干扰素具有序列表中序列1所示核苷酸序列。

一种重组猪α干扰素，通过以下方法制备：

A1：人工修饰后的猪a干扰素基因的合成：将天然IFNα核苷酸序列中的信号肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位点序列及保护碱基。将基因中第24位氨基酸的三联体密码子的第3个碱基进行点突变，即将TGC突变为TGT；第29位氨基酸的第2个碱基进行点突变，即将ACC突变为ATC；第48位氨基酸的第3个碱基进行点突变，即将TCC突变为TCT；第101位氨基酸的第1个碱基进行点突变，即将GAT突变为AAT；第132位氨基酸的第3个碱基进行点突变，将ACG突变为ACC；第158位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由AAC突变为AGC；第161位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由CTC突变为CCC；第167位氨基酸的第1个碱基进行点突变，由ATC变为GTC；第174位氨基酸的第1和第2个碱基进行点突变，由GTC突变为TCC；第179位氨基酸的第2个碱基进行点突变，由ACA突变为AGA，突变后的基因序列编码的氨基酸未改变猪天然IFNα的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率；

A2：构建重组真核表达载体pGAPZα-IFNα：将克隆得到的IFNα基因，连接到PGM-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，得到PGM-T-IFNα；将PGM-T-IFNα和pGAPZα载体分别酶切后进行连接得pGAPZα-IFNα，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌株，质粒经双酶切后得到了与理论大小一致的载体片段和干扰素目的片段；

A3：真核细胞酵母表达***高效表达IFNα：将上述重组表达载体pGAPZα-IFNα经线性化后电转化受体菌GS115，经筛选得到阳性克隆，28度培养，使IFNα进行表达，经SDS-PAGE凝胶电泳分析，分子量19.4KD，与理论值相符，将发酵上清液用层析柱进行纯化收集。

将工程菌大量培养并表达的猪a干扰素，取上清液用层析柱纯化后，收集目标蛋白洗脱液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，采用细胞病变抑制法测定活性，按50％病变计算效价单位。测定用的细胞为牛肾细胞MDBK，攻击病毒采用水泡性口炎病毒VSV。

本发明将纯化获得的猪a干扰素应用于防治猪巨嗜细胞病毒病，实验证明对猪巨嗜细胞病毒感染细胞具有明显的保护作用。其用药途径通过注射给药或粘膜给药，剂型为注射剂或滴鼻剂。

附图说明

图1毕赤酵母表达载体pGAPZα-IFNα的双酶切(XhoI/XbaI)鉴定；1.DNA Marker D20002，3.pGAPZα-IFNα双酶切产物4.DNA MarkerD15000；

图2猪干扰素基因毕赤酵母表达载体pGAPZα-IFNα的线性化；1.DNA Marker D150002，3pGAPZα-IFNα线性化产物；

图3高抗筛选菌株的PCR鉴定；1.DNA Marker D2000 2-4，6-8：pGAPZα-IFNα转化酵母阳性克隆子；5，9：pGAPZα-IFNα转化酵母阴性克隆子

图4表达产物的SDS-PAGE电泳图；1.蛋白质Marker 2-5：阴性菌株6-7：酵母阳性菌株表达产物

图5重组猪α干扰素对VSV病毒诱导MDBK细胞产生细胞病变的抑制作用；5-1为试验组(加干扰素)后细胞；5-2为对照组(未加干扰素)的细胞.

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例一猪a干扰素的制备方法

1、人工修饰后的猪a干扰素基因的合成

将猪天然IFNα核苷酸序列中的信号肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位点及保护碱基。

具体操作如下：将天然IFNα核苷酸序列中的信号肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位点序列及保护碱基。将基因中第24位氨基酸的三联体密码子的第3个碱基进行点突变，即将TGC突变为TGT；第29位氨基酸的第2个碱基进行点突变，即将ACC突变为ATC；第48位氨基酸的第3个碱基进行点突变，即将TCC突变为TCT；第101位氨基酸的第1个碱基进行点突变，即将GAT突变为AAT；第132位氨基酸的第3个碱基进行点突变，将ACG突变为ACC；第158位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由AAC突变为AGC；第161位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由CTC突变为CCC；第167位氨基酸的第1个碱基进行点突变，由ATC变为GTC；第174位氨基酸的第1和第2个碱基进行点突变，由GTC突变为TCC；第179位氨基酸的第2个碱基进行点突变，由ACA突变为AGA，突变后的基因序列编码的氨基酸未改变猪天然IFNα的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率。序列SEQ ID NO.1为人工设计合成的不改变猪天然IFNα氨基酸序列的核苷酸序列，大小为523bp。

2、重组真核表达载体pGAPZα-IFNα的构建

以上述人工修饰后合成的猪IFNα基因为模板，设计一对特异性引物进行PCR扩增：

上游引物IFN1：TA CTCGAG AAA AGA TGT GAC CTG CCT CAG，引入XhoI酶切位点；

下游引物IFN2：GC TCTAGA TCA CTC CTT CTT CCT GAG TCT GTC，引入XbaI酶切位点；

按以下程序进行扩增：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共运行35个循环，最后72℃延伸5min，PCR结束后用琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒回收IFNα基因片段，用T4DNA连接酶与PGM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到阳性重组质粒PGM-T-IFNα。将PGM-T-IFNα和pGAPZα载体用XhoI和XbaI双酶切，用胶回收试剂盒分别回收IFNα基因片段和pGAPZα载体，然后用T4DNA连接酶将IFNα基因片段与pGAPZα连接得pGAPZα-IFNα，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌株，提取质粒做XhoI/XbaI双酶切鉴定，双酶切后得到了与预期大小一致的载体片段和干扰素目的片段，见图1。双酶切鉴定结果正确的送往上海英俊生物工程有限公司进行测序，测序结果表明成功构建了pGAPZα-IFNα表达载体，其阅读框序列见SEQ ID NO.2。

3、IFNα基因的表达

3.1重组表达载体pGAPZα-IFNα转化毕赤酵母GS115

用限制性内切酶将pGAPZα-IFNα线性化，回收线性化完全的酶切产物(图2)，将线性化的pGAPZα-IFNα转化到感受态酵母细胞，于28℃温箱中培养3-5天。待平板上的单菌落长出后，将其分别依次点种在含抗生素ZeocinTM 500、1000、1500、2000μg/ml的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，然后将ZeocinTM 2000μg/ml的YPDS平板上的单菌落再分别依次点种在ZeocinTM 2500、3000μg/ml的YPDS平板上，28-30℃孵育2-3天，得重组酵母菌株。

3.2毕赤酵母电转化菌株的阳性鉴定

提取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的基因组DNA和转化的空载体基因组DNA，用pGAP Forward和3′AOX1引物进行PCR扩增，序列为：

Forward：5′--GTCCCTATTTCAATCAATTGAA--3′，

3′AOX1：5′--GCAAATGGCATTCTGACATCC--3′，如是空载体，只能扩增出载体上的片段，大小为466bp，而连接了IFNα片段的阳性克隆，则能扩增出967bp大小片段(载体片段466bp+IFNα片段501bp)，结果2-4，6-8均扩增出了967bp左右的条带，见图3，得到了pGAPZα-IFNα载体转化后的酵母阳性菌株。

3.3重组毕赤酵母电转化菌株GS115的诱导表达

挑取重组毕赤酵母电转化菌株GS115的单克隆菌株，接种于YPD培养基中培育到OD600值达到6.0，离心收菌；用表达培养基BMGY重悬沉淀，在28-30℃震荡培养过夜后每日补加纯甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导，继续培养4天；离心收集上清液；用SDS-PAGE电泳法检测上清液中的干扰素，结果样品6，7在19.4KD左右出现了蛋白条带，见图4，与理论值基本相符，选择该菌株进行发酵、蛋白纯化。

3.4重组毕赤酵母发酵菌产业化生产

将保存菌株(Pichia pastoris GS115(pPICz-ifn)划线接种于YPD平板培养基上，28-30℃恒温培养24-32h；再从YPD平板培养基上挑出单菌落，接入250ml三角瓶装的30mlBMGY培养基中，于200-300rpm/min，28-30℃振荡培养24h，作为摇瓶种子；摇瓶种子再以10％(V/V)接入10L发酵罐的BMGY培养基中，200-300rpm，28-30℃进行搅拌培养24h；然后，每日补加甲醇于培养基中至终浓度为1％(v/v)，用10％(v/v)NH₄OH和10％(v/v)H₃PO4调pH至5.5，溶氧为50％，连续培养4d；离心，收集含IFNα的上清液。

4、表达产物猪a干扰素的分离纯化

将重组毕赤酵母菌发酵上清液通过层析柱，用乙酸钠洗脱目的蛋白峰，再进行阳离子交换柱，洗脱后进一步凝胶层析，目的蛋白得到很好的分离。

实施例二猪a干扰素生物学活性测定

一、材料方法

病毒来源：水泡性口炎病毒VSV(保藏编号：GDV-011，购于中国典型培养物保藏中心)。

细胞：牛肾细胞MDBK(NBL-1，上海生化试剂有限公司)。

待检样品(猪a干扰素)：通过基因工程方法制备。

检测方法：细胞病变抑制法，按50％病变计算效价单位。测定用的细胞为牛肾细胞MDBK，攻击病毒用VSV。

生物学活性计算法：

Pr为标准品生物学活性，IU/ml；

Ds为供试品预稀释倍数；

Dr为标准品预稀释倍数；

Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效稀释倍数；

待检样品及标准品的OD值

计算待测样品生物学活性为8.9×10⁵IU/ml，比活性为5.2×10⁶IU/mg。

如图5所示，采用VSV攻毒MDBK细胞，镜下观察MDBK细胞产生细胞病变情况，通过比较重组猪α干扰素处理和未处理情况下VSV病毒的TCID50，发现VSV对于重组猪α干扰素有显著的敏感性，与对照相比，其TCID50增加了794倍。

实施例三猪a干扰素临床治疗猪巨嗜细胞病毒病

选择120头致病猪作为猪a干扰素治疗对象。按照每公斤体重1.5万单位注射给药，每天一次，3天一个疗程，经过治疗后，大部分猪只的临床症状有所缓解。

试验猪临床症状观察

治愈：107头；无效：13头；痊愈率达89.17％，无效率10.83％。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种重组猪α干扰素，其特征在于，通过以下方法制备：

A1：人工修饰后的猪a干扰素基因的合成：将天然IFNα核苷酸序列中的信号肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位点序列及保护碱基。将基因中第24位氨基酸的三联体密码子的第3个碱基进行点突变，即将TGC突变为TGT；第29位氨基酸的第2个碱基进行点突变，即将ACC突变为ATC；第48位氨基酸的第3个碱基进行点突变，即将TCC突变为TCT；第101位氨基酸的第1个碱基进行点突变，即将GAT突变为AAT；第132位氨基酸的第3个碱基进行点突变，将ACG突变为ACC；第158位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由AAC突变为AGC；第161位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由CTC突变为CCC；第167位氨基酸的第1个碱基进行点突变，由ATC变为GTC；第174位氨基酸的第1和第2个碱基进行点突变，由GTC突变为TCC；第179位氨基酸的第2个碱基进行点突变，由ACA突变为AGA，突变后的基因序列编码的氨基酸未改变猪天然IFN α的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率；

2.根据权利要求1所述的重组猪α干扰素在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用，其特征在于，其用药途径通过注射给药或粘膜给药，剂型为注射剂或滴鼻剂。

3.根据权利要求2所述的应用制备的药物，其特征在于，其用药途径通过注射给药或粘膜给药，剂型为注射剂或滴鼻剂。