CN1426422A - 修饰的bdnf - Google Patents

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CN1426422A
CN1426422A CN01808667A CN01808667A CN1426422A CN 1426422 A CN1426422 A CN 1426422A CN 01808667 A CN01808667 A CN 01808667A CN 01808667 A CN01808667 A CN 01808667A CN 1426422 A CN1426422 A CN 1426422A
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acylglycerol
brain
neurotrophic factor
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五十岚理慧
水岛裕
泰地睦夫
中山智加男
野口浩
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Abstract

通过用1－酰基甘油衍生物修饰BDNF而获得的具有提高的药理活性、生物动力学特征和物理性质的修饰的BDNF。该修饰的BDNF具有治疗对BDNF有特异性的神经变性疾病和糖尿病的作用，还具有高效且优良的生物动力学特征，这使得其特别适于治疗2型糖尿病。

Description

修饰的BDNF
                         技术领域
本发明涉及用1-酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子。此外，本发明还涉及治疗2型糖尿病的治疗剂，其中包含作为活性组分的1-酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子。
发明背景
一种神经营养因子-脑衍生神经营养因子(在下文中有时称为BDNF)是一种蛋白质，它是由活体中的靶细胞或神经元和神经胶质细胞以及神经鞘细胞提供的，并表现出维持神经元存活和分化的活性。已知BDNF起受体(trkB)的特异性配体的作用，其是p75和trk基因的产物(参见Takeshi NONOMURA，Hiroshi HATANAKA；Jikken Igaku，vol.13，p.376(1995))。
已知BDNF是治疗神经变性疾病(例如ALS)或糖尿病性外周神经病的治疗剂(参见A.P.Mizisin等人，Journal of Neuropathology andExperimental Neurology，vol.56，p.1290(1997))。
此外，WO 98/32458公开了BDNF用作治疗糖尿病的治疗剂。
因为BDNF是表现出上述多种功能的有用蛋白质，所以希望开发出具有更高的效力和更优良的药动学特征、同时保持BDNF固有活性的化合物。
已尝试着通过修饰来改善蛋白质的物理特征和活性，同时保持其功能。例如，JP 2679852和JP 2718809公开了用卵磷脂或溶血卵磷脂修饰生理活性蛋白质，具体来说是修饰过氧化物歧化酶(SOD)的一般技术。然而，没有公开表现出多种功能的有用蛋白质的修饰BDNF。
                      本发明公开
本发明的目的是提供具有更高的效力、保持BDNF的固有活性、并具有优良的药动学特征的化合物。
本发明者们已经发现，可通过用1-酰基甘油衍生物修饰BDNF来改善BDNF的药理活性、药动学特征和物理性质，并完成了本发明。
更具体来说，本发明涉及：(1)用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF；(2)依据上述(1)修饰的BDNF，所述修饰的BDNF是式(1)化合物：
                 A(X-B)m      (1)其中A是脑衍生神经营养因子的残基，B是在甘油部分的2-位具有羟基的1-酰基甘油衍生物的残基，其是通过从羟基上除去氢原子而获得的，X是化学交联，且m是平均引入数目，并且不小于约0.5；(3)依据上述(2)修饰的BDNF，其中X是式(2)所示基团：
Figure A0180866700062
其中R1是亚烷基，或式(3)所示基团：其中R2和R3独立地为亚烷基；(4)依据上述(2)修饰的BDNF，其中所述1-酰基甘油衍生物是1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱、1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸、或1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺；(5)依据上述(2)修饰的BDNF，其中B是式(4)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱残基：
Figure A0180866700064
其中R4是酰基，式(5)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸残基：其中R4是酰基，或式(6)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺残基：其中R4是酰基；(6)依据上述(2)或(3)修饰的BDNF，其中B是式(4)所示基团：其中R4是酰基；(7)依据上述(2)、(3)、(4)、(5)和(6)任一项修饰的BDNF，其中所述酰基是具有8-30个碳原子的链烷酰基；(8)依据上述(2)、(3)、(4)、(5)、(6)和(7)任一项修饰的BDNF，其中所述酰基是棕榈酰基；(9)依据上述(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)和(8)任一项修饰的BDNF，其中m为约1-约6；(10)依据上述(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)和(9)任一项修饰的BDNF，其中X是式(2)所示基团：
Figure A0180866700081
其中R1是亚烷基；(11)依据上述(10)修饰的BDNF，其中R1是具有2-10个碳原子的直链亚烷基；(12)依据上述(10)修饰的BDNF，其中R1是三亚甲基；(13)式(7)修饰的BDNF：
                 A(X-B)n      (7)其中A是脑衍生神经营养因子的残基，B是在甘油部分的2-位具有羟基的1-酰基甘油衍生物的残基，其是通过从羟基上除去氢原子而获得的，X是化学交联，且n是1或1以上的整数；(14)依据上述(13)修饰的BDNF，其中X是式(2)所示基团：其中R1是亚烷基，或式(3)所示基团：其中R2和R3独立地为亚烷基；(15)依据上述(13)修饰的BDNF，其中B是式(4)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱残基：其中R4是酰基，式(5)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸残基：其中R4是酰基，或式(6)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺残基：
Figure A0180866700093
其中R4是酰基；(16)依据上述(13)或(14)修饰的BDNF，其中B是式(4)所示基团：其中R4是酰基；(15)用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其包括用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF作为活性组分；(16)依据上述(15)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，所述修饰的BDNF是式(1)化合物：
                 A(X-B)m      (1)其中A是脑衍生神经营养因子的残基，B是在甘油部分的2-位具有羟基的1-酰基甘油衍生物的残基，其是通过从羟基上除去氢原子而获得的，X是化学交联，且m是平均引入数目，并且不小于约0.5；(17)依据上述(16)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中X是式(2)所示基团：其中R1是亚烷基，或式(3)所示基团：其中R2和R3独立地为亚烷基；(18)依据上述(16)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中所述1-酰基甘油衍生物是1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱、1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸或1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺；(19)依据上述(16)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中B是式(4)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱残基：其中R4是酰基，式(5)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸残基：其中R4是酰基，或式(6)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺残基：其中R4是酰基；(20)依据上述(16)或(17)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中B是式(4)所示基团：
Figure A0180866700114
其中R4是酰基；(21)依据上述(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的任一项包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中所述酰基是具有8-30个碳原子的链烷酰基；(22)依据上述(16)、(17)、(18)、(19)、(20)和(21)的任一项包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中所述酰基是棕榈酰基；(23)依据上述(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)和(22)的任一项包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中m为约1-约6；(24)依据上述(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)和(23)的任一项包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中X是式(2)所示基团：
Figure A0180866700121
其中R1是亚烷基；(25)依据上述(24)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中R1是具有2-10个碳原子的直链亚烷基；(26)依据上述(25)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中R1是三亚甲基；(27)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中所述修饰的BDNF是式(7)化合物：
                 A(X-B)n      (7)其中A是脑衍生神经营养因子的残基，B是在甘油部分的2-位具有羟基的1-酰基甘油衍生物的残基，并且是通过从羟基上除去氢原子而获得的，X是化学交联，且n是1或1以上的整数；(28)依据上述(27)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中X是式(2)所示基团：
Figure A0180866700131
其中R1是亚烷基，或式(3)所示基团：其中R2和R3独立地为亚烷基；(29)依据上述(27)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中B是式(4)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱残基：其中R4是酰基，式(5)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸残基：
Figure A0180866700134
其中R4是酰基，或式(6)所示的1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺残基：其中R4是酰基；(30)依据上述(27)或(28)包含修饰的BDNF作为活性组分的用于治疗2型糖尿病的治疗剂，其中B是式(4)所示基团：
Figure A0180866700142
其中R4是酰基。
                     附图概述
附图1是在实施例1中获得的卵磷脂化的脑衍生神经营养因子与脑衍生神经营养因子的飞行时间质谱的光谱图案(TOF-MALDI MS)。
附图2是表明卵磷脂化的BDNF与BDNF对db/db小鼠血糖水平的影响的图。
附图3是表明卵磷脂化的BDNF与BDNF对db/db小鼠食物摄取量的影响的图。
附图4是表明卵磷脂化的脑衍生神经营养因子与脑衍生神经营养因子对db/db小鼠体重的影响的图。
                实施本发明的最佳方式
本发明的用1-酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子(在下文中有时简称为修饰的BDNF)可用作治疗神经***障碍和疾病或治疗糖尿病的治疗剂。更具体地，本发明的用1-酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子可施用给神经***被伤口、手术、缺血、感染、代谢性疾病、营养不良、恶性肿瘤、或毒性药物等损伤的患者。尤其是，其可用于治疗其中感觉神经元或视网膜神经节细胞被损伤的病症。更尤其是，本发明修饰的BDNF可用于治疗先天性病症或神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(帕金森氏病的症状可能是由多巴胺能神经元变性引起的)、帕金森-Plus综合征(例如进行性spranuclear麻痹(Steele-Richardson-Olszewski综合征)、橄榄体小脑脑桥萎缩(OPCA)、Shy-Drager综合征(多发性***萎缩)、和Guam帕金森氏痴呆综合征)、和亨廷顿氏舞蹈病，但并不限于此。此外，本发明修饰的BDNF可用于治疗感觉神经机能障碍和先天性疾病或与视网膜变性有关的神经变性疾病。本发明修饰的BDNF还可用于治疗与视网膜变性有关的遗传性惊厥性截瘫(Kjellin和Barnard-Scholz综合征)、色素性视网膜炎、发身期前视网膜黄斑变性、Usher综合征(伴有先天性听觉损失的色素性视网膜炎)、和Refsum综合征(色素性视网膜炎、先天性听觉损失、和多神经病)。
还可以使用本发明修饰的BDNF促进糖尿病性视网膜病或多发性单神经病患者的恢复。此外，本发明修饰的BDNF也可用作治疗糖尿病，尤其是由于胰岛素机能障碍或胰岛素抗性而具有高血糖的2型糖尿病等的治疗剂。
此外，本发明修饰的BDNF可用作改善胰岛素机能障碍或胰岛素抗性的治疗剂，或治疗或改善伴有胰岛素分泌减少或衰竭的高血糖的治疗剂，或治疗或改善高脂血的治疗剂，或治疗或改善高胰岛素血的治疗剂。
更详细地解释式(1)、式(2)、式(3)、式(4)、式(5)和式(6)的基团。
A代表的脑衍生神经营养因子残基是指通过从BDNF的官能团例如氨基酸(例如赖氨酸残基)的羧基和氨基上除去m或n个与基团(X-B)m或(X-B)n结合的羟基或氢原子而形成的残基。
引入的修饰基团的平均数目是指引入到一分子BDNF中的修饰基团的平均数目，并不小于0.5，优选为约1或1以上，更优选为约1-约10，尤其是约1-约6。其最优选为约2-约4。
对于m，1或1以上的整数是例如1-10的整数，优选为1-6的整数，更优选为2-4的整数。
亚烷基包括具有1-24个碳原子的直链或支链亚烷基，优选为具有2-10个碳原子的直链亚烷基，例如亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基、1，7-亚庚基、1，8-亚辛基、1，9-亚壬基、1，10-亚癸基等。
酰基包括例如链烷酰基、链烯酰基、芳酰基、取代的芳酰基等。
链烷酰基包括具有8-30个碳原子的链烷酰基，例如辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基、十九烷酰基、二十烷酰基、二十一烷酰基、二十三烷酰基、二十四烷酰基、二十五烷酰基、二十六烷酰基、二十七烷酰基、二十八烷酰基、二十九烷酰基、三十烷酰基等，优选为具有14-22个碳原子的链烷酰基，例如十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基、十九烷酰基、二十烷酰基、二十一烷酰基等。
芳酰基包括具有7-11个碳原子的芳酰基，例如苯甲酰基、萘甲酰基等。
链烯酰基包括具有8-30个碳原子的链烯酰基，例如油酰基、亚油酰基、花生四烯酰基等。
取代的芳酰基包括被烷基、卤素原子、烷氧基、羟基、硝基等取代的芳酰基，例如4-甲基苯甲酰基、2-甲基苯甲酰基、4-氟苯甲酰基、2-氟苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、3-氯苯甲酰基、2-氯苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、3-甲氧基苯甲酰基、2-甲氧基苯甲酰基、4-羟基苯甲酰基、3-硝基苯甲酰基等。
烷基包括具有1-6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲基丙基等。
卤素原子是氟原子、氯原子、溴原子、和碘原子。
烷氧基包括具有1-6个碳原子的低级烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲基丙氧基等。
X代表的化学交联是由在化学交联反应后联接A和B的有机基团构成的化学交联。化学交联的一个末端优选经由酯键与1-酰基甘油衍生物结合。化学交联的另一个末端直接与脑衍生神经营养因子的官能团例如氨基或羧基结合。化学交联优选具有羧基、氨基、羟基、亚氨基等作为官能团。此外，化学交联可任选具有两个或更多个官能团，其中一个官能团与1-酰基甘油衍生物结合，另一个官能团与脑衍生神经营养因子的官能团结合。化学交联还可以插在其它官能团之间。优选的化学交联是例如式(2)所示基团：其中R1是亚烷基，式(3)所示基团等：其中R2和R3独立地为亚烷基。最优选的化学交联是式(2’)所示基团：其中R1’是C2-C10亚烷基。
在定义n为1或1以上的整数中，优选的整数是1-10，更优选的整数是1-5。
本发明脑衍生神经营养因子(BDNF)包括通过删除一部分氨基酸序列、或用其它氨基酸替代、或加入一部分其它氨基酸序列而获得的修饰的BDNF，在N-末端和/或C-末端具有一个或多个结合的氨基酸的修饰的BDNF，或其中糖链被删除或替代的修饰的BDNF，只要它们表现出与天然脑衍生神经营养因子基本上相同的活性即可。
本发明所用的BDNF可通过不同方法制得，例如将可产生神经营养因子的原代培养细胞或建立的细胞系培养，并从其培养基(例如培养物上清液、培养的细胞)中分离和纯化BDNF。此外，可通过常规基因工程技术可获得重组神经营养因子，例如将编码BDNF的基因***到合适的载体中，用重组载体转化合适的宿主，并从所得转化体的培养物上清液中分离出BDNF。用于上述方法的宿主细胞不受限制，并且可以是已用于基因工程技术的任何常规宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、毛霉菌、植物细胞或动物细胞。例如，当采用常规基因工程技术时，BDNF是这样制得的：将编码BDNF的基因***到合适的载体中，用该重组载体转化合适的宿主，并从所得转化体的培养物上清液中分离出BDNF(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.88，p.961(1991)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.186，p.1553(1992))。基因工程技术适于以大批量生产具有相同质量的BDNF。
                      制备方法
                  H-B→X1-B→A(X-B)m
                  (10)  (11)    (1)其中A是脑衍生神经营养因子的残基，B是在甘油部分的2-位具有羟基的1-酰基甘油衍生物的残基，其是通过从羟基上除去氢原子而获得的，X是化学交联，m是平均引入数目，并且不小于约0.5，且X1是具有反应性官能团的化学交联。
X1的反应性官能团是指被活化以便与BDNF的官能团例如氨基、羧基进行化学交联反应的官能团。更具体地，该反应性官能团是例如羧基、氨基、或活化的羧基。
对于具有羧基作为反应性官能团的化合物(11)，反应性官能团可这样引入：在催化剂存在下在惰性溶剂中，如果需要在碱存在下，将具有2个羧基的二羧酸酐与1-酰基甘油衍生物反应。所述惰性溶剂包括例如非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氢呋喃等)、芳族溶剂(例如甲苯等)、卤代烃(例如二氯甲烷、二氯乙烷等)。所述催化剂包括例如酸(例如对甲苯磺酸等)、吡啶化合物(例如4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)。所述碱包括例如有机碱(例如三乙胺、吡啶等)。反应温度为约0℃-约100℃。
对于具有活化的羧基作为反应性官能团的化合物(11)，活化羧基的方法是例如混合酸酐法、活化酯法等。混合酸酐法是这样进行的：在无水条件下，在碱存在下，在惰性溶剂中将在上述方法中获得的具有引入的羧基的1-酰基甘油衍生物与烷氧基羰基卤反应，以生成化合物(11)。所述烷氧基羰基卤包括例如异丁氧基羰基氯、仲丁氧基羰基氯、异丙氧基羰基氯、乙氧基羰基氯、甲氧基羰基氯等。所述惰性溶剂可以是非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氢呋喃等)、芳族溶剂(例如甲苯等)等。所述碱可以是烷基胺(例如三乙胺、N-甲基吗啉等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、和这些溶剂的组合。反应温度可以为约-20℃-约室温。
活化酯法是这样进行的：在碱存在下，在惰性溶剂中，在缩合剂存在下，将在上述方法中获得的具有引入的羧基的1-酰基甘油衍生物与N-羟基二酰亚胺或苯酚反应，以生成化合物(11)。所述N-羟基二酰亚胺包括例如N-羟基琥珀酰亚胺等。苯酚包括例如4-硝基苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚、4-硝基苯硫酚等。所述缩合剂包括碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐等。所述惰性溶剂可以是非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氢呋喃等)、芳族溶剂(例如甲苯等)、卤代烃(例如二氯甲烷、二氯乙烷等)。所述碱可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、或这些溶剂的组合。反应温度可以为约0℃-约100℃。
当使用具有羧基作为反应性官能团的化合物(11)时，用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF(1)可通过在碱存在下在溶剂中使用缩合剂使化合物(11)与BDNF反应而制得。所述缩合剂包括碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐等，或这些碳二亚胺与N-羟基二酰亚胺例如N-羟基琥珀酰亚胺的组合等。所述溶剂是例如非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氢呋喃等)、或这些溶剂与水的混合溶剂、和水等。所述碱可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、和它们的组合。反应温度可以为约0℃-约100℃。
当使用具有活化的羧基作为反应性官能团的化合物(11)时，用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF(1)可通过在碱存在下在惰性溶剂中将化合物(11)与BDNF反应而制得。所述溶剂是例如非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氢呋喃等)、或这些溶剂与水的混合溶剂、和水等。所述碱可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、和它们的组合。反应温度可以为约0℃-约100℃。
当使用具有活化的二酰亚胺基团作为反应性官能团的化合物(11)时，用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF(1)可通过在碱存在下在惰性溶剂中将化合物(11)与BDNF反应而制得。所述溶剂可以是例如非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氢呋喃等)、或这些溶剂与水的混合溶剂、或水等。所述碱可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、或这些溶剂的组合。反应温度可以为约0℃-约100℃。
通过上述方法获得的本发明的用1-链烷酰基甘油衍生物修饰的BDNF可通过下列方法的一种或其组合来纯化。(1)聚乙烯亚胺分级；(2)使用Sephacryl S-200的凝胶过滤色谱法；(3)使用Biorex-70树脂或CM Sephadex的离子交换色谱法；(4)硫酸铵分级和/或pH分级，和(5)使用抗体树脂的亲和色谱法，所述抗体树脂是用从杂交瘤或致敏动物分离的抗体制备的。可在酸性条件下或轻微变性条件下将修饰的BDNF解吸。
本发明用1-链烷酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子的确切剂量和给药方案应当根据每名患者所需的剂量、治疗方法、所治疗的疾病种类、或必要程度、以及医师的诊断而变。当非胃肠道给药时，剂量和给药频率可根据患者的病症、年龄、体重、和给药途径而变，但是当以注射剂的形式皮下或静脉内给药时，对于成人，其日剂量为每kg体重约1-约2500μg、优选约10-约500μg。当以气雾剂形式呼吸道给药时，对于成人，其日剂量为每kg体重约1-约2500μg，优选约10-约500μg。给药方案是连续每日给药、间歇给药、或联合采用这些方法的方案。
当经口给药时，剂量和给药频率可根据患者的病症、年龄、体重、和给药途径而变，对于成人，其日剂量为每kg体重约5-约2500μg、优选约10-约1000μg。
本发明修饰的BDNF可局部施用给在不同组织的隔离的感觉神经元，所述组织有例如膝关节、锥体和小结神经节；第8脑神经前庭听神经复合体；三叉神经节上下颌的腹侧后外侧核；和三叉神经的中脑核。在这种情况下，优选通过吸收到能够在所述隔离的神经元周围迁移的膜例如硅橡胶膜上来给药。
对于患有2型糖尿病的患者，本发明用1-链烷酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子的确切剂量和给药方案应当根据每名患者所需的剂量、治疗方法、所治疗的疾病种类、或必要程度、以及医师的诊断而变。当非胃肠道给药时，剂量和给药频率可根据患者的病症、年龄、体重、和给药途径而变，但是当以注射剂的形式皮下或静脉内给药时，对于成人，其日剂量为每kg体重约1-约500μg、优选约10-约250μg。当以气雾剂的形式施用给气道时，对于成人，其日剂量为每kg体重约1-约500μg、优选约10-约250μg。给药方案是连续每日给药、间歇给药、或联合采用这些方法的方案。
药物组合物可通过将本发明的用1-酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子与可药用无毒载体混合来制得。当制备非胃肠道给药(皮下注射、肌内注射、或静脉内注射)的用药物组合物时，其优选呈溶液制剂或悬浮制剂的形式。当制备***内给药或直肠给药的用药物组合物时，其优选呈半固体制剂例如霜剂或栓剂的形式。当制备鼻内给药用药物组合物时，其优选呈粉剂、滴鼻剂、或气雾剂的形式。
药物组合物呈单一剂量单位的形式，并且可通过药物领域已知的任何常规方法例如在Remington’s Pharmaceutical Science(由MackPublishing Company出版，Easton，PA，1970)中描述的方法制得。注射剂可任选含有衍生自血浆的蛋白质例如白蛋白质、氨基酸例如甘氨酸、或糖类例如甘露糖醇作为药物载体，此外还可以含有缓冲剂、助溶剂、或等渗剂等。当本发明药物组合物呈水溶液制剂或冷冻干燥制剂的形式时，其可以优选含有表面活性剂例如吐温80(注册商标)、吐温20(注册商标)等以防止聚集。当本发明药物组合物是非胃肠道给药用组合物而不是注射剂时，其可以含有蒸馏水或生理盐水溶液、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、衍生自植物的油、氢化萘等。例如，***内给药或直肠给药用药物组合物例如栓剂可含有聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等作为常规赋形剂。***内给药用药物组合物可含有吸收剂例如胆汁盐、乙二胺盐、柠檬酸盐等。吸入用药物组合物可以呈固体制剂的形式，并且可以含有乳糖等作为赋形剂，滴鼻用药物组合物可以呈水溶液或油溶液的形式。
本发明药物组合物特别优选呈其中可通过单次给药在长时间内例如1周-1年时间内将本发明化合物持续地释放给受治疗者的制剂形式，并且可采用多种缓释制剂、贮药库制剂、或植入制剂。
本发明用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF可以呈在活流体中具有低溶解度的其可药用盐形式。这样的可药用盐是例如，(1)：酸加成盐例如磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、鞣酸盐、扑酸盐、藻酸盐、多谷氨酸盐等，(2)：与多价金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镍等形成的盐或络合物，或(1)与(2)的组合例如鞣酸锌盐等。优选将本发明用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF转化成其弱水溶性盐，将这样的盐与凝胶例如一硬脂酸铝凝胶和芝麻油等混合，以生成合适的注射剂。在这种情况下，特别优选的盐是锌盐、鞣酸锌盐、扑酸盐等。另一类缓释注射剂是这样的，其中本发明用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF优选转化成其弱水溶性的盐，将其包封在分解缓慢的无毒且非抗原性聚合物例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物或共聚物中。在这种情况下，特别优选的盐是锌盐、鞣酸-锌盐、扑酸盐等。此外，可将神经营养因子或其弱水溶性盐包封在胆固醇基体或胶原基体中，以生成缓释制剂。
经口施用的药物制剂可以是通过将本发明用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF或其盐与卵磷脂、胆固醇、游离脂肪酸进行微囊包封而制得的制剂，或者通过将所述微胶囊包封到明胶胶囊内而制得的制剂，或者通过将用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF或其盐包封在肠溶胶囊中而制得的制剂等。这些制剂还可以包含例如吸收剂、稳定剂、表面活性剂等。
因为卵磷脂是一种用于修饰本发明BDNF的1-酰基甘油衍生物的是广泛天然存在的无毒物质，所以从毒性的角度来看卵磷脂修饰的BDNF也是安全的。
                       实施例参考实施例1合成2-(4-羟基羰基丁酰基)溶血卵磷脂：
向在甘油部分的2-位具有羟基的溶血卵磷脂(式(4)酰基R4是棕榈酰基，在下文中也是相同的)(204mg，0.4mmol)在氯仿-吡啶(8ml/2ml)内的悬浮液中加入DMAP(N，N-二甲基氨基吡啶)(98mg，0.8mmol)和戊二酸酐(91mg，0.8ml)，并将该混合物在60℃搅拌15小时。将该反应溶液冷却，并减压浓缩。将浓缩的残余物溶解在氯仿/甲醇/水＝4∶5∶1(2ml)中，并将该反应溶液过已经用所述溶液平衡过的离子交换柱(Dowex 50W-X8)，减压浓缩，通过硅胶柱色谱纯化残余物。产量：225mg(0.36mmol，90％)。
1H-HMR(CDCL3)：0.84(t，3H)，1.20(brs)，1.52-1.60(brs，2H)，1.80-1.95
(m，2H)，2.20-2.42(m，6H)，3.35(s，9H)，3.78(m，4H)，3.90-4.35(m，4H)，
5.20(s，1H)参考实施例2合成2-(4-羟基羰基丁酰基)溶血卵磷脂的活化酯：
将在参考实施例1中获得的羧酸(225mg，0.36mmol)溶解在二氯甲烷(5ml)中，并将该混合物冷却至0℃，并向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺(41mg，0.36mmol)和DCC(74mg，0.36mmol)。将该混合物在室温搅拌15小时。经由硅藻土将不溶物过滤，并将溶剂减压蒸发，获得了活性酯。
实施例1
将水(5.4ml)加到30mg/ml的r-h BDNF溶液(1.7ml)中，在水冷却下将该溶液的pH值调节至pH 11，并搅拌。将0.6当量2-O-(4-羟基羰基丁酰基)溶血磷酰基胆碱羟基琥珀酰亚胺酯的水溶液(2.4ml)滴加到该反应混合物中，其中所述当量是相对于r-h BDNF(重组人脑衍生神经营养因子)的所有氨基而计的，并将该混合物在水冷却下搅拌12小时。经由超滤膜(分子截留：分子量为10000)过滤该反应溶液以除去未反应的物质和低分子量物质。用10mM磷酸/磷酸钾混合溶液替换溶剂，以获得本标题化合物。通过飞行时间质谱法(TOF-MALDI MS)测定引入到r-h BDNF内的卵磷脂衍生物的平均数目。r-h BDNF和上述化合物的光谱图案如附图1所示。
实施例2
将水(0.7ml)加到30mg/ml的r-h BDNF溶液(0.25ml)中，在水冷却下调节该溶液的pH，并将总体积调节至1.2ml，然后搅拌。将1个当量的2-O-(4-羟基羰基丁酰基)溶血磷酰基胆碱羟基琥珀酰亚胺酯的水溶液(0.23ml)滴加到该反应混合物中，其中所述当量是相对于r-h BDNF的所有氨基而计的(如下表所示)，并将该混合物在水冷却下静置12小时。经由超滤膜(分子截留：分子量为10000)过滤该反应溶液以除去未反应的物质和低分子量物质。用10mM磷酸/磷酸钾混合溶液替换溶剂，以获得本标题化合物。通过飞行时间质谱法(TOF-MALDIMS)测定引入到r-h BDNF内的卵磷脂衍生物的平均数目。表1
该反应溶液的pH值 相对于氨基的当量数
    化合物2     11     0.6
    化合物3     11     0.6
    化合物4     11     0.6
    化合物5     11     0.6
    化合物6     11     0.6
    化合物7     11     1.5
    化合物8     7     1.5
实施例3评价BDNF和卵磷脂化的BDNF(实施例1)对糖尿病的效力，及其给药方法和其剂量的研究：实验材料和方法(1)实验动物：
从Clea Japan，Inc购得雄性C57BL/Ksj-db/db Jcl小鼠(7周大小)。预喂养5周后，将12周大小的动物用于实验。(2)饲养条件：
将小鼠保持在于23±2℃温度和55±10％相对湿度下维持开灯(早8点到晚8点)和关灯(晚8点到早8点)照明控制室中。在预喂养和实验期间，给动物提供食物(CE-2，Clea Japan，Inc)和无菌自来水让其自由摄取。(3)识别个体和笼子
通过用油墨在尾巴上写上其编号来识别每只小鼠。用标签给笼子作标记，其中标签上表明所进行的实验的名称、抵达日期、小鼠株、性别、以及来源。在预饲养期间，将小鼠以10只小鼠/笼子的方式保持在笼子中。实验开始后，将每只小鼠以1只小鼠/笼子的方式隔离保持。(4)确定剂量和分组
设定关于BDNF、卵磷脂化的BDNF的剂量的下列组。1：BDNF 10mg/kg/天(n＝5)2：BDNF 20mg/kg/天(n＝5)3：卵磷脂化的BDNF 1mg/kg/天(n＝5)4：卵磷脂化的BDNF 3mg/kg/天(n＝5)5：卵磷脂化的BDNF 10mg/kg/天(n＝5)6：载体治疗组(n＝5)(5)选择高血糖小鼠并将其分组
给药前5天，将小鼠单独保持，监测食物摄取量、体重、血糖水平直至给药当天。在给药当天，按照上述(4)的指示根据体重和血糖水平、以及在从给药前5天到给药当天的期间内的食物摄取量(g/只/天)将小鼠分为6组。当分组时，将不患有高血糖(300mg/kg或更低)的小鼠和明显处于不良状况的小鼠排除在该实验之外。(6)制备剂量溶液
制备方法如下所示。载体是含有0.1％BSA的10mM KH2PO4/H3PO4(pH3.0)，并将测试化合物稀释。表2
组 剂量溶液的浓度
BDNF 10mg/kg/天 BDNF 1.0mg/ml
BDNF 20mg/kg/天 BDNF 2.0mg/ml
卵磷脂化的BDNF 1mg/kg/天 卵磷脂化的BDNF 0.1mg/ml
卵磷脂化的BDNF 3mg/kg/天 卵磷脂化的BDNF 0.3mg/ml
卵磷脂化的BDNF 10mg/kg/天 卵磷脂化的BDNF 1.0mg/ml
(7)给药方法
通过以10ml/kg的剂量在背部皮下给药来进行5天的给药。(8)评价项目
在给药期间的每一天、以及给药之后和之前的期间内偶然地测定体重、食物摄取量、和血糖水平。用自动平衡测定体重和食物摄取量，通过Antosense II(Sankyo.Bayer)用从尾静脉采集的血液测定血糖水平。(9)统计学分析
用统计学程序SAS(注册商标)对体重、食物摄取量、总血糖水平进行Dunnet’s检验，以在每个点与用作对照的载体治疗组的数据进行比较。显著水平设置为5％。(10)结果
在第0天到第4天(即从实验开始的当天到第4天)期间将卵磷脂化的BDNF或BDNF皮下施用给db/db小鼠。随着时间的推移测定给药期间和给药后的血糖水平，并且血糖水平的变化如附图2所示。在附图2中，■表示载体治疗组的数据；□表示BDNF 10mg/kg治疗组的数据；△表示BDNF 20mg/kg治疗组的数据；◆表示卵磷脂化的BDNF 1mg/kg治疗组的数据；○表示卵磷脂化的BDNF 3mg/kg治疗组的数据；●表示卵磷脂化的BDNF 10mg/kg治疗组的数据；每个数据都是以平均值±S.D.(n＝5)表示的；*：P＜0.0 5，**：P＜0.01vs.载体治疗组(Dunnet’s检验)。
如附图2所示，卵磷脂化的BDNF表现出显著的剂量依赖性降血糖活性。虽然BDNF也表现出剂量依赖性降血糖活性，但是在10mg/kg的剂量没有显著差异。此外，当比较卵磷脂化的BDNF 10mg/kg治疗组与BDNF 10mg/kg治疗组的数据时，卵磷脂化的BDNF表现出更强的作用。
此外，在第0天到第4天期间将卵磷脂化的BDNF和BDNF皮下施用给db/db小鼠后，随着时间的推移测定给药期间和给药后的食物摄取量，并且食物摄取量的变化如附图3所示。在附图3中，■表示载体治疗组的数据；□表示BDNF 10mg/kg治疗组的数据；△表示BDNF 20mg/kg治疗组的数据；◆表示卵磷脂化的BDNF 1mg/kg治疗组的数据；○表示卵磷脂化的BDNF 3mg/kg治疗组的数据；●表示卵磷脂化的BDNF10mg/kg治疗组的数据；每个数据都是以平均值±S.D.(n＝5)表示的；*：P＜0.05，**：P＜0.01vs.载体治疗组(Dunnet’s检验)。
此外，在第0天到第4天期间将卵磷脂化的BDNF和BDNF皮下施用给db/db小鼠后，随着时间的推移测定给药期间和给药后的体重，并且体重的变化如附图4所示。在附图4中，■表示载体治疗组的数据；□表示BDNF 10mg/kg治疗组的数据；△表示BDNF 20mg/kg治疗组的数据；◆表示卵磷脂化的BDNF 1mg/kg治疗组的数据；○表示卵磷脂化的BDNF 3mg/kg治疗组的数据；●表示卵磷脂化的BDNF 10mg/kg治疗组的数据；每个数据都是以平均值±S.D.(n＝5)表示的；*：P＜0.05，**：P＜0.01vs.载体治疗组(Dunnet’s检验)。
如附图3和附图4所示，就象对血糖水平的作用一样，卵磷脂化的BDNF对食物摄取量和体重的作用也是剂量依赖性的，并且比BDNF更显著。
                      工业实用性
通过用1-酰基甘油衍生物修饰BDNF，获得了具有比BDNF改善了的药理活性、药动学特征和物理性质的修饰的BDNF。本发明的用1-酰基甘油衍生物修饰的BDNF可用作治疗神经变性疾病的治疗剂。此外，本发明修饰的BDNF表现出剂量依赖性降血糖活性以及促进食物摄取量和体重下降的活性，因此可用作治疗糖尿病、尤其是2型糖尿病的治疗剂。

Claims (11)

1.用1-酰基甘油衍生物修饰的脑衍生神经营养因子。
2.权利要求1的修饰的脑衍生神经营养因子，其中所述修饰的脑衍生神经营养因子是式(1)化合物：
                A(X-B)m      (1)其中A是脑衍生神经营养因子的残基，B是在甘油部分的2-位具有羟基的1-酰基甘油衍生物的残基，并且是通过从羟基上除去氢原子而获得的，X是化学交联，且m是平均引入数目，并且不小于约0.5。
3.权利要求2的修饰的脑衍生神经营养因子，其中X是式(2)所示基团：
Figure A0180866700022
其中R1是亚烷基，或式(3)所示基团：其中R2和R3独立地为亚烷基。
4.权利要求2的修饰的脑衍生神经营养因子，其中所述1-酰基甘油衍生物是1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱、1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸、或1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺。
5.权利要求2或3的修饰的脑衍生神经营养因子，其中B是式(4)所示基团：其中R4是酰基。
6.权利要求4的修饰的脑衍生神经营养因子，其中所述酰基是具有8-30个碳原子的链烷酰基。
7.治疗2型糖尿病的治疗剂，其中包含式(1)的修饰的脑衍生神经营养因子作为活性组分：
                   A(X-B)m      (1)其中A是脑衍生神经营养因子的残基，B是在甘油部分的2-位具有羟基的1-酰基甘油衍生物的残基，并且是通过从羟基上除去氢原子而获得的，X是化学交联，且m是平均引入数目，并且不小于约0.5。
8.权利要求7的包含修饰的脑衍生神经营养因子作为活性组分的治疗2型糖尿病的治疗剂，其中X是式(2)所示基团：其中R1是亚烷基，或式(3)所示基团：其中R2和R3独立地为亚烷基。
9.权利要求7的包含修饰的脑衍生神经营养因子作为活性组分的治疗2型糖尿病的治疗剂，其中所述1-酰基甘油衍生物是1-酰基甘油-3-磷酰基胆碱、1-酰基甘油-3-磷酰基丝氨酸、或1-酰基甘油-3-磷酰基乙基胺。
10.权利要求7或8的包含修饰的脑衍生神经营养因子作为活性组分的治疗2型糖尿病的治疗剂，其中B是式(4)所示基团：
Figure A0180866700041
其中R4是酰基。
11.权利要求10的包含修饰的脑衍生神经营养因子作为活性组分的治疗2型糖尿病的治疗剂，其中所述酰基是具有8-30个碳原子的链烷酰基。
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