CN1425069A - 纯化蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种用于释放可溶性或膜缔合胞内感兴趣的蛋白(POI)的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含可溶性或膜缔合胞内POI的细胞；使所述细胞与膜提取组合物接触；并且使得所述POI在足以特异性地释放所述POI的条件下以可溶性形式从所述细胞中释放出来。

Description

纯化蛋白质的方法
发明领域
本发明涉及用于释放胞内感兴趣的蛋白质(POI)的方法。
具体地说，本发明涉及采用有助于释放可溶性或膜缔合胞内感兴趣的蛋白质(POI)的膜提取组合物来释放所述POI的方法。
发明背景
回收胞内POI(例如一种酶)的传统方法一直是应用机械破碎法(Naglak等1990)，例如玻珠研磨机或以弗氏压碎器原理操作的细胞匀浆器。然而，这些机械破碎法有缺点，它们是生产能力低的耗能方法，而机械破碎所需的细胞匀浆器或相似的设备对于购买者而言是昂贵的。另外，机械方法使细胞暴露并且因此也使所提取的POI暴露于非常严酷的条件，尤其是因为大多数蛋白质将因所产生的热而变性，除非所述机械装置和/或匀浆可被有效地冷却。此外，某些细胞例如酵母细胞(例如来自汉逊酵母属(Hansenula)的酵母)难以机械破碎，因而需要经受细胞匀浆器的不止一个冲程。细胞匀浆也可能含有细胞壁碎片和DNA，这导致高粘度。这意味着将细胞碎片与所述POI分开，可能证明是困难的操作。另外，所产生的无细胞匀浆可能不仅含有胞内POI，而且也含有大量(有时为数千种)不同的胞内蛋白质和与一般细胞代谢有关的酶。这意味着所产生的无细胞匀浆可能不仅难以通过超滤来浓缩，而且也可能在获得恰当的商业浓度的给定POI方面有问题。
为了最大限度地减小某些机械破碎法潜在的有害效应，已经开发出利用例如去垢剂的化学方法，来透化处理酵母细胞。作为实例，非离子去垢剂聚乙氧基化辛基酚(作为Triton X-100市售)已经被单独使用或结合冻融循环来使用(参见Naglak等1990)。另外，美国专利第5124256号(Crahay等1992)公开了一种方法，借助用中性水溶性无机盐和具有亲水性亲脂性平衡(HLB)在8和15之间的非离子水溶性聚乙氧基化烷基酚表面活性剂，处理水性介质中的酵母属(Saccharomyces)酵母，藉此从所述酵母提取蛋白质。然而，这些非离子水溶性聚乙氧基化烷基酚表面活性剂包括聚乙氧基化辛基酚、壬基酚和三丁基酚(尤其是商标为TritonX-100、Nonidet P-40和Sapogenat T-080的市售产品)有几个缺点：(i)它们当单独使用时可能没有显著的提取效应，和(ii)这些表面活性剂可能干扰后续的对所述POI酶活性的测量。
也已经用几种有机溶剂，在原位酶测定中透化处理酵母细胞以及用于从酵母细胞中提取蛋白质。这类溶剂的实例包括但不限于甲苯、乙酸乙酯、二甲亚砜以及与甘油混合的苯(Naglak等1990)。然而，当需要多达200m3的发酵罐体积时，这些溶剂对于应用于工业规模的生产没有吸引力。
也已经表明，毛地黄皂苷和其它天然存在的皂苷使许多真核细胞透化(参见Joshi等1989)。虽然尚不了解毛地黄皂苷透化的确切机制，但据认为毛地黄皂苷与细胞膜中存在的胆固醇形成络合物，使膜渗漏。毛地黄皂苷对酵母细胞的透化也可能是由于络合酵母膜的麦角固醇。Joshi等(1989)使用毛地黄皂苷(0.1％)来透化处理酵母-克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，这促进胞内催化乳糖转化为葡萄糖和半乳糖。得自皂树树皮的非离子去垢剂皂苷是另一种胆固醇络合剂，已知它至少使哺乳动物细胞透化(Naglak等1990)。再者，同以上概述的非离子去垢剂一样，应用毛地黄皂苷和其它天然存在的皂苷可能有这样的缺点：当单独使用时，它们可能没有显著的提取效应。
也已经用离液剂促进胞内酶的提取。作为实例，美国专利第3801461号(Miyake和Shiosaka 1974)公开了一种方法，采用离液溶液例如尿素溶液，提取在菌丝体或者真菌或细菌细胞中产生的胞内酶。美国专利第4683293号(Craig 1987)也公开了一种方法，通过在离液盐例如硫氰酸钠、碘化钠、次氯酸钠、溴化锂、盐酸鈲和尿素存在下裂解细胞，从毕赤酵母属(Pichia)的转化细胞中选择性地提取亲脂性蛋白质。然而，离液剂有缺点，将所述POI暴露于离液剂例如尿素，可能通过使所述POI变性而导致酶活性实际丧失。
除了以上举出的缺点外，以上引证的现有技术仅涉及了使宿主细胞对低分子量分子透化，而所述POI在所述细胞内保持不变。特别是，以上引证的现有技术中没有一个涉及在不影响所述POI的性质和/或活性的条件下提取膜缔合胞内POI。更特别是，以上引证的现有技术中没有一个涉及有助于释放被捕获并且不能从宿主细胞中分泌的膜缔合胞内POI的方法。
因而，本发明寻求克服与现有技术的提取方法有关的问题。
因此，本发明提供一种从宿主生物中释放可溶性或膜缔合胞内感兴趣的蛋白质(POI)的方法。
发明概述
本发明涉及有助于释放被捕获和/或不能从宿主细胞中分泌的可溶性或膜缔合胞内POI的方法。将采用本发明方法提取胞内POI与常规细胞破碎方法以及与采用其它离子/非离子去垢剂和乳化剂的提取方法相比较。也研究了去垢剂与蛋白酶和盐的组合。本发明的结果表明，采用本发明的方法提取可溶性或膜缔合胞内POI是有利的，因为：
(i)  可以避免常规细胞破碎技术；
(ii) 可以回收不含污染DNA和细胞壁碎片的所述胞内POI；
(iii)可以在发生糖基化之前，从真核宿主生物例如酵母中回收所
     述胞内POI。分泌型蛋白的过度糖基化是众所周知的问题，
     尤其是在真核宿主生物例如酵母中。与酵母表达***有关的
     这一缺点已经导致不愿意使用酵母作为生产***，即使酵母
     表达载体能够以高表达水平生产蛋白质以及大量的生物
     质，另外，酵母已经批准用于食品。通过在胞内表达所述
     POI，然后用本发明的方法提取所述POI，所述POI将是非
    糖基化的，因为所述POI没有通过发生糖基化的分泌途径；(iv) 在本发明方法之前的发酵法可以在适合于宿主细胞的任何
    pH下进行。在本领域中，众所周知分泌型POI可能受其胞
    外生长培养基pH的影响。迄今为止，通常必需将宿主生物
    的生长培养基的pH维持在约中性的pH下，因为认为在这
    样的pH下发酵对于维持分泌型POI稳定性是必不可少的，
    即使它们通常增加细菌污染的危险。用本发明的方法，所述
    POI可以不分泌。因此，宿主生物生长培养基的pH是不相
    关的，因为胞内pH保持恒定，而与培养基的pH无关。因
    此，本发明允许宿主生物(例如酵母)在较低pH(例如pH 4.0)
    下生长，这降低了细菌污染的危险，而不影响或者生物质或
    者POI的生产；和(v)  本发明的方法可以用来防止所述胞内POI与胞外生长培养
    基接触。如果所述POI在胞外培养基中不稳定，因为例如
    对蛋白酶的敏感性，则这是有利的。通过在胞内表达所述蛋
    白质，然后用本发明的方法提取，避免了与胞外培养基的接
    触。发明概述方面
一方面，本发明涉及从细胞中释放感兴趣的蛋白质(POI)的方法。所述方法包括以下步骤：提供包含可溶性或膜缔合胞内POI的细胞；使所述细胞与膜提取组合物接触；并且使得所述POI在足以释放所述POI的条件下以可溶性形式从所述细胞中释放出来。在此，所述POI可以是胞内感兴趣的蛋白质和/或所述POI可以是己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)。本发明的详述方面
按照本发明的一个方面，提供一种从转化细胞中释放可溶性或膜缔合胞内感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含可溶性或膜缔合胞内POI的转化细胞；使所述转化细胞与膜提取组合物接触；并且使所述POI在足以特异性地释放所述POI的条件下以可溶性形式从所述转化细胞中释放出来。
按照本发明的另一个方面，提供一种从转化细胞中释放HOX酶的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含HOX酶的转化细胞；使所述转化细胞与膜提取组合物接触；并且使所述HOX酶在足以特异性地释放所述HOX酶的条件下以可溶性形式从所述转化细胞中释放出来。
按照本发明的另一个方面，提供一种从转化细胞中释放白介素1受体拮抗剂(IL-lra)的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含IL-lra的转化细胞；使所述转化细胞与膜提取组合物接触；并且使所述IL-lra在足以特异性地释放所述IL-lra的条件下以可溶性形式从所述转化细胞中释放出来。
按照本发明的另一个方面，提供一种用于筛选产生水平提高的可溶性或膜缔合胞内POI的突变体的方法，所述方法包括以下步骤：让所述突变型细胞在30℃下生长；使所述突变型细胞与所述膜提取组合物一起孵育；回收无细胞培养基；筛选所述胞内POI水平提高的无细胞培养基；因此所述无细胞培养基中所述胞内POI的存在指示已经释放出所述胞内POI。
按照本发明的另一方面，提供适用于释放可溶性或膜缔合胞内POI的膜提取组合物，其中所述组合物在下述条件下与所述细胞接触：季铵化合物的重量百分比为约0.05％至约0.6％(更尤其是约0.1％至约0.5％，更尤其是约0.2％至约0.45％，更尤其是约0.4％)；最适pH为约2.0至约11.0(更尤其是约5.0至约7.0，更尤其是约6.3)；最适温度为约4℃至约40℃(更尤其是约20℃至约30℃，更尤其是约25℃)。
按照本发明的另一方面，提供一种膜提取组合物，所述膜提取组合物包含一种适用于释放可溶性或膜缔合胞内POI的季铵化合物。
按照本发明的另一方面，提供一种从真核宿主生物中释放的基本无糖基化的POI。
本发明的其它方面和优点在所附权利要求书中和以下描述和讨论中介绍。这些方面在独立的小节标题下介绍。然而，应该理解，在每个小节标题下的内容不一定限于该具体的小节标题。发明详述
本发明证明了下述非常令人惊讶的发现：包含季铵化合物的膜提取组合物可以用来获得快速、特异性和经济有效的可溶性或膜缔合胞内POI的提取，而无需藉助于传统细胞破碎技术的应用。有利和出乎预料的是，所得的细胞提取物含有非常少的污染性胞内DNA，并且相对无细胞壁碎片，从而简化了所述POI可能经历的任何进一步纯化步骤。这与现有技术的机械提取方法是截然不同的。胞内蛋白
本文所用的术语“胞内”POI是指在一种或多种细胞中或细胞内部存在的POI。所述胞内POI可以定位于细胞内(例如所述细胞的细胞质中)，即使它具有信号分泌机制。在这一方面，所述胞内POI可以是不从细胞中主动分泌的POI，或是即使具有信号序列分泌机制，也不能被所述细胞分泌的POI。在这两种情况之一中，胞内POI可以是已经被工程改造以防止其从细胞分泌的天然分泌型POI。或者，所述POI可以是包含一个膜结合结构域的嵌合蛋白。
本发明的方法与Ahlstrom和Edebo((1994)FEMS MicrobiologyLetters 119 7-12)中描述的方法相反，后一方法报道了用betainate十四烷酯从大肠杆菌中释放周质β-内酰胺酶。周质是细菌细胞中细胞膜和细胞壁之间的区域。因此，来自大肠杆菌的周质β-内酰胺酶定位于细胞膜之外，而不是胞质酶。截然不同的是，本发明的POI是存在于一种或多种细胞中或细胞内部的胞内POI。膜缔合POI
本文所用的术语“膜缔合POI”是指可能定位于细胞膜或质膜附近、但可能基本上不与细胞膜或质膜缔合的POI。因此，所述膜缔合酶不是基本上结合于膜的蛋白质，或者所述膜缔合酶基本上不与细胞膜结合。可以通过用细胞匀浆器进行机械处理，可以使所述膜缔合POI溶解。膜结合POI
本文所用的术语“膜结合POI”是指用细胞匀浆器进行机械处理不可使其成为可溶性的蛋白质。特异性释放
术语“特异性释放”是指所述POI的比活高于通过机械方法提取时的比活，所述机械方法例如利用玻珠研磨机或以弗氏压碎器原理操作的细胞匀浆器。转化细胞
术语“转化细胞”包括已经利用重组DNA技术转化的细胞。所述转化通常由于一种或多种核苷酸序列***被转化的细胞而发生。所***的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即是对于该转化的细胞而言不是天然的序列)。另外，或者用另一种方法，所***的核苷酸序列可以是同源核苷酸序列(即是对于该转化的细胞而言是天然的序列)-使得所述细胞接受一个或多个额外拷贝的在所述细胞中已经存在的核苷酸序列。膜提取组合物
本文所用的术语“膜提取组合物”是指这样一种组合物，所述组合物能够影响细胞膜中组分、使得膜结合和/或膜缔合胞内POI足以从所述膜组分解离和/或释放，并且可以容易地从所述膜提取组合物中回收和/或收获所述POI。所述POI也可以是可溶性POI。在一个高度优选的实施方案中，本发明的膜提取组合物包含一种或多种季铵化合物或其组合。季铵化合物
本文所用的术语“季铵化合物”是指通过用可以相同或不同的有机基团取代NH4 +离子的所有4个氢原子、可从氢氧化铵或铵盐衍生的化合物。通常，所述有机基团之一是长链(C8-C18)烷基，而其它三个有机基团是较短链的烷基或其它基团。
在一个优选实施方案中，这些化合物具有以下结构：CH3-(CH2)n-N(CH3)+ 3
其中n为所述链中亚甲基的数目，并且其中所述相反离子可以是卤素，例如氯离子或溴离子。这些化合物具有阳离子去垢剂的特性，并且是强有力的抗微生物剂。
这些季铵化合物的实例包括但不限于溴化月桂酰三甲铵(LTAB)、氯化肉豆蔻基三甲铵(MTAC)、氯化鲸蜡基三甲铵(CTAC)、溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)、溴化十六烷基三甲铵(或Cetrimidum，它包括溴化烷基铵的混合物，主要是CTAB)、氯化硬脂酰三甲铵(STAC)、溴化硬脂酰三甲铵(STAB)、苯扎氯铵(氯化烷基二甲基苄基铵)、溴化N-鲸蜡基吡啶鎓(溴化N-十六烷基吡啶鎓)、氯化N-鲸蜡基吡啶鎓(氯化N-十六烷基吡啶鎓)、氯化N-鲸蜡基吡啶鎓(氯化N-十六烷基吡啶鎓)、氯化苄基二甲基十四烷基铵和氯化苄基二甲基十六烷基铵。
作为实例，这些化合物中某些的结构描述如下。按亚甲基增加的顺序列出所述化合物：
LTAB是H3C-(CH2)11-N(CH3)3Br
MTAC是H3C-(CH2)13-N(CH3)3Cl
CTAC是H3C-(CH2)15-N(CH3)3Cl
CTAB是H3C-(CH2)15-N(CH3)3Br
STAC是H3C-(CH2)17-N(CH3)3Cl
STAB是H3C-(CH2)17-N(CH3)3Br
所述季铵化合物最好是氯化鲸蜡基吡啶鎓(CPC，C21H38NCl)。CPC的结构描述如下：
所述季铵化合物最好是溴化鲸蜡基吡啶鎓(CPB，C21H38NBr)。CPB的结构描述如下：
Figure A0081852300142
所述季铵化合物最好是氯化苄基二甲基十四烷基铵(BDTAC：C23H42NCl)。BDTAC的结构描述如下：
所述季铵化合物最好是氯化苄基二甲基十六烷基铵(BDHAC：C25H46NCl)。BDHAC的结构描述如下：
所述季铵化合物最好是苯扎氯铵(氯化烷基二甲基苄基铵)。
苯扎氯铵的结构描述如下：
C12H25N(CH3)2C7H7Cl
CTAB和苯扎氯铵(也称为氯化烷基二甲基苄基铵-下文称为专利药名Rodalon)结构的比较如下：
所述季铵化合物最好是溴化月桂酰三甲铵(LTAB)。
所述季铵化合物最好是氯化鲸蜡基三甲铵(CTAC)。
所述季铵化合物最好是溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)。
已经表明，阳离子去垢剂CTAB能够改变酵母的通透性，可能是由于引起跨膜膜孔形成，与就两种其它非离子去垢剂例如Pluronic F-68和Triiton X-100所提出的机制(King等1991)相似。采用去垢剂例如CTAB改变细胞通透性有助于测量全细胞中的胞内酶活性(Sekhar等1999)。此外，CTAB透化细胞的产生，已经证明可用于例如得自酵母菌株例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Gowda等1991)和脆璧克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)(Joshi等1987)的细胞中的胞内酶催化作用。在这些研究中，重要的是注意到，去垢剂CTAB使低分子量分子(例如底物、产物、辅因子)可透过酵母细胞，而胞内酶和其它POI在所述细胞中保持不变。与本发明截然不同，以上提及的研究中没有一个公开了或提出去垢剂CTAB(或相关的季铵化合物，例如LTAB或CTAC)可以用来有助于从宿主细胞释放可溶性或膜缔合胞内POI。
阳离子去垢剂CTAB也一直常用于分离DNA/RNA分子的方法中。作为实例，通过用CTAB于高温(约65℃)和低盐浓度(低于0.6MNaCl)下处理细胞，使得DNA-CTAB沉淀形成并且容易被回收，可以分离出DNA分子。CTAB去垢剂也通常用来从植物中提取核酸，在植物中用或者乙醇或者异丙醇共沉淀出中性多糖，可以造成严重问题。CTAB也已经用于直接裂解和从用丝状噬菌体感染的大肠杆菌培养物上清液中沉淀DNA(参见Ishaq等1990 Biotechniques 9(1)：19-20，22，24；Kambouris等1999：FEMS Immunol Med Microbiol 25(3)：255-64；Kuipers等1999 Ann Rheum Dis 58(2)：103-8；Velegraki等1999 Med Mycol 37(1)：69-73；White等1998 Med Mycol 36(5)：299-303；Woodhead等1998 MolBiotechnol 9(3)：243-6；Mito和Detschart 1998 Parasitol Res 84(7)：596-7；Zhang等191998)J Virol Methods 71(1)：45-50；Reineke等(1998)InsectMol Biol 7(1)：95-9)。所有这些基于CTAB的用来分离DNA分子的方法都依赖于利用CTAB沉淀核酸和酸性多糖、同时将其余蛋白质和中性多糖保持在溶液中的特性。令人惊讶和出乎预料的是，本发明的方法不仅促进沉淀胞内DNA，而且也促进保留胞内DNA。因此，本发明的方法便于选择性地释放胞内POI。释放
按照本发明的方法，通过将一种或多种宿主细胞在足以释放所述可溶性或膜缔合胞内POI的条件下与膜提取组合物接触，从所述细胞中释放所述胞内POI。足以释放所述POI的优选条件
(I)季铵化合物的百分比
最好是，所述膜提取组合物包含约0.05％至约0.6％(重量)的季铵化合物，优选约0.1％至约0.5％(重量)的季铵化合物，优选约0.2％至约0.45％(重量)的季铵化合物，更优选约0.4％(重量)的季铵化合物。
所述季铵化合物最好是LTAB。
所述季铵化合物最好是CTAC。
所述季铵化合物最好是CTAB。
所述季铵化合物最好是苯扎氯铵(C12H25N(CH3)2C7H7Cl)。
所述季铵化合物最好是氯化鲸蜡基吡啶鎓(CPC，C21H38NCl)。
所述季铵化合物最好是溴化鲸蜡基吡啶鎓(CPB，C21H38NBr)。
所述季铵化合物最好是氯化苄基二甲基十四烷基铵(BDTAC：C23H42NCl)。
所述季铵化合物最好是氯化苄基二甲基十六烷基铵(BDTAC：C25H46NCl)。
(II)温度
所述宿主细胞最好在约4℃至约40℃的温度下与所述膜提取组合物接触。
所述宿主细胞最好在约20℃至约30℃的温度下与所述膜提取组合物接触。
所述宿主细胞最好在约25℃的温度下与所述膜提取组合物接触。
如果所述POI是热稳定POI，则上述温度范围最好更高。
(III)pH
所述宿主细胞最好在约2.0至约11.0的pH下与所述膜提取组合物接触。
所述宿主细胞最好在约5.0至约7.0的pH下与所述膜提取组合物接触。
所述宿主细胞最好在约6.3的pH下与所述膜提取组合物接触。
非常有利的是，在本发明方法之前的发酵法可以在适合于所述宿主细胞的任何pH下进行。本领域众所周知，分泌型POI可能受其胞外生长培养基pH的影响。迄今为止，通常必需将宿主生物的生长培养基的pH维持在约中性pH，因为认为在这样的pH下发酵对于维持分泌型POI的稳定性是必不可少的，即使它们通常增加细菌污染的危险。用本发明的方法，所述POI可以不分泌。因而，宿主生物生长培养基的pH是不相关的，因为胞内pH保持恒定，而与培养基的pH无关。因此，本发明允许宿主生物(例如酵母)在较低pH(例如pH 4.0)下生长，这降低了细菌污染的危险，而不影响或者生物质或者POI的生产。
本发明方法的再一优点是，它可以用来防止所述胞内POI与胞外生长培养基接触。如果所述POI在胞外培养基中不稳定，例如因为对蛋白酶的敏感性，则这是有利的。通过在胞内表达所述蛋白质，然后用本发明的方法提取，避免了与胞外培养基的接触。POI的回收
已经按照本发明的方法提取的胞内POI，可以通过利用本领域技术人员已知的技术进一步处理，以进一步浓缩和纯化所述POI。因此，所提取的胞内POI可以通过以下方法浓缩：例如超滤、通过反相树脂然后用最小体积的溶剂洗脱、沉淀、超滤和冻干。可用来进一步纯化所述POI的技术包括但不限于：利用大小排阻树脂的大小分级分离、高效液相色谱、离子交换色谱和疏水色谱。POI
本文所用的术语“POI”包括但不限于蛋白质、多肽或肽，包括但不限于结构蛋白、酶、细胞因子(例如干扰素和/或白介素)、白介素受体拮抗剂(例如IL-1ra)、抗生素、多克隆抗体或单克隆抗体、或其有效部分例如Fv片段(所述抗体或其部分可以是天然的、合成的或人源化的)、肽类激素、抗原(例如细菌/病毒/原生动物/寄生虫抗原)、肿瘤抗原、受体、配体、调节因子、信号分子、神经递质、凝血因子或任何其它蛋白质，包括但不限于膜结合蛋白和/或膜缔合蛋白。
在本发明的方法中，所述POI在胞内表达，也就是说，它是胞内POI。
所述POI可以通过重组DNA技术采用感兴趣的核苷酸序列(NOI)来产生。NOI
本文所用的术语“NOI”的定义包括合成和天然来源的DNA和RNA，所述DNA或RNA可以含有经修饰或未经修饰的脱氧或双脱氧核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。所述核酸可以作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或RNA/DNA共聚物存在，其中术语“共聚物”是指既含有核糖核苷酸也含有脱氧核糖核苷酸的单一核酸链。所述NOI甚至可以是经密码子优化的，以进一步增加表达。合成的
本文所用的术语“合成的”定义为，它通过体外化学合成或酶合成来产生。它包括但不限于用宿主生物(例如甲基营养酵母毕赤酵母属和汉逊酵母属)的最佳密码子选择制备的NOI。构建体
所述NOI可以与在感兴趣的宿主细胞中有活性的转录和翻译调节元件有效连接。所述NOI也可以编码包含信号序列的融合蛋白，所述信号例如来源于许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)葡糖淀粉酶基因的、酿酒酵母α-因子交配型基因和米曲霉(Aspergllus oryzae)TAKA-淀粉酶的那些信号序列。或者，所述NOI可以编码包含膜结合结构域的融合蛋白。表达载体
可以用表达载体，在宿主生物中以所需水平表达所述NOI。
包含按照本发明的NOI的表达载体，可以是能够在选定宿主生物中表达编码所述NOI的基因的任何载体，载体的选择将取决于待导入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制型载体，即以附加型实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、噬菌体或附加型元件、微型染色体或人工染色体。或者，按照本发明的载体是导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并且与所述染色体一起复制的载体。表达载体的组分
所述表达载体通常包括克隆载体的组分(例如允许所述载体在所选定宿主生物中自主复制的元件)和一个或多个用于选择的表型可检测标记。所述表达载体通常包括编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制核苷酸序列和任选的阻抑蛋白基因或一个或多个激活物基因。另外，所述表达载体可以包含能够将所述POI靶向宿主细胞细胞器(例如过氧化物酶体)或特定宿主细胞区室的氨基酸序列的编码序列。这种打靶序列包括但不限于序列SKL。在本发明正文中，术语“表达信号”包括任何上述控制序列、阻抑蛋白序列或激活物序列。为了在控制序列指导下表达，将编码所述POI的NOI与所述控制序列以适合于表达的方式有效连接。启动子
在所述载体中，编码所述POI的NOI与合适的启动子序列有效组合。所述启动子可以是在所选择的宿主生物中有转录活性的任何DNA序列，并且可以来源于与所述宿主生物同源或异源的基因。细菌启动子
用于指导本发明的经修饰核苷酸序列在细菌宿主中转录的合适启动子的实例包括：大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子和来源于乳球菌(Lactococcus sp.)的启动子，包括P170启动子。当编码本发明POI的基因在细菌种(例如大肠杆菌)中表达时，可以从噬菌体启动子包括T7启动子和噬菌体λ启动子的噬菌体启动子中选择合适的启动子。真菌启动子
关于在真菌种中转录，有用启动子的实例是来源于编码以下酶的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶。酵母启动子
用于在酵母种中表达的合适启动子的实例包括但不限于酿酒酵母的Gal 1和Gal 10启动子以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)AOX1或AOX2启动子。宿主生物
(I)细菌宿主生物
合适的细菌宿主生物的实例是***种，例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、Bacillusalkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；链霉菌属(Streptomyces)种，例如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌种，包括乳球菌(Lactococcusspp.)例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)包括路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌(Leuconostoc spp.)；片球菌(Pediococcus spp.)和链球菌(Streptococcus spp.)。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)包括大肠杆菌或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌种的菌株作为宿主生物。
(II)酵母宿主生物
合适的酵母宿主生物可以选自生物技术相关的酵母种，例如但不限于酵母种如毕赤酵母、汉逊酵母或克鲁维酵母属、Yarrowinia种或酵母属种包括酿酒酵母或属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的种例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的种。
最好是用甲基营养酵母种巴斯德毕赤酵母的菌株作为宿主生物。
所述宿主生物最好是汉逊酵母属菌种。
非常有利的是应用本发明的方法，在发生糖基化之前从真核宿主生物例如酵母中回收胞内POI。分泌型蛋白的过度糖基化是众所周知的问题，尤其是在真核宿主生物例如酵母中。与酵母表达***有关的这一缺点已经导致不愿意使用酵母作为生产***，即使酵母表达载体能够以高表达水平生产蛋白质以及大量的生物质，另外，酵母已经批准用于食品。通过在胞内表达所述POI，然后用本发明的方法提取所述POI，所述POI将是非糖基化的，因为所述POI没有通过发生糖基化的分泌途径。
(III)真菌宿主生物
在丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉属菌种例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。或者，可以使用镰孢属(Fusarium)尖镰孢(Fusariumoxysporum)或根粘菌属(Rhizomucor)菌种例如Rhizomucor miehei用作宿主生物。其它合适的菌株包括嗜热霉属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)菌种。大规模应用
在本发明的一个优选实施方案中，所述POI用于大规模应用。
最好是，在培养所述宿主生物后，所述POI以每升总细胞培养物体积1g至约每升2g的量生产。
最好是，在培养所述宿主生物后，所述POI以每升总细胞培养物体积100mg至约每升900mg的量生产。
最好是，在培养所述宿主生物后，所述POI以每升总细胞培养物体积250mg至约每升500mg的量生产。食品应用
在一个优选实施方案中，应用本发明的方法来释放POI，以用于生产食品，例如饮料。
在另一优选实施方案中，使用本发明的方法来释放POI，以用于制备去垢剂。
在另一优选实施方案中，使用本发明的方法来释放适用于焙烤的POI。
在另一优选实施方案中，使用本发明的方法来释放适用作面团助发酵剂的POI。
在另一优选实施方案中，使用本发明的方法来释放适用于改进面团、面团助发酵组合物和改进的食品的特性的POI(参见WO 96/39851和EP-B-0 833 563)。
在一个优选实施方案中，所释放的POI是一种己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)。HOX酶
己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)(也称为HOX)是一种在氧存在下能够将D-葡萄糖和几种其它还原糖包括麦芽糖、乳糖和纤维二糖氧化为其相应的内酯，并且随后水解为相应的二糖醛酸的酶。因此，HOX不同于另一种氧化还原酶-仅可以转化D-葡萄糖的葡萄糖氧化酶，因为该酶可以利用种类繁多的糖底物。由HOX催化的氧化可以描述如下：
，或
HOX由几种海洋藻类物种天然产生。这类物种尤其是在杉藻科(Gigartinaceae)中发现。本文所用的术语“HOX”是指能够氧化选自D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、麦芽糖、乳糖和纤维二糖的底物的酶。HOX的生产
已经从海藻皱波角叉菜(Chondrus crispus)中克隆了编码所述HOX酶的基因(Stougaard和Hansen 1996，Hansen和Stougaard，1997)。甲基营养酵母多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)(在Rhein Biotech，Dusseldorf/德国作为异源蛋白表达***而开发的)也已经用来生产所述HOX酶(所述天然蛋白从海藻中纯化(Poulsen和H_strup，1998))。WO96/40935和WO 98/13478也公开了在重组宿主生物中克隆和表达编码具有HOX活性的蛋白的基因。
在一个优选实施方案中，所述HOX酶包含SEQ ID No 22中所示的序列。
在一个优选实施方案中，所述HOX酶包含SEQ ID No 22中所示的序列或其变异体、同源物、衍生物或片段。变异体/同源物/衍生物(氨基酸序列)
本发明的优选氨基酸序列示于SEQ ID No 22中，或者是可得自本发明HOX酶的序列，但也包括得自任何来源的同源序列，例如相关的病毒/细菌蛋白、细胞同源物和合成肽以及其变异体或衍生物。
因此，本发明包括本文所示氨基酸序列的变异体、同源物或衍生物以及编码所述氨基酸序列的核苷酸序列的变异体、同源物或衍生物。
在本发明的正文中，同源物序列用来包括在氨基酸水平上与例如本文序列表的SEQ ID No 22所示氨基酸序列至少75％、85％或90％相同、最好是至少95％或98％相同的氨基酸序列。特别是，同源性应该通常根据已知酶活性必需的序列区域来考虑，而不是根据非必需的相邻序列来考虑。这些区域包括但不限于HOX中推定的FAD结合结构域，例如SGGH79C、LGGH146I和LGGH320A。虽然也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本发明正文中，最好是以序列同一性来表述同源性。
同源性比较可以例如借助眼睛来进行，或更通常借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可以计算两个或更多各序列之间的同源性百分率。
同源性百分率可以在连续序列范围内进行计算，即将一个序列与另一序列对齐，并且将一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“没有空位的(ungapped)”比对。通常，这种没有空位的比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
虽然这是一种非常简单而恒定的方法，但它不能考虑例如在其它情况下相同的一对序列中，一个***或缺失将引起随后的氨基酸残基不能对齐，从而当进行全序列比对时，潜在地导致同源性百分率大大降低。因此，大多数的序列比较方法设计产生最佳比对，最佳比对考虑到可能的***和缺失，而对整体同源性分值不会处以过高的罚分。通过在序列比对中***“空位”以尝试使局部同源性最大化，来达到这一点。
然而，这些更为复杂的方法为在序列比对中发生的每个空位指定“空位处罚(gap penality)”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位、反映出两个比较序列之间较高相关性的序列比对将获得比具有许多空位的序列比对有更高的分值。“Affine空位罚分(gap cost)”通常用来对存在一个空位处以相对高的罚分，而对该空位的每个后续残基的罚分较低。这是最常用的空位打分***。不用说，高空位处罚会产生具有较少空位的最佳序列比对。大多数的序列比对程序允许对空位处罚进行修改。然而，当使用这类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用GCGWisconsin Bestilt软件包(参见下文)时，氨基酸序列的默认空位罚分为：一个空位为-12，而每个空位延伸为-4。
因此，最大同源性百分率的计算首先需要考虑空位处罚，产生最佳比对。用于进行这类序列比对的合适计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12：387)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999，出处同上-第18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具程序组。BLAST和FASTA都可用于脱机和在线搜索(参见Ausubel等，1999，出处同上，第7-58至7-60页)。然而，最好是使用GCG Bestilt程序。
虽然可以根据同一性测量最终的同源性百分率，但序列比对过程本身通常不基于全或无成对比较。而是，通常用分等级的相似性分值矩阵，该分值矩阵根据化学相似性或进化距离，为每个成对比较指定分值。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般或者使用公共默认值，或者使用用户符号比较表(如果供应的话)(有关进一步的细节，参见用户手册)。最好使用GCG软件包的公共默认值，或在其它软件的情况下，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，则有可能计算出同源性百分率，最好是序列同一性百分率。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，并且产生数字结果。
与本发明氨基酸序列相关的术语“变异体”或“衍生物”包括在所述序列中的一个(或多个)氨基酸的任何取代、变异、修饰、取代、缺失或添加，条件是所得氨基酸序列具有酶活性，最好具有与序列表的SEQ ID No 22中所示氨基酸序列至少相同的酶活性。
可以对SEQ ID No 22进行修饰，以用于本发明。通常，进行维持所述序列酶活性的修饰。可以进行例如1个、2个或3个至10个或20个取代的氨基酸取代，条件是所述经修饰的序列保留所需的酶活性。氨基酸取代可以包括利用非天然存在的类似物。
本发明的SEQ ID No 22也可以具有产生沉默改变并且产生功能等同的酶的氨基酸残基的缺失、***或取代。可以根据所述残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性，进行有意的氨基酸取代，只要保留所述HOX酶的酶活性即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而不带电极性头基团具有相似亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以例如按照下表，进行保守取代。第二栏同一框中的氨基酸、最好是第三栏同一行中的氨基酸可以相互取代：
脂族 非极性 GAP
ILV
极性-不带电 CSTM
NQ
极性-带电 DE
KR
芳族 HFWY
变异体/同源物/衍生物(核苷酸序列)
技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核苷酸序列可以编码相同的HOX酶。另外，人们会理解，技术人员可以利用常规技术，制备不影响由本发明核苷酸序列编码的HOX酶的核苷酸取代，以反映出在其中待表达本发明HOX酶的任何特定宿主生物的密码子选择。
与本发明的SEQ ID No 22中所示核苷酸序列有关的术语“变异体”、“同源物”或“衍生物”，包括所述序列中一个(或多个)核酸的任何取代、变异、修饰、取代、缺失或添加，条件是所得的核苷酸序列编码具有酶活性的HOX酶，最好是具有与本发明序列表的SEQID No 22中所示核苷酸序列至少相同的活性的HOX酶。
如上所述，就序列同源性而言，优选与本文序列表中所示序列具有至少75％同源性，更优选具有至少85％同源性，更优选具有至少90％同源性。更优选具有至少95％同源性，更优选具有至少98％同源性。核苷酸同源性比较可以如上所述进行。一种优选的序列比较程序是以上所述的GCG Wisconsin Bestilt程序。默认打分矩阵对于每个相同核苷酸的匹配值为10，而每个错配为-9。对于每个核苷酸而言，默认空位产生罚分为-50，而默认空位延伸罚分为-3。
本发明也包括能够选择性地与本文所述序列杂交的核苷酸序列或任何上述序列的任何变异体、片段或衍生物或上述任一序列的互补序列。核苷酸序列最好长至少15个核苷酸，更优选长至少20个、30个、40个或50个核苷酸。杂交
本文所用的术语“杂交”将包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明的能够选择性地与本文所述核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列，在至少20个、优选至少25个或30个、例如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸范围内与本文所述相应的核苷酸序列的同源性一般至少为75％、优选至少为85％或90％，更优选至少为95％或98％。优选的本发明核苷酸序列将包含与SEQ ID No 22中所示核苷酸序列同源的区域，所述同源区域与SEQ ID No 22中所示核苷酸序列的同源性优选至少为80％或90％，更优选至少为95％。
术语“选择性地杂交”是指用作探针的核苷酸序列在发现本发明的靶核苷酸序列与所述探针以显著高于本底的水平杂交的条件下使用。本底杂交的发生可能是由于在例如待筛选的cDNA文库或基因组DNA文库中存在的其它核苷酸序列所致。在这一事件中，本底意味着通过所述探针和所述文库的非特异性DNA成员之间的相互作用而产生的信号水平，其强度比用靶DNA观测到的特异性相互作用的强度的10分之一，最好是100分之一。相互作用的强度可以例如通过用32P对所述探针进行放射性标记来测量。
杂交条件基于所述核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology，第152卷，Academic Press，San Diego CA)中所述，并且提供在下文解释的限定的“严格性”。
最高严格性通常发生在约Tm-5℃(比所述探针Tm低5℃)；高严格性发生在低于Tm约5℃至10℃；中等严格性发生在低于Tm约10℃至20℃；而低严格性发生在低于Tm约20℃至25℃。正如本领域技术人员会理解的，可以用最高严格性杂交来鉴定或检测相同的核苷酸序列，而可以用中等(或低)严格性杂交来鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
在一个优选方面，本发明包括可以在严格条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠pH 7.0))与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。当本发明的核苷酸序列是双链时，则本发明包括或者单独或者组合的所述双链体的两条链。当所述核苷酸序列是单链时，人们会理解，该核苷酸序列的互补序列也包括在本发明的范围内。
可以以多种方式，获得与本发明序列并非100％同源、但属于本发明范围内的核苷酸序列。本文所述序列的其它变异体可以例如通过探测由各种各样来源制备的DNA文库来获得。另外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物、特别是在哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，这类同源物及其片段一般将能够与本文序列表中所示序列选择性地杂交。通过探测由其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，以及在中等严格性至高严格性条件下用包含SEQ ID No 22中所示核苷酸序列的全部或其部分的探针来探测这类文库，可以获得这类序列。相似的考虑适用于获得本发明氨基酸序列和/或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变异体。
也可以利用简并PCR获得变异体和株系/物种同源物，简并PCR所利用的引物设计用以靶向所述变异体和同源物内编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列。通过对来自几种变异体/同源物的氨基酸序列进行序列比对，可以预测保守序列。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。用于简并PCR的引物将含有一个或多个简并位置，并且将在低于用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的严格性条件下使用。
或者，通过对已表征序列例如SEQ ID No 22中所示核苷酸序列进行定点诱变，可以获得这类核苷酸序列。这在例如需要对序列进行沉默密码子改变以对于表达所述核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏好时可能是有用的。为了导入限制性酶识别位点，或为了改变由所述核苷酸序列编码的HOX酶的酶活性，可能需要其它的序列改变。
可以利用本发明的核苷酸序列产生引物(例如PCR引物、用于可变扩增反应的引物)、探针(例如采用放射性或非放射性标记通过常规方法用揭示性标记来标记的探针)，或可以将所述核苷酸序列克隆到载体中。这类引物、探针和其它片段的长度至少为15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，例如至少25个、30个或40个核苷酸，本文所用的术语本发明的核苷酸序列也包括这些引物、探针和其它片段。
按照本发明的核苷酸序列(例如DNA多核苷酸和探针)可以重组产生、合成产生，或通过本领域技术人员可利用的任何方法来产生。也可以通过标准技术将其克隆。
一般而言，通过合成方法产生引物，包括分步制备所需的核酸序列，每次一个核苷酸。采用自动化技术完成这一步的技术是本领域容易获得的。
较长的核苷酸序列一般采用重组方法产生，例如采用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这将包括制备邻接需要克隆的打靶序列中一个区的一对引物(例如约15-30个核苷酸)，使所述引物与mRNA或cDNA接触，在引起扩增所需区的条件下进行聚合酶链式反应(PCR)，分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并且回收所扩增的DNA。可以设计所述引物，以使其含有合适的限制性酶识别位点，使得可以将所扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。
由于遗传密码固有的简并性，可以运用编码基本相同或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，来克隆和表达所述HOX酶。正如本领域技术人员会理解的，可能最好产生具有非天然存在的密码子的编码所述HOX酶的核苷酸序列。可以选择特定原核宿主或真核宿主优选的密码子(Murray E等(1989)Nuc Acids Res 17：477-508)，例如以增加所述HOX酶的表达速率，或产生具有所需特性的重组RNA转录物，所述所需特性例如为半寿期比由天然存在的序列所产生的转录物的半寿期长。筛选
本发明的方法可以用来筛选在突变型宿主细胞生物中水平提高的胞内POI。可以将用于这类筛选的细胞固定于固相支持体或固体基质(例如塑料钉或某些其它表面)上。可以使所述细胞与本发明的膜提取组合物接触，然后可以采用本领域已知的方法测量所释放的POI的水平。高通量筛选(HTS)
本发明的方法可以用于高通量筛选(HTS)***，其中让靶细胞在微量滴定板中生长和并通过机器人***筛选(每天10000个突变体)。作为实例，当制备新重组生产菌株时，一般必需进行一轮或数轮传统的诱变，以提高产率。采用突变型细胞的HTS，可最为有效地完成这一步。
本发明的方法是非常有利的，因为它可供用于高通量筛选(HTS)水平提高的胞内POI。迄今为止，这些***仅能够筛选较高水平的分泌型POI。
实施例小节和附图的介绍
现在仅通过实施例描述本发明，其中参考以下附图：
图1提供一种遗传构建体；
图2A提供一种遗传构建体；
图2B提供照片图象；
图3A和3B提供照片图象；
图4提供一幅曲线图；
图5提供序列表；
图6提供序列表；
图7A-7D提供照片图象；
图8提供一幅图；
图9提供一幅图；
图10A-10B提供照片图象；
图11A-11B提供曲线图；
图12A-12B提供照片图象；
图13A-13B提供照片图象；和
图14A-14B提供照片图象。
略微更详细地说明：
图1提供用于在多形汉逊酵母中生产HOX的表达载体的物理图谱。将带有与任选的信号序列融合的所述合成HOX基因编码区的EcoRI/NotI平端片段，克隆到标准汉逊酵母属表达载体的多克隆位点中。所述表达载体含有用于片段***的多克隆位点分开的甲酸脱氢酶(FMD)基因的启动子和甲醇氧化酶基因的终止子(MOX-T)、用于在大肠杆菌中繁殖和选择的ori和bla(ampR)、用于在多形汉逊酵母中复制的ARS(HARS)序列和用于选择的URA3基因。
图2A显示了1.4kb真正的FMD基因(上图)和FMD启动子与所克隆的异源DNA(下图)的简图。限制性位点是Asp718，NcoI。
图2B显示了整合型HOX基因的基因拷贝数。1-12道显示不同重组分离物及其相应的DNA稀释液。13道显示未转化的宿主菌株，而14道显示大小标记物(M)。
图3A和3B提供了HOX表达的SDS-PAGE分析。图3A提供了对来自诱变菌株DK8-27KanII3-mut25的甘油发酵的培养物滤液的SDS-PAGE分析。1道显示了标记物蛋白，2道显示HOX标准品(0.03U/ml，18ul)，3道显示来自探针3的上清液(18ul)，4道显示来自探针4的上清液(18ul)，5道显示来自探针5的上清液(18ul)，6道显示来自探针6的上清液(18ul)，7道显示来自探针7的上清液(18ul)，8道显示来自探针8的上清液(18ul)，9道显示来自探针9的上清液(18ul)，而10道显示来自探针10的上清液(18ul)。
图3B提供表达HOX的重组菌株的蛋白质印迹分析。用于各道的样品与图3A相同。所述膜用多克隆HOX抗体探测。
图4显示了分泌型菌株DK8-27KanII3-mut25的10升发酵培养物的生长和产率。发酵在25℃和pH 5.0下进行，并且控制甘油和pO2。
图5提供用来合成密码子优化的HOX基因的各种寡核苷酸。
图6提供所述合成HOX基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
图7A-7D显示所述HOX酶在多形汉逊酵母中的定位，通过免疫荧光法测定。显示出所述HOX酶(緑色信号)的位置与核位置(蓝色信号)重叠。参见A)无HOX基因的RB11菌株，B)DK8-27，C)DK8-27mut25，D)DK2II-I。
图8提供一幅图，显示随通过细胞匀浆器的循环数而变化的HOX活性。
图9提供一幅图，显示用不同浓度CTAB和Triton X-100提取的多形汉逊酵母细胞。
图10A显示在CTAB处理之后在细胞上清液(7-10道)和沉淀(2-5道)中HOX酶水平的SDS-PAGE分析。通过机械提取，从沉淀中释放HOX酶。在得自MES的4-12％NuPAGE凝胶上分析所述样品，按以下顺序在每道中加Novex和10μl样品：2-5道：细胞沉淀中残余的HOX；7-10道：在上清液中释放的HOX；1道和6道：Novex See Blue标准品；2道：对照，3道：0.1％CTAB；4道0.2％CTAB；5道：0.4％CTAB；7道：对照；8道：0.1％CTAB；9道：0.2％CTAB，而10道：0.4％CTAB。
图10B显示在CTAB处理之后在细胞上清液(7-10道)和沉淀(2-5道)中HOX酶水平的蛋白质印迹分析。通过机械提取，从沉淀中释放HOX酶。在得自MES的4-12％NuPAGE凝胶上分析所述样品，按以下顺序在每道中加Novex和5μl样品：2-5道：细胞沉淀中残余的HOX；7-10道：在上清液中释放的HOX；1道和6道：Novex See Blue标准品；2道：对照，3道：0.1％CTAB；4道0.2％CTAB；5道：0.4％CTAB；7道：对照；8道：0.1％CTAB；9道：0.2％CTAB，而10道：0.4％CTAB。
图11A显示CTAB提取的HOX的洗脱图。
图11B显示机械提取的HOX的洗脱图。
实施例材料和方法化学药品
所用的所有化学药品都是分析级试剂。卵磷脂(3-sn-磷脂酰胆碱)作为Stern(德国)的Sternpur PM市售。链霉蛋白酶E(专利产品名称，为得自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的各种外肽酶和内肽酶的混合物，实际上能够将任何蛋白质几乎完全水解为游离氨基酸)。溶血卵磷脂(溶血磷脂酰胆碱)、D-葡萄糖、邻联茴香胺、过氧化物酶(P-8125)、癸酸、皂苷(一大类糖苷的任何成员，广泛分布于植物中，是强力表面活性剂)和CTAB(溴化鲸蜡基三甲铵，也称为溴化十六烷基三甲铵)(H-5882)都得自Sigma Chemical Co.，USA。甲醇(HPLC)得自Lab-ScanLtd。过氧化氢和Triton X-100(聚乙氧基化辛基酚的专利产品名称)得自Merck，德国。乳化剂YN在市场上也称为Palsgaard 4445，得自Palsgaard，丹麦。季铵化合物例如LTAB(溴化月桂酰三甲铵)、Cetrimide-40(也称为溴化十六烷基三甲胺，是由主要为CTAB的溴化烷基铵的混合物组成的去垢剂消毒剂)、CTAB(溴化鲸蜡基三甲铵)、STAB(溴化硬脂酰三甲铵)、MTAC(氯化肉豆蔻基三甲铵)、CTAC(氯化鲸蜡基三甲铵)、STAC(氯化硬脂酰三甲铵)都得自FeF，丹麦。Rodalon包含约9.5％(95g/l)氯化烷基二甲基苄基铵(C12H25N(CH3)2C7H7Cl)，得自Superfos Biosector，2950 Vedbaek，丹麦。氯化烷基二甲基苄基铵也称为苯扎氯铵。乳化剂十二烷基乳酸钠(Sodium lauroyl lactylate)(SLL)得自Danisco Cultor，Grindsted，丹麦。酵母发酵
按照Rhein Biotech发酵手册关于10L规模的说明，在6L或100L发酵罐中进行酵母培养。实施例1合成的密码子优化的HOX基因的装配基因设计
改变天然HOX基因的核苷酸序列，产生合成基因。设计所述合成HOX基因(图6)，使得密码子选择准确地与生物技术相关的酵母(例如毕赤酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母、Yarrowinia、粟酒裂殖酵母)已知的密码子偏好匹配，以便促进在这些生物中的高水平生产。将所述基因分为三个分开装配和/或克隆的片段。称为 5’近端一半的亚组件由以下图5中所示的作为互补对的寡核苷酸组成：HOX1a/HOX2b、HOX3a/HOX4b、HOX5a/HOX6b、HOX7a/HOX8b、HOX9a/HOX10b)；3’远端一半A使用引物1-6，而 3’远端一半B使用引物6-10。5’近端合成HOX基因
所述合成HOX基因的5’近端一半采用10种寡核苷酸HOX1A至HOX10B合成。在100μl热起始PCR反应(采用热稳定DNA聚合酶Pwo(Boehfinger))中，使用长度范围为100-120碱基对的寡核苷酸作为引物(浓度分别＝0.1μM)。热起始通过将寡核苷酸、缓冲液、MgSO4的混合物加热至90℃来进行，然后加入dNTP(250μM)和Pwo聚合酶(2.5单位)。采用以下PCR分布型进行40个循环的PCR：94℃30秒、57℃1分钟和72℃1分钟。在所述40个循环结束时，包括一个72℃10分钟的延伸步骤。在琼脂糖凝胶电泳中分析得自这种PCR的产物，显示出大小范围为100-850碱基对的DNA成片条带。用2ul来自上述反应的产物作为模板，采用侧翼引物(各1μM)HOX1A和HOX10B，再扩增第一次的PCR产物。反应物含有200μM dNTP、2.5mM MgCl2和2单位AmpliTaq_(Perkin-Elmer Cetus)。所述PCR条件是：94℃2分钟，然后用以下PCR分布型进行30个循环：94℃30秒、60℃1分钟和72℃45秒。在上述反应结束时，包括一个72℃10分钟的延伸步骤。通过琼脂糖凝胶电泳分析第二次PCR产物，显示出存在一个850bpDNA条带，随后从凝胶中纯化该条带，将其克隆到载体pCR_(Invitrogen)中。3’远端合成HOX基因
设计长度范围为90-126碱基对的10种引物，来合成所述HOX基因的远端部分。所述引物含有16-21碱基对的重叠(互补)区，其计算的解链温度约为60℃。所述HOX基因的远端部分作为两个片段(A和B)合成，每个片段的大小为530碱基对。一次使用6种引物进行两个PCR反应。PCR反应1含有引物1-6，而PCR反应2含有引物5-10。在100μl的反应体积中，用每种引物0.1μM、每种dNTP 250μM、2mM MgSO4和2.5单位得自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu DNA聚合酶(Strategene)进行PCR扩增反应。使用Pfu DNA聚合酶的2个PCR反应的循环参数包括：95℃变性1分钟，然后进行30个PCR循环：94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟。后接一个72℃3分钟的延伸步骤。通过琼脂糖凝胶电泳分析得自这两个PCR反应的PCR产物，在两种情况下显示出合成一条正确大小为长约530bp的特定DNA的条带。将所述PCR产物克隆到pCR_-Blunt载体(Invitrogen)中。用邻接所述多克隆位点的引物(M13反向引物和T7启动子引物)，对所克隆的部分合成HOX基因测序。测序结果证实，所合成的部分基因含有所述正确的序列。
最终密码子优化的HOX基因的装配
通过连接经凝胶纯化的用SpeI/NotI切割的由NcoI/PvuII 5’近端HOX、3’远端PvuII/SpeI HOX片段A和片段B组成的DNA片段，联合所述合成HOX基因的三个部分。将完整的密码子优化的合成HOX基因(图6)装配到汉逊酵母表达载体中，所述表达载体开发用来介导汉逊酵母表达和分泌外源蛋白。所述表达载体基于甲酸脱氢酶启动子(FMD)、MOX终止子、具有和没有酵母分泌信号。结果1重组HOX在多形汉逊酵母中的表达
表1显示了作为Eco RI/Not I平端片段***多形汉逊酵母表达/整合载体的多克隆位点中的各种HOX/分泌融合构建体。所述不同的信号序列来源于许旺酵母的葡糖淀粉酶基因、酿酒酵母的α-因子交配型基因和米曲霉的TAKA淀粉酶。也将无信号序列的NcoI/NotI HOX构建体克隆到该载体中。
 克隆名称 信号序列 HOX 融合接点
 1.DK 1 葡糖淀粉酶 野生型合成的 SAIQA  MATLP
 2.DK 2 葡糖淀粉酶 野生型合成的 SAIQA  ATLP
 3.DK 3 α-因子 野生型合成的 KREAEA MATLP
 4.DK 4 α-因子 野生型合成的 KREAEA ATLP
 5.DK 5 α-因子 突变型合成的 KREAEA MATLP
 6.DK 6 α-因子 突变型合成的 KR     MATLP
 7.DK 7 TAKA淀粉酶 突变型合成的 APALA  MATLP
 8.DK 8 无信号序列 野生型合成的 无-    MATLP
术语突变型合成的是指推定的KEX 2蛋白酶切割位点R331-K332至(to)R331-P332。实施例2转化和传代
用所述不同的HOX表达质粒将尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌株RB11转化为尿苷原养型。带有所述不同表达质粒的HOX转化体在选择性条件下培养30代，以扩增所述质粒DNA，并让其整合到基因组中。让转化体在完全非选择性培养基上生长20代。除所述选择之外，应用PCR和DNA印迹分析来鉴定所述转化体。所整合的异源DNA拷贝数的测定
用限制性酶Asp718/NcoI消化未转化的宿主菌株和特定HOX构建体的各种重组分离物的基因组DNA。经限制的DNA在0.8％琼脂糖凝胶上分离，将其转移到膜(硝化纤维素)并与32P标记的克隆FMD启动子片段杂交。杂交模式显示出两个信号，一个是真正的单拷贝1.4kbFMD基因，而一个源于略小的异源融合体。一系列的稀释使得可以估计与原有单拷贝对照相比的所整合DNA的信号强度。结果2HOX表达的筛选
让转化体在3ml试管培养物中生长，然后通过补充具有1％甘油的培养基，在去阻抑条件下培养。通过对来自甘油发酵的培养物的SDS-PAGE分析，分析HOX的表达。应用多克隆HOX抗体的蛋白质印迹分析，用来检测HOX蛋白的存在。表2.表达HOX的选定转化体的特征
转化体 拷贝数 N末端 表达的定位 HOX活性
DK1-49 ≈10 未经加工的信号肽 可溶性和不溶性部分 无
DK2II-1 ≈20 未经加工的信号肽 可溶性和不溶性部分 无
D3II-4 ≈20 未经加工的信号肽 可溶性和不溶性部分 无
DK4-39 ≈10 未经加工的信号肽 可溶性和不溶性部分 无
DK5-13 ≈30-40 未经加工的信号肽 可溶性和不溶性部分 无
DK6-16 ≈10 未经加工的信号肽 可溶性和不溶性部分 无
DK7-1 ≈10 未经加工的信号肽 可溶性和不溶性部分 无
DK8-1 ≈2-3 与成熟的相同 可溶性和不溶性部分 活性
DK8-27 ≈20 与成熟的相同 可溶性和不溶性部分 活性
DK8-27*Kan    II3-mut25 ≈20 与成熟的相同 胞外胞内 活性活性
DK8-27Kan*IV2-mut301 ≈20 与成熟的相同 胞外胞内 活性活性
*菌株DK8-27经过化学诱变(NTG-亚硝基胍)。实施例3重组HOX在多形汉逊酵母中的定位
为了对重组多形汉逊酵母进行免疫荧光显微镜检查，将细胞在酵母含氮碱(YNB)+葡萄糖中预先培养至108细胞/ml的密度。为了诱导表达，将3×108细胞转移到100ml补充YNB+1％甘油的摇瓶培养物中。在去阻抑条件下生长1、2或3天后，通过联合低聚甲醛(4％)和戊二醛(0.2％)处理，将5×108细胞固定(Hagen和Hyam，1988)。用1mlPEM(100mM Pipes，1mM EGTA，1mM MgSO4，pH 6.9)洗涤3次后，在补充0.5mg/ml酶解酶(Zymolyase)-100T的PEMS(PEM+1M山梨醇)中部分除去细胞壁。消化约60分钟后，将细胞转移到PEMS+0.1％Triton X-100中，孵育30秒，然后用0.5ml PEM洗涤3次。为了猝灭未反应的戊二醛，将细胞重悬于PEM+1mg/ml硼氢化钠中。此后立即将细胞在PEM中洗涤2次，重悬于PEMBAL(PEM+1％BSA(无球蛋白)、1mM盐酸赖氨酸、0.1％NaN3)中，在旋转轮上孵育30分钟。在相当于108细胞的25％的所述细胞悬浮液中补充10μg/ml亲和纯化的多克隆抗HOX抗体，并于室温孵育过夜。在0.5ml PEMBAL中洗涤3次后，将细胞悬浮于PEMBAL中，与0.5％FITC缀合的山羊抗兔抗体(Sigma)一起避光孵育5-20小时。在PEMBAL中洗涤后，细胞在PBS中洗涤1次，在PBS+0.2μg/ml二酰氨基苯基吲哚(diamidinophenylindole)(DAPI)中洗涤1次，最后悬浮于PBS+0.1％NaN3中。为了进行显微镜观测，将细胞悬浮液的小样品在聚L-赖氨酸包被的盖玻片上干燥，倒置到含有1mg/ml对苯二胺的100％甘油小滴中。用配备有间接免疫荧光的1.000 X Zeiss显微镜检查细胞，通过CCD照相机(MicroMAX Kodak)捕获图象，并用MetaMorph软件进行加工。结果3
对DK8-27转化体的免疫荧光显微镜检查表明，重组HOX蛋白主要作为聚集体定位于细胞外周(图7b)。综合生物化学数据，这些结果表明，HOX在一定程度上可能是膜缔合蛋白(与基本上膜结合的蛋白相反)。最有可能是，HOX定位于多形汉逊酵母的质膜。此外，在衍生于DK8-27的DK8-27 mut25菌株中，HOX与质膜缔合(图7c)。然而，所述蛋白不以聚集体积累，而是分布更为均一。当与各种前导肽融合时，HOX以巨大的胞内聚集体积累(图7d)。实施例4利用不同的去垢剂和蛋白酶从重组汉逊酵母属细胞提取HOX
通过在15ml离心管中应用5.0ml细胞悬浮液(细胞+上清液)(HOX9926-7，317g细胞/L湿重，0.3U/ml胞外HOX活性)，进行所述实验。通过以4000g离心10分钟，分离细胞。对于透化实验，然后为上清液补充CTAB、CTAB+链霉蛋白酶E、链霉蛋白酶E、Tween 20(聚氧乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯的专利产品名称)和Tween 80(脱水山梨醇一油酸酯的专利产品名称)。然后将细胞重悬于4.0ml上清液中，于25℃(500rpm)孵育23小时。为了检查用CTAB的时间效应，将所述离心管中之一的细胞在4ml 0.4％CTAB中于25℃仅孵育7分钟。然后经离心分离细胞。然后将细胞再次重悬于原始上清液中，不加入CTAB，然后如上所述孵育23小时。孵育后，通过所述HOX测定，测量无细胞提取物中的胞外HOX。用于测定HOX活性的测定方法(HOX测定)
通过Sullivan和Ikawa的分析(1973)，估计HOX活性。该测定按比例缩小，以在微量滴定板中进行。原理
所述HOX测定基于对在葡萄糖氧化中产生的过氧化氢的测量。过氧化氢在过氧化物酶(POD)存在下氧化邻联茴香胺，形成染料。 试剂
1.100mM磷酸缓冲液，pH 6.3
2.含100mM D-葡萄糖的100mM磷酸缓冲液，pH 6.3
3.邻联茴香胺，3.0mg/ml，在蒸馏水中
4.过氧化物酶，0.10mg/ml，在100mM磷酸缓冲液pH 6.3中测定
120μl试剂1
150μl试剂2
10μl试剂3
10μl试剂4和  10μl酶溶液(以合适的稀释度)
该测定在微量滴定板中进行。通过加入酶溶液起始反应。将混合物于25℃振摇孵育10分钟。空白实验含有所有组分，而用水取代酶溶液。在微量滴定板读出仪中于405nm测量所述染料的生成。应用微量滴定板读出仪上的动力学程序，检查所述反应的线性。过氧化氢标准曲线
运用不同浓度的新鲜H2O2，制作过氧化氢标准曲线。
一个酶活性单位定义为于25℃下每分钟产生1μmol H2O2的酶量。结果4
表3中所示的数据表明，CTAB在提取HOX中非常有效。CTAB也比Tween 20和Tween 80有效得多。加入蛋白酶没有明显的益处。非常有趣的是，CTAB甚至仅用于7分钟预先孵育时，也发挥出其积极效应，这表明CTAB非常快地与汉逊酵母属细胞壁结合并使其透化。这一点得到无细胞上清液的CTAB分析(参见下文)的支持，所述分析表明，在所加入的4000ppm CTAB中，仅50-100ppm存在于无细胞上清液中。
对于每种试验试剂的离心管中沉降的比较，也表明经CTAB处理的细胞的堆积细胞体积比对照细胞或用非CTAB的去垢剂处理的细胞的所述体积要小。细胞的这种收缩表明，细胞实际上已经被透化，并且排出其某些可溶性内容物。表3去垢剂、与蛋白酶组合的去垢剂和预孵育对胞内HOX提取的影响试验                                        HOX活性，％对照                                        1000.4％CTAB                                   46000.4％CTAB+链霉蛋白酶E(400PU)                50000.4％CTAB+链霉蛋白酶E(800PU)                4800链霉蛋白酶E(400PU)                          1200.4％Tween 20                               1400.4％Tween 80                               140在0.4％CTAB中预孵育7分钟                    5100实施例5采用CTAB和苯扎氯铵(BAC)提取HOX
在15ml离心管中用5.0ml细胞悬浮液(细胞+上清液)(HOX9959，Mut 45)进行试验。然后向细胞悬浮液中补充CTAB(得自10％CTAB储备液)或苯扎氯铵(Rodalon，9.5％苯扎氯铵)，于25℃(200rpm)孵育22小时。孵育后，通过HOX测定，测量胞外HOX(通过以4000g离心10分钟除去细胞)。结果5
表4所示的数据表明，苯扎氯铵(BAC)在从所述细胞释放HOX酶方面非常有效。表4CTAB和苯扎氯铵(BAC)对从细胞释放HOX的影响试验                          HOX活性，％对照                          1000.4％CTAB                     13000.08％BAC                     25000.17％BAC                     23000.50％BAC                     23000.70％BAC                     21000.83％BAC                     17001.00％BAC                     1600实施例6通过CTAB与盐组合在不同温度提取HOX
为了检查CTAB作用的机制，将CTAB与离液盐和非离液盐组合。将5ml细胞悬浮液(细胞+上清液)加入15ml离心管中(HOX9926-7，317g细胞/升湿重，0.3U/ml胞外HOX活性)。通过以4000g离心10分钟，分离细胞。然后为上清液补充CTAB、CTAB+NaCl、CTAB+尿素、CTAB+硫酸铵或非离子去垢剂辛基葡糖苷。然后将细胞重悬于4.0ml上清液中，于25℃(500rpm)孵育26小时。在该实验中，也研究振摇和温度的效应。孵育后，采用实施例4中概述的HOX测定，用无细胞提取物来估计HOX活性。结果6
结果示于表5中。显然，为了在CTAB存在下提取HOX，振摇不是必需的。有明显的温度效应，这意味着于4℃提取所获得的活性仅为于25℃提取时活性的一半。加入氯化钠和硫酸铵，都降低了CTAB处理的效应，这可能表明CTAB的离子性质是重要的。加入尿素的效应不太显著，但仍将所提取的HOX量减少至用0.4％CTAB所提取量的大约一半。虽然尿素是非离子的，但它可能干扰疏水性相互作用。在现有技术中，已经报道尿素作为使毕赤酵母属细胞透化来提取亲脂蛋白的手段(Craig 1987)。非离子去垢剂辛基葡糖苷没有显著的提取效应。表5去垢剂、去垢剂与盐、振摇和温度的组合对胞内HOX提取的影响试验                                       HOX活性，％对照                                       1000.4％CTAB                                  67000.4％CTAB，无振摇                          77000.4％CTAB，无振摇，4℃                     28000.4％CTAB+1.0MNaCl                         19000.4％CTAB+1.0M尿素                         36000.4％CTAB+1.0M硫酸铵                       23000.2％辛基葡糖苷                            1300.4％辛基葡糖苷                            190实施例7在含HOX的细胞提取物中通过LC-ESI-MS测定CTAB和LTAB
在包含以下装置的Hewlett-Packard 1100 HPLC-MS***上，通过LC-ESI-MS分析得自实施例5的提取的HOX样品的CTAB含量：
a)双梯度泵，HP1100
b)自动取样器，HP1100，
c)恒温柱室，HP1100
d)质量选择性检测器，HP1100
e)色谱数据***，HP ChemStation，Version 6.01该***配有Zorbax Eclipse_XDB-C8，5μM，150×4.6mM内径(Hewlett-Packard)柱。柱温为25℃。
色谱条件为由两种溶剂组成的流动相。溶剂A：1mM NH4OAc/水，溶剂B：1mM NH4OAc/甲醇。用等度条件(也就是说，使用在色谱分离期间洗脱液的组成保持恒定的条件)：5％A+95％B，来洗脱柱，溶剂流速为0.80ml/min，注射体积为10μl。将样品直接注射。
质谱条件按照以下喷雾室设置：
    电离方式：以阳离子方式进行电喷雾
    干燥气体(N2)温度：350℃
    干燥气体流速：6.01/min
    雾化器压力：60psi
    毛细管电压：～4000伏
    裂分器(fragmentor)电压：100伏
检测器设置如下：SIM参数：m/z 284.1(十六烷基三甲铵阳离子)。含有500μg CTAB/ml水的储备液(浓度指数1000)用水稀释，以获得具有以下浓度指数的标准溶液：300-100-30-10。向样品中加入0.4％CTAB，如果所有的CTAB都存在于提取物中，则这将产生4000μg/ml。
通过采用不同的柱，并且通过采用不同的流动相，对用于季铵化合物的分析方法进行优化。向两个90L规模的发酵物(Vest0002b，生物质浓度为314g/L湿细胞；和Vest0003b，生物质浓度为332g/L湿细胞)加入LTAB，至浓度为0.20％(w/v)，提取HOX达24小时。将得自每个发酵物的样品以10000g离心10分钟，取出所得的上清液用于LTAB分析。使用以下方法，通过在包含以下装置的Hewlett-Packard1100 HPLC-MS***上，通过LC-ESI-MS定量测定上清液中的LTAB含量：
a)双梯度泵，HP1100
b)自动取样器，HP1100，
c)恒温柱室，HP1100
d)质量选择性检测器，HP1100
e)色谱数据***，HP ChemStation，Version 6.01该***配有PLRP-S，100_，5μm，250×4.6mM内径(PolymerLaboratories)柱。柱温为25℃。
色谱条件为由0.1％七氟丁酸的甲醇溶液组成的流动相。以溶剂流速1.00ml/min和注射体积5μl，来洗脱柱。样品用甲醇稀释25倍，并且通过Gelman GHP Acrodisc 13mM Minispike 0.45μM过滤，然后注射。
质谱条件按照以下喷雾室设置：
    电离方式：以阳离子方式进行电喷雾
    干燥气体(N2)温度：350℃
    干燥气体流速：13.0L/min
    雾化器压力：60psi
    毛细管电压：-4000伏
    裂分器电压：150伏
检测器设置如下：SIM参数：m/z 228.1(月桂酰三甲铵阳离子)。含有250μg LTAB/ml甲醇的储备液(浓度指数1000)用甲醇稀释，以获得具有以下浓度指数的标准溶液：400-200-120-80-36-10.8-5.4-2.16-0.864。结果7
从表6中可明显看出，含有HOX酶的细胞提取物中CTAB的水平比加入细胞中的量低得多。这可解释为CTAB与酵母细胞壁结合并因而固定化于酵母细胞壁上。这意味着，所得到的HOX酶仅含有非常低水平的CTAB。表6来自实施例6的提取的HOX上清液中的CTAB含量试验                         1CTAB浓度，μg/ml对照，不加入CTAB                     210.4％CTAB                            1150.4％CTAB，无振摇                    520.4％CTAB，无振摇，4℃               350.4％CTAB+1.0MNaCl                   2120.4％CTAB+1.0M尿素                   2350.4％CTAB+1.0M硫酸铵                 2461采用第一种方法分析
所获得的上清液中LTAB的结果(参见表6a)表明，所加入的LTAB中仅约27％在无细胞部分中发现。这一结果显示出与表6中用CTAB获得的结果相同的倾向。表6a从得自实施例6的发酵物Vest0002b和Vest0003b中提取的上清液中LTAB的含量
发酵物      所加入的LTAB[μg/ml]   1无细胞提取物中的LTAB[μg/ml]
Vest0002b   2000                    538Vest0003b   2000                    550
1通过所述优化方法分析实施例8温度对CTAB提取HOX的时间末端效率(time end efficiency)的影响
对汉逊酵母属样品：Mut 45，HOX9949，282g/L，2.6U/ml，检查温度对CTAB提取HOX的时间末端效率的影响。
向离心管中的5ml发酵物(细胞+上清液)中加入0.2％或0.4％CTAB(得自10％CTAB溶液)。将试管分别于25℃、30℃、35℃和40℃下孵育(200rpm)。在指定的时间，取出样品，在以10000g离心5分钟后，分析上清液中的HOX活性。结果示于表7。表7在不同温度下从多形汉逊酵母提取HOX的时间进程
 提取条件            所提取的HOX[U/ml]
25℃，0.2％CTAB25℃，0.4％CTAB30℃，0.2％CTAB30℃，0.4％CTAB35℃，0.2％CTAB35℃，0.4％CTAB40℃，0.2％CTAB40℃，0.4％CTAB     4h     8h     24h   31h   48h
    5.1    7.5    31    36    445.9    9.2    25    29    376.8    15     38    45    447.4    15     36    40    426.4    16     36    44    418.2    15     33    37    2316     27     44    43    3217     28     56    59    40
结果8
显然，CTAB提取依赖于温度，并且采用较高的温度可以达到较快的提取。然而，这是必须与所提取蛋白稳定性一起权衡的一个参数。在该实验中，看来在采用0.2％或0.4％CTAB之间没有显著差异。然而，这取决于特定实验的细胞浓度。实施例9用不同的季铵化合物提取HOX
在从多形汉逊酵母中提取胞内HOX酶方面，测试几种季铵化合物。从6L规模的发酵物中取出发酵肉汤样品，在所述发酵物中生物质浓度约为340g湿重/L。将1ml的表8中的每种季铵化合物的4％(w/v)溶液加入到塑料管中的9ml发酵肉汤中。于25℃、200RPM孵育24小时后，将所述塑料管以12000g离心10分钟。用前述的HOX测定，分析上清液中的HOX活性。
用CTAB、LTAB和CTAC研究HOX提取的时间进程。从发酵罐中取出含有280g湿重多形汉逊酵母/L的发酵样品。向装有9ml发酵肉汤的塑料管中加入4％(w/v)的CTAB、LTAB和CTAC溶液，至终浓度为0.2％或0.4％(w/v)。于25℃、200RPM孵育0小时、7小时、17小时、24小时和48小时后，将塑料管以12000g离心10分钟。采用前述的HOX测定，分析上清液中的HOX活性。
用在胞内产生HOX的巴斯德毕赤酵母菌株#349，测试LTAB的提取效应。从6L规模的发酵物中取出发酵肉汤样品，在所述发酵物中生物质浓度约为232g湿重/L。将9ml发酵肉汤与0(对照)或180μl10％(w/v)LTAB溶液一起加入到塑料管中。于30℃、20 RPM孵育24小时后，将所述塑料管以9000g离心5分钟。用前述的HOX测定，分析上清液中的HOX活性。结果9
用所有所测试的季铵化合物(参见表8)，当所述季铵化合物以0.4％(w/v)的终浓度加入到发酵样品中时，都可以提取出HOX。于25℃孵育24小时后，就HOX的提取而言，LTAB优于所测试的其它化合物。HOX的提取量看来随季铵化合物的链长度的增加而降低。
用CTAB、LTAB或CTAC提取HOX的时间进程示于表9中。显然，孵育时间和提取试剂的浓度均影响所提取的HOX活性的量。发现LTAB是所分析的所有孵育时间都是最佳的提取试剂，这与表8所示的结果一致。用LTAB提取HOX，看来在0.2％(w/v)LTAB浓度下进行的速度比在0.4％(w/v)LTAB浓度下要慢。就HOX酶的提取而言，使用0.2％或0.4％(w/v)CTAB之间看来差异很小。表8用各种季铵化合物从多形汉逊酵母提取HOX商标名          a链中的   相反离子   根据用LTAB   b标准偏差
             亚甲基               的提取量归一
                                  化的所提取的
                                  HOX活性LTAB             11        溴离子     100           7Cetrimide-40     13        溴离子     62            6Cetrimide-40     13        溴离子     65            1溶于丁醇CTAB             15        溴离子     53            10STAB             17        溴离子     38            11MTAC             13        氯离子     71            2CTAC             15        氯离子     67            7STAC             17        氯离子     54            10巴斯德毕赤酵母   11        溴离子     3000c        未测定LTAB巴斯德毕赤酵母   -         溴离子     100c         未测定对照在加入提取试剂之前，发酵肉汤中的胞外HOX水平约为用LTAB 24小时后提取的HOX活性的9％。a所述化合物具有的全部结构：CH3-(CH2)n-N(CH3)+ 3与作为相反离子的氯离子或溴离子。b所有的实验均以复份样品进行。c得自巴斯德毕赤酵母的结果根据在没有加入任何LTAB的对照管中所提取的HOX进行归一化。在开始提取之前发酵物中的胞外HOX水平为对照(即没有加入任何LTAB的塑料管)中提取水平的约24％。表9用CTAB、LTAB和CTAC提取HOX酶的时间进程
               0.4％(w/v)                    0.2％(w/v)时间[h]  CTAB        LTAB          CTAC         CTAB     LTAB0        3±1，n＝3  6±1，n＝3    4±1，n＝3   2        57        9           25            8            8        1517       28          74            27           38       4924       36±5，n＝3 83±8，n＝3   38±6，n＝3  43       6548       65±8，n＝3 100±25，n＝3 64±20，n＝3 65       78
在加入提取试剂之前发酵肉汤中的胞外HOX水平为用0.4％(w/v)LTAB提取48小时后的HOX活性的约4％。数值以±1标准偏差给出。N：实验次数。
所有的数值都用0.4％(w/v)LTAB 48小时后的提取水平来归一化。实施例10CTAB和用于提取HOX的其它乳化剂之间的比较
已知溶血卵磷脂(溶血磷脂酰胆碱)可以至少使哺乳动物细胞透化，选择性地释放大分子。为了测试溶血卵磷脂和许多其它乳化剂和短链脂肪酸的效应，检查其提取HOX的能力并将其与CTAB比较。
将5ml细胞悬浮液(细胞+上清液)加入到15ml离心管中(HOX9910B，305g细胞/升湿重，1.6U/ml胞外HOX活性)。通过以4000g离心10分钟，分离细胞。然后将细胞重悬于补充CTAB、乳化剂SLL、YN、癸酸、溶血卵磷脂或卵磷脂的4.0ml 25mM柠檬酸pH 6.3中。然后将细胞于25℃(500rpm)孵育20小时。结果10
孵育之后，通过HOX测定，测量无细胞提取物中的HOX活性水平。表10中所示的数据表明，所测试的CTAB以外的乳化剂仅能够释放非常低水平的活性酶。结果也表明，CTAB能够活化上清液中的潜在酶，可能是由于从膜结合片段中释放出所述酶。表10去垢剂、乳化剂和磷脂对HOX提取的影响试验                        HOX活性，％对照(细胞和缓冲液)          1000.4％CTAB                   11000.5％乳化剂SLL              1601.0％乳化剂SLL              1400.5％乳化剂YN               1301.0％乳化剂YN               1300.5％癸酸                   1201.0％癸酸                   1400.4％溶血卵磷脂             2600.4％卵磷脂                 140对照(细胞+上清液)           170细胞+上清液+0.4％CTAB       1900实施例11CTAB和皂苷之间在提取HOX方面的比较
为了确立皂苷是否像毛地黄皂苷一样起作用，检查了皂苷对从汉逊酵母属提取HOX酶的影响。
在15ml离心管中用5.0ml细胞悬浮液(细胞+上清液)进行该实验(HOX190799，340g细胞/升湿重，0.5U/ml胞外HOX活性)。通过以4000g离心10分钟，分离细胞。然后将细胞重悬于补充CTAB或皂苷的4.0ml上清液中，或者重悬于补充CTAB或皂苷4.0ml 25mM柠檬酸pH6.3中。
为了证实在无细胞提取物(在用CTAB处理之后)测量的HOX活性真正是提取的结果，而不仅仅是上清液HOX活化的结果(这可能是HOX已经存在于上清液中，但却无活性)，也将所述无细胞上清液(在补充CTAB或皂苷之后)孵育，并分析HOX活性。将离心管于25℃(500rpm)孵育19小时。孵育之后，通过HOX测定，测量无细胞提取物中的胞外HOX。结果11
表11中的结果表明，皂苷从细胞中提取HOX的能力可忽略不计。另外，没有显示出皂苷或CTAB活化HOX。表11采用不同的透化剂的比较性HOX提取/活化试验                           HOX活性，％对照0(细胞+上清液)             1000.2％CTAB(细胞+上清液)         12000.4％CTAB(细胞+上清液)         31000.2％皂苷(细胞+上清液)         1500.4％皂苷(细胞+上清液)         1400.8％皂苷(细胞+上清液)         140对照1(细胞+缓冲液)             1000.2％CTAB(细胞+缓冲液)         31000.4％CTAB(细胞+缓冲液)         77000.2％皂苷(细胞+缓冲液)         2300.4％皂苷(细胞+缓冲液)         2300.8％皂苷(细胞+缓冲液)         230上清液+0.2％CTAB               80上清液+0.4％CTAB               80上清液+0.2％皂苷               80上清液+0.4％皂苷               80上清液+0.8％皂苷               80实施例12在100L发酵罐中CTAB提取HOX
在发酵(FermID Vest9910b)120小时之后，将CTAB溶液(360gCTAB溶于3.6L 40℃的水中)通过100L发酵罐的入口端直接加入肉汤中。发酵肉汤中CTAB的终浓度约为4g/L，因为发酵罐的有效体积约为90L。同时，停止搅拌、通气、pH控制和加料。温度控制到25℃，CTAB处理22小时之后，肉汤的HOX含量已经从1.6U/ml提高至30U/ml。实施例13HOX生产多形汉逊酵母的实验室规模匀浆
为了测试由于CTAB处理所致的HOX提取效率，通过运用细胞破碎装置“Z Plus”2.2kW(Constant Systems Ltd，UK)，破碎来自两个不同发酵试验的细胞。用单塞泵(one shot pump)压头以不同的压力破碎细胞(5ml)。打开后，通过离心(10,000g 5分钟)从上清液中分离细胞碎片，如前所述，用HOX测定测量无细胞上清液中的胞内HOX水平。也用0.2％CTAB处理(25℃，500rpm，20h)同样的细胞，将无细胞提取物用作相当的物质。结果13
表12中所示的数据表明，通过用0.2％CTAB处理提取胞内HOX的总量。表12CTAB处理的效率试验                    压力[巴]             HOX活性[U/ml]HOX9931-8               1500                 14.1HOX9931-8               2000                 16.3HOX9931-8               2200                 16.4HOX9931-8               2500                 16.2HOX9931-8               2600                 16.7HOX9931-8               2700                 15.7HOX9931-8+0.2％CTAB*   -                    18.6HOX9934-8               2700                 8.9HOX9934-8+0.2％CTAB*   -                    7.3*细胞于25℃孵育48小时实施例14HOX生产多形汉逊酵母的大规模匀浆
在APV Gaulin 30CD型高压匀浆器中，将10L发酵肉汤(FermIDVest9907b)匀浆。匀浆器以最大流速(100L/min)和1000巴的压力操作。在匀浆步骤期间，用冰水冷却肉汤，产物的温度从不超过20℃。在前三个循环期间观测到HOX活性快速提高，然后在5-7个循环之后几乎为稳定的水平。结果14
结果示于表13和图8中。表13从多形汉逊酵母中机械提取HOX循环编号          HOX活性[U/ml]0                 0.861                 5.62                 6.43                 6.64                 6.65                 6.76                 6.97                 6.7实施例15Triton X-100对从多形汉逊酵母中提取HOX的影响
将CTAB或Triton X-100加入到离心管内的5ml发酵物(样品HOX9954，Mut 45，18.10.99，HVP)中。将水加入到对照中。将样品于25℃、200rpm孵育22小时。孵育后，将样品离心，如前所述分析上清液中的HOX活性。结果15
结果示于表14和图9中。已经用非离子去垢剂Triton X-100使酵母细胞透化(参见Naglak等1990和美国专利第5124256)，但从该实验中明显看出，Triton X-100没有提取效应，与CTAB相反，在现有技术中没有描述过CTAB能够提取胞内酶例如HOX酶，虽然已经描述过使细胞透化。表14与Triton X-100相比用CTAB提取HOX试验                     HOX活性，％0.2％CTAB                14.50.4％CTAB                20.50.1％Triton X-100        1.50.2％Triton X-100        1.60.4％Triton X-100        1.80.6％Triton X-100        1.91.0％Triton X-100        1.9对照，发酵物             1.2实施例16蛋白质印迹
用蛋白质印迹法，通过分析HOX酶的残留(沉淀)量和释放(上清液)量，测试HOX分泌的效率。分别用0、0.1％、0.2％和0.4％CTAB处理细胞20小时。孵育之后，通过以4000g离心10分钟来分离细胞。所得上清液的SDS-PAGE(4-12％Mes NuPage)示于图10A的7-10道。沉淀用缓冲液洗涤2次，然后重悬于缓冲液中，在FastPrep细胞破碎机上破碎。将沉淀提取物也上样至SDS-PAGE(参见图10A的2-5道)，按照生产商的说明(Novex，San Diego，US)使用预制Novex凝胶。按照生产商的说明(Novex，San Diego，US)，将SDS-Page凝胶吸印至硝化纤维素膜上。将印迹与针对所述HOX酶产生的抗体(兔抗血清#4364BI/OCH 190797)一起温育，所述抗体的制备在下文中描述。HOX特异性抗体的产生
在大肠杆菌中，由WO 96/40935中所述的表达质粒PUPO181产生重组HOX酶。通过SDS-PAGE分析表达重组HOX的大肠杆菌细胞的粗提物。将对应于HOX的相对分子量(Mr)为62kD的主要蛋白条带转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，如WO 96/40935中所述进行N末端氨基酸序列分析。所鉴定的氨基酸序列为：Ala-Thr-Leu-Pro-Gln-Lys-Asp-Pro-Gly-Tyr-(SEQ ID NO：1)。该序列对应于所公开的HOX序列(Hansen和Stougaard，1997)的氨基酸第2-11号。因此，推断出所表达的62kD蛋白是缺乏N末端氨基酸甲硫氨酸Met1的重组HOX。
通过制备性SDS-PAGE纯化在SDS-PAGE中观测到的62kD HOX条带，如Hunkapiller等所述(1983)，从所述凝胶中电洗脱出所述条带。通过SDS-PAGE分析经电洗脱的62kD HOX条带的纯度，并且如上所述进行氨基酸序列分析。将纯化的HOX用于在兔子中产生抗体。将约50μg的部分与等体积的不完全弗氏佐剂混合，用于免疫。
在蛋白质印迹分析的整个该项研究中，使用在所述兔子中产生的HOX特异性多克隆抗体。如上所述，将待通过蛋白质印迹分析的蛋白质电泳，并且按照标准方法，将其转移至硝化纤维素滤膜上。硝化纤维素膜在含有3％脱脂奶粉的TBS-T溶液(50mM Tris，pH 7.5；150mMNaCl；0.1％Tween-20)中封闭1小时。加入在含1.5％脱脂奶粉的TBS-T中以1∶10,000稀释的HOX特异性抗体，将印迹保温过夜。将印迹在TBS-T中洗涤3次，然后与在含1.5％脱脂奶粉的TBS-T中以1∶1000稀释的第二抗体(碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔免疫球蛋白，DAKO，cat.no.D0487)一起保温(1-2小时)。随后将印迹在TBS-T中洗涤(2×20分钟)，在TBS(50mM Tris，pH 7.5；150mM NaCl；1×5分钟)中洗涤，然后按照标准方法，在氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(NBT/BCIP)缓冲液显色。
在一系列蛋白质印迹中，用分别得自皱波角叉菜、大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母的含HOX提取物，研究所述抗体的特异性。巴斯德毕赤酵母的含HOX提取物的蛋白质印迹分析，除显示出较低分子量的两条或三条较弱的条带外，还在Mr 62kDa显示出一条强的HOX特异性条带。结果16
蛋白质印迹的结果示于图10B中。该蛋白质印迹证实，在用0.4％CTAB处理之后，实际上在细胞中没有留下HOX。实施例17水平提高的胞内酶高通量筛选(HTS)的描述
用波长为254nm的紫外线，使表达胞内HOX酶的多形汉逊酵母菌株突变。将突变的菌株平板接种到琼脂平板(1.4g/L得自Gibco的酵母含氮碱(YNB)、5g/L(NH4)2SO4、1g/L甘油和2％(w/v)琼脂)上，于30℃培养，直至形成菌落。将菌落用机器人菌落挑选器(picker)(Q-Pix，Genetix，Christchurch Dorsett，UK)接种到96孔微量滴定板中。微量滴定板的各孔含有200μl YNB培养基(100mM MES pH 6.1、1.4g/L得自Gibco的YNB、5g/L(NH4)2SO4和10g/L甘油)。将微量滴定板在IOC400.XX2.C振荡培养箱(SANYO Gallenkamp BV，Breda，TheNetherlands)中，于25℃振荡培养7天。采用经修改以仅含105μl试剂1的HOX测定，并且所述测定物中加入15μl 0.4％(w/v)CTAB，用10μl发酵肉汤测定HOX活性。反应时间是于30℃下60分钟。用Plato 7取液机器人(Rosys，Hombrechtikon，Switzerland)进行HOX测定，在Spectramax plus微量滴定板读出仪(Molecular Devices，UK)中测定吸光度。通过将10μl发酵肉汤转移到新的微量滴定板上，加入100μl 100mM磷酸缓冲液pH 6.3，并于600nm下测量吸光度，测量在每块微量滴定板各孔中的生长。考虑到生长差的情况，将所述HOX测量根据600nm下的吸光度归一化。结果17
结果证明，有可能筛选出产生水平提高的胞内HOX酶的多形汉逊酵母突变体。实施例18
经CTAB提取的HOX酶(参见例如表12)和“经机械提取的”HOX酶(参见例如表13和图8)的比活比较。结果18
结果证明，经CTAB提取的HOX的比活高于“经机械提取的”HOX的比活。这些结果表明，CTAB不是提取位于细胞器中的所有胞内蛋白，而主要提取胞质蛋白。实施例19通过阴离子交换色谱表征经CTAB提取的HOX和经机械提取的HOX
为了分析经CTAB提取的HOX的纯度，将其与利用细胞破碎法提取的HOX进行比较。测定并比较比活，并且比较提取物的核酸含量。此外，通过阴离子交换色谱检查纯度。
将7ml细胞悬浮液(细胞+上清液)加入到15ml离心管中(HOX9957，Mut 45)。加入0.4％CTAB后，将细胞悬浮液于30℃(200rpm)孵育23小时。通过离心(10000g，10分钟)除去细胞，用无细胞上清液作为经CTAB提取的HOX源。用一个单塞泵压头以2×2400巴(ZPlus，2.2kW，Constant Systems Ltd，UK)，破碎另一7ml相同细胞悬浮液(不加入CTAB)。然后通过离心(10000g，10分钟)分离细胞碎片，用上清液作为经机械提取的HOX源。
将两种样品在PD10柱(Pharmacia Biotech.)上，在20mM TEA(三乙醇胺，Merck)缓冲液pH 7.3中脱盐。分析样品的HOX活性，并进行蛋白浓缩(蛋白质分析基于Schleif和Wensink，1981描述的分析方法)。通过测量260nm和280nm的吸光度，测定核酸含量(Bollag和Edelstein，1991)。
通过采用Biologic Duo Flow(BioRad，CA，USA)***，进行离子交换色谱。将500μl脱盐样品上样于用TEA缓冲液(缓冲液A，20mM，pH7.3)平衡的Source Q 15柱(HR5/5，Pharmacia Biotech.)上。用在缓冲液A中0-0.5M NaCl的20ml线性梯度，以1.5ml/min的流速，洗脱所述HOX，在此期间，收集1.5ml的部分，并分析HOX活性。结果19
比活的测定表明，经CTAB提取的HOX比经机械提取的HOX纯比活高得多(表15)。此外，经CTAB提取的HOX中的核酸含量比经机械提取的HOX中的含量低得多(表15)。表15经CTAB提取的HOX和经机械提取的HOX中的HOX浓度和蛋白浓度试验          HOX活性    蛋白浓度    比活        核酸浓度
          [U/ml]     [mg/ml]     [U/mg蛋白]  [μg/ml]经CTAB提取的  30.6       2.33        13.1        102经机械提取的  32.0       12.7        2.5         384
图11A和11B显示了经CTAB提取的HOX和经机械提取的HOX的Source Q分析的色谱图，在图11A和11B中的阴离子交换色谱分析也强烈地证明了这一结果。用CTAB进行的实验实施例201.摇瓶实验
选择两种不同的培养基用于采用CTAB进行的实验：
●YP/1％甘油
●YNB/1％甘油+0.1 NaPi pH 6.0
a)在YP/1％甘油中培养
在50ml培养基中接种2.5ml YPD预培养物，于37℃、160rpm下培养。
培养28小时后，加入1％(v/v)甲醇，再于37℃、160rpm下培养18小时。
测量OD600nm，以计算CTAB的必需量。
取出1.5ml培养物的等份的上清液(SN)和细胞沉淀。
在机械破碎所述细胞后，分离可溶性部分(CX)。
＝＞             将这些条件的SN命名为A
                 将这些条件的CX命名为D
将相同体积的所述培养物(20ml)分成等份加入到两个摇瓶中。
为20ml所述培养物补充0.005g CTAB。
(CTAB-储备液：0.02g/ml；DANISCO：在发酵罐培养物中为0.4％(OD600nm～300)
＝＞摇瓶实验OD600nm～20＝＞0.027g CTAB/100ml培养物)
培养物的孵育·24小时，4℃，不振摇
＝＞             将这些条件的SN命名为C
                 将这些条件的CX命名为F
在与CTAB-摇瓶相同的条件下孵育无CTAB的第二个摇瓶，用作参比培养物。
＝＞             将这些条件的SN命名为B
                 将这些条件的CX命名为E
培养带有5种不同IL-lra构建物的菌株。菌株4-17、AL 9/2和II3-1含有三种不同的无信号序列的构建物，而菌株MFα2和MFαAL7/1代表具有MFα前原序列的两种不同构建物。
在与所述重组菌株相同的条件下培养菌株FPMT 8。该菌株是一种RB11整合体，具有近30个拷贝的空汉逊酵母属载体pFPMT121，用作阴性对照。
用CTAB处理之后，在带有无信号序列的构建物的菌株的上清液中，检测到IL-lra浓度增加40倍(20倍)至110倍。
对于用CTAB处理的MFα菌株，测量到IL-lra浓度增加较少(2-5倍)。结果20
结果概述于表16中。
菌株  序列  OD600nm  SN样品  ELISAIL-lra[μg/ml]  因数
4-17  2  20,5  ABC  0,3450,34639,0  C/A＝113C/B＝113
AL 9/2  3  22,6  ABC  0,166*0,1793,39  C/A＝20C/B＝19
II 3/1  4  18,7  ABC  1,671,9481,2  C/A＝49C/B＝42
MFα2  6  20,4  ABC  4,855,6927,7  C/A＝6C/B＝5
MFαAL 7/1  8  22,6  ABC  2,282,025,23  C/A＝2,3C/B＝2,6
表16：在YP/甘油/甲醇中用CTAB进行的实验A：在YP/甘油/甲醇中培养46小时后的上清液B：在YP/甘油/甲醇中培养46小时后的上清液，然后不加CTAB孵育24小时C：在YP/甘油/甲醇中培养46小时后过滤除菌的上清液，然后加入CTAB孵育24小时*注释：
在菌株AL 9/2的上清液中IL-lra的浓度通常低。在进一步的实验中，检测到浓度在0.6μg/ml和0.7μg/ml之间。
不知道低收率的原因。实施例21
b)在YNB/1％甘油+0.1M NaPi pH 6.0中培养
对于用CTAB进行的进一步实验中，选择带有三种无信号序列的不同构建物的三个菌株(菌株4-17；AL 9/2；II 3-1)。
在45ml培养基中接种5ml YPD预培养物，于37℃、160rpm下培养。
培养28小时后，加入1％(v/v)甲醇，再于37℃、160rpm下孵育18小时。
测量OD600mm，以计算CTAB的必需量。
取出3ml培养物的等份的上清液(SN)和细胞沉淀。
在机械破碎所述细胞后，分离可溶性部分(CX)。
＝＞             将这些条件的SN命名为A
                 将这些条件的CX命名为D
将相同体积的所述培养物(20ml)分成等份加入到两个摇瓶中。
为20ml所述培养物补充0.003g CTAB。
培养物的孵育：24小时，4℃，不振摇
＝＞             将这些条件的SN命名为C
                 将这些条件的CX命名为F
在与CTAB-摇瓶相同的条件下孵育无CTAB的第二个摇瓶，用作参比培养物。
＝＞             将这些条件的SN命名为B
                 将这些条件的CX命名为E
在所有情况下，与CTAB一起孵育，导致上清液中IL-lra浓度显著增加(100-130倍)。结果21
在以下表17中比较了在两种不同培养基中培养后所述CTAB试验的ELISA结果。
菌株 SN样品              YP/甘油/甲醇         YNB/甘油/甲醇(pH 6,0)
 OD600nm  ELISAIL-lra[μg/ml]  因数   OD600nm  ELISAIL-lra[μg/ml]  因数
4-17  ABC  20,5  0,3450,34639,0  C/A＝113C/B＝113  10,210,89,8  0,2050,069？22,2  C/A＝108(C/B＝322)
AL 9/2  ABC  22,6  0,1660,1793,39  C/A＝20C/B＝19  10,111,611,0  0,0450,025？6,16  C/A＝137(C/B＝246)
II 3/1  ABC  18,7  1,671,9481,2  C/A＝49C/B＝42  10,011,410,6  0,2760,27929,1  C/A＝105C/B＝104
表17：在YP/甘油/甲醇中和在YNB/甘油/甲醇中CTAB实验的比较A：在YP/甘油/甲醇(或YNB/甘油/甲醇)中培养46小时后的上清液B：在YP/甘油/甲醇(或YNB/甘油/甲醇)中培养46小时后的上清液，然后不加CTAB孵育24小时C：在YP/甘油/甲醇(或YNB/甘油/甲醇)中培养46小时后过滤除菌的上清液，然后加入CTAB孵育24小时实施例22不同孵育条件的试验
对于在YP甘油/甲醇中培养的菌株II 3-1(参见1.a)，在加入CTAB后试验不同的孵育条件。
条件：
 24h CTAB，4℃，无振摇(“标准条件”)
 24h CTAB，4℃，温和振摇
 24h CTAB，37℃，无振摇
 24h CTAB，37℃，温和振摇结果22
通过ELISA测定上清液中IL-lra的浓度。结果概述于表18中。
菌株II 3-1  ELISAIL-lra[μg/ml]  因数
上清液    A  1,67
4℃       B无振摇    C  1,9481,2  C/B＝42C/A＝49
4℃       B温和振摇  C  1,6244,7  C/B＝28C/A＝27
37℃      B无振摇    C  8,04127,4  C/B＝16C/A＝76
37℃      B温和振摇  C  11,146,2  C/B＝4C/A＝28
表18：CTAB的不同孵育条件(ELISA结果)A：在YP甘油/甲醇中培养46小时后的上清液B：在YP/甘油/甲醇中培养46小时后的上清液，然后不加CTAB孵育24小时C：在YP/甘油/甲醇中培养46小时后过滤除菌的上清液，然后加入
CTAB孵育24小时
在于37℃无振摇(76倍)和于4℃无振摇(49倍)CTAB孵育后，测量到所述上清液中IL-lra增加最多。
在37℃检测到最高IL-lra浓度，但在未与CTAB孵育的参比样品中所述浓度也增加(16倍)。
参比样品中的所述高浓度可能是由于细胞裂解所致。
＝＞ 最佳条件：4℃(以避免细胞裂解)无振摇实施例23SDS-PAGE、蛋白质印迹和考马斯染色
通过SDS-PAGE，在还原条件下分析从摇瓶实验中分离的粗提物的上清液和可溶性部分。凝胶：16％Novex-gel TG 1mm；还原条件
  胶体考马斯染色(BIO-SAFE Coomassie，Biorad)样品：A：在YP/甘油/甲醇中培养46小时后的上清液
  B：无CTAB的参比上清液
  D：粗提物的可溶性部分(CX)1∶3稀释的
  E：参比培养物粗提物的可溶性部分(CX)1∶3稀释的
  F：用CTAB处理后粗提物的可溶性部分(CX)1∶3稀释的结果23
Figure A0081852300691
WB 33和Coo2
菌株：4-17pFPMT icIL lraI
      Al 9/2pFPMT icIL lraI+Al
CTAB：孵育24小时；4℃，无振摇
蛋白质印迹(WB33)的结果示于图12A
所述试验样品和加入量示于以下图12A的图例说明中。
1.MW标记See Blue                  10μl(总量)2.4-17      A SN                  11,3μl3.4-17      D CX 1∶3稀释         11,3μl4.4-17      C SN CTAB             11,3μl5.4-17      F CX CTAB 1∶3稀释    11,3μl6.rhIl-lra标准品(无BSA)           30ng7.AL9/2     A SN                  11,3μl8.AL9/2     D CX 1∶3稀释         11,3μl9.AL9/2     C SN CTAB             11,3μl10.AL9/2    F CX CTAB 1∶3稀释    11,3μl
结果表明，在用CTAB处理后，检测到这两种菌株的SN中IL-lra(4道、9道)均增加了，而CX中的IL-lra(5道、10道)均降低。
胶体考马斯(Coo 2)蓝染色示于图12B
所述试验样品和加入量示于以下图12B的图例说明中。
1.MW标记Mark 12                     10μl(总量)2.4-17      A SN                    11,3μl3.4-17      D CX 1∶3稀释           11,3μl4.4-17      C SN CTAB               11,3μl5.4-17      F CX CTAB 1∶3稀释      11,3μl6.4-17      B SN w/o CTAB           11,3μl7.4-17      E CX w/o CTAB 1∶3稀释  11,3μl8.rhIl-lra标准品(无BSA)             100ng9.AL9/2     A SN                    11,3μl10.AL9/2    D CX 1∶3稀释           11,3μl11.AL9/2    C SN CTAB               11,3μl12.AL9/2    F CX CTAB 1∶3稀释      11,3μl13.AL9/2    B SN w/o CTAB           11,3μl14.AL9/2    E CX w/o CTAB 1∶3稀释  11,3μl15.FPMT 8   A SN                    11,3μl
Figure A0081852300701
WB 34和Coo 3
菌株：MFα2pFPMT MFαIL-lraI
      MFαAL 7/1pFPMT MFαIL-lraI+Al
CTAB：孵育24小时；4℃，无振摇
蛋白质印迹(WB 34)的结果示于图13A
所述试验样品和加入量示于以下图13A的图例说明中。
1.MW标记See Blue                   10μl(总量)2.MFα2      A SN                  11,3μl3.MFα2      D CX 1∶3稀释         11,3μl4.MFα2      C SN CTAB             11,3μl5.MFα2      F CX CTAB 1∶3稀释    11,3μl6.rhIl-lra标准品(无BSA)            30ng7.MFαAL7/1  A SN                  11,3μl8.MFαAL7/1  D CX 1∶3稀释         11,3μl9.MFαAL7/1  C SN CTAB             11,3μl10.MFαAL7/1 F CX CTAB 1∶3稀释    11,3μl
结果表明，在用CTAB处理后，在4道和9道的上清液中检测到胞内IL-lra和分泌的IL-lra的混合物。
MFα2：来源于胞内IL-lra的约20kDa和34kDa的额外条带
MFα7/1：来源于胞内IL-lra的＜17kDa的额外条带
18kDa信号强度增加
胶体考马斯(Coo 3)的结果示于图13B
所述试验样品和加入量示于以下图13B的图例说明中。
1.MW标记Mark 12                       10μl(总量)2.MFα2      A SN                     11,3μl3.MFα2      D CX 1∶3稀释            11,3μl4.MFα2      C SN CTAB                11,3μl5.MFα2      F CX CTAB 1∶3稀释       11,3μl6.MFα2      B SN w/o CTAB            11,3μl7.MFα2      E CX w/o CTAB 1∶3稀释   11,3μl8.rhIl-lra标准品(无BSA)               100ng9.MFαAL7/1  A SN                     11,3μl10.MFαAL7/1 D CX 1∶3稀释            11,3μl11.MFαAL7/1 C SN CTAB                11,3μl12.MFαAL7/1 F CX CTAB 1∶3稀释       11,3μl13.MFαAL7/1 B SN w/o CTAB            11,3μl14.MFαAL7/1 E CX w/o CTAB 1∶3稀释   11,3μl15.FPMT 8    C SN CTAB                11,3μl
WB 35和Coo 4
菌株：II 3/1pFPMT icIL-lraII型
在加入CTAB后的不同温育条件：
 24h CTAB，4℃，无振摇(“标准条件”)
 24h CTAB，37℃，无振摇
蛋白质印迹(WB 35)的结果示于图14A
所述试验样品和加入量示于以下图14A的图例说明中。
1.MW标记See Blue                    10μl(总量)2.II3/1    SN                       11,3μl3.II3/1    CX 1∶3稀释              11,3μl4.II3/1    SN CTAB 4℃              11,3μl5.II3/1    CX CTAB 4℃ 1∶3稀释     11,3μl6.rhIl-lra标准品(无BSA)             30ng7.II3/1    SN CTAB 37℃             11,3μl8.II3/1    CX CTAB 37℃ 1∶3稀释    11,3μl9.II 3/1   SN w/o CTAB 37℃         11,3μl10.II3/1   CX w/o CTAB 37℃ 1∶3稀释11,3μl
胶体考马斯(Coo 4)蓝染色示于图14B
所述试验样品和加入量示于以下图14B的图例说明中。
1.MW标记Mark 12                          10μl(总量)2.II3/1    SN                            11,3μl3.II3/1    CX  1∶3稀释                  11,3μl4.II3/1    SN CTAB 4℃                   11,3μl5.II3/1    CX CTAB 4℃ 1∶3稀释          11,3μl6.II3/1    SN w/o CTAB 4℃               11,3μl7.II3/1    CX w/o CTAB 4℃ 1∶3稀释      11,3μl8.II3/1    SN CTAB 37℃                  11,3μl9.II3/1    CXCTAB 37℃ 1∶3稀释          11,3μl10.II3/1   SN w/o CTAB 37℃              11,3μl11.II3/1   CX w/o CTAB 37℃ 1∶3稀释     11,3μl12.rhIl-lra标准品(无BSA)                 100ng13.FPMT 8  CX CTAB 4℃ 1∶3稀释          11,3μl14.FPMT 8  SN CTAB 4℃                   11,3μl15.FPMT 8  SN                            11,3μl
结果表明，在4℃以及在37℃进行CTAB孵育后，检测到在所述SN(WB 35：4道，8道)中IL-lra增加，而在所述CX(WB 35：5道，9道)中IL-lra减少。
在SN CTAB 37℃(8道)中，获得最高量的IL-lraII。这一结果与ELISA的结果(参见表3)一致。
在这种上清液中，不仅IL-lraII染色增强，而且其它蛋白(＞35kDa)的染色也增强(Coo 4∶8道)。这一观测证实了与4℃相比在37℃发生显著的细胞裂解的假设。讨论
通过用汉逊酵母属宿主生物更常用的密码子取代较少使用的密码子，对皱波角叉菜HOX基因(Stougaard和Hansen 1996，Hansen和Stougaard，1997)的密码子选择进行修饰。制备了甲基营养酵母多形汉逊酵母的转化体-含有密码子优化的HOX DNA片段的表达***(开发于Rhein Biotech，Düsseldorf/Germany)，以用于表达HOX。
对编码所述HOX酶的基因进行密码子优化，导致在多形汉逊酵母酵母宿主生物中高水平地表达(根据高水平的酶活性)所述HOX酶。当信号序列不存在时，所述HOX酶定位于胞内。然而，甚至当在不同构建体中使用不同的信号序列时，在胞外培养基中可以测定的HOX活性很低或没有活性。这些结果表明，所述HOX酶甚至不能从表达含信号序列的HOX酶的宿主菌株中分泌。蛋白质印迹也证实，所述HOX酶甚至在存在信号序列时也可以定位于膜缔合部分，表明虽然有所述HOX基因的转录和翻译，但所述HOX酶不被分泌，看来其分泌途径受阻。
比较了用本发明的方法与传统的细胞破碎法和采用其它离子/非离子去垢剂和乳化剂的提取法对胞内具酶活性的HOX酶的提取。也研究了去垢剂与蛋白酶和盐的组合。总结
在本发明的一个广义方面，提供一种用于释放可溶性或膜缔合胞内感兴趣的蛋白(POI)的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含可溶性或膜缔合胞内POI的细胞；使所述细胞与膜提取组合物接触；并且使得所述POI在足以释放所述POI的条件下以可溶性形式从所述细胞中释放出来。
在本发明的另一广义方面，提供一种用于特异性地释放可溶性或膜缔合胞内感兴趣的蛋白(POI)的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含可溶性或膜缔合胞内POI的细胞；使所述细胞与膜提取组合物接触；并且使得所述POI在足以释放所述POI但不足以释放其它污染蛋白的条件下从所述细胞中释放出来。
在上述说明书中提及的所有出版物均通过引用结合到本文中。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，对本发明的所述方法和***的各种修改和改变对于本领域技术人员是显而易见的。虽然结合具体优选实施方案描述了本发明，但应该理解，要求保护的本发明不应被过度限制于这些具体的实施方案。实际上，对分子生物学领域或相关领域技术人员显而易见的用于实施本发明的方法的各种修改将属于所附权利要求书的范围内。
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        20                  25                  30Gln Gly Phe Asn Arg Arg Trp Ile Gly Thr Asn Ile Asp Phe Val Tyr
    35                  40                  45Val Val Tyr Thr Pro Gln Gly Ala Cys Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met
50                  55                  60Glu Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg Ile Val Ser Gly Gly His Cys65                  70                  75                  80Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys Val Lys Ala Ile Ile Asn Val
            85                  90                  95Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp Asp Asp Arg Gly Tyr Phe Val
        100                 105                 110Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp
    115                 120                 125His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly
130                 135                 140Gly His Ile Val Gly Gly Gly Asp Gly Ile Leu AlaArg Leu His Gly145                 150                 155                160Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val Glu Val Val Val Lys Pro Val
            165                 170                 175Leu Thr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr Val His Lys Asp Ser Glu Gly
        180                 185                 190Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn
    195                 200                 205Phe Gly Ile Ile Thr Lys Tyr Tyr Phe Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro
210                 215                 220Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu His Phe Ser Trp Asp Gly Phe Thr225                 230                 235                 240Arg Asp Ala Leu Gln Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Arg
            245                 250                 255Cys Asp Trp Lys Asn Thr Val Gly Lys Phe Gln Ile Phe His Gln Ala
        260                 265                 270Ala Glu Glu Phe Val Met Tyr Leu Tyr Thr Ser Tyr Ser Asn Asp Ala
    275                 280                 285Glu Arg Glu Val Ala Gln Asp Arg His Tyr His Leu Glu Ala Asp Ile
290                 295                 300Glu Gln Ile Tyr Lys Thr Cys Glu Pro Thr Lys Ala Leu Gly Gly His305                 310                 315                 320Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg Pro Arg Lys Arg His Thr Ser
            325                 330                 335Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala
        340                 345                 350Leu Thr Glu Thr Ile Asn Gly Ser Gly Pro Asn Gln Arg Gly Lys Tyr
    355                 360                 365Lys Ser Ala Tyr Met Ile Lys Asp Phe Pro Asp Phe Gln Ile Asp Val
370                 375                 380Ile Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu385                 390                 395                 400Met Lys Asp Ala Leu Leu Gln Val Asp Met Phe Gly Gly Glu Ile His
            405                 410                 415Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val Ala Gln Arg Glu Tyr Ile Ile
        420                 425                 430Lys Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val
    435                 440                 445Asn Leu Lys Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr
450                 455                 460Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gln Val Glu Ser Gly Lys Gly Val465                 470                 475                 480Phe Glu Gly Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp
            485                 490                 495Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu
        500                 505                 510Asn Arg Leu Ile Lys Ala Lys Trp Leu Trp Asp Pro Asn Glu Ile Phe
    515                 520                 525Thr Asn Lys Gln Ser Ile Pro Thr Lys Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gln
530                 535                 540Thr Lys545

Claims (23)

1.一种用于从细胞中释放可溶性或膜缔合胞内感兴趣的蛋白(POI)的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含可溶性或膜缔合胞内POI的细胞；
使所述细胞与膜提取组合物接触；并且
使得所述POI在足以特异性地释放所述POI的条件下以可溶性形式从所述细胞中释放出来。
2.一种权利要求1的方法，其中所述细胞是转化细胞。
3.一种用于从转化细胞中释放POI的权利要求1或权利要求2的方法，其中所述POI是一种HOX酶，所述方法包括以下步骤：
提供包含HOX酶的转化细胞；
使所述转化细胞与膜提取组合物接触；并且
使所述HOX酶在足以特异性地释放所述HOX酶的条件下以可溶性形式从所述转化细胞中释放出来。
4.一种用于从转化细胞中释放POI的方法，其中所述POI是一种白介素1受体拮抗剂(IL-lra)，所述方法包括以下步骤：
提供包含IL-lra的转化细胞；
使所述转化细胞与膜提取组合物接触；并且
使所述IL-lra在足以特异性地释放所述IL-lra的条件下以可溶性形式从所述转化细胞中释放出来。
5.一种任一前述权利要求的方法，其中所述细胞选自酵母细胞、真菌细胞和细菌细胞，最好是选自酵母细胞和真菌细胞。
6.一种任一前述权利要求的方法，其中所述胞内POI通过重组DNA技术生产。
7.一种任一前述权利要求的方法，其中所述膜提取组合物包含一种季铵化合物。
8.一种任一前述权利要求的方法，其中所述季铵化合物选自：溴化月桂酰三甲铵(LTAB)、氯化肉豆蔻基三甲铵(MTAC)、氯化鲸蜡基三甲铵(CTAC)、溴化十六烷基三甲铵、溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)、氯化硬脂酰三甲铵(STAC)、溴化硬脂酰三甲铵(STAB)、苯扎氯铵(氯化烷基二甲基苄基铵)、溴化N-鲸蜡基吡啶鎓(溴化N-十六烷基吡啶鎓)、氯化N-鲸蜡基吡啶鎓(氯化N-十六烷基吡啶鎓)、氯化苄基二甲基十四烷基铵、氯化苄基二甲基十六烷基铵和任何两种或更多种上述化合物的组合。
9.一种任一前述权利要求的方法，其中所述膜提取组合物包含约0.05％至约0.6％(重量)的所述季铵化合物，优选约0.1％至约0.5％(重量)的所述季铵化合物，优选约0.2％至约0.45％(重量)的所述季铵化合物，更优选约0.4％(重量)的所述季铵化合物。
10.一种任一前述权利要求的方法，其中所述细胞在约4℃至约40℃、优选约20℃至约30℃、更优选约25℃的温度下与所述膜提取组合物接触。
11.一种任一前述权利要求的方法，其中所述细胞在约2.0至约11.0、更尤其约5.0至约7.0、更尤其6.3的最适pH下与所述膜提取组合物接触。
12.一种用于筛选产生水平提高的可溶性或膜缔合胞内POI的突变型细胞或转化细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)让所述突变型细胞在30℃下生长；
(b)使所述突变型细胞或转化细胞与权利要求7或权利要求8中限定的膜提取组合物一起孵育；
(c)回收所述无细胞培养基；
(d)筛选所述胞内POI水平提高的无细胞培养基；使得所述无细胞培养基中所述胞内POI的存在，指示已经释放出所述胞内POI。
13.一种适用于特异性地释放可溶性或膜缔合胞内POI的膜提取组合物，其中所述组合物在下述条件下与所述细胞接触：
(a)季铵化合物的重量百分比为约0.05％至约0.6％，更尤其是约0.1％至约0.5％，更尤其是约0.2％至约0.45％，更尤其是约0.4％；
(b)最适pH为约2.0至约11.0，更尤其是约5.0至约7.0，更尤其是约6.3；
(c)最适温度为约4℃至约40℃，更尤其是约20℃至约30℃，更尤其是约25℃；使得获得基本上无污染蛋白的所述胞内POI。
14.一种包含季铵化合物的膜提取组合物的应用，用于选择性地释放可溶性或膜缔合胞内POI。
15.一种任一前述权利要求的方法，其中所述POI是一种HOX酶。
16.一种权利要求15的方法，其中所述HOX酶包含SEQ ID No22中所示的氨基酸序列或其变异体、同源物、衍生物或片段。
17.一种权利要求15或权利要求16的方法，其中所述HOX酶由SEQ ID No 22中所示的核苷酸序列或其变异体、同源物、衍生物或片段编码。
18.一种权利要求15或权利要求16或权利要求17的方法，其中所述HOX酶由能够与SEQ ID No 22中所示核苷酸序列或其变异体、同源物、衍生物或片段杂交的核苷酸序列或所述可杂交序列的互补序列编码。
19.一种可采用按照任一前述权利要求的方法生产的HOX酶，其中所述HOX酶由权利要求16-18中任一项中限定的核苷酸序列编码，并且其中所述核苷酸序列用SEQ ID No 2-22中所示的寡核苷酸来合成。
20.一种权利要求1或其任一从属权利要求中限定的POI，所述POI从真核宿主生物中以基本上无糖基化形式释放出来。
21.一种从真核宿主生物中释放的基本无糖基化的POI。
22.一种权利要求21的基本无糖基化的POI，其中所述POI采用任一前述权利要求的方法来释放。
23.基本如本文所述并参照附图的一种方法和一种组合物。
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