CN1408719A

CN1408719A - 用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法

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Publication number: CN1408719A
Application number: CN02136839.2A
Authority: CN
Inventors: 邱蔚然; 阎蓬勃; 丁庆豹
Original assignee: SHANGHAI QIUZHIYOU BIOLOGIAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Nantong Qiuzhiyou Bioscience & Biotechnology Co ltd
Priority date: 2002-09-05
Filing date: 2002-09-05
Publication date: 2003-04-09
Anticipated expiration: 2022-09-05
Also published as: CN1177859C

Abstract

用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法。本发明通过阴离子交换树脂和炭柱的有序排列组合，一次分离纯化得到高纯度单核苷酸。本发明的方法可高收率、高浓度地获得5’－AMP、5’－GMP、5′－CMP和5′－UMP四种核苷酸，分离总收率可达90％，酶解液中的大部分杂质被截留在阴离子交换树脂中，或被分离时洗脱掉。本发明方法，具有树脂用量少、成本低、收率高、分离效果好、所得产品纯度高以及适合大规模工业化生产等优点。

Description

用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法

技术领域

本发明涉及一种分离方法，尤其涉及一种采用离子交换树脂从核糖核酸(RNA)酶解液中分离核苷酸的方法。

核苷酸，如5’-腺苷酸(简称5′-AMP)、5’-鸟苷酸(简称5′-GMP)、5’-胞苷酸(简称5′-CMP)和5’-尿苷酸(简称5′-UMP)及其衍生物为重要的生物化工原料，可以作为食品添加剂、保健食品和医药中间体。一般，通过连续发酵培养高核酵母，然后从中提取分离可获得RNA，亦可从啤酒酵母或其他酵母中分离获得RNA。将RNA用核酸酶P1(或磷酸二酯酶)酶解，然后对酶解液进行分离，即可获得所说的5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-胞苷酸和5’-尿苷酸。目前，已有一些文献报道了分离方法，如：

文献：核苷酸类物质的生产和应用，中国科学院微生物研究所编，科学出版社：1971，报道了一种分离方法，该方法通过阳-阴离子树脂结合的方法，进行核苷酸的分离，该方法虽然可以一次分离出大量的5’-腺苷酸，但5’-鸟苷酸、5’-胞苷酸和5’-尿苷酸的分离效果并不理想，5’-尿苷酸的损失将近50％，5’-鸟苷酸和5’-胞苷酸的损失将近40％，生产周期长，料液容易变质，分离总收率约为65％；该文献同时报道了另一种分离方法，该方法直接采用阴离子交换树脂进行分离，该方法分离周期长，气温高时上柱液容易长霉，流出液体积大，耗水量多，没有工业应用价值。

发明者等曾报道用阳阴离子交换树脂组合分离的方法，中国专利申请号：00119589.1，解决了分离的关键问题，使产品收率和纯度大幅度地提高。但是，其缺陷是树脂用量大，能耗和用水量较大。

随着核苷酸及其衍生物药物疗效的发掘和作为保健晶的应用，其需求量日益增大，原有的生产方法已不能满足人们的需要，有关的产业部门希望提供更为有效的生产方法。

本发明需要解决的技术问题在于公开一种用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法，包括5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-胞苷酸和5’-尿苷酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足人们的需要。本发明的构思是这样的：

本发明采用二根阴离子交换树脂柱，将酶解液串联上柱，分段洗脱。由于5′-AMP、5′-GMP、5′-CMP和5′-UMP具有磷酸基，在中性的条件下，如pH＝6.5～7.5的条件下，磷酸基被离解，带有负电荷，故与阴离子交换树脂进行离子交换，被吸附。

二根阴离子交换树脂柱洗脱的基本原理是这样的：由于5′-AMP、5′-GMP和5′-CMP氨基的离解常数分别为3.70、2.30和4.24，5′-AMP、5′-GMP、5′-CMP、5′-CMP的磷酸基离解常数分别为0.89、0.70、0.80、1.02。当用酸性溶液洗时，5′-CMP带负电荷较弱，因此先被洗脱下来；改用较强酸性溶液可将5′-AMP洗脱下来。用较强酸性和盐溶液先脱时，由于嘌呤与苯乙烯树脂有亲和性原因，5′-UMP先于5′-GMP被洗脱下来。

因此采用分段洗脱的方法，可依次将5′-CMP、5′-AMP、5′-UMP、5′-GMP洗脱下来，四种洗脱液分别吸附于四个炭柱上，然后再用碱性溶液分别将4种核苷酸洗脱下来，故而可一次性地高收率分离出纯度较高的核苷酸。

以前，用阴离子交换树脂分离方法，由于为了获得较好的分离效果，核苷酸上柱总量往往很低，一般为总交换量的5％。而本发明为了节约成本，提高柱效，采用二根阴柱串联的方法，上样时，第一根柱交换量达到饱和状态，第二根柱主要作用是增加5′-CMP、5′-AMP和5′-UMP的分离效果，并采用分段洗脱的和炭性浓缩的方法，从而弥补了以前阴离子交换树脂分离的缺陷。

本发明的主要特征是，通过阴离子交换树脂和炭柱的有序排列组合，一次分离纯化得到高纯度单核苷酸，并且具有树脂用量少，成本低，所分离的单核苷酸浓度高，分离时间短，产品不易污染等优点。

本发明的方法依次包括如下步骤：

①将含有四种5-核苷酸、少量其他核苷酸(如5’-肌苷酸)以及核苷(如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷)等杂质的酶解液按序流过两根强碱阴离子交换树脂柱、使4种5’-核苷酸被吸附在两根强碱阴离子交换树脂柱中，5′-AMP、5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP被吸附在第一根强碱阴离子交换树脂柱中。

②用酸性溶液洗涤两根强碱阴离子交换树脂柱，洗脱液流入第一炭柱，使其中的5′-CMP吸附于第一炭柱中，然后用碱性醇溶液洗脱第一炭柱，收集洗脱液，即可获得纯度较高的5′-CMP溶液；

③用较强酸性溶液洗涤两根强碱阴离子交换树脂柱，洗脱液流入第二炭柱，使其中的5′-AMP吸附于第二炭柱，然后用碱溶液洗脱，即可获得纯度较高的5′-AMP溶液；

④用较强酸性和盐溶液洗涤二根强碱阴离子交换树脂柱，洗脱液流入第三炭柱，使其中的5′-UMP吸附于第三炭柱，然后用碱溶液洗脱，可得到纯度较高的5′-UMP溶液。

⑤用离子强度更强的溶液洗涤第一根阴离子交换树脂，洗脱液流入第四炭柱，使其中的5′-GMP吸附于第四炭，然后用碱性溶液洗脱，可得到纯度较高的5′-GMP溶液。

将分离出的含有四种核苷酸的溶液通过常规的方法进行浓缩和精制，即可获得纯度为98％以上的高纯度产品。

通过上述的分离过程，可高收率、高浓度地获得5’-AMP、5’-GMP、5′-CMP和5′-UMP四种核苷酸，分离总收率可达90％，酶解液中的大部分杂质被截留在阴离子交换树脂中，或被分离时洗脱掉。

本发明所说的方法，具有树脂用量少、成本低、收率高、分离效果好、所得产品纯度高以及适合大规模工业化生产等优点。

附图说明。

图1为流程图。

由图1可见，本发明所说的方法依次包括如下步骤：

①含有四种5’-核苷酸核、少量其他核苷酸(如5’-肌苷酸)以及核苷(如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷)等杂质pH值为5～8的酶解液按序流过第一强碱阴离子交换树脂柱1和第二强碱阴离子交换树脂柱2。

上柱总量为树脂总交换量的16-30％，(摩尔比)，最佳为20～25％，即10升阴离子交换树脂约可交换1.2～2公斤核苷酸，最佳为1.6-1.8公斤，柱1和柱2的体积比为1～(2∶1)；

上柱线速度为0.11～0.45米/小时，最佳为0.3～0.36米/小时；

上柱液中核苷酸含量约为0.5-2％，最佳为0.8-1.2wt％。

上柱完毕后，最好用去离子水充分淋洗，使残留在两根强碱阴离子交换树脂柱中的核苷等杂质洗掉。

②用酸性溶液如0.005mol/L～0.02mol/L甲酸洗涤强碱阴离子交换树脂柱，当有5′-CMP溶液流出时，立即连接第一炭柱3，使5′-CMP全部吸附于第一炭柱中，当5′-CMP全部从柱1、柱2洗至炭柱3后，断开柱2、柱3，并用碱性溶液洗涤柱3，便可得5′-CMP溶液。

③用较强酸性溶液，0.05mol/L～0.2mol/L甲酸串联洗涤两根强碱阴离子交换树脂柱1和2，当流出液为5′-AMP时，连接第二炭柱4，当柱2出口没有5′-AMP时，停止洗脱，并用碱性溶液洗涤柱4，便可得5′-AMP溶液。

④用较强酸性的盐溶液如0.05mol/L～0.2mol/L甲酸和0.05mol/L～-0.2mol/L甲酸钠洗脱柱1、柱2，当柱2出口出现5′-UMP时，立即与第三炭柱5连接，并用碱性溶液洗涤柱5，可得5′-UMP溶液。

⑤用更强离子强度溶液如pH＝1.0～3.0的1％～5％氯化钠溶液洗涤柱1，洗脱5’-GMP，将洗涤液送入第四炭柱6，使5’-GMP吸附于第四炭柱6，并用碱性溶液洗涤柱6，便可得5′-GMP溶液。

所说的碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等无机碱溶液，其浓度为0.1-1mol/L。

所得四种单核苷酸略经浓缩，结晶，即可得纯度为98％以上的5’-核苷酸。

所说的阴离子交换树脂为上海合成树脂厂生产的717或201X8、美国Amberlite IRA-900等强碱性苯乙烯阳离子交换树脂中的一种，目数以80-200目为适宜，优选的为100-120目，炭柱3、4、5、6所用的炭可优选上海活性炭厂生产的769炭或北京光华木材厂生产的K15炭，目数为15-50目。

通过上述的分离过程，可高收率、高浓度地获得5’-AMP、5’-GMP、5′-CMP和5′-UMP四种核苷酸，分离总收率可达90％，酶解液中的大部分杂质被截留在柱1和柱2中，或被分离时洗脱掉。将分离出的含有四种核苷酸的溶液通过常规的方法进行浓缩和精制，即可获得纯度为98％以上的高纯度产品。

实施例1

将3000毫升重量百分比为1％的RNA溶液加入300毫升核酸酶P1(酶活力为110u/ml)，于65℃下酶解反应2小时，过滤，超滤去除固体颗粒和蛋白，用6N NaOH调节滤液的pH至8.0，其中，含4.6克5′-AMP，6.4克5’-GMP，4.6克5’-CMP，4.8克5′-UMP，然后按序流过串联的二根阴离子交换柱，线速度为0.36m/h；

柱1、2的尺寸分别为①16X1000mm，①16X700mm，分别装填再生过的201X8强碱阴离子树脂(C1型)150毫升和60毫升，柱3、4、5、6的尺寸为①16X700mm，分别装769炭80毫升。

上柱完毕，用500毫升去离子水洗柱，然后用2000毫升0.02mol/L甲酸溶液洗涤柱1、2，当流出液含有5’-CMP时，立即与第一炭柱3连接，使5′-CMP吸附于炭柱3，当柱2出口5’-CMP不再流出时，用0.1mol/LNaOH洗脱炭柱，收集洗脱液150ml，其中含4.2克5’-CMP。

将柱3与柱2断开，用0.1mol/L甲酸到洗涤柱1、2，当柱2出口出现5′-AMP时与第二柱4连接，使5′-AMP吸附于柱4，用0.1mol/LNaOH将5′-AMP从柱4洗脱，收集洗脱液，其中含4.3克5′-AMP。

再用0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠洗涤柱1、2，使柱2的流出的5′-UMP吸附于第三柱5，同上法，收集洗脱液，其中含有4.3克5′-UMP。

改用pH＝3.0的3％NaCl洗脱柱1，当柱1出口有5’-GMP流出时，立即与第四炭柱6连接，以后同上，收集洗脱液，其中含有5.8克5’-GMP。

5’-核苷酸分离总收率为91％，其中，5′-AMP收率为93.4％，5’-GMP为90.6％，5’-CMP为91.3％，5′-UMP为90％。

将上述的收集的各部分溶液分别通过浓缩、结晶、干燥后，可得3.87克5′-AMP，6.1克5’-GMP(钠盐含15％结晶水)，3.78克5’-CMP，5.1克5′-UMP(钠盐含25％结晶水)，其含量均为98％以上。

实施例2

将3000毫升的酶解液(其中，含4.6克5′-AMP，6.4克5’-GMP，4.6克5’-CMP，4.8克5′-UMP)按序流过串联通过二根离子交换柱，线速度为0.6m/h；

柱1、2的尺寸分别为①16X1000mm，①16X700mm，分别装填再生过的Amberlite IRA-900(120目)强碱阴离子树脂，装填150毫升，柱2装填60毫升，柱3、4、5、6的尺寸为①16X700mm，分别装K15活性炭90ml。

上柱完毕，用500毫升去离子水洗柱。其余操作同上。于柱3可得4.3克5′-CMP，收率为93.4％；柱4可得4.18克5′-AMP，收率为91％；柱5可4.41克得5′-UMP，收率为92％；柱6可得5.765′-GMP克，收率为90％。

将上述的收集的各部分溶液分别通过浓缩、结晶、干燥后，可获得3.76克5′-AMP，6.1克5′-GMP(钠盐含15％结晶水)，3.95克5′-CMP，5.3克5′-UMP(钠盐含25％结晶水)，其含量均为98％以上。

Claims

1.用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于依次包括如下步骤：

①将含有四种5’-核苷酸的酶解液按序流过两根强碱阴离子交换树脂柱、使4种5’-核苷酸被吸附在两根强碱阴离子交换树脂柱中；

②用酸性溶液洗涤强碱阴离子交换树脂柱，洗脱液流入第一炭柱，使其中的5′-CMP吸附于第一炭柱中，然后用碱性醇溶液洗脱第一炭柱，收集洗脱液，收集5′-CMP溶液；

③用较强酸性溶液洗涤强碱阴离子交换树脂柱，洗脱液流入第二炭柱，使其中的5′-AMP吸附于第二炭柱，然后用碱溶液洗脱，收集5′-AMP溶液；

④用较强酸性和盐溶液洗涤强碱阴离子交换树脂柱，洗脱液流入第三炭柱，使其中的5′-UMP吸附于第三炭柱，然后用碱溶液洗脱，收集5′-UMP溶液；

⑤用离子强度更强的溶液洗涤阴离子交换树脂，洗脱液流入第四炭柱，使其中的5′-GMP吸附于第四炭，然后用碱性溶液洗脱，收集5′-GMP溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于酶解液的pH值为5～8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上柱总量为树脂总交换量的16-30％(摩尔比)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于上柱总量为树脂总交换量的20～25％(摩尔比)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上柱线速度为0.11～0.45米/小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上柱线速度为0.3～0.36米/小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上柱液中核苷酸含量为0.5-2wt％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上柱液中核苷酸含量为0.8-1.2wt％。

9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于上柱完毕后，用去离子水充分淋洗。

10.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于酸性溶液为0.005mol/L～0.02mol/L的甲酸，较强酸性溶液为0.05mol/L～0.2mol/L甲酸，较强酸性盐溶液如0.05mol/L～0.2mol/L甲酸和0.05mol/L～-0.2mol/L甲酸钠，更强离子强度溶液为pH＝1.0～3.0的1％～5％氯化钠溶液。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于酸性溶液为0.005mol/L～0.02mol/L的甲酸，较强酸性溶液为0.05mol/L～0.2mol/L甲酸，较强酸性盐溶液如0.05mol/L～0.1mol/L甲酸和0.05mol/L～0.2mol/L甲酸钠，更强离子强度溶液为pH＝1.0～3.0的1％～5％氯化钠溶液。

12.根据权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于所说的碱性溶液为无机碱溶液，其浓度为0.1-1mol/L。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所说的碱性溶液为无机碱溶液，其浓度为0.1-1mol/L。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所说的碱性溶液为无机碱溶液，其浓度为0.1-1mol/L。

15.根据权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯阳离子交换树脂。

16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯阳离子交换树脂。

17.根据权利要求11所述的方法，其特征在于阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯阳离子交换树脂。

18.根据权利要求12所述的方法，其特征在于阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯阳离子交换树脂。