CN1406273A - 生产5′－肌苷酸的微生物和使用其生产5′－肌苷酸的生产工艺 - Google Patents

生产5′－肌苷酸的微生物和使用其生产5′－肌苷酸的生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新的产5’－肌苷醇的微生物，以及一种利用其产生5’－肌苷酸的工艺。

Description

生产5’-肌苷酸的微生物和使用其 生产5’-肌苷酸的生产工艺
                       技术领域
本发明涉及一种生产5’-肌苷酸的新型微生物以及使用该微生物生产5’-肌苷酸的生产工艺。
                       背景技术
5’-肌苷酸是核酸生物合成代谢***的一个中间物质，它被用于多种领域，如食品和医药、以及多种医学领域，并且对动物和植物在生理上有重要意义。而且，特别地，它是核酸类型调味品之一，作为一种与谷氨酸钠一起使用时具有协同作用的调味剂而受到特别的关注。
通过直接发酵生产5’-肌苷酸的生产工艺在这一领域中是已知的，在经济方面的重要关键为以高浓度和高产量生产5’-肌苷酸。
                       发明公开
本发明者为开发一种能够达到上述目的之新菌株进行了广泛的研究，结果发现了一种能够通过直接发酵以高浓度和产量产生5’-肌苷酸的新微生物。
本发明提供了产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)CJIP009(KCCM-10226)的一种突变体，特征为可以通过直接发酵以高浓度和高产量积累5’-肌苷酸，并且对选自重氮丝氨酸或者6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)的L-谷氨酸类似物具有抗性，并且对选自3，4-脱氢脯氨酸、L-氮杂-环丁烷羧酸、L-噻唑烷-4羧酸、(S)-2，2-二甲基-4-羟氨基碳酸((S)-2，2，-dimethyl-4-oxazolidecarboxylic acid)、(S)-5，5-二甲基-4-噻唑烷-羧酸、(4S，2RS)-2-乙基-4-噻唑啉-羧酸、(2S，4S)-4-羟基-2-吡咯啉-羧酸、2-哌啶羧酸或者2，5-吡咯烷二酮的L-脯氨酸类似物具有抗性。
本发明还提供一种生产5’-肌苷酸的生产工艺，其特征为通过培养产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-100226)的突变体，随后收集培养物质。
依据本发明，微生物即产氨棒状菌(ATCC-6872)的一种突变体，与产生5’-肌苷酸的传统腺嘌呤泄漏突变体[Agr.Bio.Chem.，卷47(5)，1035-1042页，1983年(KY13102、KY13171、KY13184等等)]或者同时需要腺嘌呤和黄嘌呤或鸟嘌呤的微生物相比，其生长需要腺嘌呤，但不需要黄嘌呤或者鸟嘌呤，尽管加入它们可以促进生长。
此外，本发明微生物缺乏同化尿素的脲酶，而且对溶菌酶(细胞壁降解酶)具有高敏感性，该酶被认为可使细胞壁合成能力部分丧失，从而使大量的细胞内产生的5’-肌苷酸容易地分泌出细胞。
Balabushevich，M.I.和Kazarinova，L.A.等人(Prikl.Biokhm.Mikrobiol.19(5)卷，590-698页，1983年)，俄罗斯，发现把链霉素和卡那霉素加入到培养基可增强细胞通透性，并且有助于5’-肌苷酸在培养基中的积累。有鉴于此，构思了通过把对链霉素的抗性引入一种已知的菌株来增强微生物的膜之通透性的方法，由此将可能发现一种能够以高浓度和高产量产生5’-肌苷酸的突变体。还构思了通过使用上述突变体并且在培养基中加入链霉素将阻止在发酵时频繁发生的污染。因此，本发明者获得了一种对高浓度链霉素具有抗性的菌株，并且研究了该菌株的性质。实践中，已经证明将对高浓度链霉素的抗性引入菌株能有效阻止发酵时发生的污染。
很多细菌积累钙离子和有机溶质，也就是渗透剂，方法是通过提高细菌的细胞内渗透压力来阻止细菌在细胞外渗透压环境下的渗透性脱水。关于这样的渗透剂，已知有L-脯氨酸、L-谷氨酸、糖类、N-甲基氨基酸衍生物等等。其中，已知L-脯氨酸是一种重要的渗透调节因子，Brevibacterium typhimurium中报道(Agr.Bio.Chem.，卷53(9)，2475-2479页，1989年)，L-脯氨酸可以在细胞内积累，增强吡咯啉羧基还原酶的活性，后者是在由细胞外5’-肌苷酸增加造成的渗透性环境下脯氨酸生物合成途径的重要酶。此外，有报道[J，Bacteriol.，，163卷，296页，1985年，]，L-脯氨酸在大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等等细胞内积累，并且被细胞外渗透压调节。
因此，可以预期对于一种能够以高浓度和高产量产生5’-肌苷酸的微生物，通过增加细胞内L-脯氨酸的合成来抑制生长和生物化学代谢过程非常重要，通过加强L-脯氨酸的合成能力来增强渗透压抗性的特征同样很重要。
此外，为了从5-磷酸核糖-α-1-焦磷酸(PRPP)(也就是嘌呤型核酸的一种前体物质)产生5’-肌苷酸，需要2分子谷氨酰胺。谷氨酰胺合成酶是从谷氨酸钠中产生谷氨酰胺的酶，可以被如甘氨酸、丙氨酸、组氨酸等等的氨基酸和CTP、AMP等等非常精巧的调节[大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，1987年，302-320页]。因此，一个相称的谷氨酰胺储备对于5’-肌苷酸的合成是必要的。此外，产生的谷氨酰胺作为一种前体可在多种反应中使用。PRPP酰胺转移酶和5-磷酸核糖-N-甲酰甘氨酰胺(FGAR)酰胺转移酶两种酶采用谷氨酰胺作为底物，合成5’-肌苷酸[大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，1987年，445-473页]。因此，为了更加有效地完成5’-肌苷酸的合成，认为合成相称的谷氨酰胺对于增加涉及5’-肌苷酸合成之PRPP酰胺转移酶和FGAR酰胺转移酶对谷氨酰胺的亲和性非常重要，而不是增加多种需要谷氨酰胺的反应中的其它酶对谷氨酰胺的亲和性。
因此，本发明者对各种氨基酸如何通过直接发酵影响5’-肌苷酸的合成进行了试验。结果，发明者证实当L-谷氨酰胺被加入到5’-肌苷酸培养基内，5’-肌苷酸的发酵浓度增加了，并且对本发明菌株，适量提供L-谷氨酰胺是5’-肌苷酸合成的限速步骤。
发明者证明，导入了对L-谷氨酰胺类似物[如重氮丝氨酸或者6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)]的抗性和对多种L-脯氨酸类似物(诸如3，4-脱氢脯氨酸、L-氮杂-环丁烷羧酸、L-噻唑烷-4羧酸、(S)-2，2-二甲基-4-羟氨基碳酸、(S)-5，5-二甲基-4-噻唑烷-羧酸、(4S，2RS)-2-乙基-4-噻唑啉-羧酸、(2S，4S)-4-羟基-2-吡咯啉-羧酸、2-哌啶羧酸或者2，5-吡咯烷二酮)的抗性之微生物和其它已知菌株相比，可以通过直接发酵的方法以高浓度和高产量产生5’-肌苷酸。本发明就是基于上述这样的发现。
以下，将对本发明进行更明确的解释。
首先，本发明微生物即产氨棒杆菌(ATCC-6872)的一种突变体，其需要腺嘌呤，但不需要黄嘌呤或鸟嘌呤，尽管加入后者可以促进其生长。而且这种微生物缺乏可以同化尿素的脲酶，对溶菌酶(细胞壁降解酶)有高敏感性，该酶被认为能够使细胞壁合成能力部分丧失，从而使大量胞内产生的5’-肌苷酸易于分泌出细胞，而且上述微生物具有对链霉素的抗性，从而可有效应对发酵时发生的污染。
培养期间加入的高浓度葡萄糖、其它碳源以及培养后期积累的5’-肌苷酸可以导致生产5’-肌苷酸的微生物细胞外渗透压增加，从而抑制它们的正常生理活性和细胞生长。因此，希望改善渗透压耐受性来防止5’-肌苷酸产生的降低。
在细胞外环境存在大量积累的溶质时，细胞内脯氨酸对渗透调节起重要作用。本发明微生物对L-脯氨酸类似物(例如L-氮杂环丁烷羧酸、L-噻唑烷-4羧酸、(S)-2，2-二甲基-4-羟氨基碳酸、(S)-5，5-二甲基-4-噻唑烷-羧酸、(4S，2RS)-2-乙基-4-噻唑啉-羧酸、(2S，4S)-4-羟基-2-吡咯啉-羧酸、2-哌啶羧酸或者2，5-吡咯烷二酮)存在抗性，因此，增加脯氨酸的细胞内浓度，能够更有效地排除渗透压的作用。
此外，本发明微生物对L-谷氨酰胺类似物(例如重氮丝氨酸或者6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸(DON))存在抗性，所述类似物在为合成5’-肌苷酸的嘌呤型合成***中尤其重要，通过协调地供应谷氨酰胺导致以高产量和高浓度直接积累5’-肌苷酸。
获得自微生物(CJ112)的一个菌落的本发明突变体，其需要腺嘌呤，而不需要黄嘌呤或者鸟嘌呤，尽管后两个物质可以促进它的生长，并且该菌株缺乏同化尿素的脲酶，作为一个亲本菌株，通过用X-射线、紫外射线和化学的有机致突变物质处理(例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二乙基硫酸盐、乙胺等等)并且通过在含有1.7％琼脂和各种浓度变化量的基本培养基(培养基2)中被适当悬浮和铺展。随后，各个克隆被培养在营养培养基(培养基1)中，然后在种子培养基(培养基3)中培养24小时，然后在发酵培养基(培养基4)中培养5～6天，从而逐步筛选出一种可以产生在培养基中积累最大量5’-肌苷酸的微生物。随后，本发明者在最后步骤的微生物中选择了可以产生在培养基中积累最大量5’-肌苷酸的菌株。上述菌株被命名为CJIP009。根据布达佩斯条约，产氨棒杆菌CJIP009在2000年11月20日被保藏到坐落在汉城Honje-dong，Seodaemun-gu的韩国微生物培养中心，其保藏号为KCCM-10226。
具体的，本发明提供了一个产生5’-肌苷酸的生产工艺，其特征为，依据权利要求1中的产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)突变体在种子培养基中于30℃被培养24小时，然后在发酵罐内种子培养基中于28-34℃，900转/分，pH值7.2的条件下培养和活化1-2天，再在发酵罐中的主培养基内于30℃，900转/分，pH值7.2的条件下培养5-6天，随后，当培养液内的还原糖为2％时，加入果糖、葡萄糖和糖蜜混合物第一、二、三和四次糖分，各次加入并培养的终糖含量达32％。
本发明采用的培养基具有如下组成：
培养基1：营养培养基
蛋白胨1％、牛肉提取物1％、氯化钠(NaCl)0.25％、酵母提取物1％、琼脂2％，pH7.2
培养基2：基本培养基
葡萄糖2.0％、硫酸铵((NH4)2SO4)0.3％、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1％、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.3％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.3％、氯化钙(CaCl2)10mg/l、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)10mg/l、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)1.0mg/l、氯化锰(MnCl2·H2O)3.6mg/l、L-半胱氨酸20mg/l、泛酸钙10mg/l、硫胺盐酸盐5.0mg/l、生物素30μg/l、腺嘌呤20mg/l、鸟嘌呤20mg/l、pH7.3
培养基3：种子培养基
葡萄糖5％、蛋白胨0.5％、牛肉提取物0.5％、酵母提取物1％、氯化钠(NaCl)0.25％、腺嘌呤100mg/l、鸟嘌呤100mg/l，pH7.2
培养基4：烧瓶发酵培养基
谷氨酸钠0.1％、氯化铵(NH4Cl)1.0％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.2％、氯化钙(CaCl2)0.01％、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20mg/l、硫酸锰(MnSO4·H2O)20mg/l、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)20mg/l、硫酸铜(CuSO4·7H2O)5.0mg/l、L-半胱氨酸23mg/l、丙氨酸24mg/l、烟酸8.0mg/l、生物素45μg/l、硫胺盐酸盐5.0mg/l、腺嘌呤30mg/l、磷酸(H3PO4)(85％)1.9％、作为还原糖的果糖、葡萄糖、糖蜜混合物占8％(pH7.2)
培养基5：发酵罐种子培养基
葡萄糖5.4％、蛋白胨1.0％、酵母提取物2.0％、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1％、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.1％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1％、硫酸铵((NH4)2SO4)0.5％、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)80mg/l、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)40mg/l、硫酸锰(MnSO4·H2O)40mg/l、L-半胱氨酸80mg/l、泛酸钙60mg/l、硫胺盐酸盐20mg/l、生物素240μg/l、腺嘌呤1200mg/l、鸟嘌呤1200mg/l，(pH7.2)
培养基6：发酵罐主培养基氯化钙(CaCl2)120mg/l、硫酸铜(CuSO4·7H2O)8.0mg/l、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.5％、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)24mg/l、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)24mg/l、硫酸锰(MnSO4·H2O)24mg/l、L-半胱氨酸26.4mg/l、谷氨酸钠0.12％、硫胺盐酸盐6.0mg/l、生物素40μg/l、烟酸50mg/l、丙氨酸145mg/l、腺嘌呤200mg/l、磷酸(H3PO4)(85％)4.3％、作为还原糖的果糖、葡萄糖、糖蜜混合物占32％(pH7.2)
根据本发明的新突变体CJIP009的代表性变异体之生物化学性质列于如下表1中(本发明不限于如下性质)。表1
  性质   ATCC6872  CJIP009(KCCM-10226)
  腺嘌呤   非需要     需要
  鸟嘌呤(黄嘌呤)   非需要     泄漏
  溶菌酶敏感性(最小生长抑制浓度)   80μg/ml     8μg/ml
  对3，4-脱氢脯氨酸的抗性   1000μg/ml     3500μg/ml
  链霉素   500μg/ml     2000μg/ml
  L-氮杂-环丁烷羧酸   5mg/ml     30mg/ml
  L-噻唑烷-4羧酸   10μg/ml     100μg/ml
  重氮丝氨酸   25μg/ml     100μg/ml
用于本发明的5’-肌苷酸的培养过程如下：
能够产生5’-肌苷酸并且属于棒杆菌类之微生物在受控的温度、pH值等等以及需氧条件下被培养于含有碳源、氮源、氨基酸、维生素等等的常规培养基中。
葡萄糖、果糖、已灭菌预处理的糖蜜(回复为还原糖的糖蜜)等等能被用作碳源。如氨水、氯化铵、硫酸铵的无机氮源和例如蛋白胨、NZ-胺、肉类提取物、酵母提取物、玉米消化液、酪蛋白水解产物、鱼类或者其分解产物，脱脂大豆饼或者其分解产物等等的有机氮源中的每一种可被用作有机氮源。磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸锰(MnSO4·H2O)、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、碳酸钙(CaCO3)等等能被用作无机化合物。如果需要，可加入维生素和碱。例如培养过程可如下进行：在需氧条件下优选在20～40℃，摇动或者鼓气或搅动培养5～6天。培养基pH值优选保持在中性左右。采用传统方法分析通过直接发酵积累的5’-肌苷酸。
                   实现本发明的最佳模式
可以通过以下实施例更好的理解本发明。然而，本领域技术人员易于发现具体材料和下面描述的结果仅仅为例证性的，而不是用来，也不意在用来限定这种如随后的权利要求中充分描述的发明。实施例1：对溶菌酶(LY002)敏感的微生物的选择
实施例1的突变体是由产氨棒杆菌(ATCC-6872)的微生物(CJ112)制备而来，作为亲本菌株，该菌株需要腺嘌呤而不需要黄嘌呤或鸟嘌呤，然而加入后者可以促进生长，该菌株还缺乏同化尿素的脲酶。菌株按107～108细胞/毫升的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH7.0)或者柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)，通过室温下或者32℃加入终浓度为10～50μg/ml N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)20～40分钟来诱导突变，用0.85％生理盐水洗涤二次。通过在含有1.7％琼脂的基本培养基(培养基2)中适当地悬浮和铺展来获得克隆。然后，每个克隆在含有1.7％琼脂的基本培养基(培养基2)和含有1.7％琼脂以及40μg/ml溶菌酶的基本培养基(培养基2)上通过***方式选择。首先，选择在含1.7％琼脂的基本培养基生长而在含1.7％琼脂以及40μg/ml溶菌酶的基本培养基上不生长的微生物。微生物被作为亲本菌株并且被不断地诱导上述突变。第二，选择在含有16μg/ml溶菌酶的基本培养基上不生长的敏感微生物。最后，根据上述方法，选择在含有8μg/ml溶菌酶的基本培养基上不生长的高敏感微生物。高敏感的微生物菌落培养在营养培养基(培养基1)中，然后在种子培养基(培养基3)培养24小时，并且在培养基(培养基4)上培养3～4天，从而选择出能够在培养基中产生并积累最多量的5’-肌苷酸的LY002。显示出微生物敏感性的溶菌酶的浓度列于表2内。表2
 CJ112  LY002
溶菌酶浓度  80μg/ml  8μg/ml
实施例2：链霉素抗性菌株(CISM10)的选择
在实施例2的突变体中，实施例1的LY002被用作亲本菌株。菌株按107～108细胞/毫升的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH7.0)或者柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)，通过室温下或者32℃加入终浓度10～50μg/mlNTG 20～40分钟来诱导突变，然后用0.85％生理盐水洗涤二次。通过适当悬浮和铺展在含有1.7％琼脂并且分别含有1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml链霉素的三种基本培养基(培养基2)中来获得克隆。然后，各个克隆被培养在营养培养基(培养基1)中，随后在种子培养基(培养基3)中培养24小时，并且在培养基(培养基4)中培养3～4天，从而选择出能够在培养基中产生且积累最多量的5’-肌苷酸的CISM10。显示出微生物抗性的链霉素的浓度列于表3内。表3
 LY002  CISM10
链霉素浓度  500μg/ml  2000μg/ml
实施例3：具有3，4-脱氢脯氨酸抗性的菌株(CS101)的选择
在实施例3的突变体中，实施例2的CISM10被用作亲本菌株。菌株按107～108细胞/毫升的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH7.0)或者柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)，通过室温下或者32℃加入终浓度10～50μg/mlNTG20～40分钟来诱导突变，然后用0.85％生理盐水洗涤二次。通过适当悬浮和铺展在含有1.7％琼脂并且分别含有1500μg/ml、2500μg/ml、2000μg/ml 3，4-脱氢脯氨酸的三种基本培养基(培养基2)中来获得克隆。然后，各个克隆被培养在营养培养基(培养基1)中，随后在种子培养基(培养基3)中培养24小时，并且在培养基(培养基4)中培养3～4天，从而选择出能够在培养基中产生目积累最多量的5’-肌苷酸的CIS104。显示出微生物抗性的3，4-脱氢脯氨酸的浓度列于表4内。表4
 CISM10  CS101
 3，4-脱氢脯氨酸浓度  1000μg/ml  3500μg/ml
实施例4：具有L-氮杂环丁烷羧酸抗性的菌株(CIAC12)的选择
在实施例4的突变体中，实施例3的CS101被用作亲本菌株。菌株按107～108细胞/毫升的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH7.0)或者柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)，通过室温下或者32℃加入终浓度10～50μg/mlNTG20～40分钟来诱导突变，然后用0.85％生理盐水洗涤二次。通过适当悬浮和铺展在含有1.7％琼脂并且分别含有10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml的L-氮杂环丁烷羧酸的三种基本培养基(培养基2)中来获得克隆。然后，各个克隆被培养在营养培养基(培养基1)中，随后在接种子培养基(培养基3)中培养24小时，并且在培养基(培养基4)中培养3～4天，从而选择出能够在培养基中产生目积累最多量的5’-肌苷酸的CIAC12。显示微生物抗性的L-氮杂环丁烷羧酸的浓度列于表5内。表5
 CISM10  CIAC12
 L-氮杂环丁烷羧酸浓度  5mg/ml  30mg/ml
实施例5：具有L-噻唑烷-4羧酸抗性的菌株(CITP13)的选择
在实施例5的突变体中，实施例4的CIAC12被用作亲本菌株。菌株按107～108细胞/毫升的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH7.0)或者柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)，通过室温或者32℃下加入终浓度10～50μg/mlNTG20～40分钟来诱导突变，用0.85％生理盐水洗涤二次。通过适当悬浮和铺展在含有1.7％琼脂并且分别含有20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的L-噻唑烷-4羧酸的三种基本培养基(培养基2)中来获得克隆。然后，各个克隆被培养在营养培养基(培养基1)中，随后在种子培养基(培养基3)中培养24小时，并且在培养基(培养基4)中培养3～4天，从而选择出能够在培养基中产生且积累最多量的5’-肌苷酸的CITP13。显示出微生物抗性的L-噻唑烷-4羧酸的浓度列于表6内。表6
 CIAC12  CITP13
 L-噻唑烷-4羧酸浓度  10μg/ml  100μg/ml
实施例6：具有重氮丝氨酸抗性的菌株CJIPP009(KCCM-10226)的选择
在实施例6的突变体中，实施例5的CITP13被用作亲本菌株。菌株按107～108细胞/毫升的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH7.0)或者柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)，通过室温下或者32℃加入终浓度10～50μg/mlNTG20～40分钟来诱导突变，并且用0.85％生理盐水洗涤二次。通过适当悬浮和铺展在含有1.7％琼脂并且分别含有50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml的重氮丝氨酸的三种基本培养基(培养基2)中来获得克隆。然后，各个克隆被培养在营养培养基(培养基1)中，随后在种子培养基(培养基3)中培养24小时，并且在培养基(培养基4)中培养3～4天，从而选择出能够在培养基中产生且积累最多量的5’-肌苷酸的CJIPP009(KCCM-10226)。显示出微生物抗性的重氮丝氨酸的浓度列于表7内。表7
 CITP13 CJIPP009(KCCM-10226)
重氮丝氨酸浓度  25μg/ml  100μg/ml
实施例7：在锥形烧瓶中5’-肌苷酸积累量的测定菌株：CJIPP009(KCCM-10226)种子培养基：葡萄糖5％、蛋白胨0.5％、牛肉提取物0.5％、酵母提取物1％、氯化钠(NaCl)0.25％、腺嘌呤100mg/l、鸟嘌呤100mg/l，pH7.2烧瓶发酵培养基谷氨酸钠0.1％、氯化铵(NH4Cl)1.0％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.2％、氯化钙(CaCl2)0.01％、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)20mg/l、硫酸锰(MnSO4·H2O)20mg/l、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)20mg/l、硫酸铜(CuSO4·7H2O)5.0mg/l、L-半胱氨酸23mg/l、丙氨酸24mg/l、烟酸8.0mg/l、生物素45μg/l、硫胺盐酸盐5.0mg/l、腺嘌呤30mg/l、磷酸(H3PO4)(85％)1.9％、作为还原糖的果糖、葡萄糖和糖蜜的混合物占8％(pH7.2)发酵过程：
在直径18mm的试管内加入3ml种子培养基，并且通过一般方法在高压下灭菌。然后向其中接种菌株，30℃下振摇培养24小时，用作种子培养基。将27ml发酵培养基转入500ml的锥形烧瓶中振摇，在高压下120℃灭菌10分钟。然后向其中接种3ml种子培养液，并培养5～6天。烧瓶在200转/分、30℃和pH7.2下振摇。
5’-肌苷酸积累量为19.1g/l。实施例8：在5L发酵罐内5’-肌苷酸积累量的测定菌株：CJIP009(KCCM-10226)种子培养基：与实施例7相同发酵罐种子培养基
葡萄糖5.4％、蛋白胨1.0％、酵母提取物2.0％、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1％、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.1％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1％、硫酸铵((NH4)2SO4)0.5％、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)80mg/l、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)40mg/l、硫酸锰(MnSO4·H2O)40mg/l、L-半胱氨酸80mg/l、泛酸钙60mg/l、硫胺盐酸盐20mg/l、生物素240μg/l、腺嘌呤1200mg/l、鸟嘌呤1200mg/l(pH7.2)发酵罐主培养基
氯化钙(CaCl2)120mg/l、硫酸铜(CuSO4·7H2O)8.0mg/l、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.5％、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)24mg/l、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)24mg/l、硫酸锰(MnSO4·H2O)24mg/l、L-半胱氨酸26.4mg/l、谷氨酸钠0.12％、硫胺盐酸盐6.0mg/l、生物素40μg/l、烟酸50mg/l、丙氨酸145mg/l、腺嘌呤200mg/l、磷酸(H3PO4)(85％)4.3％、作为还原糖的果糖、葡萄糖和糖蜜的混合物占32％(pH7.2)发酵过程：
在500ml锥形烧瓶中加入50ml种子培养基振摇，并且通过一般方法高压下灭菌。向其中接种菌株，在30℃下振摇培养24小时，用作种子培养基。将1000ml发酵罐种子培养基加入到2.5L发酵罐中，在高压下120℃灭菌15分钟。向其中接种50ml种子培养液，并且培养1～2天。烧瓶在900转/分、28～34℃和pH7.2℃下振摇。然后，将1250ml发酵罐主培养基加入5L发酵罐内，在高压下120℃灭菌15分钟。向其中接种250ml种子培养液，并且培养1～2天。在培养期间当培养基中的还原糖为2％时，补加第一、第二、第三、第四次额外的糖类，即果糖、葡萄糖和糖蜜的混合物，从而令最终还原糖达到32％。然后，混合物被培养5～6天。烧瓶在900转/分、30℃和pH7.2℃下振摇。
5’-肌苷酸在培养基中的积累量为70.3g/l。
                      工业适用性
依照本发明，可以获得比现有技术更高浓度和产量的5’-肌苷酸。依照本发明，可以比现有技术更加经济地获得5’-肌苷酸。

Claims (6)

1.  产氨棒状杆菌CJIP009(KCCM-10226)的突变体，特征为通过直接发酵以高浓度和高产量积累5’-肌苷酸，并且该突变体对选自如重氮丝氨酸或者6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)的L-谷氨酰胺类似物具有抗性，对选自3，4-脱氢脯氨酸、L-氮杂环丁烷羧酸、L-噻唑烷-4羧酸、(S)-2，2-二甲基-4-羟氨基碳酸、(S)-5，5-二甲基-4-噻唑烷-羧酸、(4S，2RS)-2-乙基-4-噻唑啉-羧酸、(2S，4S)-4-羟基-2-吡咯啉-羧酸、2-哌啶羧酸或者2，5-吡咯烷二酮的脯氨酸类似物具有抗性。
2.权利要求1的产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)的突变体，其特征为该突变体是鸟嘌呤或黄嘌呤泄漏型或者需要腺嘌呤的微生物。
3.权利要求1的产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)的突变体，其特征为对溶菌酶的最小生长抑制浓度为8μg/ml。
4.权利要求1的产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)的突变体，其特征为对为防止发酵时发生污染的链霉素具有抗性。
5.一种生产5’-肌苷酸的方法，方法是通过培养权利要求1的棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)突变体，并随后收集培养物质。
6.权利要求5的方法，其特征为权利要求1的产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)突变体在30℃被培养于种子培养基中24小时，在28～34℃，900转/分和pH7.2下在发酵罐种子培养基中培养1～2天，然后在30℃，900转/分和pH7.2下于发酵罐主培养基中培养5-6天。当培养基溶液中的还原糖为2％时，补加入一、二、三、四次果糖、葡萄糖和糖蜜的混合物并培养，各次最终的糖量达到32％。
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