CN111183218B - 新型5’-肌苷酸脱氢酶以及使用其制备5’-肌苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

提供了5'‑肌苷酸脱氢酶的变体、包含其的微生物和使用其制备5'‑肌苷酸的方法。

Description

新型5’-肌苷酸脱氢酶以及使用其制备5’-肌苷酸的方法

发明背景

1.发明领域

本公开涉及5'-肌苷酸脱氢酶的变体、包含其的微生物和使用其制备5'-肌苷酸的方法。

2.相关领域的描述

作为基于核苷酸的材料的5'-肌苷酸(5'-肌苷一磷酸，以下称为IMP)是核酸生物合成的代谢***的中间材料，并且用于多种领域(诸如医疗产品和医疗应用)中。IMP是与5'-鸟苷酸(5'-鸟嘌呤一磷酸，下文称为GMP)一起广泛用作食品调味添加剂或用于食品的材料。已知IMP本身具有牛肉风味，并且已知其增强谷氨酸钠(以下称为MSG)的风味，如同GMP一样。因此，IMP作为基于核苷酸的味道调味料已受到很多关注。

制备IMP的方法包括酶促降解从酵母细胞提取的核糖核酸的方法，将通过发酵产生的肌苷化学磷酸化的方法(Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972)等)，培养能够直接产生IMP的微生物且然后在其培养物中回收IMP的方法等。在这些中，最常用的方法是使用能够直接产生IMP的微生物的方法。

同时，处于其天然状态的酶在工业应用中所需的光学异构体的活性、稳定性、底物特异性等方面并不总是表现出最佳特性。因此，已经进行各种尝试以通过其氨基酸序列的突变等来改进酶，使得它们变得适合于预期用途。在这些中，已经应用酶的合理设计和定点诱变以改进酶功能。然而，在许多情况下，仍存在缺点，因为关于靶酶的结构的信息不充分或结构 - 功能关系不清楚，且因此，不能有效地应用所述方法。在这方面，据报道，已经通过从突变酶文库筛选期望性状的酶的定向进化方法进行酶改进的尝试，导致其活性的改进，所述突变酶文库通过酶基因的随机诱变构建。

本发明人已经进行了广泛的研究，以通过经由微生物发酵直接生产IMP的方法以高产率生产IMP，并且他们已经鉴定参与IMP生产力的蛋白的变体，由此完成了本公开。

发明概述

本公开的一个目的是提供5'-肌苷酸脱氢酶的变体。

本公开的另一个目的是提供编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸。

本公开的又另一个目的是提供包含所述多核苷酸的载体。

本公开的又另一个目的是提供产生5'-肌苷酸的微生物，其包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体和载体。

本公开的又另一个目的是提供制备5'-肌苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养棒杆菌属的微生物；和从微生物或培养基回收5'-肌苷酸。

优选实施方案的详述

优选实施方案如下详细描述。同时，本申请中公开的各个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。也就是说，本申请中公开的各种要素的所有组合都落入本申请的范围内。进一步，本申请的范围不受以下具体描述的限制。

为了实现上述目的，本公开的一个方面提供了5'-肌苷酸脱氢酶的变体，其具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代的多肽。具体地，本公开提供了5'-肌苷酸脱氢酶的变体，其具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代的多肽，其中所述氨基酸取代包括至少任一个选自以下的氨基酸取代：用苏氨酸取代N-末端起位置377的氨基酸和用异亮氨酸取代N-末端起位置499的氨基酸。本公开的另一个方面提供了具有5'-肌苷酸脱氢酶活性的5'-肌苷酸脱氢酶的变体，所述变体具有包含以下的氨基酸序列：在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中用苏氨酸取代位置377的氨基酸，用异亮氨酸取代位置499的氨基酸，或其组合。具体地，5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代，其中所述氨基酸取代可以包括至少任一个选自以下的氨基酸取代：用苏氨酸取代位置377的氨基酸和用异亮氨酸取代位置499的氨基酸。

如本文所用，术语“5'-肌苷酸脱氢酶”是指参与产生5'-肌苷酸(5'-肌苷一磷酸；IMP)的蛋白。关于本公开的目的，该术语可与肌苷-5'-一磷酸脱氢酶、IMP脱氢酶、肌苷酸脱氢酶、IMPDH等互换使用。

在本公开中，SEQ ID NO:2是指具有5'-肌苷酸脱氢酶活性的氨基酸序列。具体地，SEQ ID NO:2是具有5'-肌苷酸脱氢酶活性的蛋白的序列，其由guaB基因编码。SEQ ID NO:2的氨基酸序列可以从NCBI GenBank(其为公共数据库)获得。例如，SEQ ID NO:2的氨基酸序列可以源自停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但不限于此，并且可以包括且不限于具有与上述氨基酸序列的活性相同的活性的任何序列。进一步，所述氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80%或更高同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，所述氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性或同一性的氨基酸序列。具有同源性或同一性的氨基酸序列可以是来自上述范围的那些，不包括具有100%同一性的序列，或者可以是具有少于100%同一性的序列。进一步，显而易见的是，其具有的氨基酸序列具有一些氨基酸的缺失、修饰、取代或添加的蛋白也落在本发明的范围内，只要其具有同源性或同一性并且表现出对应于上述蛋白的效力的效力。

如本文所用，术语“5'-肌苷酸脱氢酶的变体”可与具有产生IMP的能力的变体多肽、产生IMP的变体多肽、具有5'-肌苷酸生产力的变体多肽、产生5'-肌苷酸的变体多肽、具有5'-肌苷酸脱氢酶活性的变体多肽、5'-肌苷酸脱氢酶变体等互换使用。进一步，所述蛋白可以源自棒杆菌属，具体地停滞棒杆菌，但不限于此。

5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的N-末端起位置377和/或位置499的变异。5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以是与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的那些或源自野生型微生物的未修饰的5'-肌苷酸脱氢酶相比具有以下取代且具有弱化活性的变体：用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸，用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸，或用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸和用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸。这种5'-肌苷酸脱氢酶的变体意指在SEQ ID NO:2和/或与SEQ ID NO:2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性或同一性的氨基酸序列中从N-末端起在位置377和/或位置499具有氨基酸变异的那些，如上所述。

具体地，与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有用苏氨酸取代位置377的氨基酸，用异亮氨酸取代位置499的氨基酸，或用苏氨酸取代位置377的氨基酸和用异亮氨酸取代位置499的氨基酸，并且所述多肽可以具有弱化的5'-肌苷酸脱氢酶活性，但不限于此。

关于本公开的目的，包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体的微生物的特征在于产生的IMP的量增加。这是显著的，因为本公开的5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以增加产生的IMP的量，而棒杆菌属的野生型菌株不能产生IMP，或者即使其可以产生IMP，其只能产生非常少量的IMP。

具体地，包含在由SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列中具有用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸、用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸或用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸和用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸的氨基酸序列的5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以包含选自SEQ ID NO:6、7和8的至少任一者。更具体地，在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有用苏氨酸取代位置377的氨基酸、用异亮氨酸取代位置499的氨基酸或用苏氨酸取代位置377的氨基酸和用异亮氨酸取代位置499的氨基酸的5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以包含选自SEQ ID NO:6、7和8的至少任一者。5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以由选自SEQ ID NO:6、7和8的至少任一者组成。进一步，5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以包含具有SEQ ID NO:6、7或8的氨基酸序列或与其具有80%或更高同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开的5'-肌苷酸脱氢酶的变体可以包括具有SEQ ID NO:6、7或8的多肽和与SEQ ID NO:6、7或8具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性或同一性的多肽。进一步，显而易见的是，其具有的氨基酸序列具有除了位置377或499的氨基酸以外的一些氨基酸的缺失、修饰、取代或添加的蛋白也落在本发明的范围内，只要其具有同源性或同一性并且表现出对应于上述蛋白的效力的效力。

换言之，即使本公开描述了‘具有由特定SEQ ID NO代表的氨基酸序列的蛋白或多肽’，但显而易见的是，本公开中还可以使用其具有的氨基酸序列具有一些氨基酸的缺失、改变、取代、保守取代或添加的蛋白，只要其具有与具有相应SEQ ID NO的氨基酸序列的多肽的活性相同或相应的活性。例如，只要蛋白具有与5'-肌苷酸脱氢酶的变体的活性相同或相应的活性，其不排除在氨基酸序列的前端和末端的不改变蛋白的功能的序列的添加，天然存在的突变，沉默突变或其保守取代。显而易见的是，具有这种序列添加或突变的蛋白也落在本公开的范围内。

“保守取代”意指用另一种具有相似结构和/或化学特性的氨基酸替代氨基酸。该氨基酸取代通常可以基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；且带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；且疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

因此，在本公开中，“变体”可以进一步包括在‘具有由特定SEQ ID NO代表的氨基酸序列的蛋白或多肽’中的一个或多个氨基酸的保守取代和/或修饰。例如，某些变体可以包括其中已去除一个或多个部分(诸如N-末端前导序列或跨膜结构域)的变体。其他变体可以包括其中已从成熟蛋白的N-和/或C-末端除去一部分的变体。所述变体还可以包含其他修饰，包括氨基酸的缺失或添加，其对多肽的特性和二级结构具有最小影响。例如，所述多肽可以在蛋白的N-端末端与信号(或前导)序列缀合，所述信号(或前导)序列在翻译同时或翻译后指导蛋白的转移。所述多肽还可以与另一序列或接头缀合，以易于多肽的鉴定、纯化或合成。术语“变体”可以与修饰、修饰的蛋白、修饰的多肽、突变体、突变蛋白、相异体(divergent)等互换使用，并且可以使用且不限于任何术语，只要它在被修饰的意义上使用。

同源性和同一性意指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。

术语“同源性和同一性”经常可以彼此互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，所述标准比对算法与由待使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，同源或相同序列可以在中等或高度严格条件下沿其整个序列或在整个长度的至少约50%、约60%、约70%、约80%或约90%杂交。关于待杂交的多核苷酸，还可以考虑包含简并密码子而不是密码子的多核苷酸。

任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过例如已知的计算机算法诸如使用如Pearson等人(1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]:2444等人中的默认参数的“FASTA”程序来确定，或者可替代地，可以通过使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)来确定，如EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等人, 2000, Trends Genet.16:276-277) (版本5.0.0或更新版本) (包括GCG程序包(Devereux, J., 等人, Nucleic Acids Research 12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]:403 (1990); Guide toHuge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994和[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48:1073)中所实施。例如，可以使用National Center for Biotechnology Information的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序(诸如Needleman等人(1970), J Mol Biol.48:443，如Smith和Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482中所公开)比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短的符号的总数。GAP程序的默认参数可以包括：(1)Gribskov等人(1986) Nucl.Acids Res.14:6745的一元比较矩阵(对于同一性，含有值1，且对于非同一性，含有值0)和加权比较矩阵(或EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)，如Schwartz和Dayhoff, 编, Atlas Of Protein Sequence AndStructure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979)所述；(2)每个空位的罚分为3.0，且每个空位中的每个符号的额外罚分为0.10(或空位开放罚分10，空位延长罚分0.5)；和(3)末端空位没有罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”代表序列之间的相关性。

显而易见的是，也可以包括由于密码子简并性而被翻译成具有选自SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列的多肽或与其具有同源性或同一性的多肽的多核苷酸。例如，所述多核苷酸可以具有选自SEQ ID NO:3、4和5的核苷酸序列。进一步，通过在严格条件下与由已知基因序列制备的探针杂交，例如，与所述核苷酸序列的全部或部分互补的序列，编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体(其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有用苏氨酸取代位置377的氨基酸、或用异亮氨酸取代位置499的氨基酸的氨基酸序列)的多核苷酸序列，可以包括在内，但不限于此。

本公开的又另一个方面提供了编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指作为核苷酸聚合物的具有超过特定长度的DNA或RNA链，所述核苷酸聚合物为通过共价键连接的核苷酸单体的长链，更具体地，术语“多核苷酸”是指编码多肽的多核苷酸片段。

编码本公开的5'-肌苷酸脱氢酶变体的多核苷酸可以包括且不限于任何多核苷酸序列，只要其编码具有本公开的5'-肌苷酸脱氢酶活性的变体多肽。在本公开中，编码5'-肌苷酸脱氢酶的氨基酸序列的基因是guaB基因，且具体地，所述基因可以源自停滞棒杆菌，但不限于此。

具体地，由于密码子简并性或通过考虑其中能够表达多肽的微生物偏好的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内在本公开的多核苷酸的编码区中进行各种修饰。可以包括且不限于任何多核苷酸序列，只要其编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体，所述5'-肌苷酸脱氢酶的变体在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有以下取代：用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸，用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸，或用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸和用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸。例如，编码本公开的5'-肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸可以具有编码选自SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列的多核苷酸序列，但不限于此。更具体地，所述多核苷酸可以具有选自SEQ ID NO:3、4和5的多核苷酸序列，但不限于此。

进一步，通过在严格条件下与由已知基因序列制备的探针杂交，例如，可以包括且不限于与所述核苷酸序列的全部或部分互补的序列，编码具有5'-肌苷酸脱氢酶的变体的活性的蛋白的序列，所述5'-肌苷酸脱氢酶的变体在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有以下取代：用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸，用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸，或用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸和用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸。“严格条件”意指允许多核苷酸之间的杂交的条件。此类条件在文献中详细描述(例如，J. Sambrook等人，与上述相同)。所述严格条件可以包括具有高同源性或同一性的基因，例如，具有40%或更多、具体是90%或更多、更具体是95%或更多、又更具体是97%或更多、尤其具体是99%或更多同源性或同一性的基因能够彼此杂交的条件，具有较低同源性或同一性的基因不能彼此杂交的条件，或作为Southern杂交的常见洗涤条件的条件，例如，对应于60℃、1X SSC、0.1%SDS，具体是60℃、0.1X SSC、0.1% SDS，更具体是68℃、0.1X SSC、0.1% SDS的盐浓度和温度，洗涤一次，具体是两次或三次。

杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与完整序列互补的分离的核酸片段以及实质上相似的核酸序列。

具体地，可以通过包括在55℃的T_m下的杂交步骤的杂交条件且通过利用上述条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。此外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且根据目的由本领域技术人员适当地控制。

用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域众所周知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51, 11.7-11.8)。

在本公开中，编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体的氨基酸序列的基因是guaB基因，并且编码其的多核苷酸与上述相同。

在本公开中，编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸也与上述相同。

如本文所用，术语“载体”意指含有编码期望多肽的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，所述核苷酸序列与合适的调节序列可操作连接，使得期望多肽在合适的宿主中表达。所述调节序列可以包括引导转录的启动子，调节此类转录的某些操纵子序列，编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列，以及调节转录和翻译的终止的序列。一旦转化至合适的宿主中，所述载体可以独立于宿主基因组复制或发挥功能，或者可以整合至基因组本身中。

本公开中使用的载体可以没有具体限制，只要所述载体在宿主细胞中可复制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和细菌噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等，并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

例如，可以将编码期望多肽的多核苷酸***染色体中。可以使用本领域已知的任何方法，例如通过同源重组，进行多核苷酸***染色体，但不限于此。可以进一步包括用于证实载体***染色体的选择标记。所述选择标记用于选择用载体转化的细胞，即，以证实是否已***期望的核酸分子，并且可以使用能够提供可选择的表型(诸如耐药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性和表面多肽的表达)的标记。在处理选择性试剂的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才可以存活或表达其他表型性状，且因此可以容易地选择转化的细胞。在本公开的又另一个方面，本公开通过包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体或编码其的多核苷酸提供了产生5'-肌苷酸的微生物。具体地，包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体和/或编码其的多核苷酸的微生物可以是通过用包含所述多核苷酸的载体转化制备的微生物，但不限于此。

如本文所用，术语“转化”是指这样的过程：将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，使得由所述多核苷酸编码的蛋白能够在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸是否***宿主细胞的染色体并位于其上或位于染色体外是无关紧要的，只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达。进一步，所述多核苷酸可以包括编码靶蛋白的DNA和RNA。所述多核苷酸可以以任何形式引入，只要可以将所述多核苷酸引入宿主细胞并在其中表达。例如，所述多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包含其自主表达所需的所有元件的基因构建体。所述表达盒可以包含启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和可与所述多核苷酸可操作连接的翻译终止信号。所述表达盒可以呈进行自我复制的表达载体的形式。另外，可以将所述多核苷酸引入宿主细胞中，以便与宿主细胞中表达所需的序列可操作连接，但不限于此。

进一步，术语“可操作连接”是指基因序列和启动子序列之间的功能性连接，所述启动子序列启动和介导编码本公开的期望多肽的多核苷酸的转录。

如本文所用，术语“包含变体多肽的微生物”或“包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体的微生物”意指通过为具有产生IMP的天然弱能力的微生物或没有产生IMP的能力的亲本菌株提供产生IMP的能力而制备的微生物。具体地，所述微生物可以是表达5'-肌苷酸脱氢酶的变体的微生物，所述5'-肌苷酸脱氢酶的变体具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代的多肽，其中所述氨基酸取代可以包括至少任一个选自以下的氨基酸取代：用苏氨酸取代N-末端起位置377的氨基酸和用异亮氨酸取代N-末端起位置499的氨基酸。进一步，所述微生物可以是表达变体多肽的微生物，其中所述微生物通过在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中进行以下取代而具有5'-肌苷酸脱氢酶活性：用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸，用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸，或用另一种氨基酸取代位置377的氨基酸和用另一种氨基酸取代位置499的氨基酸，但不限于此。

所述微生物可以是这样的细胞或微生物，所述细胞或微生物可以包含编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸，或者可以用包含编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸的载体转化所述细胞或微生物以表达5'-肌苷酸脱氢酶的变体，并且就本公开的目的而言，所述宿主细胞或微生物可以是任何微生物，只要其包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体以产生5'-肌苷酸。

在本公开中，产生5'-肌苷酸的微生物可以与产生5'-肌苷酸的微生物或具有5'-肌苷酸生产力的微生物互换使用。

如本文所用，术语“产生5'-肌苷酸的微生物”可以是其中发生遗传修饰或增强活性以产生期望的5'-肌苷酸的微生物，包括所有野生型微生物或其中天然或人工发生遗传修饰的微生物，并且所述微生物可以是其中通过***外源基因或通过内源基因的活性的增强或失活来弱化或增强特定机制的微生物。就本公开的目的而言，产生5'-肌苷酸的微生物的特征在于，所述微生物包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体，以具有期望的5'-肌苷酸的增加生产力，且具体地，所述微生物可以是棒杆菌属的微生物。具体地，在本公开中，产生5'-肌苷酸的微生物或具有5'-肌苷酸生产力的微生物可以是其中参与5'-肌苷酸生物合成途径的一部分基因被增强或弱化或者参与5'-肌苷酸降解途径的一部分基因被增强或弱化的微生物。例如，所述微生物可以是其中编码磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶的purF的表达增强或编码腺苷酸琥珀酸合成酶的purA的表达弱化的微生物，但不限于此。

如本文所用，术语“产生5'-肌苷酸的棒杆菌属微生物”是指其天然或通过突变而具有5'-肌苷酸生产力的棒杆菌属的微生物。具体地，如本文所用，具有5'-肌苷酸生产力的棒杆菌属微生物可以是棒杆菌属的微生物，其通过增强或弱化编码5'-肌苷酸脱氢酶的guaB基因的活性而具有提高的5'-肌苷酸生产力。更具体地，如本文所用，具有5'-肌苷酸生产力的棒杆菌属微生物可以是棒杆菌属的微生物，其通过包含5'-肌苷酸脱氢酶的变体或编码其的多核苷酸或通过用包含编码5'-肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸的载体转化而具有提高的5'-肌苷酸生产力。‘具有提高的5'-肌苷酸生产力的棒杆菌属的微生物’意指与转化前的亲本菌株或未修饰的微生物相比具有提高的5'-肌苷酸生产力的微生物。‘未修饰的微生物’意指野生型菌株本身，或不包含产生5'-肌苷酸的变体蛋白的微生物，或未用包含编码5' - 肌苷酸脱氢酶的变体的多核苷酸的载体转化的微生物。

如本文所用，“棒杆菌属的微生物”可以具体地是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)等，但不限于此。

本公开的又另一个方面提供了制备5'-肌苷酸的方法，其包括在培养基中培养产生5'-肌苷酸的棒杆菌属微生物；和从微生物或培养基回收5'-肌苷酸。

在所述方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养、连续培养、补料分批培养等进行，但不具体限于此。在这方面，培养条件没有具体限制，但可以通过使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节最佳pH(例如，pH 5至pH 9，具体是pH 6至pH 8，并且最具体是pH 6.8)。可以通过向培养物中添加氧气或含氧气体混合物来维持需氧条件。培养温度可以维持在20℃至45℃，且特别是在25℃至40℃，并且培养可以进行约10小时至约160小时，但不限于此。通过培养产生的5'-肌苷酸可以分泌至培养基中或可以保留在细胞内。

此外，在待使用的培养基中，作为碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等可以单独使用或在混合物中使用，但碳源不限于此。作为氮源，含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可以单独使用或在混合物中使用，但氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、与其对应的含钠盐等可以单独使用或在混合物中使用，但磷源不限于此。所述培养基还可以包含必需的生长促进物质，诸如其他金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。

回收在本公开的培养步骤中产生的5'-肌苷酸的方法是根据培养方法通过使用本领域已知的适当方法从培养液收集5'-肌苷酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以通过使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物回收期望的5'-肌苷酸。

进一步，所述回收步骤可以包括纯化过程。可以通过使用本领域已知的适当方法进行纯化过程。因此，回收的5'-肌苷酸可以是纯化形式或包含5'-肌苷酸的微生物发酵液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008)。

在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，对于本公开所属领域的技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明性目的，并且本公开的范围不旨在受这些实施例的限制。

实施例1：基于野生型的产生IMP的菌株的制备

棒杆菌属的野生型菌株不能产生IMP或可以以非常少的量产生IMP。因此，基于停滞棒杆菌ATCC6872制备产生IMP的菌株。更具体地，产生IMP的菌株通过增强编码磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase)(嘌呤生物合成的第一种酶)的PurF的活性和弱化5'-肌苷酸降解途径中编码腺苷酸琥珀酸合成酶的PurA的活性来制备。

实施例1-1：purF-增强的菌株的制备

为了制备其中改变purF的起始密码子的菌株，首先制备含有purF的***载体。为了将purF基因克隆至***载体中，具体地，使用作为模板的停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA和SEQ ID NO: 9和10以及SEQ ID NO:11和12的引物进行PCR，30个循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。使用作为模板的通过上述PCR获得的两个DNA片段和SEQ ID NO:9和12的引物进行PCR，30个循环：在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟，以获得DNA片段。获得的DNA片段通过限制酶XbaI切割，并克隆至已用同一酶切割的载体(pDZ(韩国专利号10-0924065和国际专利公开号2008-033001))中。通过上述方法制备的载体命名为pDZ-purF-g1a。

[表1]

SEQ ID NO.	引物	序列(5'-3′)
			9	pDZ-purF(g1a)-1	GCTCTAGACCACTCTAAGACGCGGCCACC
10	pDZ-purF(g1a)-2	AAGTAGTGTTCACCATGACGCTGATTCTACTAAGTTT
			11	pDZ-purF(g1a)-3	AGTAGAATCAGCGTCATGGTGAACACTACTTTCCCCAG
12	pDZ-purF(g1a)-4	GCTCTAGACTGTGCGCCCACGATATCCAG

将重组载体pDZ-purF-g1a通过电穿孔转化至停滞棒杆菌ATCC6872中，然后在含有25 mg/L卡那霉素的培养基上选择其中通过同源重组将载体***基因组DNA的菌株。对因此选择的初始菌株进行二次交换，且然后对选择的菌株进行测序，由此选择其中引入突变的期望菌株，并将该菌株命名为ATCC6872::purF(g1a)菌株。

实施例1-2：purA-弱化的菌株的制备

为了制备其中改变purA的起始密码子的菌株，首先制备含有purA的***载体。为了将purA基因克隆至***载体中，具体地，使用作为模板的停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA和SEQ ID NO: 13和14以及SEQ ID NO:15和16的引物进行PCR。如实施例1-1中那样进行PCR产物的克隆，并将因此制备的载体命名为pDZ-purA-a1t。

[表2]

SEQ ID NO.	引物	序列(5'-3′)
			13	pDZ-purA(a1t)-1	GCTCTAGAGGCCACGATGCCCGGAGCATC
14	pDZ-purA(a1t)-2	TAACGATAGCTGCCAAGGTTATTCACTTCCTAGATTT
			15	pDZ-purA(a1t)-3	AGGAAGTGAATAACCTTGGCAGCTATCGTTATCGTCG
16	pDZ-purA(a1t)-4	GCTCTAGAGGTCACGAATGGGTAGGTGCC

将重组载体pDZ-purA-a1t通过电穿孔转化至实施例1-1中制备的ATCC6872::purF(g1a)菌株中，然后在含有25 mg/L卡那霉素的培养基上选择其中通过同源重组将载体***基因组DNA的菌株。对因此选择的初始菌株进行二次交换，且然后对选择的菌株进行测序，由此选择其中引入突变的期望菌株。

将最终选择的基于野生型停滞棒杆菌ATCC6872的产生IMP的菌株命名为CJI2331。

实施例1-3：CJI2331的发酵滴度测试

将2 mL种子培养基分配至直径为18 mm的试管中并在压力下高压灭菌。接种ATCC6872和CJI2331中的每一种并在30℃下在振荡下孵育24小时以用作种子培养物。将29mL发酵培养基分配至250 mL摇动锥形瓶中，并在压力下在121℃下高压灭菌15分钟，并接种2 mL种子培养物并孵育3天。调节培养条件，转速为170 rpm，温度为30℃，且pH为7.5。

在完成培养之后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量产生的IMP的量，且培养结果如下表3中所示。以下结果表明purF-增强和purA-弱化的菌株具有IMP生产力。

[表3]

菌株的名称	IMP (g/L)
		ATCC6872	0
CJI2331	1.05

- 种子培养基：1%葡萄糖，1%蛋白胨，1%肉提取物，1%酵母提取物，0.25%氯化钠，100 mg/L腺嘌呤，100 mg/L鸟嘌呤，pH 7.5

-发酵培养基：0.1%谷氨酸钠，1%氯化铵，1.2%硫酸镁，0.01%氯化钙，20 mg/L硫酸铁，20 mg/L硫酸锰，20 mg/L硫酸锌，5 mg/L硫酸铜，23 mg/L L-半胱氨酸，24 mg/L丙氨酸，8 mg/L烟酸，45 μg/L生物素，5 mg/L盐酸硫胺素，30 mg/L腺嘌呤，1.9%磷酸(85%)，2.55%葡萄糖，1.45%果糖

实施例2：5'-肌苷酸脱氢酶弱化的变体的制备

为了鉴定提高IMP生产力的5'-肌苷酸脱氢酶突变，制备guaB(其为编码5'-肌苷酸脱氢酶的基因)的突变体文库。

实施例2-1：含有guaB的载体的制备

为了制备guaB突变体文库，首先制备含有guaB的重组载体。使用作为模板的停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA和SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物进行PCR，并通过使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆至大肠杆菌载体pCR2.1中以获得pCR-guaB。

[表4]

SEQ ID NO.	引物	序列(5'-3′)
			17	pCR-guaB-F	ACTGCATTACACGGATATGTA
18	pCR-guaB-R	CCTCGTGGCGTCCCCACAAAC

实施例2-2：guaB突变体文库的制备

基于实施例2-1中制备的载体制备guaB突变体文库。通过使用易错PCR试剂盒(clontech Diversify® PCR随机诱变试剂盒)制备文库。在可以发生突变的条件下，使用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物进行PCR。具体地，在可以发生每1000 bp 0至3个突变的条件下，在94℃下进行预热30秒，随后进行25个循环的94℃持续30秒和68℃持续1分30秒。对因此获得的PCR产物使用大引物(500 ng至125 ng)进行PCR，25个循环：95℃持续50秒，60℃持续50秒和68℃持续12分钟，且然后用DpnI处理，并转化至大肠杆菌DH5α中，并在含有卡那霉素(25 mg/L)的LB固体培养基上涂布。选择20种转化的菌落，且然后获得质粒，随后进行测序分析。结果证实，突变以2个突变/ kb的频率在不同位点引入。取约20,000个转化的大肠杆菌菌落并提取质粒，并命名为pTOPO-guaB-文库。

[表5]

SEQ ID NO.	引物	序列(5'-3′)
			19	ptopO-guaB-文库-F	ATTGCATGGCTTGACGTTTGA
20	ptopT-guaB-文库-R	ATCAATGTGCCACTGCGTGCT

实施例2-3：制备的文库的评估和菌株的选择

将实施例2-2中制备的pTOPO-guaB-文库通过电穿孔转化至实施例1中制备的CJI2331菌株中，且然后涂布在含有25 mg/L卡那霉素的营养培养基上，以获得其中***突变体基因的10,000个菌落。将每个菌落命名为CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1至CJI2331_pTOPO_guaB(mt)10000。

- 营养培养基：1%蛋白胨，1%肉提取物，0.25%氯化钠，1%酵母提取物，2%琼脂，pH7.2

将获得的10,000个菌落各自接种于200 μL在压力下高压灭菌的种子培养基中，并在96-深孔板中通过使用微孔板振荡器(TAITEC)在30℃、1200 rpm下在振荡下培养24小时，且然后用作种子培养物。将290 μL在压力下高压灭菌的发酵培养基分配至96-深孔板中，并将20 μL每种种子培养物接种至其中，随后在与上述相同的条件下在振荡下培养72小时。

为了分析培养基中5'-肌苷酸的产生，在完成培养之后，将3 μL培养上清液转移至96-孔UV板中，每个孔含有197 μL蒸馏水。接下来，使用微孔板阅读器进行振荡30秒，并使用分光光度计来在25℃下测量270 nm处的光密度，并与CJI2331菌株的光密度进行比较，以选择显示光密度的10%或更多增加的50个突变菌株菌落。与调节物(the regulatory)相比，其他菌落显示相似或降低的光密度。

以与上述相同的方式测量50个所选菌株的光密度，以重复检查5'-肌苷酸的产生量。选择CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209和CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927的三种菌株，与CJI2331菌株相比，其显示5'-肌苷酸生产力的显著提高。

实施例2-4：通过测序鉴定突变

为了鉴定突变菌株的基因突变，对CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133、CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209和CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927各自进行使用SEQ ID NO:21和22的引物的PCR，随后进行测序。将它们的guaB基因与野生型菌株ATCC6872和CJI2331的guaB基因进行比较。

作为结果，发现所有三种菌株包含在不同位点的guaB基因突变。

具体地，证实在由SEQ ID NO:2代表的GuaB基因的氨基酸序列中，CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133菌株在位置499具有苏氨酸至异亮氨酸的取代突变，CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209菌株在位置377具有丙氨酸至苏氨酸的取代突变，并且CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927菌株在位置377具有丙氨酸至苏氨酸的取代突变且在位置499具有苏氨酸至异亮氨酸的取代突变。因此，在以下实施例3和4中，检查上述突变各自是否影响棒杆菌属微生物的产生的IMP量。

实施例3：CJI2331中IMP生产力的检查

将实施例2中鉴定的突变引入CJI2331，其是源自ATCC6872的产生IMP的菌株，并检查IMP生产力。

实施例3-1：引入突变的菌株的制备

为了引入实施例2中鉴定的突变，分别设计含有靶突变的反向寡核苷酸，长度为75-聚体。

具体地，将30 μg的SEQ ID NO:23或24的寡核苷酸通过电脉冲方法(Appl.Microbiol. Biothcenol., 1999,52:541-545)转化至CJI2331菌株中，并且向其中添加1mL的复合液体培养基，随后在30℃和160 rpm下在振荡下培养30分钟。其后，将培养物在冰中孵育10分钟，并在4℃和4000 rpm下离心10分钟，并弃去上清液，以获得细胞沉淀。然后，向其中添加4℃的1 mL 10%甘油溶液，随后混合。将混合物在4℃和4000 rpm下离心10分钟。弃去上清液，并洗涤细胞沉淀。再次洗涤细胞沉淀，并向其中添加4℃的0.1 mL 10%甘油溶液以制备用于随后转化的细胞。其后，将细胞通过上述电脉冲方法用SEQ ID NO:23或24的寡核苷酸转化，并将该程序重复十次。将细胞涂布在复合琼脂板上以获得菌落(Nat.Protoc., 2014 Oct;9(10):2301-16)。

对获得的菌落进行测序分析。作为结果，发现靶突变被引入菌株中。将在由guaB基因编码的蛋白中引入有A377T突变的菌株命名为CJI2331_guaB_m1，并将在相同蛋白中引入有T499I突变的菌株命名为CJI2331_guaB_m2。

进一步，为了制备包含A377T和T499I突变两者的突变菌株，将30 μg的SEQ ID NO:24的寡核苷酸转化至CJI2331_guaB_m1菌株中，并以与上述相同的方式获得菌落(Nat.Protoc., 2014 Oct;9(10):2301-16)。对获得的菌落进行测序分析，并选择在由guaB基因编码的蛋白中引入有A377T和T499I突变两者的菌株，并命名为CJI2331_guaB_m1m2。

[表6]

实施例3-2：引入突变的菌株中IMP生产力的检查

将2 mL种子培养基分配至直径为18 mm的试管中并在压力下高压灭菌。接种ATCC6872和CJI2331每一者并在30℃下在振荡下孵育24小时以用作种子培养物。将29 mL发酵培养基分配至250 mL摇动锥形瓶中，并在压力下在121℃下高压灭菌15分钟，并接种2 mL种子培养物并孵育3天。调节培养条件，转速为170 rpm，温度为30℃，且pH为7.5。

在完成培养之后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量产生的IMP的量，且结果如下表7中所示。如以下结果中所示，与调节性CJI2331菌株相比，在由guaB基因编码的蛋白中具有A377T突变或T499I突变的CJI2331_guaB_m1或CJI2331_guaB_m2菌株显示IMP浓度分别提高0.42 g/L (40%)或0.21 g/L (20%)。进一步，具有A377T和T499I突变两者的CJI2331_guaB_m1m2菌株显示IMP浓度的0.58 g/L (50%)的最大提高，表明当同时包含两个突变时，可以获得IMP浓度的最有效提高。

[表7]

菌株	IMP (g/L)
		CJI2331	1.05
CJI2331_guaB_m1	1.47
		CJI2331_guaB_m2	1.26
CJI2331_guaB_m1m2	1.58

实施例4：源自ATCC6872的产生IMP的菌株中IMP生产力的检查

实施例4-1：源自ATCC6872的产生IMP的菌株的选择

为了制备源自ATCC6872的产生IMP的菌株，将ATCC6872以10⁷个细胞/mL至10⁸个细胞/mL的密度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH 7.0)或柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中，且然后在室温或32℃下用UV处理20分钟至40分钟以诱导突变。将菌株用0.85%盐水溶液洗涤两次，并涂布在含有1.7%琼脂的基本培养基上，所述培养基补充有适当浓度的用于提供抗性的物质，且因此获得菌落。将每个菌落在营养培养基中培养，并在种子培养基中培养24小时，且然后在发酵培养基中培养3至4天。作为结果，选择显示已在培养基中积累的IMP的最优异产生的菌落。为了制备产生高浓度的IMP的菌株，通过上述程序依次提供腺嘌呤-营养缺陷型、鸟嘌呤-泄漏型、溶菌酶敏感性、3,4-脱氢脯氨酸抗性、链霉素抗性、氮杂环丁烷羧酸抗性、硫代脯氨酸抗性、重氮丝氨酸抗性、磺胺胍抗性、正缬氨酸抗性、和三甲氧苄二氨嘧啶抗性。最终选择提供有上述抗性并具有优异IMP生产力的CJI2335。比较CJI2335相对于ATCC6872的抗性并显示于下表8中。

[表8]

特征	ATCC6872	CJI2335
			腺嘌呤-营养缺陷型	非营养缺陷型	营养缺陷型
鸟嘌呤-泄漏型	非营养缺陷型	泄露型
			溶菌酶敏感性	80 μg/mL	8 μg/mL
3,4-脱氢脯氨酸抗性	1000 μg/mL	3500 μg/mL
			链霉素抗性	500 μg/mL	2000 μg/mL
氮杂环丁烷羧酸抗性	5 mg/mL	30 mg/mL
			硫代脯氨酸抗性	10 μg/mL	100 μg/mL
重氮丝氨酸抗性	25 μg/mL	100 μg/mL
			磺胺胍抗性	50 μg/mL	200 μg/mL
正缬氨酸抗性	0.2 mg/mL	2 mg/mL
			三甲氧苄二氨嘧啶抗性	20 μg/mL	100 μg/mL

-基本培养基：2%葡萄糖，0.3%硫酸钠，0.1%磷酸二氢钾，0.3%磷酸氢二钾，0.3%硫酸镁，10 mg/L氯化钙，10 mg/L硫酸铁，1 mg/L硫酸锌，3.6 mg/L氯化锰，20 mg/L L-半胱氨酸，10 mg/L泛酸钙，5 mg/L盐酸硫胺素，30 μg/L生物素，20 mg/L腺嘌呤，20 mg/L鸟嘌呤，调节至pH 7.3。

实施例4-2：CJI2335的发酵滴度测试

将2 mL种子培养基分配至直径为18 mm的试管中并在压力下高压灭菌。接种ATCC6872和CJI2335每一者并在30℃下在振荡下孵育24小时以用作种子培养物。将29 mL发酵培养基分配至250 mL摇动锥形瓶中，并在压力下在121℃下高压灭菌15分钟，并接种2 mL种子培养物并孵育3天。调节培养条件，转速为170 rpm，温度为30℃，且pH为7.5。

在完成培养之后，通过HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量产生的IMP的量，且结果如下表9中所示。

[表9]

菌株	IMP (g/L)
		ATCC6872	0
CJI2335	5.4

实施例4-3：含有guaB突变的***载体的制备

为了将实施例3中选择的突变引入菌株，制备***载体。如下制备用于引入guaB突变的载体。使用作为模板的实施例2中选择的CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209菌株的guaB(A377T)基因和CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133菌株的guaB(T499I)基因和SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物进行PCR。通过如下进行PCR：在94℃下变性5分钟，且然后，20个循环的在94℃下持续30秒，在55℃下持续30秒，在72℃下持续1分钟，随后在72℃下聚合5分钟。所得基因片段各自通过XbaI切割。将已通过限制酶XbaI切割的每个基因片段通过使用T4连接酶克隆至线性pDZ载体中，且因此制备pDZ-guaB (A377T)和pDZ-guaB (T499I)。

[表10]

SEQ ID NO.	引物	序列(5'-3′)
			25	pDZ-guaB-F	GCTCTAGAGACATGACTATCCAGGAAGTT
26	pDZ-guaB-R	GCTCTAGAATCAATGTGCCACTGCGTGCT

实施例4-4：将突变体引入CJI2335菌株并评估

为了证实实施例4-1中选择的CJI2335菌株的guaB基因的核苷酸序列，通过PCR扩增CJI2335的基因组DNA。具体地，首先使用作为模板的CJI2335的染色体DNA和SEQ ID NO:21和22的引物用Taq DNA聚合酶进行PCR，28个循环：在94℃下聚合1分钟，在58℃下持续30秒，和在72℃下持续2分钟，以扩增约2.1 kb 的guaB。使用相同的引物进行其测序，并且作为结果，其序列与野生型ATCC6872的guaB基因的序列相同，表明guaB基因中没有突变。

[表11]

SEQ ID NO.	引物	序列(5'-3′)
			21	guaB-seq-F	AATGAAAGATGCCGGATCATT
22	guaB-seq-R	TCAATGTGCCACTGCGTGCT

用实施例4-3中制备的pDZ-guaB(A377T)和pDZ-guaB(T499I)载体各自转化CJI2335，并在含有25 mg/L卡那霉素的培养基上选择其中通过同源重组将载体***基因组DNA的菌株。对因此选择的初始菌株进行二次交换，以选择其中引入靶基因突变的菌株。通过使用SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物的PCR检查基因突变引入期望的转化菌株，且然后进行测序以证实突变引入菌株。具体地，将在由guaB基因编码的蛋白中引入有A377T突变的菌株命名为CJI2335_guaB_m1，并将在由guaB基因编码的蛋白中引入有T499I突变的菌株命名为CJI2335_guaB_m2。进一步，为了制备具有A377T和T499I突变两者的突变菌株，用pDZ-guaB(T499I)载体转化CJI2335_guaB_m1菌株，并以与上述相同的方式获得菌落。对于获得的菌落的测序分析，选择在由guaB基因编码的蛋白中引入有A377T和T499I突变两者的菌株，并命名为CJI2335_guaB_m1m2。

如表12中所示，与调节性CJI2335菌株相比，在由guaB基因编码的蛋白中具有A377T突变或T499I突变的CJI2335_guaB_m1或CJI2335_guaB_m2菌株分别显示IMP浓度提高2.2 g/L (40%)或1.0 g/L (18.5%)。进一步，具有A377T和T499I突变两者的CJI2331_guaB_m1m2菌株显示IMP浓度提高2.7 g/L (50%)，表明当同时包含两个突变时，可以获得IMP浓度的最有效提高。

[表12]

菌株	IMP (g/L)
		CJI2335	5.4
CJI2335_guaB_m1	7.6
		CJI2335_guaB_m2	6.4
CJI2335_guaB_m1m2	8.1

这些结果支持当将本公开的5'-肌苷酸脱氢酶的变体引入具有IMP生产力的各种棒杆菌属微生物时，可以大大提高5'-肌苷酸生产力。

根据布达佩斯条约的规定，CJI2335在2018年6月22日保藏在Korean CultureCenter of Microorganisms，并指定检索号KCCM12278P。进一步，根据布达佩斯条约的规定，制备的CJI2335_guaB_m1m2菌株，也称为CJI2347，在2018年6月22日保藏在KoreanCulture Center of Microorganisms，并指定检索号KCCM12279P。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开可以以不同的具体形式实现，而不改变其技术精神或本质特征。因此，应当理解，上述实施方案不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本公开的范围由所附权利要求限定，而不是由权利要求之前的说明书限定，且因此，落入权利要求的公认范围内的所有变化和修改、或者此类公认范围的等同物因此旨在由权利要求涵盖。

保藏机构的名称：Korean Collection for Type Cultures(外国)

保藏检索号：KCCM12278P

保藏日：20180622

保藏机构的名称：Korean Collection for Type Cultures(外国)

保藏检索号：KCCM12279P

保藏日：20180622

发明效果

当使用本公开的5'-肌苷酸脱氢酶的变体培养产生5'-肌苷酸的棒杆菌属微生物时，可以以高产率生产5'-肌苷酸。

Claims (7)

1.通过在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中引入以下取代而获得的5'-肌苷酸脱氢酶的变体：i)用苏氨酸取代位置377的氨基酸，ii)用异亮氨酸取代位置499的氨基酸，或iii)用苏氨酸取代位置377的氨基酸和用异亮氨酸取代位置499的氨基酸。

2.多核苷酸，其编码权利要求1的5'-肌苷酸脱氢酶的变体。

3.载体，其包含权利要求2的多核苷酸。

4.产生5'-肌苷酸的棒杆菌属的微生物，所述微生物包含权利要求1的5'-肌苷酸脱氢酶的变体、权利要求2的多核苷酸或权利要求3的载体。

5.权利要求4的产生5'-肌苷酸的棒杆菌属的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)。

6.制备5'-肌苷酸的方法，其包括：

在培养基中培养权利要求4的棒杆菌属的微生物；和

从所述微生物或培养基回收5'-肌苷酸。

7.权利要求6的制备5'-肌苷酸的方法，其中所述棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。