CN1398187A - 用于治疗肝细胞癌的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
用于在哺乳动物中预防或治疗癌症的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白的至少一部分，该方法包括在哺乳动物中引发针对甲胎蛋白分子的至少部分氨基酸序列的免疫应答的步骤，其中免疫应答包括激活针对癌细胞的甲胎蛋白肽特异性T淋巴细胞。用于预防或治疗癌症的组合物，该组合物包含具有甲胎蛋白的至少部分序列的肽。
Description
关于受到联邦赞助的研究或开发的声明
本发明是在美国联邦政府的支持下进行的，合同编号NIH/NCI ROICA 77623。美国联邦政府对本发明拥有某些权利。
相关申请的交叉参照
本申请要求2000年2月10日提交的题目为“用于预防或治疗肝细胞癌的方法和组合物”的美国专利申请60/181,966的收益；而且，本申请是2000年9月12日提交的题目为“使用经替代甲胎蛋白的肝细胞癌治疗”的美国专利申请09/660,252的部分继续申请；且是2000年9月14日提交的题目为“使用甲胎蛋白cDNA的肝细胞癌治疗”的美国专利申请09/662,505的部分继续申请；将它们的内容完整收入本文作为参考。
背景
原发性肝癌是世界范围内由癌症引起死亡的主要原因。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的最常见类型，全球发病率是大约每年120万例。在有些地区，诸如东南亚和Subsahara Africa，肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一。这种疾病的高频率似乎与病毒性肝炎在这些地区的高发病率有关。
肝细胞癌的有效治疗目前限于非转移性疾病个体，而且涉及手术切除肿瘤，伴随或不伴随肝脏移植。然而，由于切除后的复发，即使手术切除和移植也不能治愈大多数肿瘤。化疗方法在很大程度上也是无效的。
因此，仍然需要针对肝细胞癌的有效治疗。理想的是，这种治疗方法适用于具有最高发病率的较不发达国家。另外，这种治疗方法应当适用于患有不可切除的肿瘤和转移性疾病的个体。
概述
在一个实施方案中，本发明是用于在哺乳动物中预防或治疗癌症的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分。该方法包括在哺乳动物中引发针对甲胎蛋白分子的至少部分氨基酸序列的免疫应答的步骤，其中免疫应答包括激活针对癌细胞的甲胎蛋白肽特异性T淋巴细胞。在一个实施方案中，甲胎蛋白肽特异性T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞。在一个优选的实施方案中，甲胎蛋白分子是SEQID NO：2。在一个特别优选的实施方案中，甲胎蛋白分子选自下组：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和SEQ ID NO：2的第542-550位残基。在一个实施方案中，癌症是肝细胞癌。在另一个实施方案中，哺乳动物是人。
在一个优选的实施方案中，引发免疫应答的步骤包括对哺乳动物施用一种或多种组合物，其中该组合物包含具有甲胎蛋白的至少部分氨基酸序列的肽。在一个特别优选的实施方案中，肽选自下组：SEQ IDNO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQID NO：2的第325-334位残基、和SEQ ID NO：2的第542-550位残基。在另一个优选的实施方案中，该肽选自下组：SEQ ID NO：2的第1-9位残基、SEQ ID NO：2的第178-186位残基、SEQ ID NO：2的第218-226位残基、SEQ ID NO：2的第235-243位残基、SEQ ID NO：2的第306-315位残基、SEQ ID NO：2的第485-493位残基、SEQ ID NO：2的第492-500位残基、SEQ ID NO：2的第507-516位残基、SEQ ID NO：2的第547-556位残基、和SEQ ID NO：2的第555-563位残基。
在另一个优选的实施方案中，引发免疫应答的步骤包括对哺乳动物施用一种或多种组合物，其中所述组合物包含经过构成氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分的一种或多种肽脉冲的树突细胞。在还有一个优选的实施方案中，引发免疫应答的步骤包括对哺乳动物施用一种或多种组合物，其中所述组合物包含经过编码甲胎蛋白的重组腺病毒载体转导的树突细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用一种或多种组合物从而针对氨基酸序列SEQID NO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤，其中所述组合物包含选自下组的肽：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、和SEQ ID NO：2的第325-334位残基。
在另一个实施方案中，本发明是用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用一种或多种组合物从而针对氨基酸序列SEQ IDNO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤，其中所述组合物包含选自下组的肽：SEQ ID NO：2的第542-550位残基。
在另一个实施方案中，本发明是用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用一种或多种组合物从而针对氨基酸序列SEQ IDNO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤，其中所述组合物包含选自下组的肽：SEQ ID NO：2的第1-9位残基、SEQ ID NO：2的第178-186位残基、SEQ ID NO：2的第218-226位残基、SEQ ID NO：2的第235-243位残基、SEQ ID NO：2的第306-315位残基、SEQ ID NO：2的第485-493位残基、SEQ ID NO：2的第492-500位残基、SEQ ID NO：2的第507-516位残基、SEQ ID NO：2的第547-556位残基、和SEQ ID NO：2的第555-563位残基。
在另一个实施方案中，本发明是用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用一种或多种组合物从而针对氨基酸序列SEQ IDNO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤，其中所述组合物包含经过构成氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分的一种或多种肽脉冲的树突细胞。用于脉冲树突细胞的一种或多种肽选自下组：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和SEQ IDNO：2的第542-550位残基。
在另一个实施方案中，本发明是用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用一种或多种组合物从而针对氨基酸序列SEQ IDNO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤，其中所述组合物包含经过编码甲胎蛋白的重组腺病毒载体转导的树突细胞。
在另一个实施方案中，本发明是可用于预防或治疗癌症的分离肽，该肽选自下组：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、和SEQ ID NO：2的第325-334位残基。在一个优选的实施方案中，本发明是用于预防或治疗癌症的组合物，其中该组合物包含选自下组的一种或多种肽：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、和SEQ ID NO：2的第325-334位残基，其量足以在哺乳动物中引发针对甲胎蛋白的免疫应答。组合物中还可包含佐剂。在另一个实施方案中，本发明是用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用这些肽之一或这些组合物之一的步骤。
本发明还包括用于预防或治疗癌症的手段，其中包含选自下组的一种或多种肽：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和SEQ ID NO：2的第542-550位残基。
在另一个实施方案中，本发明是可用于预防或治疗癌症的分离肽，该肽具有依照SEQ ID NO：2的第542-550位残基的序列。在一个优选的实施方案中，本发明是用于预防或治疗癌症的组合物，其中该组合物包含具有依照SEQ ID NO：2的第542-550位残基的序列的肽。组合物中还可包含佐剂。在另一个实施方案中，本发明是用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用这种肽或这些组合物之一的步骤。
本发明还包括用于预防或治疗癌症的手段，其中包含具有依照SEQID NO：2的第542-550位残基的序列的肽。
详述
在一个实施方案中，本发明是可单独或联合用于治疗肝细胞癌的一组肽。在另一个实施方案中，本发明是通过单独或联合施用一种或多种本发明肽或者包含一种或多种本发明肽的组合物来预防或治疗肝细胞癌的方法。在另一个实施方案中，本发明是通过施用经过一种或多种本发明肽脉冲或者经过编码甲胎蛋白的重组腺病毒(AdV)载体转导的树突细胞来预防或治疗肝细胞癌的方法。
大约80％的肝细胞癌重新激活甲胎蛋白的表达。鼠和人的T细胞库都能够在I型MHC环境中识别AFP衍生肽表位。因此，尽管在胚胎发育过程中暴露于高血浆水平的这种癌胚蛋白，并非所有的AFP特异性T细胞都在免疫***的个体发生过程中丧失。
本发明涉及由人甲胎蛋白即SEQ ID NO：2衍生的肽的鉴定，其呈现于HLA-A*0201的环境中时受到人T细胞库的识别。正如下文表1所概述的，鉴定了4种AFP衍生肽，称为“显性”肽。它们是PLFQVPEPV，hAFP137-145，SEQ ID NO：2的第137-145位残基；FMNKFIYEI，hAFP158-166，SEQID NO：2的第158-166位残基；GLSPNLNRFL，hAFP325-334，SEQ ID NO：2的第325-334位残基；和GVALQTMKQ，hAFP542-550，SEQ ID NO：2的第542-550位残基。每一种都拥有一个或两个锚定残基。
在浓度依赖性I型结合测定法中，每一种显性肽都在T2细胞上稳定HLA-A*0201。它们在解离动力学测定法中稳定达2-6小时。另外，每一种显性肽在体外都由几名正常HLA-A*0201供体诱导肽特异性T细胞。重要的是，这些hAFP肽特异性T细胞还能够在细胞毒性测定法和IFNγELISPOT测定法中识别HLA-A*0201+/AFP阳性肿瘤细胞。这些信息概述于下文表1。表1：显性肽的概述肽 位置 序列 锚 T2结合浓度 相对解离动力学hAFP137-145 137-145 PLFQVPEPV 2 2.5mM 4小时hAFP158-166 158-166 FMNKFIYEI 2 0.5mM 4小时hAFP325-334 325-334 GLSPNLNRFL 2 10mM 2小时hAFP542-550 542-550 GVALQTMKQ 1 ＞100mM 6小时
正如本发明所证明的，这些T细胞的激活可以通过在免疫刺激环境中呈递这些显性肽来实现，包括专职抗原呈递树突细胞的呈递。经过编码甲胎蛋白cDNA即SEQ ID NO：1的重组腺病毒(AdV)载体转导的树突细胞将在MHC的环境中加工并呈递这4种显性肽表位，还将诱导AFP特异性T细胞激活。类似免疫的HLA-A*0201/Kb小鼠也在细胞因子释放测定法中识别经过AFP肽脉冲的细胞。另外，经过AFP肽刺激的人和HLA-A*0201/Kb小鼠T细胞应答识别经过hAFP改造的靶和(在较低程度上)天然表达AFP的人肝细胞癌细胞。最后，使用质谱法由自HLA-A*0201+HCC细胞洗脱的复杂肽混合物鉴定了至少3种AFP表位。因而，多种证据表明，这4种显性肽的每一种都具有免疫原性，而且在HLA-A*0201的环境中得到天然加工和呈递。
还鉴定了具有微弱或较少可再现应答但在一种以上类型的测定法中呈阳性的另外10种肽，称为“亚显性”肽。这10种肽是MKWVESIFL，SEQ ID NO：2的第1-9位残基；ILLWAARYD，SEQ ID NO：2的第178-186位残基；LLNQHACAV，SEQ ID NO：2的第218-226位残基；FQAITVTKL，SEQ ID NO：2的第235-243位残基；TTLERGQCII，SEQID NO：2的第306-315位残基；CIRHEMTPV，SEQ ID NO：2的第485-493位残基；PVNPGVGQC，SEQ ID NO：2的第492-500位残基；NRRPCFSSLV，SEQ IDNO：2的第507-516位残基；TMKQEFLINL，SEQ ID NO：2的第547-556位残基；和NLVKQKPQI，SEQ ID NO：2的第555-563位残基。
虽然本发明公开的组合物和方法主要是使用一种或多种显性肽hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基、hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基、hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和hAFP542-550即SEQ ID NO：2的第542-550位残基，但是使用10种亚显性肽之一种或多种来替代4种显性肽中的一种或多种或与之联合也属于本发明的范围之内。
现在要更详细的讨论显性肽和亚显性肽的鉴定。首先，由hAFP即SEQ ID NO：2(Genbank编号：J00077、J00076、和V01514)鉴定潜在结合HLA-A*0201的肽序列。这些肽的长度是9或10个氨基酸，第2位是异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；或者，根据肽的长度，第9或10位是异亮氨酸、亮氨酸、或缬氨酸，或二者兼之。使用威斯康星大学遗传学计算机小组(University of Wisconsin，Genetics Computer Group)的“寻找样式”(find patterns)程序筛选hAFP序列即SEQ ID NO：2，鉴定了74种这样的肽。使用标准技术合成了这74种肽。
在HLA-A*0201稳定测定法中，对这74种肽候选物的每一种均测试与T2细胞的浓度依赖性结合。前一天晚上将T2(TAP缺陷型)细胞于室温保温以增加细胞表面I型MHC分子的表达，然后与每一种肽保温过夜，肽的浓度范围是0.1-100mM。用抗HLA-A2抗体(BB7.2)和山羊抗小鼠-FITC将细胞染色后，通过流式细胞术测定HLA-A*0201的稳定性。将强烈结合Flu基质肽(第58-66位氨基酸)(Flu)的HLA-A*0201用作阳性对照。
然后，通过解离动力学测定法来测定MHC-肽复合物的稳定性。用温和的pH3.2柠檬酸盐-磷酸盐酸性缓冲液剥离HLA-A*0201 LCL。立即以200mM的浓度将每一种肽脉冲到细胞上，即在存在3μg/ml b2微球蛋白时于室温保温1小时。洗掉过量的肽，并将细胞于37℃保温0、2、4、和6小时。在每个时间点结束时清洗细胞，并对细胞表面HLA-A2表达进行染色，然后通过流式细胞术进行分析。若平均荧光强度相对于剥离但未用肽脉冲的细胞升高至少1.5倍，则认为肽-I型MHC复合物是稳定的。在解离动力学测定法中，所有4种显性肽稳定达2-6小时。
然后对4种显性肽进行其它免疫学和物理化学研究。这些研究包括体外研究，其中(1)将肽用于生成AFP肽特异性人T细胞培养物，这些培养物既具有肽特异性，又受到天然表达AFP的细胞的识别；(2)将经过AdVhAFP转导的树突细胞用于生成识别AFP阳性细胞和经过显性肽脉冲的AFP阴性细胞的AFP特异性人T细胞。这些研究还包括体内研究，其中(1)用肽免疫的转基因小鼠具有识别肽和AFP阳性细胞的脾细胞；和(2)AdVhAFP/DC免疫的小鼠识别AFP阳性细胞和经过显性肽脉冲的AFP阴性细胞。这些研究显示，显性肽具有免疫原性，AFP自身具有免疫原性，显性肽被天然加工和呈递到AFP阳性细胞表面上，且AFP/DC或显性肽可用于生成AFP特异性T细胞，这些细胞生成细胞因子并杀伤A即阳性细胞。另外，质谱法被用于在物理上由AFP阳性肝细胞癌细胞表面鉴定AFP肽。
首先，对原初的HLA-A2*0201人T细胞培养物进行反复肽刺激，以证明肽在人T细胞库环境中的免疫原性和肽特异性T细胞识别经AFP转染的靶的能力。由经过每一种显性AFP衍生肽脉冲(添加KLH、IL-7、和IL-2)的PBMC制备大批T细胞培养物，并在扩增的第3和7周之间测试识别经过肽脉冲和表达AFP的两种靶的能力。这些培养物扩增肽特异性T细胞，证据是它们在EL ISPOT测定法中能够在识别经过特定肽脉冲的JY细胞而非经过对照MART-17-35脉冲的JY后分泌IFNγ。相对于未修饰或经过空AdVRR5转导的亲本细胞，AFP肽特异性T细胞群还识别经过AFP阴性稳定转染和经过AdVhAFP转导的HLA-A2*0201黑素瘤细胞(M202)，显示为生成IFNγ的AFP特异性T细胞的频率增加。为了评估识别HLA-A*0201+的能力，对天然表达AFP的肝细胞癌细胞系HepG2(相对于HLA-A2-/AFP阳性HCC系Hep3B)进行细胞毒性和ELISPOT测定法。
另外，由经过AdV转导的树突细胞制备CTL。简而言之，将由PBMC与GM-CSF和IL-4一起保温制备的树突细胞用AdVhAFP或AdVMART1以感染复数(moi)1000转导达2小时。清洗转导后的树突细胞，照射，并以1-2×105细胞/ml涂布，作为CTL制备的刺激物。通过磁珠排除法由自体非贴壁细胞中消除CD4、CD14、CD19、和CD56+细胞以制备CD8+富集的效应细胞(群体中通常80％是CD8+，未显示)。将CD8+细胞与经转导树突细胞一起以2×106细胞/ml在添加10-25ng/ml IL-7的5％自体培养基中进行涂布。每3-4天向培养物中添加10U/ml IL-2。每周用新鲜的自体AdV转导树突细胞以1个树突细胞对10-20个CD8+CTL的比率再次刺激CD8+CTL。每周鉴定大多数培养物的表现，区分CD4+和CD8+细胞。每一种显性肽在体外都由几名正常HLA-A*0201供体诱导了肽特异性T细胞。
因为在体外经过AdVhAFP/DC刺激的人T细胞在CTL和ELISPOT测定法中均特异识别经hAFP转染的靶，所以接着研究这4种显性肽，测定它们是否受到经过AdVhAFP/DC刺激的T细胞的特异识别。培养7-21天后，对每周用AdVhAFP/DC刺激的CD8富集T细胞测试hAFT肽特异性IFNγ细胞因子生成细胞的细胞毒性和频率。AdVhAFP/DC T细胞培养物对经过4种AFP肽之一脉冲的JY细胞具有细胞毒性，指示能够由正常供体的外周血扩增了针对这些肽的CTL。用经自体肽脉冲过的LCL或JY细胞进行再刺激后，这些大批培养物还包含相对于MART-127-35频率高得多的对AFP肽特异的IFNγ分泌细胞，指示除了hAFP542-550以外，其它3种显性肽也天然的由经AdVhAFP转导的树突细胞得到加工和呈递。
经AdVhAFP/DC刺激的T细胞培养物还具有低频率的细胞因子生成细胞，后者可识别A*0201+/AFP阳性肝细胞癌系HepG2，但不识别A*0201-/AFP阳性HCC系Hep3B。检测到合成Th1细胞因子IFNγ和TNFα的T淋巴细胞，而没有检测到Th2细胞因子IL-4。在不含T细胞而涂布肝细胞癌系时还检测到IL-10，指示这种细胞因子的生成是来自肿瘤细胞。
如下所述将HLA-A*0201/Kb转基因小鼠用于筛选74种肽，以确定这些肽是否具有免疫原性，是否天然的在HLA-A*0201的环境中得到加工和呈递。HLA-A*0201/Kb转基因雌性小鼠最初购自Harlan-SpragueDawley(印第安纳波利斯市，印地安那州，美国)，目前由加利福尼亚大学(洛杉矶)放射肿瘤学系的动物房饲养。
关于肽免疫，小鼠皮下接受100μg以1∶1在完全弗氏佐剂中乳化的AFP或对照肽。用在完全弗氏佐剂中乳化的每一种肽免疫后，引流***细胞在识别经hAFP稳定转染的细胞后生成IFNγ。另外，可以在经树突细胞(经过表达AFP的腺病毒(AdVhAFP)的转导)免疫的小鼠脾中鉴定出甲胎蛋白肽特异性T细胞。因而，4种显性肽天然的在I型环境中得到加工和呈递，而且具有免疫原性。
接着，确认这4种显性肽的体内免疫原性。用脉冲到同系树突细胞上的每一种显性肽免疫HLA-A*0201/Kb小鼠。对在体外用免疫显性肽或MART-1肽或者用经Jurkat/AFP或Jurkat/MART转染的细胞系再次刺激的脾细胞进行IFNγ特异性ELISPOT测定法。每一种hAFP肽的免疫及随后每一种肽或Jurkat/AFP的再次刺激诱导了大量的AFP特异性IFNγ生成细胞。不管是否进行再次刺激，来自PBS注射小鼠的淋巴细胞不显示细胞毒性和IFNγ生成。用MART-127-35肽免疫的小鼠生成MART-1特异性应答而不生成AFP肽应答。
然后，通过在GM-CSF和IL-4中的分化而由骨髓祖细胞制备树突细胞，并用包含hAFP cDNA即SEQ ID NO：1的重组腺病毒载体(AdVhAFP)进行转导。在RPMI/2％FCS中以moi 100转导体外培养的树突细胞。转导于37℃进行2小时。然后清洗树突细胞并以每只动物0.2ml PBS 5×105个树突细胞重悬，用于注射。在所有情况中，存活率超过95％。免疫后2周，用经hAFP(Jurkat/AFP)或MART-1(Jurkat/MART)稳定转染的Jurkat细胞再次刺激小鼠脾细胞。通过ELISPOT测定AFP特异性与MART-1特异性IFNγ释放的频率，计算3组独立实验的平均值，p＜0.02。在5小时51Cr释放测定法中测定了针对Jurkat/AFP和Jurkat/MART的细胞毒性。
其次，对由HLA-A*0201人肝细胞癌系洗脱的显性肽进行了HPLC和质谱鉴定。这些分析结果的概述显示于下文表2。
为了洗脱肽，将HepG2和Hep3B细胞用PBS清洗3次之后，在5ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH3.2中保温1分钟。将悬浮液离心(800×g，5分钟)，获得上清液，合计每种细胞系收集了500ml无细胞上清液。将实验材料冻干并保存于-20℃。
将冻干材料重新溶于30ml水/乙腈/三氟乙酸(W/A/TFA体积比95/5/0.1)。将该溶液以0.2ml/min流速抽吸到分析性反相HPLC柱(Keystone Scientific C18 Betasil，250mm×2mm，5mm颗粒大小，100孔径)上，层析柱事先用W/A/TFA平衡。使用0.1％TFA在乙腈中的渐增线性梯度(时间/％乙腈＝0/5、5/5、55/100、60/100)进行洗脱。在215和280nm处监测层析柱洗脱液吸光值，并收集1分钟的级分。在不同的层析柱上使用相同的分离梯度获得了具有对应于免疫刺激肽的氨基酸序列的合成肽的停留时间。
进行MALDI-TOF质谱法，以分析由AFP生成肝细胞癌细胞系HepG2(HLA-A2+)和Hep3B(HLA-A2-)酸性洗脱的HPLC分级分离肽。将Voyager-REACTION PRODUCTS(PerSeptive Biosystems，弗雷明汉市，马萨诸塞州)Matrix Assisted Laser DesorptionIonization/Time-Of-Flight(MALDI-TOF)用于获得质谱。该设备使用不锈钢靶，样品在其上存放和干燥。所有光谱用胰岛素进行外部校准，导致质量精确度通常在±0.1％以内。将冻干的HPLC级分重悬于10μl含0.1％TFA的70％乙腈。将1μl这种材料与1μl基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(Sigma，以10mg/ml溶于70％ACN/0.1％TFA)一起点样。扫描m/z 500-7000获得光谱。
HPLC级分的MALDI分析确定了几乎所有的级分都包含多达20种质量范围700-1500Da的不同肽，尽管常常存在优势信号。在这种复杂混合物中，鉴定出m/z值对应于hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基、hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和hAFP542-550即SEQ ID NO：2的第542-550位残基的计算所得单各向同性质子化分子((M+H)+)的峰，hAFP542-550、hAFP158-166和hAFP325-334存在于由HepG2细胞洗脱的肽集合中。在来自HepG2肽集合的一份HPLC级分中鉴定出m/z 975.6的肽。hAFP542-550的计算所得(M+H)+是975.5，具有对应于hAFP542-550即SEQ ID NO：2的第542-550位残基的氨基酸序列的合成肽的停留时间是21.2分钟。另外，在仅含基质的样品和来自Hep3B洗脱的HPLC级分18-22中没有观察到在m/z 975.5±1处的信号。相似的，根据标准肽表现的预测，在衍生自HepG2的适当级分中还发现了m/z对应于hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基和hAFP325-334即SEQ IDNO：2的第325-334位残基的计算所得(M+H)+的峰。在由Hep3B洗脱的肽集合的级分中不存在这些峰。在一份级分中观察到m/z 1152.2的峰，说明存在hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基的钠加合物。
因此，在由HLA-A*0201阳性HepG2细胞而非HLA-A*0201阴性Hep3B细胞洗脱的HPLC分级分离肽集合中鉴定了这4种肽中的3种的潜在质量候选。在所鉴定的3种肽中，峰是在对点样的重复扫描中观察到的。在来自HepG2肽集合的一份级分中在m/z 1020.9处观察到宽峰，超过了这种物理化学分析的容许误差范围。因此，不可能证明HepG2细胞的表面上存在hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基。
为了在免疫学上确认这些级分中存在显性肽，在ELISPOT测定法中将1ml来自HepG2或Hep3B细胞的各种HPLC级分用于再次刺激经AdVhAFP/DC免疫的鼠脾细胞。由包含显性肽的级分观察到200-250个斑点/106个细胞，由其它级分观察到100-130个斑点/106个细胞，由Hep3B级分观察到最多50个斑点/106个细胞。这进一步支持了显性肽的质谱鉴定。
| 表2 | |||||||
| 肽1 | 肽 的HPLC停留时间(min)2 | 计算所得(M+H)+，3 | HepG2中观察 到 的(M+H)+，4 | Hep3B中观察 到 的(M+H)+，5 | 鉴 定 出(M+H)+的HPLC级分#6 | 免疫学反应性级分(IFNγ ELISPOT)7 | |
| HepG2 | Hep3B | ||||||
| hAFP542-550 | 21.2 | 975.5 | 975.6 | 无 | 21 | 20，21 | 0 |
| hAFP158-166 | 28.9 | 1204.6 | 1204.9 | 无 | 28 | 27，28，29 | 0 |
| hAFP137-145 | 28.1 | 1025.6 | 无 | 无 | - | 27，28，29 | 0 |
| hAFP325-334 | 27.7 | 1130.6 | 1130.1 | 无 | 28 | 27，28，29 | 0 |
脚注：1.肽标识；2.对照合成肽的典型HPLC停留时间；3.预期质量/
电荷测量；4.在来自HepG2的酸性洗脱肽中观察到的质量/电荷测量值；5.在来自Hep3B的酸性洗脱肽中观察到的质量/电荷测量值；6.在来自HepG2的酸性洗脱肽中观察到hAFP肽质量/电荷测量值的级分(分钟)；7.通过IFNγ ELISPOT含有能够再次刺激经AdVhAFP/DC肽引发的脾细胞的级分。
实施例实施例1：通过施用肽来预防或治疗肝细胞癌的方法
依照本发明的一个实施方案，提供了用于预防或治疗肝细胞癌患者的方法。该方法包括选择合适的患者，诸如患有AFP阳性肝细胞癌的HLA-A*0201+患者，然后对患者施用一种或多种本发明肽。对患者施用足够剂量的肽，而且优选多次重复施用，从而引发针对AFP的免疫应答，并由此引发针对肝细胞癌的免疫应答。
在一个优选的实施方案中，肽是hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基、hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基、hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和hAFP542-550即SEQ ID NO：2的第542-550位残基的联合。在另一个优选的实施方案中，所述一种或多种肽被施用了2-5次。在一个特别优选的实施方案中，肽施用了3次。在另一个优选的实施方案中，所述一种或多种肽以2周的间隔施用了3次。
在一个优选的实施方案中，肽是皮内施用的，尽管本领域技术人员参照本公开书可以领会其它施用路径也是合适的。
在一个优选的实施方案中，一种或多种肽的每一种都是在0.5mlMontanide ISA-51中乳化后施用的。因此，在联合四种肽时，它们是在合计2ml Montanide ISA-51中乳化后施用的。将乳化后的肽分成四等份，每份施用于不同位点。在一个优选的实施方案中，该一种或多种肽是以每种大约50-2000μg的剂量施用的。在一个优选的实施方案中，该一种或多种肽是以每种大约100-1000μg的剂量施用的。在一个特别优选的实施方案中，该一种或多种肽是以每种大约500μg的剂量施用的。
将本发明的方法和组合物用于治疗几名AFP阳性/A2.1+肝细胞癌患者。依照该方法，用四种肽hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基、hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基、hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和hAFP542-550即SEQ ID NO：2的第542-550位残基免疫每位患者。将肽在0.5ml Montanide ISA-51中乳化，联合后合计2ml。将乳化后的肽分成四等份，每份施用于不同位点。通过ELISPOT和四聚体测定法来测量外周T细胞应答。这些试验显示这四种AFP衍生肽在体内具有免疫原性，甚至在免疫前AFP血清水平极高的患者中也是如此。
第一位患者(称为AFP-A1)患有复发的、不可切除的AFP阳性/A2.1+肝细胞癌。以2周的间隔对他施用三次免疫，每次免疫均是在MontanideISA中含有这四种肽，每种100μg。同时，由该第一位患者的免疫前血液建立平行体外PBMC培养物，并用每种肽重复脉冲。根据ELISPOT的检查，在第28天的培养物中所有肽都存在清楚的体外识别；根据四聚体测定法的检查，发现对3种肽的2种存在清楚的体外识别，即hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基和hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基有，而对hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基却没有。四聚体测定法不能评估AFP542特异性T细胞的存在与否，因为AFP542肽四聚体不能被制备这些试剂的设备折叠。体内应答指示对hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基、hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基、和hAFP542-550即SEQ ID NO：2的第542-550位残基的清楚识别，并且在第二次和第三次免疫后趋向于识别hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基。
第二位患者(称为AFP-A2)是具有酒精诱发肝硬化病史的70岁白人男性，其乙肝和丙肝都是阴性。他呈现肿胀，而且在肝脏左叶发现8cm硬块。他的AFP水平当时是10,400ng/ml。肝脏活检在硬化肝脏揭示了充分分化的肝细胞癌。对他进行实验性抗真菌剂FV-462尝试，但是病情发展且产生耳毒性。检查后7个月，使用依照本发明的方案，对他施用四种肽hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基、hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基、hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和hAFP542-550即SEQ ID NO：2的第542-550位残基的联合。他接受了两次免疫，间隔两周。两次免疫后的四聚体和ELISPOT数据显示，检测到针对所有4种AFP肽表位的T细胞应答。
因此，这些结果指示，本方法在病情严重的肝细胞癌患者中引发了由AFP特异性T细胞进行的可检测免疫应答。实施例2：通过施用经过本发明肽脉冲的树突细胞来预防或治疗肝细胞癌的方法
依照本发明的一个实施方案，提供了用于预防或治疗肝细胞癌患者的方法。该方法包括选择合适的患者，诸如患有AFP阳性肝细胞癌的HLA-A*0201+患者，然后对患者施用经过一种或多种本发明肽脉冲的树突细胞。对患者施用足够剂量的树突细胞，而且优选多次重复施用，从而引发针对AFP的免疫应答，并由此引发针对肝细胞癌的免疫应答。
在一个优选的实施方案中，树突细胞是用hAFP137-145即SEQ ID NO：2的第137-145位残基、hAFP158-166即SEQ ID NO：2的第158-166位残基、hAFP325-334即SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和hAFP542-550即SEQID NO：2的第542-550位残基的联合脉冲的。在另一个优选的实施方案中，树突细胞施用了2-5次。在一个特别优选的实施方案中，树突细胞施用了3次。在另一个优选的实施方案中，树突细胞间隔2周施用了3次。
在一个优选的实施方案中，树突细胞是皮内施用的，尽管本领域技术人员参照本公开书可以领会其它施用路径也是合适的。在一个实施方案中，树突细胞是以大约1×105与1×108之间的剂量施用的。在另一个优选的实施方案中，树突细胞是以大约1×106与1×107之间的剂量施用的。在一个特别优选的实施方案中，树突细胞是以大约5×106的剂量施用的。
依照本领域技术人员知道的技术，由在组织培养中暴露于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)达1周的贴壁自体外周血单核细胞制备树突细胞。通过Ficoll-Hypaque离心由得自一次白细胞单采法(leukapheresis)的细胞分离单核细胞，并冻存于液氮中直至用于生产树突细胞。将解冻的单核细胞用盐水清洗一次，并以2-4×107个细胞/25cm2Costar瓶的密度以2.5-5×106个存活细胞/ml培养基(RPMI 1640+5％热灭活自体血清+庆大霉素)的浓度涂布。使之于37℃贴壁2小时后，通过盐水清洗除去非贴壁细胞。将贴壁细胞在完全培养基中在存在rhGM-CSF(800U/ml)和rhIL-4(500U/ml)时培养7天。临床级GM-CSF由Immunex提供，IL-4由Schering-Plough提供。
对患者进行一次白细胞单采法(leukapheresis)以获得至少2×109个PBL，并冷藏于70％RPMI 1640、20％自体血清、和10％DMSO。在研究的第-7、7、和21天各取等分液解冻。在第一次免疫那天，在进行白细胞单采法(leukapheresis)时取用于制备自体血清的血液(60ml)，这足够用于所有的细胞培养。依照本领域技术人员知道的技术，制备并纯化本发明的AFP衍生免疫显性肽。
如下免疫患者。在免疫那天，收获树突细胞，用无菌盐水清洗一次，并以适当浓度(诸如106)重悬于1ml无血清RPMI 1640和50mg/ml四种免疫显性肽的每一种。最短保温1小时后，沉淀AFP肽/DC，并用无菌盐水清洗3次。在锥虫蓝中进行细胞计数，并将细胞重悬于0.1ml无菌盐水，用于皮内注射。
在足量施用前，受试者将接受皮试，即0.1ml盐水中含1％的剂量。30分钟观察期后，他们将接受0.1ml盐水中足量的经过AFP肽脉冲的树突细胞，即在腋窝下两侧或腹股沟上下皮内注射。免疫后对患者监控2小时。优选的是，患者接受50mg苯海拉明(diphenhydramine)和650mg扑热息痛(Tylenol)的预处理，二者皆口服。实施例3：通过施用经过人AFP腺病毒转导的树突细胞来预防或治疗肝细胞癌的方法
依照本发明的一个实施方案，提供了用于预防或治疗肝细胞癌患者的方法。该方法包括选择合适的患者，诸如患有AFP阳性肝细胞癌的HLA-A*0201+患者，然后对患者施用经过人AFP腺病毒转导的树突细胞。对患者施用足够剂量的树突细胞，而且优选多次重复施用，从而引发针对AFP的免疫应答，并由此引发针对肝细胞癌的免疫应答。
在另一个优选的实施方案中，树突细胞施用了2-5次。在一个特别优选的实施方案中，树突细胞施用了3次。在另一个优选的实施方案中，树突细胞以2周的间隔施用了3次。
在一个优选的实施方案中，树突细胞皮内施用于腋窝下或腹股沟两侧，尽管本领域技术人员参照本公开书可以领会其它施用路径也是合适的。在一个实施方案中，树突细胞是以大约1×105与1×108之间的剂量施用的。在另一个优选的实施方案中，树突细胞是以大约1×106与1×107之间的剂量施用的。在一个特别优选的实施方案中，树突细胞是以大约5×106的剂量施用的。
通过Ficoll-Hypaque离心由白细胞单采法(leukapheresis)产物分离单核细胞，并保存于10％DMSO/20％自体血清中。在DC接种前一周，将细胞解冻，用PBS清洗一次，并以2-4×107个细胞/25cm2Costar瓶的密度以2.5-5×106个存活细胞/ml培养基(RPMI 1640+5％热灭活自体血清)的浓度涂布。使之于37℃贴壁2小时后，通过PBS清洗温和除去非贴壁细胞。将贴壁细胞在完全培养基中在存在rhGM-CSF(800U/ml)和rhIL-4(500U/ml)时培养7天。临床级GM-CSF和IL-4由Schering-Plough提供。
AdVhAFP是E1缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体，其中人AFP cDNA由CMV增强子/启动子驱动。每批病毒终产物的病毒滴度是根据基因组DNA定量和感染滴度来提供的。病毒颗粒产物对生物学活性病毒的比率低于100∶1被认为是可接受的。
如下免疫患者。在免疫那天，收获树突细胞，用无菌盐水清洗一次，并以106-107的浓度重悬于1ml 2％自体血清-RPMI 1640和109-1010pfu/ml AdVhAFP(感染复数＝1000∶1)。于37℃保温2小时后，将AdVhAFP/DC重悬于RPMI 1640-5％自体血清以灭活未吸附的腺病毒载体，然后沉淀并用无菌盐水清洗3次。在锥虫蓝中进行细胞计数，并将适当数目(根据患者群不同，在105与108之间)的细胞重悬于无菌盐水，用于皮内注射。
对患者施用经过AdVhAFP转导的DC，即在腋窝下或腹股沟的两侧皮内注射0.1ml普通盐水。免疫后对患者监控2小时。优选的是，患者接受50mg苯海拉明(diphenhydramine)和650mg扑热息痛(Tylenol)的预处理，二者皆口服。
虽然通过参照某些优选实施方案已经相当详细的讨论了本发明，但是其它实施方案也是可能的。因此，所附权利要求的范围不应当限于本公开书所含优选实施方案的描述。
序列表<110> The Regents of the University of California
Economou，James
Butterfield，Lisa
Ribas Bruguera，Antoni<120> 用于治疗肝细胞癌的方法和组合物<130> 11969-5PCT<140> to be assigned<141> 2001-02-12<150> US 60/181,966<151> 2000-02-10<150> US 09/660,252<151> 2000-09-12<150> US 09/662,505<151> 2000-09-14<160> 2<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 2032<212> DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221> CDS<222> (48)..(1874)<400> 1tccatattgt gcttccacca ctgccaataa caaaataact agcaacc atg aag tgg 56
Met Lys Trp
1gtg gaa tca att ttt tta att ttc cta cta aat ttt act gaa tcc aga 104Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr Glu Ser Arg
5 10 15aca ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct tac 152Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr20 25 30 35caa tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt ttt 200Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe
40 45 50gcc cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg gtg 248Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val
55 60 65aaa gat gca ttg act gca att gag aaa ccc act gga gat gaa cag tct 296Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser
70 75 80tca ggg tgt tta gaa aac cag cta cct gcc ttt ctg gaa gaa ctt tgc 344Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys
85 90 95cat gag aaa gaa att ttg gag aag tac gga cat tca gac tgc tgc agc 392His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser100 105 110 115caa agt gaa gag gga aga cat aac tgt ttt ctt gca cac aaa aag ccc 440Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro
120 125 130act cca gca tcg atc cca ctt ttc caa gtt cca gaa cct gtc aca agc 488Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser
135 140 145tgt gaa gca tat gaa gaa gac agg gag aca ttc atg aac aaa ttc att 536Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile
150 155 160tat gag ata gca aga agg cat ccc ttc ctg tat gca cct aca att ctt 584Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu
165 170 175ctt tgg gct gct cgc tat gac aaa ata att cca tct tgc tgc aaa gct 632Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala180 185 190 195gaa aat gca gtt gaa tgc ttc caa aca aag gca gca aca gtt aca aaa 680Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys
200 205 210gaa tta aga gaa agc agc ttg tta aat caa cat gca tgt gca gta atg 728Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met
215 220 225aaa aat ttt ggg acc cga act ttc caa gcc ata act gtt act aaa ctg 776Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu
230 235 240agt cag aag ttt acc aaa gtt aat ttt act gaa atc cag aaa cta gtc 824Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val
245 250 255ctg gat gtg gcc cat gta cat gag cac tgt tgc aga gga gat gtg ctg 872Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu260 265 270 275gat tgt ctg cag gat ggg gaa aaa atc atg tcc tac ata tgt tct caa 920Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln
280 285 290caa gac act ctg tca aac aaa ata aca gaa tgc tgc aaa ctg acc acg 968Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr
295 300 305ctg gaa cgt ggt caa tgt ata att cat gca gaa aat gat gaa aaa cct 1016Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro
310 315 320gaa ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt tta gga gat aga gat ttt 1064Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe
325 330 335aac caa ttt tct tca ggg gaa aaa aat atc ttc ttg gca agt ttt gtt 1112Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Lau Ala Ser Phe Val340 345 350 355cat gaa tat tca aga aga cat cct cag ctt gct gtc tca gta att cta 1160His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu
360 365 370aga gtt gct aaa gga tac cag gag tta ttg gag aag tgt ttc cag act 1208Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr
375 380 385gaa aac cct ctt gaa tgc caa gat aaa gga gaa gaa gaa tta cag aaa 1256Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys
390 395 400tac atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc ttc 1304Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe
405 410 415cag aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct tac 1352Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr420 425 430 435aca aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc acc 1400Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr
440 445 450aga aaa atg gca gcc aca gca gcc act tgt tgc caa ctc agt gag gac 1448Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp
455 460 465aaa cta ttg gcc tgt ggc gag gga gcg gct gac att att atc gga cac 1496Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His
470 475 480tta tgt atc aga cat gaa atg act cca gta aac cct ggt gtt ggc cag 1544Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln
485 490 495tgc tgc act tct tca tat gcc aac agg agg cca tgc ttc agc agc ttg 1592Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu500 505 510 515gtg gtg gat gaa aca tat gtc cct cct gca ttc tct gat gac aag ttc 1640Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe
520 525 530att ttc cat aag gat ctg tgc caa gct cag ggt gta gcg ctg caa acg 1688Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr
535 540 545atg aag caa gag ttt ctc att aac ctt gtg aag caa aag cca caa ata 1736Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile
550 555 560aca gag gaa caa ctt gag gct gtc att gca gat ttc tca ggc ctg ttg 1784Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu
565 570 575gag aaa tgc tgc caa ggc cag gaa cag gaa gtc tgc ttt gct gaa gag 1832Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu580 585 590 595gga caa aaa ctg att tca aaa act cgt gct gct ttg gga gtt 1874Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val
600 605taaattactt caggggaaga gaagacaaaa cgagtctttc attcggtgtg aacttttctc 1934tttaatttta actgatttaa cactttttgt gaattaatga aatgataaag acttttatgt 1994gagatttcct tatcacagaa ataaaatatc tccaaatg 2032<210> 2<211> 609<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 2Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr1 5 10 15Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu
20 25 30Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr
35 40 45Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser
50 55 60Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp65 70 75 80Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu
85 90 95Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp
100 105 110Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His
115 120 125Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro
130 135 140Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn145 150 155 160Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro
165 170 175Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys
180 185 190Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr
195 200 205Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys
210 215 220Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln
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260 265 270Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile
275 280 285Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys
290 295 300Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu ASn Asp305 310 315 320Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp
325 330 335Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala
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355 360 365Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys
370 375 380Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu385 390 395 400Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys
405 410 415Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu
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580 585 590Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly
595 600 605Val
Claims (38)
1.用于在哺乳动物中预防或治疗癌症的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括在哺乳动物中引发针对甲胎蛋白分子的至少部分氨基酸序列的免疫应答的步骤，其中免疫应答包括激活针对癌细胞的甲胎蛋白肽特异性T淋巴细胞。
2.权利要求1的方法，其中甲胎蛋白肽特异性T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
3.权利要求1的方法，其中甲胎蛋白分子是SEQ ID NO：2。
4.权利要求1的方法，其中所述甲胎蛋白分子的一部分选自下组：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、SEQ ID NO：2的第542-550位残基、及上述各项的联合。
5.权利要求1的方法，其中癌症是肝细胞癌。
6.权利要求1的方法，其中哺乳动物是人。
7.权利要求1的方法，其中引发免疫应答的步骤包括对哺乳动物施用一种或多种组合物，其中所述组合物包含具有甲胎蛋白分子的至少部分氨基酸序列的肽。
8.权利要求7的方法，其中肽选自下组：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、SEQ ID NO：2的第542-550位残基、及上述各项的联合。
9.权利要求7的方法，其中肽选自下组：SEQ ID NO：2的第1-9位残基、SEQ ID NO：2的第178-186位残基、SEQ ID NO：2的第218-226位残基、SEQ ID NO：2的第235-243位残基、SEQ ID NO：2的第306-315位残基、SEQ ID NO：2的第485-493位残基、SEQ ID NO：2的第492-500位残基、SEQ ID NO：2的第507-516位残基、SEQ ID NO：2的第547-556位残基、SEQ ID NO：2的第555-563位残基、及上述各项的联合。
10.权利要求1的方法，其中引发免疫应答的步骤包括对哺乳动物施用一种或多种组合物，其中所述组合物包含经过构成氨基酸序列SEQID NO：2的至少一部分的一种或多种肽脉冲的树突细胞。
11.权利要求1的方法，其中引发免疫应答的步骤包括对哺乳动物施用一种或多种组合物，其中所述组合物包含经过编码甲胎蛋白的重组腺病毒载体转导的树突细胞。
12.用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用选自下组的一种或多种肽从而针对氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、及SEQ IDNO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQID NO：2的第325-334位残基、和SEQ ID NO：2的第542-550位残基中至少两项的联合。
13.用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用选自下组的一种或多种肽从而针对氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤：SEQ ID NO：2的第158-166位残基和SEQ ID NO：2的第542-550位残基。
14.用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用选自下组的一种或多种肽从而针对氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤：SEQ ID NO：2的第1-9位残基、SEQ ID NO：2的第178-186位残基、SEQ ID NO：2的第218-226位残基、SEQ ID NO：2的第235-243位残基、SEQ ID NO：2的第306-315位残基、SEQ ID NO：2的第485-493位残基、SEQ ID NO：2的第492-500位残基、SEQ ID NO：2的第507-516位残基、SEQ ID NO：2的第547-556位残基、和SEQ ID NO：2的第555-563位残基。
15.用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用一种或多种组合物从而针对氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤，其中所述组合物包含经过构成氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分的一种或多种肽脉冲的树突细胞。
16.权利要求15的方法，其中用于脉冲树突细胞的一种或多种肽选自下组：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和SEQ ID NO：2的第542-550位残基。
17.用于在人中预防或治疗肝细胞癌的方法，其中癌细胞在细胞表面表达甲胎蛋白分子的至少一部分，该方法包括通过对人施用一种或多种组合物从而针对氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少一部分激活针对癌细胞的甲胎蛋白细胞毒性T淋巴细胞的步骤，其中所述组合物包含经过编码甲胎蛋白的重组腺病毒载体转导的树突细胞。
18.可用于预防或治疗癌症的分离肽，其选自下组：SEQ ID NO：2的第137-145位残基和SEQ ID NO：2的第325-334位残基。
19.用于预防或治疗癌症的组合物，其包含权利要求18的一种或多种肽，它们的量足以在哺乳动物中引发针对甲胎蛋白的免疫应答。
20.权利要求19的组合物，其中还包含佐剂。
21.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求18的肽的步骤。
22.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求19的组合物的步骤。
23.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求20的组合物的步骤。
24.用于预防或治疗癌症的手段，其中包含选自下组的一种或多种肽：SEQ ID NO：2的第137-145位残基、SEQ ID NO：2的第158-166位残基、SEQ ID NO：2的第325-334位残基、和SEQ ID NO：2的第542-550位残基。
25.可用于预防或治疗癌症的分离肽，其中具有依照SEQ ID NO：2的第158-166位残基或SEQ ID NO：2的第542-550位残基的序列。
26.用于预防或治疗癌症的组合物，其中包含权利要求25的一种或多种肽，它们的量足以在哺乳动物中引发针对甲胎蛋白的免疫应答。
27.权利要求26的组合物，其中还包含佐剂。
28.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求25的肽的步骤。
29.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求26的组合物的步骤。
30.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求27的组合物的步骤。
31.用于预防或治疗癌症的手段，其中包含权利要求19的组合物。
32.权利要求31的手段，其中还包含佐剂。
33.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求31的手段的步骤。
34.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求32的手段的步骤。
35.用于预防或治疗癌症的手段，其中包含权利要求26的组合物。
36.权利要求35的手段，其中还包含佐剂。
37.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求35的手段的步骤。
38.用于在人中预防或治疗癌症的方法，包括对人施用权利要求36的手段的步骤。
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