CN1391478A - α－干扰素水性溶液制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以长期保持α－干扰素生物活性及其物化性质的水性溶液制剂。具体地说，本发明涉及包含α－干扰素、稳定剂、渗透压调节剂、选自苯酚、间甲酚或其混合物的抗菌防腐剂和缓冲体系的α－干扰素水性溶液制剂。本发明水性溶液制剂具有许多优点，因为它可长期保持α－干扰素的活性，通过将防腐剂的量减到最少消除了对人体的潜在危害，并且很稳定。

Description

α-干扰素水性溶液制剂
发明领域
本发明涉及不含人血清白蛋白的稳定的α-干扰素(α-IFN)水性溶液制剂。
背景技术
大多数蛋白质在水性溶液中容易变性或者丧失其生物活性。因此，许多药物公司开发了可改善蛋白质药物产品稳定性的冻干制剂。然而，蛋白质药物的冻干制剂有许多缺点。因为冻干工艺比较昂贵，并且在对病人给药之前还需对蛋白质药物进行另外的重建步骤，因此从经济或者方便的角度考虑则不优选液体制剂。在α-IFN制剂的研制中也应考虑到上述因素。
干扰素(IFN)对正常或者肿瘤细胞的生长、分化和功能起作用，并且是一种抑制多种病毒增殖的蛋白质细胞因子。具体地说，IFN控制自然杀伤细胞(NK)的活性，提高细胞毒性T淋巴细胞的活性并增加巨噬细胞的吞噬细胞活性。因此，IFN最终介导被病毒等感染的细胞的免疫反应。根据分泌细胞或者诱导物质的种类，可将IFN分成α、β和γ型。其中的α和β型在pH2时稳定，而γ型在酸性条件不稳定。
在上述3种类型中，α-干扰素长久以来被用作抗病毒剂，因为它可非常有效治疗包括肝炎C在内的由病毒引起的疾病。因此，许多研究者一直致力于研制能更长期保持α-干扰素活性的制剂。
US4496537涉及α-干扰素冻干制剂，其中包含丙氨酸(或甘氨酸)和人血清白蛋白为稳定剂，以及保持溶液pH为6.5-8.0的缓冲体系。并且，US4847079涉及α-干扰素水性制剂，其中含有人血清白蛋白、甘氨酸、硫柳汞，以及维持pH在6.5-8.0的缓冲体系。有趣地是，上述两个专利的特征在于制剂中含有对保持α-干扰素生物活性有效的人血清白蛋白。然而，当制剂包含人血清白蛋白时，制剂被感染性病原体例如人免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)潜在污染的可能性就较高。因此，近来已不推荐使用人血清白蛋白。同时，已知上述白蛋白可诱发某些人的免疫反应。
欧洲专利0736303A2公开了一种α-干扰素水性制剂，其中含有稳定剂聚山梨酸酯和抗菌防腐剂苯甲醇以及维持pH在4.5-5.5范围内的缓冲体系。在上述专利中，采用安全的聚山梨酸酯代替潜在有害的人血清白蛋白。然而，众所周知的是，在与非离子型表面活性剂例如聚山梨酯80同时使用时，苯甲醇的抗菌活性会降低。事实上，人们已发现苯甲醇与聚山梨酯80同时使用是不可接受的(药物赋形剂手册，美国制药协会，1986，p18)。因此，为了保持抗菌活性，苯甲醇的用量就相对较大(0.9，1.0％)。然而，如此过量地使用苯甲醇会引起肽的聚集(Richard L.Remmele等，Pharmaceutical Research，卷15，2期，1998年)。同时，根据本发明人观测的α-干扰素制剂在40℃时的加速试验表明，与含有苯酚(或者间甲酚)和0.02％聚山梨酯80的制剂相比，含有1.0％苯甲醇和0.02％聚山梨酯80的液体制剂的α-干扰素活性非常低。
WO96/11018涉及一种含有聚山梨酸酯和螯合剂例如EDTA二钠，和防腐剂的水性溶液制剂。然而，由于其中所含的EDTA二钠已知具有细胞毒性(Paula Saarien-Savolainen等，Pharmaceutical Research，卷15，2期，1998)因此上述液体制剂潜在有害，并且，由于可与人体内钙离子形成螯合物，其还有其它问题。上述专利中提及的另一种螯合剂柠檬酸盐，也已知在施用后可引起严重的疼痛。
发明概述
为了解决上述提及的问题，本发明人研究开发出了α-干扰素水性溶液制剂，其中既不含潜在有害的人血清白蛋白也不含有螯合剂，它可长期保持α-干扰素的生物活性并且非常稳定。本发明人已经完成了本发明，所研制出的α-干扰素水性溶液制剂可长期保持α-干扰素的生物活性，并且由于采用了聚山梨酸酯为稳定剂和采用苯酚、间甲酚或其混合物为抗菌防腐剂，使防腐剂的用量减到最少。
本发明的一个目的是提供稳定的α-干扰素水性溶液制剂，所述制剂可长期保持生物活性和物化稳定性，即便在仅含有非常少量防腐剂的情况下，它也可满足欧洲药典(European Pharmacopoeia)中抗菌防腐剂的抗菌效力试验所规定的验收标准。
本发明的另一个目的是提供安全的α-干扰素水性溶液制剂，其在不含有潜在对人体有害的物质例如人血清白蛋白或者螯合剂的情况下，也可保持抗菌活性。
本发明提供α-干扰素的水性溶液制剂，其中包含α-干扰素、稳定剂、渗透压调节剂、选自苯酚、间甲酚或其混合物的抗菌防腐剂，和缓冲体系。
根据本发明，提供稳定的α-干扰素水性溶液制剂。同时，也提供更安全的α-干扰素水性溶液制剂。参考下面的描述和所附的权利要求书，将会更透彻地理解本发明的上述和其它特征、方面及优点。
附图简述
图1为本发明水性溶液制剂4℃贮存4个月时，稳定剂对α-干扰素(α-IFN)生物活性的影响曲线图。
图2a为本发明水性溶液制剂4℃贮存36周时，抗菌防腐剂对α-干扰素(6×106IU/ml)水性溶液制剂稳定性的影响曲线图(通过测定α-IFN生物活性)。
图2b为本发明水性溶液制剂40℃贮存16周时，抗菌防腐剂对α-干扰素(6×106IU/ml)水性溶液制剂稳定性的影响曲线图(通过测定α-IFN生物活性)。
图3a为本发明水性溶液制剂40℃贮存12周时，pH对α-干扰素(6×106IU/ml)水性溶液制剂稳定性的影响曲线图(通过测定α-IFN生物活性)。
图3b为40℃贮存12周后经银染色十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶，测得pH对α-IFN二聚作用影响的照片。
图4a，4b和4c分别表示α-IFN(1×106IU/ml)水性溶液制剂于4、25和40℃贮存12周时，含有0.15％苯酚和0.1％间甲酚混合物的制剂与仅含0.3％苯酚抗菌防腐剂的制剂间的生物活性差异曲线图。
图4d，4e和4f分别表示α-IFN(1×106IU/ml)水性溶液制剂于4、25和40℃贮存12周时，经反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定，含有0.15％苯酚和0.1％间甲酚混合物的制剂与仅含0.3％苯酚抗菌防腐剂制剂间的纯度差异曲线图。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了α-干扰素的水性溶液制剂，其中包含α-干扰素、稳定剂、渗透压调节剂、选自苯酚、间甲酚或其混合物的抗菌防腐剂和缓冲体系。
本发明中的术语“α-干扰素”包括各种类型的经重组细菌、酵母和动物细胞表达和纯化的α-干扰素。即，在此所用的术语“α-干扰素”包括天然和重组α-干扰素。同样，天然人α-干扰素的氨基酸部分被取代但保持高于50％天然人α-干扰素活性的α-干扰素类似物(analog)或者变异体(variant)，也可包括在本发明水性溶液制剂。本发明水性溶液制剂中所加α-干扰素的量优选为1×106-1×108IU/ml。
有助于维持本发明水性溶液制剂中α-干扰素稳定性的稳定剂，优选为聚山梨酯80，其浓度为0.01-0.05w/v％。
本发明水性溶液制剂还含有包含苯酚和/或间甲酚的防腐剂以抑制微生物的生长。苯酚浓度优选为0.1-0.3w/v％，间甲酚浓度优选为0.1-0.2w/v％，并且本发明水性溶液制剂也可采用苯酚与间甲酚的适宜混合物。
本发明水性溶液制剂中的缓冲体系包括醋酸盐缓冲溶液或者磷酸盐缓冲液。具体地说，优选是由乙酸铵和醋酸组成的缓冲体系，或者是由磷酸氢二钠(Na2HPO4)与磷酸二氢钠(NaH2PO4)组成的缓冲体系。同时，本发明水性溶液制剂中所述缓冲体系的浓度优选为在5-20mM。本发明水性溶液制剂的pH取决于上述缓冲体系。在大多数情况下本发明水性溶液制剂的pH为4.0-8.0，并优选为4.5-6.0。
本发明水性溶液制剂中还包括渗透压调节剂例如氯化钠。渗透压调节剂用量的取决于制剂中的其他组分。最后，本发明水性溶液制剂是在无菌条件下制备的。
为了筛选优选的稳定剂，本发明中制备了含有不同浓度可注射用多种赋形剂的水性溶液制剂，并研究了所述稳定剂对α-干扰素生物活性的影响。4℃贮存4个月的结果表明，分别含有人血清白蛋白、聚山梨酯80、聚乙二醇或者明胶为稳定剂的水性溶液制剂的活性高于贮存前最初标示(filled)生物活性的90％，而仅含有α-干扰素和缓冲体系的水性溶液制剂活性大约为贮存前最初标示生物活性的80％。这大概是由于上述稳定剂防止α-干扰素被小瓶的内表面所吸附。但是近来并不推荐使用人血清白蛋白和明胶，这是出于对外源性病毒例如HIV和HBV等潜在污染的日益关注所致。而且，它对某些人是致免疫性的。因此，聚山梨酯80被选为本发明最适宜的稳定剂。
本发明人还研究了聚山梨酯80与抗菌防腐剂的浓度对所述水性溶液制剂外观的影响。结果显示，0.01-0.02％范围内的聚山梨酸酯对所述水性制剂的澄清度(clearance)无影响。然而，当所用间甲酚的浓度超过0.15％时，水性溶液制剂变混浊，并且混浊程度与间甲酚的浓度成比例。当苯酚用作抗菌防腐剂时，0.1-0.3％范围内的苯酚对水性溶液制剂的澄明度没有影响，但是如果所用苯酚的浓度超过0.3％，水性溶液制剂变混浊。
尽管与包含间甲酚或者苯甲醇的水性溶液制剂相比，含有苯酚的水性溶液制剂具有稍微大的保持生物活性的能力，但是它们之间的差异不是很大。然而，如果将所述水性溶液制剂贮存于40℃的高温下，含有苯甲醇的水性溶液制剂的生物活性会大大地降低。
pH对α-干扰素的生物活性以及其二聚作用也有影响。在约pH5.8时，α-干扰素的生物活性相对稳定，其二聚作用在较高pH时较频繁。因此，α-干扰素水性溶液制剂不优选在高pH环境中长期贮存。
按照欧洲药典有关抗菌制剂效力试验方案(欧洲药典，1997，5.1.3.，抗菌制剂的效力)，本发明人还考察了含有不同组成及浓度的防腐剂对所述水性溶液制剂抗菌防腐的影响。所述欧洲药典关于抗菌制剂效力试验的具体方案见参考实施例3的描述，下面作以简述。
人工接种该试验所用的五种标准菌种(革兰氏阳性和阴性菌、真菌的标准菌株)，浓度为105-106细胞每1ml水性溶液制剂。在确定时间间隔，取一份该制剂样品，并将活细胞数变化的数值作对数变换。将上述对数变换值(对数减少值(Log reduction values))与欧洲药典中的表5.1.3-1数值比较，以估计抗菌活性的水平。由最后所关心的微生物的对数减少值的差值，即可得到欧洲药典中描述的A和B类间的分类。对于细菌，A类规定相对于获得的用于接种的值，活微生物数在6小时内出现2个对数减少(2log-reductions)，并在24小时内出现3个对数减少；B类规定从接种起，24小时内出现1个对数减少，并在7天内出现3个对数减少。相似地，对于真菌，A类规定7天内出现2个对数减少；B类规定14天内出现1个对数减少。在上述规定的时间后，不得观察到活微生物数的恢复和增加。上述每类的对数减少值适用于注射剂和滴眼剂，同时也适用于本发明α-干扰素水性溶液制剂。因此，通过制备含有不同防腐剂的多种α-干扰素水性溶液制剂，并通过抗5种标准菌株的抗菌效力试验来估计其相对抗菌活力，本发明人确定了最佳制剂。
结果显示，包含0.2％苯酚和0.1％间甲酚的制剂，和包含0.15％苯酚和0.1％间甲酚的制剂满足欧洲药典抗黑曲霉、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的A和B类标准。然而，对于含有0.15％苯酚和0.1％间甲酚的制剂，防腐剂的总量占制剂的0.25％。因此，出于安全性的考虑，更优选含有0.15％苯酚和0.1％间甲酚的制剂，因为其中防腐剂的含量最小。
如上所述，本发明具有许多优点，包括提供稳定的α-干扰素水性溶液制剂，并且由于防止了α-干扰素在小瓶表面上的吸附而更长期保持α-干扰素的生物活性；
提供了一种α-干扰素水性溶液制剂，所含减至最小量的防腐剂即可保持α-干扰素的生物活性和抗菌活性；
提供一种更安全α-干扰素水性溶液制剂，其中含有最小量的防腐剂，因为已知这些防腐剂大量使用时对人体有害；
提供一种α-干扰素水性溶液制剂，其中不含有潜在对人体有害的物质例如人血清白蛋白或者螯合剂；和
提供一种非常稳定的α-干扰素水性溶液制剂。
以下实施例将对本发明作进一步说明。对本领域技术人员显而易见的是，这些实施例旨在更详细地阐明本发明，并不对本发明作任何限制。参考实施例1：纯化重组α-干扰素的制备
采用IntermaTM(干扰素-α2a，LG化学有限公司)的活性物质生产工艺，制备制剂研究用的纯化α-干扰素。
待含有人α-干扰素基因***物的酿酒酵母(酿酒酵母，pYLBC A/G，αfα-干扰素；1992年7月2日保藏于韩国生物科学及生物工艺学研究所典型培养中心，保藏号为KCTC 0051 BP)发酵后，通过包括离子交换色谱和凝胶过滤色谱的几个若干纯化步骤，即可获得反相色谱纯度高于95％的α-干扰素。更多细节，请参阅1992年12月28日提交的韩国专利申请1992-25912(现为韩国专利111251)，发明名称为“重组酵母表达的α-干扰素的纯化方法”，在此引入作为参考。参考实施例2：α-干扰素水性溶液制剂的制备及其生物活性的测定
制备含有以下成分的α-干扰素水性溶液制剂：
    α-干扰素         1×106IU/ml-100×106IU/ml；
    聚山梨酯80        0.1-0.5mg/ml；
    苯酚              1.5mg/ml；
    间甲酚      1.0mg/ml；和
包括10mM醋酸盐缓冲溶液或者10mM磷酸盐缓冲液的缓冲体系。
按欧洲药典专刊1997：1110“干扰素α-2浓溶液”中规定的方法，测定上述制备的α-干扰素水性溶液制剂的生物活性。换言之，测量该α-干扰素水性溶液制剂对细胞抗病毒感染的保护效应，通过与国际标准重组人干扰素α-2(IFNα-2)或者内部工作标准比较，来计算国际单位(I.U.)。
在37℃和5％CO2培养条件下，于微量滴定板中培养MDBK细胞(Madin-Derby牛肾细胞：ATCC No CCL22)形成单细胞层。然后，将3种以上不同浓度的α-干扰素试样和经重组人α-干扰素国际标准校准的α-干扰素工作标准(来自美国国立卫生研究所，产品样本号：Gxa 01-901-535，美国)加到微量滴定板中并培养。一组分别含有未用α-干扰素处理的细胞的微量滴定板，它们用作阴性对照。在37℃和5％CO2条件下培养18-24小时后，弃去处理的α-干扰素溶液，并将致细胞病变的水疱性口炎病毒(ATCC No.VR 158)加至所有微量滴定板孔中，但对照组除外。培养24-48小时后，微量滴定板用结晶紫染色并在空气中干燥。每一孔中加入乙二醇提取染色染料，采用微量反应板分光光度计于600nm处测定吸光度。
标准溶液和待试溶液的吸光度值对α-干扰素剂量作图呈线性关系。然后，采用平行线分析方法比较，计算出待试溶液的效价。参考实施例3：α-干扰素水性溶液制剂的抗菌效力试验
试验采用了以下五种标准菌种：两种真菌菌株即黑曲霉(ATCC 16404)和白色念珠菌(ATCC 10231)，和3种细菌菌株即铜绿假单胞菌(ATCC9027)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和大肠杆菌(ATCC 8739)。
琼脂B(15g/L酪胨，5g/L Soytone，5g/L NaCl，18g/L琼脂，pH7.3±0.2)用作细菌固体培养，琼脂C(10g/L胨，40g/L葡萄糖，15g/L琼脂，pH5.6±0.2)用作真菌固体培养。细菌于30-35℃培养18-24小时，真菌于20-25℃下培养，白色念珠菌培养24-48小时，而黑曲霉则培养2-7天。
对于曲霉菌，于培养约5天后收集所形成的黑孢子并代替真菌供实验使用。
为了在含有α-干扰素水性溶液制剂的容器中直接接种浓度为105-106个细胞(对于曲霉菌而言为孢子)/ml标准菌株的标准菌株，在接种前用稀释缓冲液将细胞浓度稀释到107-108个细胞(或孢子)/ml，然后将稀释的细胞悬液加到水性溶液制剂中，使所加细胞悬液的量占水性溶液制剂的1(v/v)％。对于稀释缓冲液，稀释缓冲液-A(9g/L NaCl，1g/L胨)用于稀释细菌和念珠菌，而稀释缓冲液-B(9g/L NaCl，0.5g/L聚山梨酯80)用于稀释曲霉菌。
将标准菌株悬液接种到待试水性溶液制剂中后，分别于0小时、6小时、24小时、7天、14天和28天对每一待试制剂取样0.1-0.5ml，样品溶液用稀释缓冲液稀释1-103倍。然后，将稀释的样品涂布到琼脂固体培养基上，并按上述培养温度培养。对固体培养中形成的菌落数计数，计算每毫升样品中的活细胞数。在此期间，取样后应立即将待试水性溶液制剂贮存于20-25℃的恒温箱中。至于测定活细胞数的方法和试验用的培养基，可参见欧洲药典(E.P1997，2.6.12)的描述。实施例1：优选稳定剂的筛选
下面的实验旨在筛选出优选的稳定剂，它可防止α-干扰素在小瓶表面上的吸附而保持生物活性。
首先，按表1制备包含不同浓度注射用赋型剂的水性溶液制剂，并加入氯化钠调节等张(tonicity)。将每一水性溶液制剂置于4℃贮存4个月，按参考实施例2方法测定每一制剂中α-干扰素的生物活性。结果见下面图1和表1。图1显示相对于含有9×106 IU/ml α-干扰素的水性溶液制剂标示生物活性的相对α-干扰素生物活性(％)的曲线图。
表1：4℃实时贮存试验
待试水性制剂 组分 对照组 2个月后 4个月后
活性  ％活性水平 活性 ％活性水平 活性 ％活性水平
1-1 只含缓冲溶液，不含稳定剂 7.24  80.4％ 7.03  78.1％ 5.15  57.2％
1-2 人血清白蛋白0.01w/v％ 10.5  116.7％ 9.85  109.4％ 7.64  84.9％
1-3 人血清白蛋白0.5w/v％ 9.75  108.3％ 8.41  93.4％ 8.08  89.8％
1-4 聚山梨酯800.01w/v％ 9.21  102.3％ 8.65  96.1％ 8.00  88.9％
1-5 聚山梨酯800.1w/v％ 10.4  115.6％ 9.63  107.0％ 9.55  106.0％
1-6 聚乙二醇40000.5w/v％ 8.07  89.7％ 6.60  73.3％ 5.79  64.3％
1-7 聚乙二醇60000.5w/v％ 8.06  89.6％ 8.39  93.2％ 7.95  88.3％
1-8 明胶0.05w/v％ 8.35  92.8％ 8.83  98.1％ 9.24  102.7％
1-9 明胶0.2w/v％ 9.33  103.7％ 8.04  89.3％ 8.96  99.6％
1-10 右旋糖酐40T0.5w/v％ 7.31  81.2％ 6.72  74.7％ 7.39  82.1％
*α-干扰素标示生物活性：9×106IU/ml(单位：×106IU/ml)
仅包含α-干扰素和缓冲体系的阴性对照制剂，保持了约最初标示生物活性的80％。另一方面，包含人血清白蛋白、聚山梨酯80、聚乙二醇或明胶的水性溶液制剂保持了高于最初标示生物活性的90％。这可能是由于上述添加剂防止了α-干扰素在小瓶表面上的吸附。
尽管上述添加剂有助于保持α-干扰素的生物活性，但是由于存在潜在的外源病毒污染问题，人血清白蛋白和明胶在注射制剂中的应用仍受到限制。因此，聚山梨酯80是最适宜的稳定剂。实施例2：聚山梨酯80与抗菌防腐剂的浓度对水性溶液制剂外观的影响
对初步筛选的α-干扰素水性溶液制剂进行了初步实验，研究聚山梨酯80与抗菌防腐剂的浓度对水性溶液制剂外观的影响。制备100毫升包含各种浓度聚山梨酯80和包含苯酚、间甲酚或其混合物的抗菌防腐剂的α-干扰素水性溶液制剂。然后，分别采用0.8％氯化钠和10mM醋酸铵缓冲液对每一制剂调节等张和pH。将每一制剂pH调节到5.3。
肉眼观察上述包含各种浓度聚山梨酯80与抗菌防腐剂的水性溶液制剂的颜色和混浊度。结果下面如表2所示。
表2：依据聚山梨酯80与抗菌防腐剂的浓度，α-干扰素水性溶液制剂外观的变化
  待试水性制剂                组分     外观
聚山梨醇酯80   苯酚    间甲酚
  2-12-22-3     0.01％0.01％0.01％   ---     0.15％0.20％0.30％     澄清且透明白色并浑浊白色并浑浊
  2-42-52-62-7     0.01％0.01％0.01％0.01％   0.20％0.30％0.40％0.50％     ----     澄清且透明澄清且透明白色并浑浊白色并浑浊
  3-13-23-3     0.02％0.02％0.02％   ---     0.15％0.20％0.30％     澄清且透明白色并浑浊白色并浑浊
  3-42-53-63-7     0.02％0.02％0.02％0.02％   0.20％0.30％0.40％0.50％     ----     澄清且透明澄清且透明白色并浑浊白色并浑浊
  3-83-9     0.02％0.02％   0.15％0.20％     0.10％0.10％     澄清且透明白色并浑浊
当间甲酚高于0.15％时，水性溶液制剂变得混浊，并且混浊程度与间甲酚的浓度成比例。当苯酚用作抗菌防腐剂时，0.1-0.3％浓度范围的苯酚不会使水性溶液制剂变混浊，但是所用苯酚的浓度超过0.3％时水性溶液制剂变混浊。上述试验结果与采用0.01％和0.02％聚山梨酯80的结果相似。实施例3：抗菌防腐剂对α-干扰素生物活性的影响
采用醋酸铵缓冲液将水性溶液制剂的pH控制在4.5-5.5，加入氯化钠调节水性溶液制剂等张。将所有水性溶液制剂的α-干扰素的浓度调节到6×106IU/ml。贮存温度为4℃或40℃。按参考实施例2所述的方法，在贮存期间测定α-干扰素生物活性的变化。下面表3和图2a显示水性溶液制剂于4℃贮存期间的生物活性试验结果，下面表4和图2b显示40℃的结果。
表3：包含多种抗菌防腐剂的水性溶液制剂于4℃贮存期间α-干扰素生物活性的变化
待试水性制剂   防腐剂(w/v％)                           贮存期
    0     4周   8周     12周   16周     20周   36周
  4-1   苯甲醇(1.0％)    6.79     6.14   6.72     6.61   6.20     5.98   5.77
   100％     90.4％   99.0％     97.4％   91.3％     88.1％   85.0％
  4-2   间甲酚(0.15％)    6.51     5.58   7.35     6.46   5.96     -   5.67
   100％     85.7％   112.9％     99.2％   91.6％     -   87.1％
  4-3   苯酚(0.3％)    6.69     5.42   6.87     6.48   6.34     5.92   6.53
   100％     81.0％   102.7％     96.9％   94.8％     88.5％   97.6％
    标示生物活性：6×106IU/ml                     单位：106IU/ml
表4：包含多种抗菌防腐剂的水性溶液制剂于40℃贮存期间α-干扰素生物活性的变化
  待试水性制剂   防腐剂(w/v％)     贮存期
    0   2周   4周   6周   8周   10周   12周   16周
  4-1   苯甲醇(1.0％)   6.79   5.81   5.18   5.44   4.50   3.18   3.57   2.26
  100％   85.6％   76.3％   80.1％   66.3％   46.8％   52.6％   33.3％
  4-2   间甲酚(0.15％)   6.51   6.12   5.78   5.41   5.09   4.52   4.79   3.81
  100％   94.0％   88.8％   83.1％   78.2％   69.4％   73.6％   58.5％
  4-3   苯酚(0.3％)   6.69   6.27   5.94   5.14   5.41   3.97   4.19   2.9
  100％   93.7％   88.8％   76.8％   80.9％   59.3％   62.6％   43.3％
  标示生物活性：6×106IU/ml                        单位：106IU/ml
*在表3和4中，上部的数值为α-干扰素的绝对生物活性，下部数值为相对于时间为0时α-干扰素的相对生物活性(％)。
如表3和图2a所示，与其他水性溶液制剂相比，包含苯酚的水性溶液制剂保持生物活性的能力略高，但是它们之间的差异并不大。然而，对于40℃贮存的情况下，与其它水性溶液制剂相比，包含苯甲醇的水性溶液制剂的生物活性的大大降低(参见表4和图2b)。实施例4：pH对α-干扰素生物活性及其二聚作用的影响
制备包含6×106 IU/mlα-干扰素、0.15％间甲酚和10mM醋酸铵缓冲液的水性溶液制剂。将每一水性溶液制剂的pH值分别控制在5.3、5.8和6.3。将制得的水性溶液制剂于40℃下贮存12周，并于适宜的时间间隔测定每一水性溶液制剂的生物活性。结果见下面表5和图3a。
表5：水性溶液制剂于40℃贮存期间pH对α-干扰素生物活性的影响
  待试水性制剂    水性制剂pH     贮存期
    0     2周     4周     6周     8周     10周     12周
  5-1     5.3     6.51     6.12     5.78     5.41     5.09     4.52     4.79
    100％     94.0％     88.8％     83.1％     78.2％     69.4％     73.6％
  5-2     5.8     6.58     6.54     7.33     6.66     6.54     5.83     5.83
    100％     99.4％     111.4％     101.2％     99.4％     88.6％     88.6％
  5-3     6.3     7.21     6.60     6.62     6.76     6.79     5.27     5.68
    100％     91.5％     91.8％     93.8％     94.2％     73.1％     78.8％
    标示生物活性：6×106IU/ml                 单位：106IU/ml
12周后，于非还原条件下，采用14％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)(不连续缓冲体系，分离凝胶；14％，0.375 M Tris-HCl，pH8.8，积层凝胶；5％；0.125M Tris-HCl，pH6.8)，再经银染色，测定二聚作用的发生及其程度。
首先，制备固化于两片玻璃板间的14％分离凝胶，再配制5％的积层(stacking)凝胶溶液并倾注到分离凝胶上，然后***梳子(comb)。待积层凝胶完全凝固后，除去梳子后所形成的孔用电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3)洗涤。向100μl上述水性溶液制剂中，加入3倍浓缩的试样缓冲液50μl(0.186M Tris，3％SDS，30v/v％甘油，0.009％溴酚蓝，pH6.8)并混合孔。然后，将混合物于沸腾水浴中煮沸2分钟，再用冷水浴冷却。取50μl该样品和10μl分子量标记(Bio-Rad，低范围分子量标记)加入不同孔中。加完该样品和分子量标记后，将凝胶置于电泳***(Hoeffer科学仪器公司，SE600)中，然后将电泳缓冲液倾入***中。将***与供电装置(Hoeffer科学仪器公司，PS2500)连接，对每片凝胶施加10mA电流，至溴酚蓝带出现在分离凝胶与积层凝胶间的界面上停止电泳。当溴酚蓝带出现在界面时，电流升至20mA，并且在溴酚蓝带达到玻璃板下端时停止电泳。电泳完成后关闭电源，从***中取出凝胶，室温下将含有蛋白质的凝胶置于甲醇∶乙酸∶水(50∶10∶40)混合物中固定12-16小时。然后将凝胶转移至10％戊二醛溶液中搅拌30分钟并用去离子水洗涤3次(每次20分钟)。配制硝酸银溶液(0.8％硝酸银，0.08％NaOH和4％氨水)，将凝胶转移至该溶液中并于暗处搅拌5分钟。然后，凝胶用去离子水洗涤3次(每次1分钟)。展开液(0.005％柠檬酸，0.14％甲醛和0.005％甲醇)在加入凝胶之前即时配制，轻轻摇荡凝胶以展开银染色的蛋白质带。结果见下面表6和图3b。
表6：pH对α-干扰素二聚作用的影响
  待试水性制剂     水性制剂pH                          贮存期
   0   2周   4周   6周   8周   10周   12周
  5-1     5.3    -     -     -     -     -     -     -
  5-2     5.8    -     +     +     +     +     ++     ++
  5-3     6.3    -     +     +     +     ++     ++     ++
* -：未发现二聚物+：发现低于1％的二聚物++：发现1％或高于1％的二聚物
如表5和如3a所示，α-干扰素的生物活性在pH约5.8的条件下相对稳定。在此期间，α-干扰素的二聚作用在高pH下较频繁(参见表6和图3b)。因此，不优选在高pH条件下长期贮存α-干扰素水性溶液制剂。实施例5：两种防腐剂对抗菌活性的影响
按欧洲药典(E.P1997，5.1.3)描述的方法，对包含苯酚和/或间甲酚的α-干扰素水性溶液制剂进行抗菌效力试验。首先，制备包含6×106IU/mlα-干扰素、0.02％聚山梨酯80和10mM醋酸铵缓冲液的水性溶液制剂。向制剂中加入表7所示的各种浓度的防腐剂，并加入氯化钠以调节每一制剂等张。水性溶液制剂的抗菌效力试验结果见下面表7。按参考实施例3描述的方法，测定每毫升水性溶液制剂的活细胞数。将每一取样时间测定的活细胞数作对数变换，计算每一时间间隔的对数减少。所得对数减少与欧洲药典规定的标准A或B值比较，以确定上述制剂是否满足标准A或B。
表7：包含各种浓度防腐剂的水性溶液制剂的抗菌效力试验
待试水性制剂     防腐剂(w/v％)                              结果
  黑曲霉 白色念珠菌 铜绿假单包菌 金黄色葡萄球菌   大肠杆菌
  6-1     0.15％间甲酚   A&B   A&B   A&B    B     A&B
  6-2     0.10％间甲酚   A&B   A&B   B   ≠A≠B     ≠A≠B
  6-3     0.075％间甲酚   A&B   A&B   A&B   ≠A≠B     -
  6-4     0.30％苯酚   A&B   A&B   A&B   A&B     B
  6-5     0.20％苯酚   A&B   A&B   A&B   B     ≠A≠B
  6-6     0.15％苯酚   A&B   A&B   B   B     -
  6-7     0.20％苯酚+0.10％间甲酚   A&B   A&B   A&B   A&B     A&B
  6-8     0.15％苯酚+0.10％间甲酚   A&B   A&B   A&B   A&B     A&B
  6-9     0.15％苯酚+0.075％间甲酚    -   -    -   B      -
  6-10     0.20％苯酚+0.05％间甲酚    -   -    -   B      -
  6-11     0.10％苯酚+0.10％间甲酚    -   -    -   B      -
*A：表示水性溶液制剂满足欧洲药典的标准A
B：表示水性溶液制剂满足欧洲药典的标准B
-：表示试验未进行。
如表7的结果所示，包含0.15％苯酚和0.1％间甲酚的水性溶液制剂满足欧洲药典有关抗菌效力试验规定的A和B标准，尽管其仅含有最低量的防腐剂(防腐剂的总量为0.25％)。实施例6：包含0.15％苯酚和0.1％间甲酚混合物的水性溶液制剂与仅包含0.3％苯酚的水性溶液制剂间的稳定性比较试验
制备包含6×106IU/mlα-干扰素、0.02％聚山梨酯80、0.3％苯酚和10mM醋酸铵缓冲液的水性溶液制剂(即待试水性溶液制剂#7-1)，并制备另一如上所述水性溶液制剂，除用0.15％苯酚和0.1％间甲酚混合物代替0.3％苯酚(即待试水性溶液制剂#7-2)。将每一水性溶液制剂的pH调到5.3，并与水性溶液制剂中加入氯化钠以调节等张。将这两种制剂分别分成3组，并分别置于4℃、25℃和40℃下贮存12周。每组有3批。于固定时间间隔，测定α-干扰素生物活性的变化。纯度的测定采用反向高效液相色谱(RP-HPLC，Waters Alliance System，UV检测器，Jupiter C18柱)。结果见下面的表8-13和图4a-4f。
(6-1)测定α-干扰素生物活性的变化
表8：4℃贮存时α-干扰素的生物活性
  待试水性制剂    防腐剂(w/v％)                              贮存期
    0     4周     8周     12周
  7-1a 苯酚0.3％     6.11     6.05     6.58     5.98
    100.0％     99.0％     107.7％     97.9％
  7-1b 苯酚0.3％     6.53     6.57     6.54     5.43
    100.0％     100.6％     100.2％     83.2％
  7-1c 苯酚0.3％     7.94     7.48     7.94     7.18
    100.0％     94.2％     100.0％     90.4％
  7-2a 苯酚0.15％+间甲酚0.1％     6.68     6.69     6.29     6.18
    100.0％     100.1％     94.2％     92.5％
  7-2b 苯酚0.15％+间甲酚0.1％     7.77     6.89     7.67     8.06
    100.0％     88.7％     98.7％     103.7％
  7-2c 苯酚0.15％+间甲酚0.1％     6.39     6.02     6.24     6.72
    100.0％     94.2％     97.7％     105.2％
表9：25℃贮存时α-干扰素的生物活性
  待试水性制剂     防腐剂(w/v％)                                贮存期
    0    2周   4周   8周   12周
  7-1a   苯酚0.3％   6.11   6.94   5.85   -   6.72
  100.0％   113.6％   95.7％   -   110.0％
  7-1b   苯酚0.3％   6.53   7.18   7.20   -   8.26
  100.0％   110.0％   110.3％   -   126.5％
  7-1c   苯酚0.3％   7.94   7.33   6.87   7.66   7.34
  100.0％   92.3％   86.5％   96.5％   92.4％
  7-2a   苯酚0.15％+间甲酚0.1％   6.68   6.63   6.60   -   6.49
  100.0％   99.3％   98.8％   -   97.2％
  7-2b   苯酚0.15％+间甲酚0.1％   7.77   7.59   7.07   -   7.67
  100.0％   97.7％   91.0％   -   98.7
  7-2c   苯酚0.15％+间甲酚0.1％   6.39   -   -   6.14   6.45
  100.0％   -   -   96.1％   100.9％
表10：40℃贮存时α-干扰素的生物活性
  待试水性制剂     防腐剂(w/v％)                                            贮存期
    0     1周     2周     3周     4周     8周     12周
   7-1a     苯酚0.3％     6.11     5.28     5.89     5.68     5.56     5.02     4.39
    100.0％     86.4％     96.4％     93.0％     91.0％     82.2％     71.8％
   7-1b     苯酚0.3％     6.53     6.24     6.56     6.47     6.06     4.84     4.88
    100.0％     95.6％     100.5％     99.1％     92.8％     74.1％     74.7％
   7-1c     苯酚0.3％     7.94     7.55     6.69     6.61     -     5.49     4.49
    100.0％     95.1％     84.3％     83.2％     -     69.1％     56.5％
   7-2a     苯酚0.15％+间甲酚0.1％     6.68     6.02     6.34     6.71     6.46     5.59     6.27
    100.0％     90.1％     94.9％     89.5％     85.3％     68.1％     72.2％
   7-2b     苯酚0.15％+间甲酚0.1％     7.77     7.23     6.34     6.71     6.46     5.59     6.27
    100.0％     93.1％     81.6％     86.4％     83.1％     71.9％     80.7％
   7-2c     苯酚0.15％+间甲酚0.1％     6.39     5.40     5.94     5.20     5.22     4.75     4.02
    100.0％     84.5％     93.0％     81.4％     81.7％     74.3％     62.9％
●在表8-10中，上部的数值为α-干扰素的绝对生物活性，下部的数值为相对于时间为0时α-干扰素生物活性，α-干扰素的相对生物活性(％)。表中每一数值的单位为106IU/ml。
(6-2)α-干扰素的纯度
表11：采用RP-HPLC测定的水性溶液制剂在4℃贮存时的纯度
    待试水性制剂     防腐剂(w/v％)                              贮存期
    0     4周     8周     12周
    7-1a   苯酚0.3％   100.0％     98.3％     96.9％     99.6％
    7-1b   苯酚0.3％   100.0％     98.3％     95.9％     98.5％
    7-1c   苯酚0.3％   100.0％     98.3％     98.3％     97.7％
7-2a   苯酚0.15％+间甲酚0.1％ 100.0％ 100.0％ 97.7％ 98.1％
7-2b   苯酚0.15％+间甲酚0.1％ 99.0％ 100.0％ 98.2％ 98.7％
7-2c   苯酚0.15％+间甲酚0.1％ 100.0％ 100.0％ 98.6％ 98.0％
表12：采用RP-HPLC测定的水性溶液制剂在25℃贮存时的纯度
   待试水性制剂     防腐剂(w/v％)                           贮存期
    0     2周     4周     8周     12周
   7-1a   苯酚0.3％   100.0％   99.1％   99.0％   94.6％   94.8％
   7-1b   苯酚0.3％   100.0％   97.6％   97.9％   94.8％   95.3％
   7-1c   苯酚0.3％   100.0％   97.8％   97.8％   95.3％   93.4％
   7-2a   苯酚0.15％+间甲酚0.1％   100.0％   99.2％   96.9％   96.1％   94.8％
   7-2b   苯酚0.15％+间甲酚0.1％   99.0％   99.2％   97.2％   96.5％   93.9％
   7-2c   苯酚0.15％+间甲酚0.1％   100.0％   98.0％   97.8％   97.2％   94.9％
表13：采用RP-HPLC测定的水性溶液制剂在40℃贮存时的纯度
  待试水性制剂     防腐剂(w/v％)                                       贮存期
    0   1周   2周   3周   4周   8周   12周
  7-1a   苯酚0.3％ 100.0％ 100.0％ 98.4％ 94.4％ 95.8％ 89.7％  86.3％
  7-1b   苯酚0.3％ 100.0％ 100.0％ 98.1％ 94.9％ 94.3％ 89.4％  86.4％
  7-1c   苯酚0.3％ 100.0％ 97.6％ 96.0％ 94.7％ 95.0％ 84.2％  78.6％
  7-2a   苯酚0.15％+间甲酚0.1％ 100.0％ 100.0％ 98.3％ 97.3％ 96.4％ 88.5％  82.9％
  7-2b   苯酚0.15％+间甲酚0.1％ 99.0％ 99.4％ 98.2％ 96.3％ 95.7％ 88.4％  83.8％
  7-2c   苯酚0.15％+间甲酚0.1％ 100.0％ 98.7％ 100.0％ 96.8％ 95.4％ 85.9％  78.9％
图4a、4b和4c为与时间为0时的α-干扰素生物活性相比，相对生物活性变化曲线图。如表8-13和图4a-4f所示，在整个试验过程中，含有0.15％苯酚和0.1％间甲酚混合物的水性溶液制剂的活性及纯度显示与仅含有0.3％苯酚的制剂相似的趋势。同时，两种制剂均满足欧洲药典有关抗菌效力试验规定的必要条件。然而，含有0.1 5％苯酚和0.1％间甲酚混合物水性溶液制剂比仅含有0.3％苯酚的水性溶液制剂对人体更安全，因为前者含有更少量的防腐剂。

Claims (9)

1.一种α-干扰素水性溶液制剂，其中包含α-干扰素、稳定剂、渗透压调节剂、选自苯酚、间甲酚或其混合物的抗菌防腐剂和缓冲体系。
2.根据权利要求1的α-干扰素水性溶液制剂，其中所加α-干扰素的量为1×106 IU/ml-1×108IU/ml。
3.根据权利要求1的α-干扰素水性溶液制剂，其中稳定剂为聚山梨酯80。
4.根据权利要求3的α-干扰素水性溶液制剂，其中聚山梨酯80的浓度为0.01-0.05w/v％。
5.根据权利要求1的α-干扰素水性溶液制剂，其中渗透压调节剂为氯化钠。
6.根据权利要求1的α-干扰素水性溶液制剂，其中防腐剂选自0.1-0.3w/v％的苯酚、0.1-0.2w/v％的间甲酚或者其混合物。
7.根据权利要求1的α-干扰素水性溶液制剂，其中缓冲体系是由醋酸铵和醋酸组成的缓冲体系；或者是由磷酸氢二钠(Na2HPO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)组成的缓冲体系。
8.根据权利要求7的α-干扰素水性溶液制剂，其中水性溶液制剂中缓冲体系的浓度为5-20mM。
9.根据权利要求1的α-干扰素水性溶液制剂，其中制剂的pH为4.5-6.0。
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