CN1391463A - 鼻内流感病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用非活体流感病毒抗原制品、尤其是片段流感病毒制品生产用于单剂鼻内抗流感接种的疫苗制剂，其中所述单剂接种符合国际流感疫苗管理要求。本发明进一步提供生产所述疫苗的方法以及包括鼻内给予装置和所述单剂疫苗的药盒。

Description

鼻内流感病毒疫苗
本发明涉及新型流感病毒制剂、其制备方法及其在预防或治疗中的用途。具体而言，本发明涉及粘膜给予的疫苗，更具体地说是涉及鼻给予的疫苗。更具体地说，本发明涉及使用可以单剂鼻内给予的流感疫苗获得满足管理要求的合适免疫应答。
流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人类，也可感染家畜。流感的经济影响是显著的。
流感病毒是RNA包膜病毒，病毒颗粒的直径大小约为125nm。流感病毒的基本组成为：内部为与核蛋白结合的核糖核酸(RNA)核衣壳或核心，外部包绕着脂质双层结构和外部糖蛋白的病毒包膜。病毒包膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要是宿主来源的脂类物质。表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)以10-12nm长的刺突显露在病毒颗粒表面上。就是用这些表面蛋白、尤其是血细胞凝集素决定流感亚型的抗原特异性。
典型的流感流行使肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，其证据是住院率或死亡率增加。老年人或潜在慢性病的人最有可能发生这样的并发症，但幼小婴儿也可能罹患严重疾病。因此，这些人群尤其需要接受保护。
现时可用的流感疫苗或者是灭活流感疫苗，或者是减毒流感活疫苗。灭活流感疫苗由三种类型的抗原制品组成：灭活完整病毒、其中纯化的病毒颗粒用去污剂或其它试剂破坏以溶解脂质包膜的亚病毒体(所谓的“片段”疫苗)或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)。这些灭活疫苗肌内(i.m.)给予。
所有种类的流感疫苗通常都是三价疫苗。它们含有的抗原一般得自两种甲(A)型流感病毒株和一种乙(B)型流感病毒株。据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Wood等：用于测定流感血细胞凝集素抗原的改良单辐射免疫扩散技术：适于测定灭活完整病毒疫苗和亚单位疫苗效价，J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等：用于流感病毒血细胞凝集素抗原测定的单辐射扩散技术和免疫电泳技术的国际协作研究，J.Biol.Stand.9(1981)317-330)检测，标准0.5ml注射剂量在大多数情况下含有15μg每种毒株的血细胞凝集素抗原组分。
每个季节加入到流感疫苗中的流感病毒株由WHO和美国卫生管理局以及疫苗生产商共同研究确定。
目前在控制与每年流感流行相关性发病率和死亡率方面的努力是基于使用肌内给予的灭活流感疫苗。这些疫苗在预防呼吸疾病和流感并发症方面的效力由健康成年人的75％至老年人的低于50％不等。
流感病毒同许多病原体一样，侵染粘膜表面，首先是上呼吸道粘膜表面。粘膜免疫构成了宿主的第一道防线，是鼻道和下呼吸道免疫反应的主要组成部分。尽管目前使用的注射流感疫苗在大部分健康个体中刺激血清HA-特异性IgG，但仅有小部分接种者HA-特异性IgA抗体出现显著上升。免疫原性和临床效力更佳的改进流感疫苗必须以局部抗体反应和***抗体反应这二者为目标。
人类实验性鼻内接触灭活流感疫苗可追溯至20世纪40年代(参见综述：Eyles等，2000 BioDrugs 13(1)：35-59)。尽管在20世纪60年代和70年代重新燃起了对使用IN免疫的灭活病毒的兴趣，但在鼻内领域注意力大部分都集中在活体减毒方式。
鼻内给予的减毒流感活疫苗(例如冷适应疫苗)改善了粘膜免疫，特别是对儿童的效果很有前景。然而，迄今为止该方案也不能获得全世界范围的认同。
因此，大部分市售流感疫苗或者是注射片段疫苗，或者是注射亚单位疫苗。一般通过用有机溶剂或去污剂破坏病毒颗粒，并分离或纯化病毒蛋白至不同的程度，制备这些疫苗。通过用增溶浓度的有机溶剂或去污剂片段化感染性或灭活的完整流感病毒，随后去除增溶剂以及某些或大部分病毒脂质物质，制备片段疫苗。片段疫苗通常含有污染性基质蛋白和核蛋白以及膜性包膜蛋白，有时含有脂质。片段疫苗通常含有大部分或全部病毒结构性蛋白，尽管不一定与它们在完整病毒中的比例相同。另一方面，亚单位疫苗基本由高度纯化的病毒表面蛋白血细胞凝集素和神经氨酸酶组成，它们是在疫苗接种时负责激发需要的病毒中和抗体的表面蛋白。
已经将更新、更高纯度、更好表征的片段流感疫苗与佐剂组合，尝试改进其在成年人和老年人中的免疫原性。尽管在小鼠中的免疫应答明显升高，但还未证明使用新一代佐剂的众多方案有可能在人类获得批准。
国际上提出了检测流感疫苗效力的标准。在下表中给出了有效抗流感疫苗的欧盟官方标准。理论上，为了满足欧盟要求，对流感疫苗中包括的所有流感病毒株来说，流感疫苗仅需满足表中的一项标准。然而实际上，所有病毒株必须满足所述标准中的至少两项或全部三项标准，特别是对于新型疫苗(例如新型鼻内疫苗)而言。在某些情况下，两项标准可能就足够了。例如，可以接受所有病毒株满足三项标准中的两项，而部分但不是全部病毒株满足第三项标准(例如三种病毒株中的两种)。对成年人群体(18-60岁)和老年人群体(大于60岁)的要求是不同的。
  18-60岁   ＞60岁
血清阳转率*     ＞40％   ＞30％
转化系数**     ＞2.5   ＞2.0
保护率***     ＞70％   ＞60％
*血清阳转率定义为每种疫苗株接种后血清血细胞凝集素抑制(HI)滴度增加至少3倍的接种者的百分率。**转化系数定义为每种疫苗株接种后血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数。***保护率定义为(每种疫苗株)接种后血清HI滴度等于或高于1∶40的接
种者的百分率，通常接受所列出的保护率。
对于市售用途的鼻内流感疫苗而言，不仅仅需要满足这些标准，而且实际上还需要和目前使用的注射疫苗至少等效。此外，需要的抗原量和给予次数在商业上必须可行。
在过去的几十年中研究的基于灭活病毒的鼻内流感疫苗未能满足这些标准。
Fulk等1969(J.Immunol.102，1102-5)在老年患者中比较了鼻内(滴鼻加喷雾)给予灭活流感病毒和皮下(s.c.)给予。尽管在接受s.c.给予的患者中有56％显示抗体滴度(HI)增加3倍，但在接受鼻内给予的患者中仅有25％观察到相应的增加。两次鼻内给予产生75％的血清阳转。
Gluck等1999(J.Virol.73，7780-6)证实，诱导与肌内给予相当的血清阳转(体液抗体应答增加3倍)需要以含有效粘膜佐剂(大肠杆菌热不稳定毒素，HLT)的喷雾给予两次连续鼻内接种。存在佐剂时鼻内单次给予15μg HA(每种病毒株)，乃至不存在佐剂时给予两次，都不能达到相同的血清阳转。流感抗原为病毒体形式，病毒体为由使用磷脂酰胆碱产生的脂质双层和提取自卵源流感病毒的病毒表面蛋白重新构成。
其他研究者还运用了使用两次或多次鼻内给予的构思，以便尝试获得较高水平的血清阳转。Petrescu等(1979.Rev.Rom.Med-Virol.30，109-115)在两周的时间内两次鼻内给予灭活病毒(1000国际单位/接种剂量)。Oh等(1992 Vaccine 10，506-11)以一周的间隔给予4次鼻喷雾形式的片段疫苗，每次给予15μg HA(每种病毒株)(每次每个鼻孔0.25ml)。Kuno-Sakai等(1994 Vaccine 12，1303-1310)间隔一周给予两次三倍于市售片段流感疫苗强度的气溶胶灭活疫苗。
最近Muszkat等(2000 Vaccine 18，1696-9)给予老年患者两次灭活完整流感病毒(每剂20μg A型病毒株和B型病毒株以及40μg另一种A型病毒株)鼻内免疫，观察到鼻内给予的***血清阳转低于肌内注射标准剂量市售灭活片段流感疫苗的***血清阳转。
因此，1969至2000年间的文献表明，尽管已广泛研究了灭活流感疫苗鼻内接种，但还没有研究小组能够通过鼻内给予单剂疫苗获得与肌内或皮下注射相等的***血清阳转。而且，为了获得多次给予疫苗的超时效力，使用的抗原剂量已经显著高于每个接种者15μgHA(每种病毒株)的标准常规剂量。实际上，数据显示需要多次给予，最好存在强免疫刺激剂，如大肠杆菌HLT。
Kimura等(1988.Acta Paediatr Jpn.30，601-3)证实，通过喷雾器给予两剂灭活流感病毒和单剂皮下给予等效，但通过鼻内喷雾给予两剂效力低得多。雾化产生非常细小的喷雾，直达肺部。因此在公开的临床实验中还显示，鼻喷雾可能无效，而雾化可能较好。
该文献进一步指出，鼻内疫苗需要有效佐剂，更具体地说是需要有效的免疫刺激剂。
例如，Gluck等(以上引用)证实，在没有免疫刺激剂时鼻内给予流感疫苗效力远低于有免疫刺激剂时。作者表明，即使两次鼻内给予没有免疫刺激剂的疫苗，也不能诱导出与皮下给予获得的血清阳转相同的血清阳转。
Hashigucci等1996(Vaccine 14，113-9)证实，间隔四周鼻内给予两次以大肠杆菌热不稳定毒素及其B型-亚单位(LTB)为佐剂的片段流感疫苗，获得50％的血清阳转率。在没有佐剂时仅获得31％的血清阳转。通常皮下给予产生75-90％的血清阳转。
因此，该文献明确指出，为了使获得的***血清阳转与常规流感疫苗相等，需要给予一次以上，另外所述疫苗应当用毒素作为佐剂。
现在，已经发现非活体流感病毒抗原可用于商业上可行的鼻内流感疫苗。具体地说，单次给予鼻内流感病毒疫苗制品刺激保护水平的***免疫。而且，这满足有效流感疫苗的国际标准。更具体地说，鼻内给予非活体流感病毒抗原制品产生的***血清阳转(抗HA滴度增加3倍)可以等同于皮下给予相同疫苗获得的***血清阳转。令人惊讶的是，提供给每个接种者的流感抗原剂量可显著低于先有技术中指出的剂量。
以前还没有报道过单次鼻内给予标准剂量灭活流感病毒产生的血清阳转与注射获得的血清阳转相同。
本发明首次提供鼻内传递的单次给予流感疫苗。所述疫苗满足上文陈述的流感疫苗的部分或全部欧盟标准，使得该疫苗可在欧洲批准为商业性单剂疫苗。所述疫苗中提供的所述或全部流感病毒株优选满足三项欧盟标准中的至少两项。更优选所有的病毒株都满足至少两项标准，而所有的病毒株或至少除去其中一种的全部病毒株满足第三项标准。最优选所有的病毒株满足全部三项标准。
因此，在一个方面，本发明提供非活体流感病毒抗原制品在用于单剂鼻内抗流感接种的疫苗制剂生产中的用途。该疫苗可以单剂形式或双剂形式给予(通常为每个鼻孔一个亚剂量)。
另一方面，本发明提供低剂量非活体流感病毒抗原物质在用于抗流感免疫的粘膜疫苗生产中的用途。
非活体流感病毒抗原制品优选包含至少一种表面活性剂，其具体可为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂优选为选自以下的至少一种表面活性剂以及它们之中两种或多种的组合：辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如市售的TritonTM系列)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(TweenTM系列)和通式(I)的聚氧乙烯醚或酯：
(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n为1-50，A为连接键或-C(O)-，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
属于式(I)的优选表面活性剂分子其中的n为4-24，更优选为6-12，而最优选为9；其中的R部分为C1-50烷基，优选为C4-C20烷基，而最优选为C12烷基。
辛基苯氧基聚氧乙醇和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯描述于“表面活性剂***”编辑：Attwood和Florence(1983，Chapman和Hall)。辛基苯氧基聚氧乙醇(辛苯聚糖(octoxynol))，包括叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100TM)，还描述于Merck Index Entry 6858(1162页，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN0911910-12-3)。聚氧乙烯山梨糖醇酐酯，包括聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80TM)，描述于Merck Index Entry 7742(1308页，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN0911910-12-3)。这二者都可以使用其中描述的方法制备，或者由商业渠道(如Sigma Inc.)购买。
特别优选的非离子表面活性剂包括Triton X-45、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-165、Triton X-205、Triton X-305、Triton N-57、Triton N-101、TritonN-128、Breij 35、聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)和聚氧乙烯-9-硬脂酰醚(steareth 9)。尤其优选Triton X-100和laureth 9。还特别优选聚氧乙烯山梨糖醇酐酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80TM)。
通式(I)的其它合适的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
在CAS注册中公开了聚氧乙烯月桂基醚的替代术语或名称。聚氧乙烯-9-月桂基醚的CAS注册号为9002-92-0。聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂基醚描述于Merck Index(第12版：索引项7717，Merck &Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN 0911910-12-3)。laureth9通过将环氧乙烷和十二烷醇反应形成，平均具有9个环氧乙烷单元。
表面活性剂中聚氧乙烯部分的长度相对于烷基链长度的比率(即n∶烷基链长度的比率)影响该类表面活性剂在水性介质中的溶解度。因此，本发明的表面活性剂可以为溶液形式，或者可以形成诸如胶束或小泡的微粒结构。作为溶液，本发明的表面活性剂安全、易于除菌、给予简单，并可以不存在与形成均一颗粒结构相关的GMP和QC争议的简单方式生产。某些聚氧乙烯醚，如laureth 9，能够形成无泡溶液。然而，聚氧乙烯-8棕榈酰醚(C18E8)能够形成小泡。因此，本发明的制剂可使用聚氧乙烯-8棕榈酰醚小泡与至少一种其它非离子表面活性剂。
用于本发明的制剂的聚氧乙烯醚最好具有溶血活性。可参照以下的测定体外检测聚氧乙烯醚的溶血活性，该活性表示为不能引起红细胞裂解的表面活性剂最高浓度：
1.用磷酸缓冲盐水(PBS)以台式离心机清洗豚鼠新鲜血液3次。重悬浮至原始体积后，再用PBS稀释血液10倍。
2.将50μl的该血液悬浮液加入到含稀释2倍的去污剂的800μlPBS中。
3. 8小时后，目测或通过检测上清液的光密度评价溶血。存在于570 nm吸收光的红色上清液表明存在溶血作用。
4.结果表示为不再发生溶血的第一个去污剂稀释浓度。
在此生物测定的固有实验变异范围内，本发明的聚氧乙烯醚或通式(I)的表面活性剂具有的溶血活性优选约为0.5-0.0001％，更优选为0.05-0.0001％，甚至更优选为0.005-0.0001％，而最优选为0.003-0.0004％。理想的是，所述聚氧乙烯醚或酯应当具有类似于(即在10倍差异范围内)聚氧乙烯-9月桂基醚或聚氧乙烯-8硬脂酰醚的溶血活性。
在本文描述的疫苗制剂中可存在所描述的不同种类表面活性剂中的两种或多种非离子表面活性剂。具体地说，优选聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(如聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80TM))和辛苯聚糖(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton)X-100TM)的组合物。另一个特别优选的非离子表面活性剂组合包括laureth 9和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯或辛苯聚糖或者这二者。
在最终疫苗制剂中存在的所述或每种非离子表面活性剂的浓度优选为0.001-20％，更优选为0.01-10％，而最优选最高约为2％(w/v)。在存在一种或两种表面活性剂的情况下，它们存在于最终制剂中的浓度一般最高约每种2％，通常最高约每种0.6％。可存在一种或多种其它的表面活性剂，浓度一般最高约每种1％，通常痕量最高约每种0.2％或0.1％。本发明的疫苗制剂中可存在任何表面活性剂混合物。
在最终疫苗组合物中的非离子表面活性剂(如以上论述的表面活性剂)的优选浓度如下：聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(如Tween 80TM)：0.01-1％，最优选约0.1％(w/v)；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如TritonX-100TM或其它Triton系列的去污剂)：0.001-0.1％，最优选0.005-0.02％(w/v)；通式(I)的聚氧乙烯醚(如laureth 9)：0.1-20％，优选0.1-10％，最优选0.1-1％或约0.5％(w/v)。
对于某些疫苗制剂而言，制剂中可包括其它疫苗组分。因此，本发明的制剂也可以含有胆汁酸或其衍生物，尤其是其盐形式。这些衍生物包括胆酸衍生物及其盐，特别是胆酸或胆酸衍生物的钠盐。胆汁酸及其衍生物的实例包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、猪脱氧胆酸和衍生物，如上述胆汁酸的甘氨-、牛磺-、氨丙基-1-丙磺基-、氨丙基-2-羟基-1-丙磺基衍生物或N，N-双(3D葡糖酸氨丙基)脱氧胆酰胺。特别优选的实例是可存在于最终疫苗剂量中的脱氧胆酸钠(NaDOC)。
本发明的制剂优选为水溶液形式或无泡形式的悬浮液。这样的制剂易于重复生产，还易于除菌(最后通过450或220nm孔径膜过滤除菌)，并易于以喷雾形式给予鼻粘膜，而不降解所述佐剂的复合物理结构。
用于本发明的非活体流感抗原制品可选自片段病毒抗原制品、亚单位疫苗(由完整病毒重组表达或制备)、可用例如甲醛、β-丙酸内酯化学灭活或其它方式灭活(例如紫外灭活或热灭活)的灭活完整病毒。所述抗原制品优选为片段病毒制品或(特别是利用裂解方法，然后纯化表面抗原)由完整病毒制备的亚单位抗原。
在一个优选的实施方案中，所述疫苗制剂含有与一种或多种非离子表面活性剂组合的片段流感病毒制品。所述一种或多种非离子表面活性剂可以是片段流感抗原制品产生过程中残余物和/或之后加入到所述抗原制品中的表面活性剂。据信，存在非离子表面活性剂可稳定片段流感抗原物质，但显然本发明不依赖于必须是这种情况。
另一方面，本发明提供非活体流感病毒抗原制品(优选片段流感病毒制品)在未添加免疫刺激剂的单剂鼻内流感疫苗生产中的用途。在本发明的范围内，免疫刺激剂为能够直接刺激免疫***细胞的物质，与仅能够例如通过起抗原(当与载体结合时其自身具有刺激作用)载体作用间接刺激免疫***细胞的物质相反。
在本发明的一个替代方面，所述制剂还包含佐剂或免疫刺激剂，包括霍乱毒素及其B型亚单位、任何来源的解毒脂质A、脂质A的无毒衍生物，包括US 4,912,094和GB 2,220,211描述的那些脂质A无毒衍生物(包括单磷酰脂质A和双磷酰脂质A的无毒衍生物，如3-脱氧-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)和3-脱氧-酰化双磷酰脂质A)、皂苷，如Quil A(得自南美Quillaja Saponaria Molina树的树皮)，以及它们的部分，包括QS21和QS17(US5,057,540；Kensil，C.R.，Crit RevTher Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；EP 0 362 279 B1；Kensil等(1991，J.Immunology 146卷，431-437；WO 99/10008)和包含未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸佐剂***(如WO 96/02555所述)。
在本发明此方面的一个优选的实施方案中，所述制剂包含选自3D-MPL和双磷酰脂质A无毒衍生物的无毒脂质A衍生物，尤其是3D-MPL。所述制剂更优选包含3D-MPL以及如上定义的通式(I)的聚氧乙烯醚或酯(尤其是laureth 9)。
因此，本发明还提供包含3D-MPL和laureth 9组合物以及流感病毒抗原制品(特别是片段抗原制品)的疫苗。该疫苗尽管不是唯一的、但特别适于粘膜给予，包括本文描述的鼻内给予。
按照本发明此方面优选存在于所述制剂中的其它组分还包括非离子去污剂，诸如本文所述的辛苯聚糖和聚氧乙烯醚，尤其是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80)；以及本文所述的胆汁盐或胆酸衍生物，尤其是脱氧胆酸钠或鹅脱氧胆酸钠。因此，特别优选的制剂包含可与流感病毒抗原制品组合的3D-MPL、laureth 9、Triton X-100、Tween 80和脱氧胆酸钠，以提供适于粘膜或鼻内应用的疫苗。
本发明还提供生产含混合的3D-MPL、laureth 9和流感病毒抗原制品的疫苗的方法，其中所述流感病毒抗原制品优选为片段抗原制品，例如用于常规肌内流感疫苗的片段抗原制品。
进一方面，本发明提供含鼻内喷雾装置和单剂非活体流感病毒疫苗的药盒。所述装置优选为用于两个亚剂量疫苗的双剂量传递装置。
本发明的血细胞凝集素的低剂量最好为与目前市售流感疫苗的血细胞凝集素剂量相当。因此，优选的低剂量最好不超过约30μg血细胞凝集素(每种流感病毒株)，更优选不超过约15μg。这通常等于约0.1-2μg/kg体重。本发明的低剂量疫苗优选但不是必须作为单剂疫苗(例如以两个亚剂量，每个鼻孔一个亚剂量)给予。
最好以小于常规注射片段流感疫苗(通常为0.5或1ml/剂)的体积提供本发明的疫苗剂量。本发明的低体积剂量优选低于500μl/剂，更优选低于300μl/剂，而最优选不超过约200μl/剂或更低的体积。当给予两个亚剂量时，每个亚剂量的优选体积为以上提及的总剂量体积的一半。
因此，按照本发明的优选疫苗剂量为在低体积中低抗原剂量的剂量，例如在约200μl体积中约15μg或约7.5μg HA(每种病毒株)。
本发明还提供预防患者流感感染或疾病的方法，所述方法包括经粘膜表面给予所述患者单剂非活流感疫苗。
本发明进一步提供预防患者流感感染或疾病的方法，所述方法包括经粘膜表面给予所述患者低剂量的非活流感疫苗。
所述疫苗优选鼻内给予。
所述疫苗最优选局部给予至鼻咽部位，最好不吸入肺中。理想的是使用鼻内传递装置，该装置将疫苗制剂传递至鼻咽部位，没有或基本没有进入肺部。
鼻内给予本发明疫苗的优选装置为喷雾装置。合适的市售鼻喷雾装置包括AccusprayTM(Becton Dickinson)。雾化器产生非常细小雾滴，容易吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。
用于鼻内用途的优选喷雾装置的性能与使用者施加的压力无关。这些装置称为压力域装置。只有施加临界压力时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的喷雾。适用于本发明的压力域装置在本领域是已知的，描述于例如WO 91/13281和EP 311863 B和EP 516 636，这些文献通过引用结合到本文中。这样的装置可从Pfeiffer GmbH购买，也描述于Bommer，R.PharmaceuticalTechnology Europe，1999年9月。
优选的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体检测)范围为1-200μm，优选10-120μm。小于10μm存在吸入风险，因此理想的是10μm以下的液滴不超过约5％。120μm以上的液滴扩散不如较小的液滴好，所以理想的是120μm以上的液滴不超过约5％。
双剂量传递是用于本发明疫苗的鼻内传递***的更优选特征。双剂量装置包含单剂疫苗的两个亚剂量，每个鼻孔给予一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于一个容器中，装置的构造允许每次有效传递单个亚剂量。或者，可使用单剂量装置给予本发明疫苗。
再一个方面，本发明提供含有本文所述的鼻内给予装置的药盒，所述装置中装有本发明的疫苗制剂。
本发明不一定限于喷雾传递液体制剂。本发明的疫苗可以其它形式(例如粉末)给予。
本发明的流感疫苗优选为包含两种或多种流感病毒株的多价流感疫苗。最优选为包含三种病毒株的三价疫苗。常规流感疫苗包含三种流感病毒株，两种A型病毒株和一种B型病毒株。然而，本发明不排除可能在例如大流行情况下有用的单价疫苗。单价大流行流感疫苗最可能含有单个A型病毒株的流感抗原。
可由常规胚胎化卵法产生非活体流感病毒制品，或者可由任何使用组织培养来培养病毒的新生代方法产生。适于培养病毒的细胞支持物包括例如犬肾细胞(如MDCK或MDCK克隆细胞、MDCK样细胞)、猴肾细胞(诸如AGMK细胞，包括非洲绿猴肾细胞株系细胞)，或任何其它适于产生流感疫苗病毒的哺乳动物细胞类型。合适的细胞培养支持物还包括人细胞，例如MRC-5细胞。合适的细胞培养支持物不限于细胞系；例如还包括原代细胞，如鸡胚成纤维细胞。
可通过众多商业上适用的方法中的任一种产生流感病毒抗原制品，所述方法例如专利号DD 300 833和DD 211 444(通过引用结合到本文中)中描述的片段流感法。使用溶剂/去污剂处理产生传统的片段流感抗原制品，例如磷酸三正丁酯，或者二***组合TweenTM(称作“Tween-醚”裂解)，该方法仍在某些生产厂家中使用。目前使用的其它裂解剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆汁盐，例如专利号DD 155875(通过引用结合到本文中)描述的脱氧胆酸钠。可用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；其它离子去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；或非离子去污剂，如上述非离子去污剂，包括Triton X-100(例如在Lina等，2000，Biologicals 28，95-103描述的工艺中)和Triton N-101；或者任何两种或多种去污剂的组合物。
其它可用于产生片段流感病毒制品的合适裂解剂包括：
1.胆汁酸及其衍生物：包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、猪脱氧胆酸和衍生物，如上述胆汁酸的甘氨-、牛磺-、氨丙基-1-丙磺基-、氨丙基-2-羟基-1-丙磺基-衍生物或N，N-双(3D葡糖酸氨丙基)脱氧胆酰胺。具体的实例是可以痕量存在于最终疫苗剂量中的脱氧胆酸钠(NaDOC)。
2.烷基糖苷或烷基硫糖苷，其中烷基链为C6-C18，通常为C8-C14，糖部分为任何戊糖或己糖或其具有不同连接的组合，如1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。烷基链可为饱和、不饱和和/或支链。
3.以上2的衍生物，其中一个或多个(优选6个)羟基被修饰，例如酯、乙氧基化物、硫酸盐、醚、碳酸盐、磺基琥珀酸盐、羟乙基磺酸盐、醚羧酸盐、季铵化合物。
4.酰糖，其中酰基链为C6-C18，通常为C8-C12，糖部分为任何戊糖或己糖或其具有不同连接的组合，如1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。酰基链可为饱和或不饱和和/或支链、环链或非环链，具有或不具有一个或多个杂原子，例如N、S、P或O。
5.结构为R-N，N-(R1，R2)-3-氨基-1-丙磺酸盐的磺基甜菜碱，其中R为C6-C18的任意烷基链或芳烷基链，通常为C8-C16。烷基链R可为饱和、不饱和和/或支链。R1和R2优选为C1-C4的烷基链，通常为C1，或者R1、R2可与氮一起形成杂环。
6.结构为R-N，N-(R1，R2)-甘氨酸的甜菜碱，其中R为C6-C18的任意烷基链，通常为C8-C16。烷基链可为饱和、不饱和和/或支链。R1和R2优选为C1-C4的烷基链，通常为C1，或者R1、R2可与氮一起形成杂环。
7.结构为R-(N-R1)-葡糖酰胺的N，N-双烷基-葡糖酰胺，其中R为C6-C18的任意烷基链，通常为C8-C12。烷基链可为饱和、不饱和和/或支链或环链。R1和R2为C1-C6的烷基链，通常为C1。糖部分可修饰为戊糖或己糖。
8.结构为R，-N+(-R1，-R2，-R3)的季铵盐化合物，其中R为C6-C20的任意烷基链，通常为C20。烷基链可为饱和、不饱和和/或支链。R1、R2和R3优选为C1-C4的烷基链，通常为C1，或者R1、R2可与氮一起形成杂环。具体的实例为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
片段疫苗的制备方法包括许多不同的过滤和/或其它分离步骤，如各种组合的超离心、超滤、区带离心和层析(例如离子交换)步骤，以及任选灭活步骤，例如可在裂解前或后用甲醛或β-丙酸内酯或紫外线灭活。裂解过程可以分批、连续或半连续形式进行。
诸如脱氧胆酸钠的胆汁酸盐，优选以痕量存在于本发明的片段疫苗制剂中，存在的浓度优选不超过0.05％，或不超过约0.01％，更优选约为0.0045％(w/v)。
尽管可在制备片段抗原之后加入Tween 80和/或Triton X-100或者调节它们的浓度，但本发明的片段流感疫苗抗原制品优选包含生产过程中剩余的残量Tween 80和/或Triton X-100。Tween 80和TritonX-100最好都存在。这些非离子表面活性剂在疫苗剂量中的优选最终浓度范围为：
Tween 80：0.01-1％，更优选约0.1％(w/v)。
Triton X-100：0.001-0.1％(w/v)，更优选0.005-0.02％(w/v)。
已经发现，这两种表面活性剂以低浓度组合存在促进所述抗原在溶液中的稳定性。这种增强的稳定性可能使得所述抗原的鼻内免疫原性比以前的制剂更强。这种增强作用可能由普遍存在的小抗原凝集或抗原天然构型增强引起。应当认识到，本发明与这种理论上正确的解释无关。
还有证据显示，对于片段流感病毒制品，存在结合或包含病毒蛋白(特别是HA)的完整片段流感病毒可维持抗原提呈和有助于诱导强免疫应答。因此，片段流感病毒是精选用于本发明各个方面的抗原。
在一个具体实施方案中，优选的片段病毒制品还含有laureth 9，优选浓度范围为0.1-20％，更优选为0.1-10％，而最优选为0.1-1％(w/v)。
本发明的疫苗一般含有不超过25％(w/v)的去污剂或表面活性剂，优选少于15％，最优选不超过约2％。
另一方面，本发明提供生产鼻内应用的流感疫苗的方法，该方法包括：
(i)提供基本如常规注射(例如肌肉)流感疫苗一样产生的片段流感病毒制品，其含有至少一种非离子表面活性剂；
(ii)任选调节所述制品中血细胞凝集素的浓度和/或非离子表面活性剂的浓度；
(iii)用疫苗剂量的片段流感病毒制品装填鼻内传递装置，所述剂量的体积适于鼻内给予，可选为双剂量形式。
按照本发明此方面的方法中的进一步任选步骤包括加入吸附增强型表面活性剂，如laureth 9；和/或加入佐剂，如无毒脂质A衍生物，特别是3D-MPL。
生产常规注射灭活流感疫苗的方法是众所周知的，并已在文献中描述。可对这些方法进行改良，例如通过在疫苗最后除菌过滤之前加入浓缩步骤，以产生用于本发明的单剂粘膜疫苗，因为鼻内疫苗使用的疫苗制剂体积最好比注射疫苗小。或者，可通过加入将其它组分(例如非离子表面活性剂)浓度调节至对本发明的鼻内疫苗合适的百分比(w/v)的步骤，改良所述方法。然而，疫苗的活性成分，即流感抗原，可与常规肌内疫苗和本发明的单剂鼻内疫苗基本相同。
本发明的疫苗制剂当以单剂疫苗给予时，优选不包括所有病毒株未满足欧盟标准中至少两项的制剂。
现在以下面的非限制性实施例进一步描述本发明。
                        实施例实施例1-制备片段流感疫苗
按照以下步骤制备单价片段疫苗。制备病毒接种物
在接种胚胎化卵当天，通过混合工作批种子(working seed lot)与含0.5mg/ml硫酸庆大霉素和25μg/ml氢化可的松(取决于病毒株)的磷酸缓冲盐水，制备新鲜接种物。将病毒接种物保持在2-8℃。接种胚胎化卵
使用9-11天龄的胚胎化卵进行病毒复制。对蛋壳消毒。用0.2ml所述病毒接种物接种鸡胚。于合适的温度(取决于病毒株)培养接种鸡胚48-96小时。在培养周期结束时，通过冷冻处死鸡胚，并将鸡胚储存于2-8℃12-60小时。收获
收获冷冻胚胎化卵中的尿囊液。通常，每个鸡胚收集8-10ml粗品尿囊液。可选地向粗品单价病毒原液中加入0.100mg/ml硫柳汞。由尿囊液浓缩和纯化完整病毒1.澄清
通过中速离心(范围：4000-14000g)澄清收获的尿囊液。2.吸附步骤
为了获得澄清的病毒合并液的CaHPO4胶体，加入0.5mol/L的Na2HPO4和0.5mol/L的CaCl2溶液，以使CaHPO4的终浓度达到1.5g-3.5g CaHPO4/L(取决于病毒株)。
沉降至少8小时后，去除上清液，根据使用的CaHPO4量通过加入0.26mol/L EDTA-Na2溶液，重溶解含流感病毒的沉淀。3.过滤
用6μm滤膜过滤重悬浮的沉淀。4.蔗糖梯度离心
以含100μg/ml硫柳汞的线性蔗糖梯度(0.55％(w/v))通过等密度离心浓缩流感病毒。流速为8-15L/小时。
在离心结束时，转子内容物回收为四种不同的组分(用折光仪检测蔗糖)：
-  组分1    55-52％蔗糖
-  组分2    约52-38％蔗糖
-  组分3    38-20％蔗糖*
-  组分4    20-0％蔗糖
*取决于病毒株：组分3可降低至15％蔗糖。
为进一步制备疫苗，只使用组分2和3。
用磷酸盐缓冲液经透析清洗组分3，以便将蔗糖含量降低至约6％以下。沉淀存在于该稀释组分中的流感病毒，以去除可溶性杂质。
重悬浮沉淀，并彻底混合，以获得均一悬浮液。合并组分2和组分3的重悬浮沉淀，加入磷酸盐缓冲液，得到约40L的体积。该产物为单价完整病毒浓缩液。5.用脱氧胆酸钠进行蔗糖梯度离心
对单价完整流感病毒浓缩液进行ENI-Mark II超离心。K3转子含有线性蔗糖梯度(0.55％(w/v))，在该梯度中另外覆盖脱氧胆酸钠梯度。在裂解期间存在的Tween 80最高为0.1％(w/v)。最大脱氧胆酸钠浓度为0.7-1.5％(w/v)，并取决于病毒株。流速为8-15L/小时。
在离心结束时，以三种不同组分(用折光仪险测蔗糖)回收转子内容物。组分2用于进一步加工。组分的蔗糖含量根据病毒株有限度(47-18％)变化，在评价后固定：6.除菌过滤
最后以0.2μm滤膜过滤片段病毒组分。使用含0.025％(w/v)Tween 80的磷酸盐缓冲液进行稀释。过滤的组分2的终体积为原始组分体积的5倍。7.灭活
于22±2℃温育过滤的单价物质至多84小时(取决于病毒株，该温育过程可缩短)。然后加入含0.025％Tween 80的磷酸盐缓冲液，以便将总蛋白含量降低至最高250μg/ml。加入甲醛至终浓度为50μg/ml，于20±2℃灭活至少72小时。8.超滤
用装备20kDa截流分子量(MWCO)醋酸纤维素膜的超滤装置将灭活的片段病毒物质浓缩至少2倍。随后用含0.025％(w/v)Tween 80的磷酸盐缓冲液清洗所述物质，此后用含0.01％(w/v)Tween的磷酸缓冲盐溶液清洗。9.最终除菌过滤
将超滤后的物质在具有0.2μm膜的过滤膜终端上过滤。经SRD(WHO推荐方法)检测的血细胞凝集素终浓度应当超过450μg/ml。10.储存
将单价终原液储存于2-8℃，最多18个月。纯度
通过考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶的O.D.扫描测定纯度。人工测定峰值。样品结果示于表1：
表1
                            病毒蛋白(HA、NP、M)％  其它病毒和宿主细胞来源蛋白％
    H3N2   HA二聚体     HA1+2     NP     M
    A/Syd/5/97A/Nan933/95     10.348.17   22.3415.8   25.1640.09   37.3330.62     4.835.32
    B
    B/Har/7/94B/Yam/166/98     5.7120.68   24.0727.62   15.6421.48   5046.02     4.584.2
    H1N1
    A/Tex/36/91A/Bei/262/95  33.4232.73  24.4635.72  34.3327.06     7.794.49
    H2N2
   A/sing/l/57     2.8     39.7   21.78   32.12     3.6
1＝100％减去所有未鉴定的峰值实施例2-由疫苗原液制备疫苗剂量
通过由单价原液配制三价疫苗，制备最终的疫苗，去污剂浓度根据需要调节。
混合注射用水、浓缩10倍的PBS pH7.4、Tween 80和Triton X-100，以获得需要的最终浓度(PBS浓缩1倍，Tween 80 0.15％和TritonX-100 0.02％)。加入以下的三种灭活片段病毒体，每次加入之间搅拌10分钟：
30μg HA A/Beijing/262/95(H1N1)
30μg HA A/Sydney/5/97(H3N2)
30μg HA B/Harbin/7/94
搅拌15分钟后调节pH至7.2+/-0.2。
剂量体积为200μl。
在用laureth 9配制的疫苗中，加入laureth 9，然后调节pH获得0.5％(w/v)的终浓度。实施例3-用于检测抗体应答的方法1.通过ELISA检测人鼻分泌物中的特异性抗流感IgA和总IgA人鼻分泌物的收集方法
将两条棉拭子涂抹志愿者的下鼻甲(每个鼻孔一个)。棉拭子在鼻中保留1分钟之后，放入2ml的0.9％NaCl、1％BSA和0.1％叠氮化钠(防腐缓冲液)中。所有的样品都在冰上保持2小时。然后挤压棉拭子回收抗体。离心(10分钟，2000g，4℃)后，收集所有的流体样品，等分并于-20℃冷冻，直至测试日。在400μl生理盐水中悬浮沉淀，显微镜观察血细胞污染。使用鼻棉拭子收集人鼻分泌物并进行处理，然后用两种不同的ELISA对总IgA和特异性抗流感IgA进行检测：检测总IgA的捕获ELISA
用固定在微量滴定板上的抗人IgA多克隆抗体亲和纯化Ig捕获总IgA，随后使用偶合过氧化物酶的不同多克隆抗人IgA亲和纯化Ig进行检测。
将纯化的人sIgA用作标准，以便可以定量分析收集的鼻分泌物中的sIgA。
3个纯化的人sIgA的参比在该测定中用作低、中和高参比。检测特异性抗流感IgA的直接ELISA
进行三个不同的ELISA，所述疫苗制剂中存在的每种流感病毒株都对应一个ELISA。
用包被在微量滴定板上的片段灭活流感抗原捕获特异性抗流感IgA，随后使用偶合过氧化物酶的不同多克隆抗人IgA亲和纯化Ig进行检测，该Ig与用于总IgA ELISA的Ig相同。试剂生物试剂
-  山羊抗人IgA亲和纯化Ig(Sigma I-0884)
-  纯化的人分泌性IgA(ICN-Cappel 55905)(总IgA定量分析标
   准)
-  人分泌性IgA(Colostrum)(Biogenesis 5111-5504)(总IgA参
   比，Bio)，稀释获得低、中和高参比
-  纯化的人IgA(Sigma I-1010)(总IgA参比，Sig)
-  特异性抗流感ELISA的阴性参比(合并针对3种病毒株的应
   答为不可检测水平的鼻分泌物；取舍值＝0.6 OD450nm)
-  特异性抗流感ELISA的阳性低参比(合并针对3种病毒株的
   应答为低检测水平的鼻分泌物)
-  特异性抗流感ELISA的阳性中参比(合并针对3种病毒株的
   应答为中等检测水平的鼻分泌物；取舍值＝0.6 OD)
-  山羊抗人IgA血清亲和纯化HRP缀合(ICN 674221)
-  得自片段失活鸡胚的抗原A/Beijing/262/95 H1N1
-  得自片段失活鸡胚的抗原A/Sydney/5/97 H3N2
-  得自片段失活鸡胚的抗原B/Harbin/7/94试剂配制
-  饱和缓冲液(PBS，Tween 20 0.1％，BSA 1％，NCS 4％)
-  NaCl T20(NaCl 9g/l，Tween 20 0.05％)方法总人IgA检测
-  以100μl孔加入山羊多克隆抗人IgA的DPBS溶液(1μg/ml)，
   并于4℃温育过夜。
-  以200μl/孔加入饱和缓冲液，并于37℃温育1小时。
-  在第一行加入：标准IgA在饱和缓冲液中的两倍稀释液，由
   250ng/ml下降至0.12ng/ml，100μl/孔。
-  在其它行加入：样品(鼻液)在饱和缓冲液中的两倍稀释液，
   由1/100下降至1/102400，100μl/孔，在第十二列加入100μl
   饱和缓冲液，并于22℃温育2小时。
-  用NaCl T20清洗所述板4次。
-  加入在饱和缓冲液中稀释10000倍的缀合过氧化物酶的山羊
   抗人IgA，100μl/孔，并于22℃温育1.5小时。
-  用NaCl T20清洗所述板4次。
-  加入TMB(四甲基联苯胺)，100μl/孔，并于室温在黑暗中温
   育10分钟。
-  以100μl/孔加入0.4 N H2SO4终止反应。
-  使用分光光度计检测每块板于450nm的吸光度(OD)，参比
   检测波长为630nm。特异性抗流感IgA检测
-  加入每种流感病毒株的DPBS溶液(1μg/ml)，100μl/孔，并
   于4℃过夜温育。
-  每孔加入200μl的饱和缓冲液，并于37℃温育1小时。
-  加入所述样品在饱和缓冲液中的两倍稀释液，由1/5下降至
   1/640，100μl/孔，并于22℃温育2小时。
-  用NaCl T20清洗所述板4次。
-  加入在饱和缓冲液中稀释10000倍的缀合过氧化物酶的山羊
   抗人IgA，100μl/孔，并于22℃温育1.5小时。
-  用NaCl T20中清洗所述板4次。
-  加入TMB(四甲基联苯胺)，100μl/孔，并于室温在黑暗中温
   育10分钟。
-  以100μl/孔加入0.4 N H2SO4终止反应。
-  使用分光光度计检测每块板于450nm的吸光度(OD)，参比
   检测波长为630nm。结果-表达与计算总IgA表达
使用Softmaxpro程序，将结果表示为1ml鼻液中的总IgA的μg数。特异性抗流感IgA表达
结果表示为终点单位滴度，以产生高于取舍值(OD450nm＝0.6)的OD450nm的最高稀释度的倒数计算。
取舍值定义为1/5稀释度的阴性对照(参见验证方案)的最高光密度。因此，可以5终点单位作为对应于取舍值的终点单位滴度的检测界限。滴度≤5终点单位的样品判为阴性，而滴度＞5终点单位的样品判为阳性。
样品的最终结果如下表示：
通过计算特异性应答和总IgA浓度的比率：终点单位/μg总IgA(文献中最常使用的计算方法)，归一化特异性应答。2.流感特异性血清抗体的血细胞凝集抑制(HAI)活性
用200μl RDE(受体破坏酶)于37℃处理血清(50μl)16小时。用150μl 2.5％柠檬酸钠终止反应，并于56℃、30分钟使血清灭活。通过加入100μl PBS配制1∶10稀释液。然后，在96孔板(V底)中通过用25μl PBS稀释25μl血清(1∶10)配制2倍稀释系列。向每孔中加入25μl参比抗原，浓度为4血细胞凝集单位/25μl。使用微量滴定板震荡器混合抗原和抗血清稀释液，并于室温温育60分钟。然后加入50μl鸡红细胞(RBC)(0.5％)，让RBC于室温沉降1小时。HAI效价相当于完全抑制病毒诱导型血细胞凝集的最高血清稀释度的倒数。实施例4-鼻内片段流感疫苗与获准的常规胃肠外疫苗(Fluarix TM )在健 康成年受试者中的免疫原性比较 用于研究的制剂
评价两个得自鸡胚的片段流感抗原制剂(A、B)。A是鼻内制剂，而B是肌内给予的FluarixTM/α-Rix。所述制剂含有三种由WHO推荐的1998/1999流感季节病毒株制备的灭活片段病毒体抗原。
用于给予所述疫苗的装置为Becton Dickson的AccusprayTM鼻内喷射器。该装置的工作原理同常规喷射器相似，但其具有一个带螺旋通道的专用喷嘴，该喷嘴甚至在压力施加于活塞上时也产生喷雾。该装置装填200μl疫苗制剂，每个鼻孔喷入100μl A制剂。制剂组成
鼻内制剂(A)含有以下的灭活片段病毒体：
1.  30μg HA A/Beijing/262/95(H1N1)
2.  30μg HA A/Sydney/5/97(H3N2)
3.  30μg HA B/Harbin/7/94以及磷酸缓冲盐水pH7.4±0.1、0.1％的Tween 80、0.015％的TritonX-100、0.0045％的脱氧胆酸钠和小于35μg/ml的硫柳汞。
一剂的体积为200μl(每个鼻孔100μl亚剂量)。
对比的FluarixTM/α-Rix为SmithKline Beecham Biological销售的灭活三价片段流感疫苗。肌内给予500μl的剂量。
该剂量包含：
15μg上述三种病毒株HA、500-1000μg/ml的Tween 80(0.05％-0.1％)、50-170μg/ml的Triton X-100(0.005％-0.017％)、最大100μg/ml的脱氧胆酸钠、100μg/ml的硫柳汞和磷酸缓冲盐水pH6.8-7.5。免疫原性研究
一个开放性对照随机化研究评价了用Tween 80和Triton X-100配制的鼻内片段流感疫苗相比于常规胃肠外疫苗(即FluarixTM)的免疫原性。20个健康成年受试者(年龄18-40岁)接受一剂FluarixTM，而10个受试者接受一剂鼻内流感疫苗。鼻内制剂(200μl)含以下的灭活病毒体：30μg A/Beijing/262/95(H1N1)血细胞凝集素、30μgA/Sydney/5/97(H3N2)血细胞凝集素、30μg B/Harbin/7/94血细胞凝集素以及磷酸缓冲盐水(pH7.4±0.1)、Tween 80(0.1％)、Triton X-100(0.015％)、脱氧胆酸钠(0.0045％)和硫柳汞(＜35μg/ml)。
对要求的局部和全身症状随访8天，两种疫苗在安全性和反应性方面都良好耐受。没有与接种相关的严重副反应事件的报告。
通过评价血清血细胞凝集抑制(HI)滴度检测所述疫苗的免疫原性，以测定血清阳转率(定义为第21天相比于第0天每种疫苗株的血清HI滴度增加至少3倍的接种者百分率)、转化系数(定义为第21天相比于第0天每种疫苗株的血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数)和血清保护率(定义为在公认保护的(每种疫苗株)接种后血清HI滴度≥40的接种者百分率)。另外，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评价粘膜IgA抗体反应。
由表2可知一剂FluarixTM或所述鼻内制剂接种后21天的HI血清阳性率、血清阳转率和血清保护率。由表2a可知转化系数。
表2：
1剂接种后21天的HI血清阳性率、血清阳转率和血清保护率
  病毒株      组别   时间     N      血清阳性n％     血清保护n％      血清阳转n％
 A/Beijing  鼻内疫苗+Tween80和TritonX100 第0天第21天     2020     4     20.017    85.0     0     0.015    75.0 15     75.0
 FluarixTM 第0天第21天     1919     4     21.119    100.0     3     15.818    94.7 19     100.0
 A/Sydney  鼻内疫苗+Tween80和TritonX100 第0天第21天     2020     13    65.020    100.0     3     15.019    95.0 15     75.0
 FluarixTM 第0天第21天     1919     14    73.719    100.0     1     5.318    94.7 16     84.2
 B/Harbin  鼻内疫苗+Tween80和TritonX100 第0天第21天     2020     10    50.020    100.0     7     35.018    90.0 14     70.0
 FluarixTM 第0天第21天     1919     17    89.519    100.0     11    57.919    100.0 15     78.9
血清阳性(n，％)：滴度≥10的受试者的数目和百分率
血清保护(n，％)：滴度≥40的受试者的数目和百分率
血清阳转(n，％)：由第0天至第21天滴度增加至少3倍的受试者的数目和百分率
在所有情况下，转化系数(接种后血清HI GMT的增加倍数)都大于2.5(成功流感疫苗必须的水平)。
由表3可知第21天与第0天(1剂)的特异性/总粘膜IgA抗体比率增加1倍或3倍的受试者百分率。
表3：
第21天与第0天(1剂)的特异性/总IgA比率增加1倍或3倍的 受试者百分率
  病毒株       组别   N  增加1倍(％)  增加3倍(％)
  A/Beijing   Tween和TritonFluarixTM   2019     55.052.6     30.026.3
 A/Sydney   Tween和TritonFluarixTM   2019     65.047.4     45.05.3
 B/Harbin   Tween和TritonFluarixTM   2019     40.026.3     30.05.3
总结
以上表格列出的免疫原性结果显示，一剂接种后21天鼻内制剂产生的血清阳性、血清阳转和血清保护水平与常规胃肠外疫苗(FluarixTM)相似。一剂接种后鼻内制剂产生的粘膜IgA应答好于常规胃肠外疫苗(FluarixTM)。实施例5-用laureth 9、Triton X-100和Tween 80配制的鼻内片段流 感疫苗与获准的常规胃肠外疫苗(Fluarix TM )在健康成年受试者中的免 疫原性比较。
评价并比较用laureth 9、Triton X-100和Tween 80配制的得自鸡胚的片段流感抗原鼻内制剂(A)和FluarixTM/α-Rix(B)。所述制剂含有三种由WHO推荐的1998/1999流感季节病毒株制备的灭活片段病毒体抗原。用于给予所述疫苗的装置为Becton Dickson的AccusprayTM鼻内喷射器。该装置的工作原理同常规喷射器相似，但其具有一个带螺旋通道的专用喷嘴，该喷嘴甚至在压力施加于活塞上时也产生喷雾。每个鼻孔喷入100μl所述制剂。制剂组成
鼻内制剂(A)含有以下的灭活片段病毒体：
1.  30μg A/Beijing/262/95(H1N1)HA
2.  30μg A/Sydney/5/97(H3N2)HA
3.  30μg B/Harbin/7/94 HA以及磷酸缓冲盐水pH7.4±0.1、0.1％的Tween 80、0.015％的TritonX-100、0.0045％的脱氧胆酸钠和小于35μg/ml的硫柳汞。
一剂的体积为200μl(每个鼻孔100μl亚剂量)。制剂A用laureth配制，以获得0.5％(w/v)的终浓度。
对比的FluarixTM/α-Rix(B)为SmithKline Beecham Biological销售的灭活三价片段流感疫苗，其以500μl的剂量肌内给予。免疫原性研究
一个开放性对照随机研究评价了用laureth 9补加Tween 80和Triton X-100配制的鼻内片段流感疫苗相比于常规胃肠外疫苗(即FluarixTM)的免疫原性。20个健康成年受试者(年龄18-40岁)接受一剂FluarixTM，而10个受试者接受一剂(两个亚剂量，每个鼻孔一个亚剂量)鼻内流感疫苗。
对要求的局部和全身症状随访8天，两种疫苗在安全性和反应性方面都良好耐受。没有与接种相关的严重副反应事件的报告。
通过评价血清血细胞凝集抑制(HI)滴度检测所述疫苗的免疫原性，以测定血清阳转率(定义为第21天相比于第0天每种疫苗株的血清HI滴度增加至少3倍的接种者百分率)、转化系数(定义为第21天相比于第0天每种疫苗株的血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数)和血清保护率(定义为在公认保护的(每种疫苗株)接种后血清HI滴度≥40的接种者百分率)。另外，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评价粘膜IgA抗体反应。
由表4可知一剂FluarixTM或所述鼻内制剂接种后21天的HI血清阳性率、血清阳转率和血清保护率。
表4：1剂接种后21天的HI血清阳性率、血清阳转率和血清保护率：
  病毒株         组别   时间     N     血清阳性n％      血清保护n％      血清阳转n％
 A/Beijing 鼻内疫苗+Laureth 9 第0天第21天     2020     5     25.019    95.0     1     5.010    50.0 15     75.0
FluarixTM 第0天第21天     1919     4     21.119    100.0     3     15.818    94.7 19     100.0
 A/Sydney 鼻内疫苗+Laureth-9 第0天第21天     2020     16    80.020    100.0     4     20.019    95.0 15     75.0
FluarixTM 第0天第21天     1919     14    73.719    100.0     1     5318    94.7 16     84.2
 B/Harbin 鼻内疫苗+Laureth-9 第0天第21天     2020     18    90.020    100.0     11    55.019    95.0 12    60.0
FluarixTM 第0天第21天     1919     17    89.519    100.0     11    57.919    100.0 15    78.9
血清阳性(n，％)：滴度≥10的受试者的数目和百分率
血清保护(n，％)：滴度≥40的受试者的数目和百分率
血清阳转(n，％)：由第0天至第21天滴度增加至少3倍的受试者的数目和百分率
在所有情况下，转化系数(疫苗接种后血清HI GMT的增加倍数)都大于2.5(成功流感疫苗必须的水平)。
由表5可知第21天与第0天(1剂)的特异性/总粘膜IgA抗体比率增加1倍或3倍的受试者百分率。表5：第21天与第0天(1剂)的特异性/总IgA比率增加1倍或3倍 的受试者百分率。
  病毒株      组别   N   增加1倍(％)   增加3倍(％)
 A/Beijing     Laureth-9FluarixTM   2019     50.052.6     20.026.3
 A/Sydney     Laureth-9FluarixTM   2019     55.047.4     25.05.3
 B/Harbin     Laureth-9FluarixTM   2019     15.026.3     10.05.3
总结
以上表格列出的免疫原性结果显示，一剂接种后21天鼻内制剂产生的血清阳性、血清阳转和血清保护水平与常规胃肠外疫苗(FluarixTM)相似。一剂接种后鼻内制剂产生的粘膜IgA应答一般好于常规胃肠外疫苗(FluarixTM)。实施例6-用接触过抗原的小鼠评价有和没有laureth 9+3D-MPL的 鼻内流感疫苗6.1.在第一个实验中，用侯选制剂接种小鼠，所述侯选制剂含有与用于小鼠初免的抗原相同的流感病毒株。实验步骤
在第0天用β-丙酸内酯灭活的得自鸡胚的三价完整流感病毒A/Beijing/262/95、A/Sydney/5/97和B/Harbin/7/94(5μg HA/病毒株)鼻内“初免”雌性Balb/c小鼠(8周龄)，以便模拟在人类发生的天然初免。
28天后，用以下的三价疫苗制剂鼻内接种小鼠(每组10只小鼠)，所述三价疫苗制剂含有与用于初免的抗原相同的病毒株：
  组别  途径(方法)   三价片段抗原       其它试剂？
普通疫苗1 鼻内(液滴) 3.0μg HA/病毒株 无
普通疫苗2 鼻内(液滴) 1.5μg HA/病毒株 无
L9 鼻内(液滴) 1.5μg HA/病毒株 0.5％Laureth-9
L9+MPL 鼻内(液滴) 0.75μg HA/病毒株 0.5％Laureth-9+5μgMPL
胃肠外 肌内(注射) 1.5μg HA/病毒株 无
给予小鼠的鼻内疫苗制剂类似于实施例7中给予人的制剂，只是给予小鼠的剂量相当于给予人的剂量的1/10。
在第42天收集血清样品，并测试其血细胞凝集抑制(HI)抗体。处死后(第42天)，进行鼻部清洗，并通过ELISA测试IgA抗体滴度。以终点滴度(EPT)检测特异性IgA抗体，结果表示为特异性IgA EPT/μg总IgA，以便排除任何由取样方法造成的差异。结果
研究的第一个目的是证实鼻内疫苗制剂能够使激发的血清HI滴度与胃肠外给予产生的血清HI滴度无显著差异。图1显示了在第42天(即接种后第14天)于血清中观测到的各种疫苗的HI滴度。
对观测的HI滴度进行统计学分析(Tukey-HSD统计比较分析)，以便比较所述鼻内疫苗和胃肠外疫苗。对于三种流感病毒株中的两种(A/H1N1和B型病毒株)而言，由普通疫苗1和2组观测到的HI滴度显著不同于(p＜0.05)由胃肠外疫苗诱导的HI滴度。抗-A/H3N2病毒株滴度无显著差异。对三种病毒株中的两种(A/H3N2和B型病毒株)而言，L9制剂的免疫原性与胃肠外疫苗相同。相反，L9+MPL配制的疫苗激发的抗三种流感病毒株的HI抗体的滴度与用胃肠外疫苗观测到的HI抗体滴度无显著差异。
第二个目的是确定鼻内接种的鼻部IgA应答是否优于在肌内加强免疫动物中观测到的IgA应答。图2图示加强接种后第14天(第42天)记录到的鼻部IgA应答。
任一种鼻内制剂诱导的应答之间不存在显著差异。鼻内给予激发的应答比胃肠外途径高1-3倍。最后，用L9+MPL配制的疫苗能够维持与其它鼻内疫苗相同的应答水平，但抗原剂量较低。结论
依据HI抗体应答的结果，用L9+MPL配制的三价片段流感抗原(0.75μg HA+0.5％Laureth 9+5μg MPL)是免疫原性最强的鼻内疫苗制剂。
所有测试的鼻部传递疫苗在诱导局部IgA抗体方面都比胃肠外给予的疫苗更有效。L9+MPL制剂诱导的应答与其它制剂类似，但抗原含量减少。6.2.在第二个实验中，用与用于小鼠初免的病毒株不同的病毒株鼻内免疫小鼠。
抗原性漂移是一年一度的流感流行的原因。每年流感疫苗中包含的病毒株是那些最经常出现的病毒株；但在疫苗中也可以存在或多或少涉及到的其它病毒株。因而，最佳的侯选流感疫苗必须诱导有效的抗广谱病毒株的保护。因此，饶有趣味的是研究在用与所述疫苗中包含的病毒株异种的病毒株“初免”之后，给定的鼻内制剂能够激发何种程度的免疫应答。实验步骤
在第0天用β-丙酸内酯灭活的得自鸡胚的三价完整流感病毒(A/Johannesburg/82/96 H1N1、A/Johannesburg/33/94 H3N2和B/Panama/45/90；5μg HA/病毒株)鼻内“初免”雌性Balb/c小鼠(8周龄)，以模拟在人类发生的天然初免。
28天后，用以下的三价疫苗制剂(含有A/Beijing/262/95 H1N1、A/Sydney/5/97 H3N2和B/Harbin/7/94作为异种病毒株)鼻内接种小鼠(每组10只小鼠)。
  组别  途径(方法)     三价片段抗原       其它试剂？
普通疫苗1 鼻内(液滴) 3.0μg HA/病毒株 无
普通疫苗2 鼻内(液滴) 1.5μg HA/病毒株 无
L9 鼻内(液滴) 1.5μg HA/病毒株 0.5％Laureth-9
L9+MPL 鼻内(液滴) 0.75μg HA/病毒株 0.5％Laureth-9+5μgMPL
胃肠外 肌内(注射) 1.5μg HA/病毒株 无
再对小鼠测试的各种鼻内疫苗制剂中包含的三价片段病毒体的量相当于实施例7中给予人类自愿接种者的剂量的1/10。
在第42天收集血清样品，并测试其血细胞凝集抑制(HI)抗体。处死后(第42天)，进行鼻部清洗，并通过ELISA测试IgA抗体滴度。以终点滴度(EPT)检测特异性IgA抗体，结果表示为特异性IgA EPT/μg总IgA，以便排除任何由取样方法造成的差异。结果
研究的第一个目的是当使用异种亚型病毒株进行初免时，确定鼻内疫苗制剂是否能够激发出抗疫苗抗原的血清HI应答。图3显示了在接种后第14天(第42天)于血清中观测到的各种疫苗制剂的HI滴度。
所有的具有L9或L9+MPL的鼻内制剂都能够诱导针对所述三种流感病毒株的免疫应答，其与通过胃肠外给予普通疫苗激发的免疫应答相当。统计学分析(Tukey-HSD统计比较分析)证实，所有的鼻内制剂激发的应答与胃肠外给予的应答无显著(p＞0.05)差异。在鼻内制剂中，未观察到统计学差异。但一般来说，L9+MPL和L9制剂免疫原性更强，前者含有的抗原含量是后者的一半(0.75μg与1.5μgHA)。
第二个目的是确定(1)在鼻内接种后是否可检测到针对异种病毒株的鼻部特异性IgA应答，和(2)这种应答是否优于在肌内接种动物中观测到的免疫应答。图4图示接种后第14天(第42天)记录到的鼻部特异性抗异种IgA应答。
第二个目标的标准都得到了满足。所有的鼻内制剂都诱导针对所述三种异种病毒株的IgA应答，其比肌内注射普通疫苗时观察到的IgA应答高2-7倍。在鼻内制剂中，IgA应答的强度无显著差异。
异源接种观测到的应答程度所达到的范围与同源接种相同(参见图2)。同样，用L9+MPL配制的疫苗能够维持与普通制剂或L9制剂(3和1.5μg HA)相同的应答强度，但抗原剂量较低(0.75μg HA)。结论
依据流感疫苗株特异性的血清HI抗体和鼻内IgA这二者的结果，鼻内给予有或没有吸附增强型表面活性剂或辅助剂的三价片段流感疫苗能够诱导异种亚型应答。
尽管组别之间的差异在统计学上不明显，但一般来说，其中的三价片段病毒体用L9或L9+MPL配制的疫苗诱导的***以及局部免疫应答更有效。另外，与含L9的疫苗相比，用L9+MPL配制的疫苗诱导相同水平的免疫，但抗原剂量较低。实施例7-与肌内给予三价片段病毒体流感疫苗相比，以18-40岁的健 康成年人评价按照单剂免疫计划鼻内给予的得自鸡胚的有或没有 laureth 9或laureth 9+3D-MPL的三价片段病毒体流感疫苗。
在此研究中，以约120个健康男性和女性受试者评价针对所述疫苗的局部粘膜免疫应答和***免疫应答。侯选疫苗组合物
在此研究中评价5种得自鸡胚的片段流感抗原制剂。鼻内给予侯选疫苗。另外，SmithKline Beecham Biologicals的FluarixTM用作对照，FluarixTM是肌内给予的灭活片段病毒体流感疫苗。
侯选鼻内疫苗含有FluarixTM制剂使用的三种灭活片段病毒体抗原。病毒株为WHO推荐的2000年度南半球流感季节病毒株。表6列出了对各种制剂的一般性描述。
表6：疫苗的一般性描述
给予 抗原/剂(μg HA/病毒株     其它试剂？
鼻内     30μg     无
鼻内     15μg     无
鼻内     15μg     Laureth-9
鼻内     7.5μg     Laureth-9
鼻内     7.5μg     Laureth-9+3D-MPL
肌内     15μg     无
无L9或MPL的鼻内三价片段流感疫苗(30μg剂量和15μg剂量)
一剂的体积为0.2 ml。
表7：
              组分    每剂剂量*
灭活片段病毒体-A/New Caledonia/20/99(H1N1)-A/Sydney/5/97(H3N2)-B/Yamanashi/166/98 30或15μg HA30或15μg HA30或15μg HA
磷酸缓冲盐水(pH7.0-7.4)-无水磷酸氢二钠-磷酸二氢钾-氯化钾-氯化钠Triton X100Tween 80注射用水 8.10mM1.47mM2.70mM1 37mM0.02％0.15％适量至0.2ml
残余硫柳汞     ＜2μg
*每个鼻内制剂小瓶装量体积超过20％用L9配制的鼻内三价片段流感疫苗(15μg剂量和7.5μg剂量)
一剂的体积为0.2ml。所述制剂如表7所示，该制剂还包括1mglaureth 9/剂，以及15或7.5μg剂量的HA/病毒株。Laureth 9得自德国Kreussler。用L9+3D-MPL配制的鼻内三价片段流感疫苗(7.5μg剂量)
一剂的体积为0.2ml。所述制剂如表7所示，该制剂还包括1mglaureth 9/剂和50μg 3D-MPL/剂以及7.5μg HA/病毒株。FluarixTM市售灭活三价片段流感疫苗用作对照
FluarixTM 2000(南半球)用作对照。肌内给予此0.5ml剂量疫苗。
一剂含有15μg每种流感疫苗病毒株(A/New Caledonia/20/99(H1N1)-A/Sydney/5/97(H3N2)-B/Yamanashi/166/98)的血细胞凝集素以及作为防腐剂的50μg硫柳汞/剂。三价片段流感侯选疫苗制剂1.浓缩三种灭活片段病毒体
在配制最终的侯选疫苗之前，通过切向流过滤将三种灭活片段病毒体分别浓缩至最高1000-1500μg HA/ml。使用配有10kDa截流的三乙酸纤维素膜的卡型膜盒。2.配制三价片段流感疫苗
以下提供了配制流程图：
            注射用水
                +
        磷酸缓冲盐水
                +
        Tween 80至0.15％
                +Triton X100至0.02％
     +                   →于室温搅拌5分钟病毒株A/New Caledonia/20/99150或75或37.5μg HA/ml
     +                   →于室温搅拌10分钟病毒株A/Sydney/5/97150或75μg HA/ml
     +                   →于室温搅拌10分钟病毒株B/Yamanashi/166/98150或75μg HA/ml
     +                   →于室温搅拌15分钟调节pH至7.2±0.2
    ↓
Figure A0081594500431
储存于+2℃至+8℃
对于含laureth 9的制剂，加入laureth 9至0.5％，然后马上调节pH，并于室温持续搅拌15分钟。
对于含laureth 9+3D-MPL的制剂，加入250μg/ml的3D-MPL，然后立即加入laureth 9，搅拌所述制剂15分钟然后加入laureth 9。装填三价片段流感侯选疫苗
最终的原液无菌装填在Pfeiffer(德国)的1型(Ph.Eur.)玻璃小瓶中。装填后马上用橡胶塞子密封小瓶。所有的操作都在无菌室(层流***)中进行。
装填和封闭以后，将塞住的小瓶***到塑料活塞中，并安装入产生喷雾的喷嘴装置中。该装置可给予100μl的两次喷雾。结果
对所有的受试者进行以下的分析：
1.第0、21和42天：分别测试针对所述疫苗中的三种流感病毒株的每一种病毒株的粘膜IgA(局部免疫应答)ELISA滴度。
2.第0、21和42天：分别测试针对三种流感病毒株中的每一种病毒株的血清血细胞凝集抑制(HI)抗体滴度。
由此获得：
1.所有时间点的血清HI抗体GMT(95％的置信区间)。
2.HI：第21天的血清阳转率。
3.HI：第21天的转化系数。
4.HI：第21天和第42天的保护率。
5.仅针对IgA：由第0天至第21天和第0天至第42天的IgA滴度增加1倍和3倍的受试者百分率。

Claims (32)

1.非活体流感病毒抗原制品在生产用于单剂鼻内抗流感接种的疫苗制剂中的应用，其中所述单剂接种产生的免疫应答符合国际流感疫苗管理要求。
2.权利要求1的用途，其中所述单剂接种达到了对所述疫苗提供的所述或全部流感病毒株的血清阳转率、血清保护率和血清转化系数的三项欧盟标准中的至少两项标准。
3.权利要求2的用途，其中所述疫苗中提供的所述或全部流感病毒株满足全部三项欧盟标准。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述流感病毒抗原制品选自片段病毒抗原制品、亚单位抗原、化学或其它方式灭活的完整病毒。
5.权利要求4的用途，其中所述流感抗原制品为片段病毒抗原制品。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述制剂含有至少一种表面活性剂。
7.权利要求6的用途，其中所述表面活性剂为至少一种选自以下的非离子表面活性剂或其中两种或多种的组合：辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(例如市售的TritonTM系列)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(TweenTM系列)和通式(I)的聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯：
(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n为1-50，A为连接键或-C(O)-，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
8.权利要求7的用途，其中所述非离子表面活性剂为至少一种选自以下的非离子表面活性剂或其中两种或多种的组合：叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80)和laureth 9。
9.权利要求8的用途，其中所述疫苗包含所述三种非离子表面活性剂中两种的组合，即聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80)和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)。
10.权利要求9的用途，其中所述疫苗包含所有三种非离子表面活性剂的组合。
11.权利要求1-10中任一项的用途，其中所述疫苗进一步包含胆汁酸或胆酸或其衍生物，例如脱氧胆酸钠。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中每剂所述疫苗制剂都含有低剂量的血细胞凝集素。
13.权利要求12的用途，其中每个流感病毒株的血细胞凝集素含量为约30μg/剂或更少。
14.权利要求13的用途，其中每个流感病毒株的血细胞凝集素含量为约15μg/剂或更少。
15.权利要求14的用途，其中所述血细胞凝集素含量为每剂疫苗约7.5μg血细胞凝集素/病毒株或更少。
16.权利要求1-15中任一项的用途，其中所述疫苗制剂的每剂体积较小。
17.权利要求16的用途，其中所述每剂体积少于500μl，或少于300μl或每剂不多于约200μl。
18.权利要求1-17中任一项的用途，其中所述疫苗以两个亚剂量的双剂量形式传递。
19.权利要求1-18中任一项的用途，其中所述疫苗不含有添加的免疫刺激剂。
20.权利要求1-18中任一项的用途，其中所述疫苗还含有脂质A的无毒衍生物，该无毒衍生物优选选自单磷酰脂质A和双磷酰脂质A的无毒衍生物。
21.权利要求20的用途，其中所述疫苗含有3D-MPL。
22.权利要求21的用途，其中所述疫苗含有3D-MPL和laureth 9。
23.一种预防患者流感感染或疾病的方法，该方法包括经粘膜表面给予所述患者单剂非活体流感病毒疫苗，以使诱导的免疫应答满足针对所述疫苗中提供的全部流感病毒株的以下标准中的至少两项标准：
(i)血清阳转率大于或等于40％；
(ii)血清保护率大于或等于70％；和
(iii)转化系数大于或等于2.5。
24.一种预防患者流感感染或疾病的方法，该方法包括经粘膜表面给予所述患者单剂低HA的非活体流感病毒疫苗，以使诱导的免疫应答满足针对所述疫苗中提供的全部流感病毒株的以下标准中的至少两项标准：
(i)血清阳转率大于或等于40％；
(ii)血清保护率大于或等于70％；和
(iii)转化系数大于或等于2.5。
25.权利要求23或权利要求24的方法，其中提供的全部流感病毒株满足全部三项标准。
26.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述疫苗鼻内传递。
27.一种包含鼻内传递装置和单剂疫苗的药盒，所述单剂疫苗含有未添加免疫刺激剂的非活体流感病毒抗原制品。
28.一种包含鼻内传递装置和单剂流感疫苗的药盒，所述单剂流感疫苗产生的免疫应答符合国际流感疫苗管理要求。
29.一种包含鼻内传递装置和单剂疫苗的药盒，所述单剂疫苗含低HA剂量的非活体流感病毒抗原制品。
30.权利要求27-29中任一项的药盒，其中所述装置为双剂量传递装置，用于在单次给予中传递两个亚剂量。
31.权利要求27-30中任一项的药盒，其中所述装置为鼻内喷雾装置。
32.一种生产鼻用流感疫苗的方法，该方法包括：
(i)提供基本如同常规注射流感疫苗制备的片段流感病毒制品，其含有至少一种非离子表面活性剂；
(ii)任选调节所述制品中的血细胞凝集素浓度和/或非离子表面活性剂浓度；
(iii)将疫苗剂量的所述片段流感病毒制品装填在鼻内传递装置内，所述疫苗剂量体积适合鼻内给予，任选为双剂量形式。
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