本发明的公开内容
为达到上述目的,我们已进行了多项研究,结果我们成功地制备出一种新型酵母突变体(营养缺陷型三重突变体),在生物合成酵母特异性外糖链的基因中,破坏了编码进行起始延伸加成反应的α-1,6甘露糖基转移酶的基因(OCH1)、编码使甘露糖加入到糖链非还原端的α-1,3甘露糖基转移酶的基因(MNN1)和调节加入甘露糖-1-磷酸的基因(MNN4),同时保留作为选择标记的营养缺陷型突变,即最终不导入补偿营养缺陷型特性的基因。所述突变体可以产生具有与哺乳动物型糖链相同的糖链结构的糖链。此外,通过将生物合成哺乳动物型糖链的基因导入所述突变体中,可以产生各种哺乳动物型糖链。
准确地说,本发明涉及下面的(1)至(14)。
(1)一种酵母突变体,所述酵母突变体具有och1突变、mnn1突变和mnn4突变的突变性状以及至少四种营养缺陷型突变性状,并且能够产生含有下式(I)表示的寡糖(为天冬酰胺-联糖链)的糖蛋白:其中Man代表甘露糖,GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺,*代表能够被磷酸化的位点。
(2)一种酵母突变体,所述酵母突变体具有其中OCH1基因被破坏的och1突变(Δoch1)、其中MNN1基因被破坏的mnn1突变(Δmnn1)和其中MNN4基因被破坏的mnn4突变(Δmnn4)的突变性状以及至少一种营养缺陷型突变性状,但最终不导入补偿营养缺陷型特性的基因;并且所述酵母突变体能够产生含有以上式(I)表示的寡糖(为天冬酰胺-联糖链)的糖蛋白。
(3)按照上述(1)或(2)的酵母突变体,其中所述营养缺陷型突变性状选自ura3突变、his3突变、leu2突变、ade2突变、trp1突变和can1突变。
(4)按照上述(3)的酵母突变体,所述酵母突变体是属于酵母属的酵母。
(5)按照上述(4)的酵母突变体,所述酵母突变体是属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母。
(6)按照上述(5)的酵母突变体,所述酵母突变体是酿酒酵母TIY19菌株。
(7)一种用于产生寡糖的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(1)-(6)中任一项的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有由以上式(I)表示的寡糖(为天冬酰胺-联糖链)的糖蛋白;
从所述培养产物中收集所述糖蛋白;和
从所收集的糖蛋白中回收所述寡糖。
(8)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(1)-(6)中任一项的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有由以上式(I)表示的寡糖(为天冬酰胺-联糖链)的糖蛋白;
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
(9)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(1)-(6)中任一项的酵母突变体,所述酵母突变体已用含有编码哺乳动物源性天冬酰胺-联糖蛋白的基因的重组质粒转化;
在培养产物中产生并且累积含有由以上式(I)表示的寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;和
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
(10)一种酵母突变体,其中与哺乳动物型糖链生物合成有关的至少两个基因导入了具有och1突变、mnn1突变和mnn4突变的突变性状的酵母突变体中。
(11)一种酵母突变体,其中与哺乳动物型糖链生物合成有关的至少一个基因导入了按照上述(1)-(6)中任一项的酵母突变体中。
(12)一种用于产生寡糖的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(10)或(11)的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;
从所述培养产物中收集所述糖蛋白;和
从所收集的糖蛋白中回收所述寡糖。
(13)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(10)或(11)的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;和
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
(14)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(10)或(11)的酵母突变体,所述酵母突变体已用含有编码哺乳动物源性天冬酰胺-联糖蛋白的基因的重组质粒转化;
在培养产物中产生并且累积含有寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;和
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
我们也制备了另一种新型酵母突变体(营养缺陷型四重突变体),其中在上述酵母突变体(营养缺陷型三重突变体)中,参与ER糖链生物合成的基因(ALG3)也被破环,所述三重突变体中编码酵母α-1,6-甘露糖基转移酶的基因(OCH1)、编码使甘露糖加入到糖链非还原端的α-1,3-甘露糖基转移酶的基因(MNN1)知调节加入甘露糖-1-磷酸的基因(MNN4)被破坏。我们发现,不导入α-甘露糖苷酶II基因(它是生物合成哺乳动物型糖链的基因之一)、但导入生物合成哺乳动物型糖链的其它基因,所述突变体可以产生各种哺乳动物型糖链。
因此,本发明还涉及下面的(15)-(30)。
(15)一种酵母突变体,所述酵母突变体具有och1突变、mnn1突变、mnn4突变和alg3突变的突变性状以及至少五种营养缺陷型突变性状,并且能够产生含有下式(II)表示的寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白:其中Man代表甘露糖,GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺。
(16)一种酵母突变体,所述酵母突变体具有其中OCH1基因被破坏的och1突变性状(Δoch1)、其中MNN1基因被破坏的mnn1突变性状(Δmnn1)、其中MNN4基因被破坏的mnn4突变性状(Δmnn4)和其中ALG3基因被破坏的alg3突变性状(Δalg3)以及至少一种营养缺陷型突变性状,但最终不导入补偿营养缺陷型特性的基因;并且所述酵母突变体能够产生含有以上式(II)表示的寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白。
(17)按照上述(15)或(16)的酵母突变体,其中所述营养缺陷型突变性状选自ura3突变、his3突变、leu2突变、ade2突变、trp1突变和can1突变。
(18)按照上述(17)的酵母突变体,所述酵母突变体是属于酵母属的酵母。
(19)按照上述(18)的酵母突变体,所述酵母突变体是属于酿酒酵母的酵母。
(20)按照上述(19)的酵母突变体,所述酵母突变体是酿酒酵母YS134-4A菌株。
(21)一种用于产生寡糖的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(15)-(20)中任一项的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有由以上式(II)表示的寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;
从所述培养产物中收集所述糖蛋白;和
从所收集的糖蛋白中回收所述寡糖。
(22)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(15)-(20)中任一项的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有由以上式(II)表示的寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;和
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
(23)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(15)-(20)中任一项的酵母突变体,所述酵母突变体已用含有编码哺乳动物源性天冬酰胺-联糖蛋白的基因的重组质粒转化;
在培养产物中产生并且累积含有由以上式(II)表示的寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;和
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
(24)一种酵母突变体,其中与哺乳动物型糖链生物合成有关的至少两个基因导入了具有och1突变、mnn1突变、mnn4突变和alg3突变的突变性状的酵母突变体中。
(25)一种酵母突变体,其中与哺乳动物型糖链生物合成有关的至少一个基因导入了按照上述(15)-(20)中任一项的酵母突变体中。
(26)一种用于产生寡糖的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(24)或(25)的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;
从所述培养产物中收集所述糖蛋白;和
从所收集的糖蛋白中回收所述寡糖。
(27)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(24)或(25)的酵母突变体;
在培养产物中产生并且累积含有寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;和
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
(28)一种用于产生糖蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(24)或(25)的酵母突变体,所述酵母突变体已用含有编码哺乳动物源性天冬酰胺-联糖蛋白的基因的重组质粒转化;
在培养产物中产生并且累积含有寡糖为一种天冬酰胺-联糖链的糖蛋白;和
从所述培养产物中收集所述糖蛋白。
(29)一种酵母菌株,在所述酵母菌株中已经导入了α-甘露糖苷酶II基因,并且所述酵母菌株具有α-甘露糖苷酶II活性。
(30)一种用于产生α-甘露糖苷酶II的方法,所述方法包括以下步骤:
在培养基中培养按照上述(29)的酵母菌株;和
收集所述培养产物中所产生和累积的α-甘露糖苷酶II。
本说明书包括日本专利申请号Heill-233215(233215/1999)的说明书和/或附图中介绍的内容,所述日本专利申请是本申请的优先权文件。
附图简述
图1显示哺乳动物常见的N-联糖链生物合物途径。
图2显示酵母(酿酒酵母)N-联糖链的生物合物途径,其中H、C、E分别产生图3中的I、D、F。
图3显示酵母(酿酒酵母)N-联糖链的生物合物途径(续)。
图4显示一种破坏酵母基因的常规方法。
图5显示一种破坏基因的方法,但最终不导入补偿营养缺陷型特性的基因。
图6显示TIY19菌株细胞表面的甘露糖蛋白糖链的分析结构。
图7显示采用酰胺-80柱,其中导入α-1,2-甘露糖苷酶基因的TIY19菌株细胞表面的甘露糖蛋白糖链的分析结构。
a:TIY19菌株甘露聚糖糖蛋白的糖链
b:其中导入α-1,2-甘露糖苷酶的TIY19菌株的甘露聚糖糖蛋白的糖链。
图8显示采用ODS-80TM柱所分析的、其中导入α-1,2-甘露糖苷酶基因的TIY19菌株细胞表面的甘露糖蛋白糖链的结构。
a:具有式(III)表示的结构的标准糖链
b:图6中获得的一个流分。
图9显示GnT-I活性的测定结果。
图10显示采用酰胺-80柱所分析的、其中导入α-1,2-甘露糖苷酶基因和GnT-I基因的TIY19菌株细胞表面的甘露糖蛋白糖链的结构。
A:其中只导入了载体的TIY19菌株糖链的分析结构
B:其中导入α-1,2-甘露糖苷酶基因和GnT-I基因的TIY19菌株的糖链的分析结构
a:Man5GlcNAc2-PA
b:GlcNAcMan5GlcNAc2-PA
c:Man6GlcNAc2-PA
d:Man7GlcNAc2-PA
e:Man8GlcNAc2-PA
图11显示采用ODS-80TM柱所分析的、其中导入α-1,2-甘露糖苷酶基因和GnT-I基因的TIY19菌株细胞表面的甘露糖蛋白糖链的结构。
A:标准产物的混合物
B:图10.B中获得的一个流分。
图12显示使用其中导入α-甘露糖苷酶II基因的YPH500菌株的细胞提取物的蛋白质印迹分析。
A:只导入载体(pYEX-BX-3HA)的YPH500菌株的细胞提取物的蛋白质印迹分析结果
B:导入含有嵌合α-甘露糖苷酶II基因的载体(pYEOM2-HA)的YPH500菌株的细胞提取物的蛋白质印迹分析结果
图13显示使用导入α-甘露糖苷酶II基因的YPH500菌株的细胞提取物测定α-甘露糖苷酶II活性的结果。
A:只导入载体(pYEX-BX-3HA)的YPH500菌株的活性测定结果
B:导入含有嵌合α-甘露糖苷酶II基因的载体(pYEOM2-HA)的YPH500菌株的活性测定结果
a:GlcNAcMan5GlcNAc2-PA
b:GlcNAcMan3GlcNAc2-PA
图14显示采用酰胺-80柱进行分析,其中导入FGF基因的TIY48菌株(上部分)和其中导入FGF基因和α-1,2-甘露糖苷酶基因的TIY53菌株(下部分)的FGF糖链结构。
符号说明
GlcNAc,GN :N-乙酰葡糖胺
Man,M :甘露糖
PA :2-氨基吡啶基化(2-aminopyridylation)
序列表简述
SEQ ID NO:1代表用于扩增MNN1基因5’区的引物A。
SEQ ID NO:2代表用于扩增MNN1基因5’区的引物B。
SEQ ID NO:3代表用于扩增MNN1基因3’区的引物C。
SEQ ID NO:4代表用于扩增MNN1基因3’区的引物D。
SEQ ID NO:5代表用于扩增MNN4基因3’区的引物E。
SEQ ID NO:6代表用于扩增MNN4基因3’区的引物F。
SEQ ID NO:7代表用于扩增MNN4基因5’区的引物G。
SEQ ID NO:8代表用于扩增MNN4基因5’区的引物H。
SEQ ID NO:9代表用于扩增ALG3基因5’区的引物I。
SEQ ID NO:10代表用于扩增ALG3基因5’区的引物J。
SEQ ID NO:11代表用于扩增ALG3基因3’区的引物K。
SEQ ID NO:12代表用于扩增ALG3基因3’区的引物L。
SEQ ID NO:13代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因N-末端区域的引物M。
SEQ ID NO:14代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因N-末端区域的引物N。
SEQ ID NO:15代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因中心区域的引物O。
SEQ ID NO:16代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因中心区域的引物P。
SEQ ID NO:17代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因C-末端区域的引物Q。
SEQ ID NO:18代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因C-末端区域的引物R。
SEQ ID NO:19代表编码重复三次的HA-标志基因的双链DNA的序列S。
SEQ ID NO:20代表编码OCH1基因跨膜区的双链DNA的序列T。
SEQ ID NO:21代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因中的一部分催化区域的引物U。
SEQ ID NO:22代表用于扩增α-甘露糖苷酶II基因中的一部分催化区域的引物V。
SEQ ID NO:23代表用于扩增人UDP-GlcNAc转运蛋白基因的引物W。
SEQ ID NO:24代表用于扩增人UDP-GlcNAc转运蛋白基因的引物X。
SEQ ID NO:25代表用于扩增人前原α-因子(prepro α-factor)和FGF基因的引物Y。
SEQ ID NO:26代表用于扩增人前原α-因子和FGF基因的引物Z。
实施本发明的实施方案
下文将详细介绍本发明。
按照本发明酵母突变体必需的突变性状是酵母特有的外链生物合成基因的突变。具体的实例是och1突变、mnn1突变和mnn4突变,或者och1突变、mnn1突变、mnn4突变和alg3突变。
也就是说,就上述突变而论,可以通过自然突变或人工突变获得所述酵母突变体。
本发明酵母突变体中导入外源基因的营养缺陷型突变性状由所用的酵母菌株来确定。准确地说,所述突变性状选自ura3突变、his3突变、leu2突变、ade2突变、trp1突变和can1突变。营养缺陷型突变性状的数目取决于要导入的基因数,并且,一种营养缺陷型突变性状一般需要导入一种基因。当导入多个基因时,由于所导入的基因片段较长,导入效率降低,因此表达效率降低。于是,所导入的基因越多,所需的营养缺陷型突变性状的数目越大。
本文所用的短语“补偿营养缺陷型特性的基因”是指合成机体成分例如氨基酸和核酸的基因。突变性状包括其中这些基因不起作用的突变,这样互补基因是原始起作用的基因本身。因此,优选得自原始酵母菌株的基因。
短语“最终不导入补偿营养缺陷型特性的基因”是指这样的现象:在破坏一种或多种基因(导入突变性状)时利用一种或多种选择标记即营养缺陷型突变性状,营养缺陷型性状保留数与破坏后破坏的基因数相同,所述相同的营养缺陷型性状可以重复用于另一基因的破坏(参见图5)。
在破坏生物合成外糖链的酵母特异性基因的同时,保留导入外源基因的营养缺陷型突变性状的本发明的酵母突变体(下文称为营养缺陷型突变体)可以如下制备。
首先,有关破坏靶基因必需的DNA基因片段的分离,由于对酿酒酵母的基因组计划,因此所述基因在染色体上的位置是已知的(Goffeau等,Nature,387(增刊1),1-105(1997)),因此包括所述靶基因附近的基因片段的分布可得自公众机构例如美国的ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))(ATCCRecombinant DNA materials,第三版,1993)。也可以应用常规方法从酿酒酵母提取基因组DNA并选择所述靶基因。可以按照例如Cryer等所述方法(Methods in Cell Biology,12,39-44(1975))以及P.Philippsen等所述方法(Methods Enzymol.,194,169-182(1991)),从酿酒酵母提取基因组DNA。
所述靶基因通过PCR扩增,然后进行基因破坏。采用所述区域两端的有义引物和反义引物组合、抗热性DNA聚合酶、DNA扩增***等,PCR可以在体外在约2-3小时内将特定DNA片段扩增几十万倍或更高。在扩增靶基因时,25-30mer合成单链DNA用作引物,基因组DNA用作模板。
在本发明中,基本上按照Rothstein,Methods Enzymol.,101,202-211(1983)所公开的方法,进行靶基因的破坏。在该方法中,首先使质粒上的靶基因DNA片段化或部分缺失,然后将适当的选择标记基因DNA***其中,以制备其中所述靶基因的上游区和下游区之间夹有选择标记的结构。随后,将所述结构导入酵母细胞中。上述操作在所导入片段(其中夹有选择标记的DNA结构)的两个末端之间的同源部分和染色体上的靶基因发生两次重组,由此用所导入的片段取代染色体上的靶基因。
采用MNN1其因破坏菌株的制备实例来具体说明。用限制酶从质粒中切下hisG-URA3-hisG盒,在所述质粒中,沙门氏菌属(Salmonella)hisG基因DNA片段与按照Alani等构建的URA3基因的两个末端连接(Alani等,Genetics,116,541-545(1987)),并将其***到质粒的靶基因中,以构建破坏等位基因。使用该质粒取代染色体靶基因,获得基因破坏菌株。***到染色体的URA3基因夹在hisG之间,由于hisG序列之间的同源重组使其1拷贝hisG一起从染色体上去除。1拷贝hisG片段仍保留在染色体上破坏靶基因中,然而,宿主细胞是Ura表型(图5)。利用5-氟乳清酸(5-FOA)可以进行hisG之间的同源重组。ura3突变体是5-FOA抗性突变体(Boeke等,Mol.Gen.Genet.,197,345-346(1984);Boeke等,Methods Enzymol.,154,165-174(1987)),具有Ura3+表型的细胞菌株在5-FOA培养基中不能再生长。因此,分离加入5-FOA的培养基中具有抗性性状的菌株能够再次使用URA3进行操作。
以同样的方式,对该MNN1基因破坏菌株进行MNN4基因破坏和OCH1基因破坏,藉此获得本发明的目的营养缺陷型三重突变体(Δoch1Δmnn1Δmnn4)。此外,以同样的方式破坏ALG3基因可以提供本发明的目的营养缺陷型四重突变体(Δoch1Δmnn1Δmnn4Δalg3)。
因此,在以上述方法进行人工基因破坏的“人工破坏菌株”中,通过基因破坏操作不损害原酵母菌株的营养缺陷型突变性状。因此,人工破坏菌株的营养缺陷型突变性状的数目等于原酵母菌株的营养缺陷型突变性状的数目,即至少1个,不论它是三重突变体或四重突变体。
另一方面,在不采用上述方法的自发实现基因破坏的“自然突变体”中,由于没有采用上述方法,因此营养缺陷型突变性状数目的增加和减少是不相关的。
关于产生按照本发明的M8高甘露糖型糖链的酵母突变体的制备,当为了破坏基因OCH1基因、MNN1基因和MNN4基因,采用具有6种营养缺陷型突变性状的酵母菌株按照常规方法制备时,仅3种营养缺陷型突变性状保留,因此,所述突变体的营养缺陷型突变性状的数目至少4种。
当制备产生M8高甘露糖型糖链的酵母突变体时,其中OCH1基因、MNN1基因和MNN4基因以及ALG3基因已发生突变,在按照常规方法制备时可使用具有mnn1突变和alg3突变的自然突变体,然而,应再破坏OCH1基因和MNN4基因。因此,利用两种营养缺陷型突变性状。所以,使用上述具有6种营养缺陷型突变性状的酵母菌株仅保留4种营养缺陷型突变性状。因此,所述突变体的营养缺陷型突变性状的数目为至少5种。
在上述操作中,除营养缺陷型标记例如URA3外,还可以使用赋予抗药性的标记作为选择标记,所述选择性药物例如G418、浅蓝菌素、金白蘑菇素(Aureobasidin)、Zeocin、刀豆氨酸、环己酰亚胺和四环素。采用赋予例如甲醇、乙醇等的溶剂抗性,针对甘油、盐等的渗透压抗性,以及针对金属离子例如铜的抗性作为标记的基因可以导入并且破坏各种基因。
当在上述操作中采用常规方法(例如采用噬菌体为载体)作为在细胞中导入DNA并由此转化的方法时,DNA通过噬菌体感染大肠杆菌宿主的方法等可以有效地掺入到宿主中。采用质粒转化酵母的方法包括其中经锂盐处理以促进DNA自发掺入而掺入质粒方法以及将DNA电导入细胞的方法(Becker和Guarente,Methods Enzymol.,194,182-187(1991))。
在上述操作中,可应用常规方法进行DNA的分离、纯化等,例如如果是大肠杆菌,则应用碱/SDS技术和乙醇沉淀提取DNA,进一步通过RNA酶处理、PEG沉淀等纯化DNA。也可以应用常规方法例如双脱氧法(Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74.5463-5467(1977))进行基因DNA序列的测定。此外,采用商业性测序试剂盒等,可以容易地进行上述DNA核苷酸序列的测定。
如此制备的营养缺陷型突变体可以产生哺乳动物高甘露糖型糖链。为了产生杂合型和复合型的哺乳动物型糖链,再将一组酵母特异性糖链水解酶基因和一组酵母特异性糖基转移酶基因导入所述突变体中。如上所述,糖链最初在ER和高尔基体中生物合成,因此用作糖链原料的糖核苷酸应存在于这些细胞器中。然而,这些糖核苷酸的转运蛋白在所述酵母中不存在,或即使存在,在实际生物合成糖链的细胞器中存在量也非常少。因此,一组糖核苷酸转运蛋白基因(将胞质中生物合成的糖核苷酸从胞质转运到ER和高尔基体)也是必需的。
因此,在本发明中,属于糖链水解酶基因组、糖基转移酶基因组和糖核苷酸转运蛋白基因组的基因称为“哺乳动物型糖链生物合成基因”。
糖链水解酶基因组包括α-甘露糖苷酶(α-甘露糖苷酶I、α-甘露糖苷酶II)基因,糖基转移酶基因组包括N-乙酰葡糖胺基转移酶(GnT-I、GnT-II、GnT-III、GnT-IV、GnT-V)基因、半乳糖基转移酶(GalT)基因、果糖基转移酶(FucT)基因等,糖核苷酸转运蛋白基因组包括UDP-GlcNAc转运蛋白基因、UDP-Gal转运蛋白基因等。这些基因可以分离的哺乳动物源性基因,或可以是合成基因。
关于“哺乳动物型糖链生物合成基因”,以产生目的糖链的必需数目导入属于一组、两组或多组上述基因的基因。当导入多个基因时,这些基因可以属于同一组或不同组。
当在培养基中培养营养缺陷型突变体或培养其中在所述营养缺陷型突变体中导入外源基因组的突变体时,酵母特有的外糖链含量减少,而在酵母细胞内或所述细胞外可以产生含有Asn-联糖链的糖蛋白,所述糖链与哺乳动物细胞产生的高甘露糖型糖链(Man5 8GlcNAc2)、杂合型糖链(GlcNAcMan5GlcNAc2)和复合型糖链(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2等)相同。
更具体地说,当将三重突变体(Δoch1Δmnn1Δmnn4)用作营养缺陷型突变体时,在所述突变体中通过导入α-甘露糖苷酶I基因和GnT-I基因可以产生杂合型糖链。另外,导入哺乳动物型糖链生物合成基因(α-甘露糖苷酶II基因、GnT-II基因、GalT基因、UDP-GlcNAc转运蛋白基因、UDP-Gal转运蛋白基因)可以产生二天线复合型糖链(Gal2GlcNAc2Man2GlcNAc2)。
导入GnT-IV基因和GnT-V基因可以产生三天线复合型糖链和四天线复合型糖链。
当四重突变体(Δoch1Δmnn1Δmnn4alg3)用作营养缺陷型突变体时,不导入α-甘露糖苷酶II基因,而通过导入哺乳动物型糖链生物合成基因(α-甘露糖苷酶I基因、GnT-I基因、GnT-II基因、Gal-T基因、UDP-GlcNAc转运蛋白基因、UDP-Gal转运蛋白基因)可以产生二天线复合型糖链(Gal2GlcNAc2Man2GlcNAc2)。
为了获得高产率的糖链和糖蛋白,所述酶最好在适当细胞器(例如高尔基体)中高水平表达。因此,使用在酵母中符合密码子选择频率的基因是有效的。为了所述酶定位在适当细胞器中,加入酵母的信号序列等是有效的。在导入基因时,可以考虑一种其中使用载体例如2μm质粒型(YEp型)、染色体掺入型(YIp型)等的方法,并且可以根据目的来确定将采用的方法。YEp型载体可以导入许多拷贝的基因,因此,可以表达大量基因。另一方面,YIp型载体可以使得基因存在于染色体中,因此,可以稳定地保留所述基因。表达基因必需的启动子包括组成型表达启动子(例如GAPDH、PGK等)和诱导型表达启动子(例如GAL1、CUP1等),而没有特别的限制。在产生糖链时,优选组成型表达启动子。然而,当需要表达一种或多种糖链水解酶基因、糖基转移酶基因以及糖核苷酸转运蛋白基因时,它可能影响酵母的繁殖。因此,在这一情况下,应该考虑使用诱导型表达启动子和导入基因的顺序。
本发明的营养缺陷型突变体除包括通过上述人工破坏基因获得的突变体外,还包括通过药物、紫外线照射和自然突变获得的突变体。通过导入上述哺乳动物型糖链生物合成基因(糖链水解酶基因组、糖基转移酶基因组以及属于糖核苷酸转运蛋白组的基因),这种自然型突变体也可以产生哺乳动物型糖链或具有哺乳动物型糖链的糖蛋白。
为了产生具有上述糖链并且是源自不同物种的糖蛋白,通过采用酵母突变体作为宿主,提供与能够在酵母中表达编码目的糖蛋白的基因(cDNA等)的启动子下游连接的基因,然后通过同源重组将所述基因掺入酵母宿主中。或者,可以将所述基因***到质粒中,然后用来转化所述宿主,以制备转化子。按照已知的方法,通过培养所述转化子,可以回收酵母细胞内或所述细胞外产生的目的糖蛋白。
按照通常用于培养酵母的常规方法,可以培养所述酵母突变体。例如,可以使用合成培养基(包括碳源、氮源、无机盐、氨基酸和维生素),在所述培养基中添加Difco供应的各种培养基成分,但去除质粒复制和保留必需的标记提供的氨基酸(Sherman,MethodsEnzymol.,194,3-57(1991))。
为了分离纯化培养产物(培养液、培养细胞)中的糖蛋白,可以采用分离纯化蛋白质的常规方法。
例如,完成培养后,通过离心回收细胞,然后将其悬浮于缓冲水溶液中。然后通过超声粉碎机、弗氏压碎器、Menton Gaulin匀浆器、DYNO-Mill等将细胞破碎,以获得无细胞提取液。采用分离纯化蛋白质的常规方法,从通过离心无细胞提取液制备的上清液中,可以获得纯化制品,也就是说,单独或联合使用以下两种或多种方法:溶剂萃取法、采用硫酸铵等盐析、脱盐法、采用有机溶剂的沉淀法、采用树脂例如二乙氨乙基(DEAE)-琼脂糖的阴离子交换层析法、采用树脂例如S-Sepharose FF(Pharmacia)的阳离子交换层析法、采用树脂例如丁基-琼脂糖和苯基-琼脂糖的疏水层析法、采用分子筛的凝胶过滤法、采用树脂例如His Bind树脂(Novagen)的亲和层析法、层析聚焦法和电泳例如等电聚焦电泳。
实施例
参照以下实施例,将更详细地介绍本发明,然而,这些实施例不限制本发明的技术范围。[实施例1]培育能够产生哺乳动物型糖链的酵母突变体(Δmnn1Δmnn4Δoch1营养缺陷型三重突变体)
(1)Δmnn1营养缺陷型突变体的制备及其特性
从报道(Alani等,Genetics,116,541-545(1987))的pNK51于BglII和BamHI处切除通过同向重复使沙门氏菌hisG基因连接到URA3基因两端的盒(HUH),然后将其***到大肠杆菌质粒pSP73中的BamHI位点。该质粒称为pSP73-HUH。
MNN1基因位于酵母第5号染色体着丝粒附近,MNN1基因的DNA核苷酸序列注册于GenBank数据库,登录号L23753(Yip等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9,2723-2727(1994))。采用引物A(GGATCCGAAGAAAACCTAATACATTGAAGT:SEQ ID NO:1)和引物B(GCATGCCCTTTGGTTTAATATAAATCTCCGGAGTGC:SEQID NO:2),通过PCR扩增MNN1基因的5’区,而采用引物C(GCATGCTACATAACTCCAATCAGCAGCAAATATGTC:SEQ IDNO:3)和引物D(GCGGCCGCGTGTTCTGTTCGGGTAACGTTTAAACCAAT:SEQ IDNO:4),通过PCR扩增3’区。将所得的DNA片段掺入到含有HIS3标记的质粒pHYH中的SphI位点,以制备pHYHΔmnn1。为了使用HUH盒破坏MNN1基因,从pHYHΔmnn1获得1.8kb SphI片段,将其***到pSP73-HUH的SphI位点,构建pSP73-Δmnn1∷HUH。在NotI位点切割所述质粒,以将其线性化,然后,采用乙酸锂方法(Ito等,J.Bacteriol.,153,163-168(1983)),用所述线型质粒转化野生型菌株W303-1A(MATa leu2-3、112his3-11、15 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)。转化后,将酵母细胞涂布于含有SD-Ura培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、无尿嘧啶的核碱基和氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。
用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的MNN1区中掺入尿嘧啶标记。该转化子称为TIY1菌株。
从该菌株,在含5-FOA的YSD培养基(1%酵母提取物、2%葡萄糖、腺嘌呤(40mg/L)、尿嘧啶(20mg/L))中进行选择,获得URA3基因缺陷型菌株。以与上述相同的方式,通过PCR证实缺乏URA3基因的mnn1破坏菌株。含有Δmnn1∷hisG的该菌株称为TIY3菌株。
在MNN1破坏菌株的情况下,已知经过N-联修饰的转化酶的迁移率比野生型菌株快,由于它在非还原端缺乏α-1,3联甘露糖所致。将在YPAD培养基中培养的野生型菌株和TIY3菌株分别重悬于含0.2%蔗糖的营养培养基(1%酵母提取物、2%细菌培养用蛋白胨、腺嘌呤(40mg/L))后,培养3小时。收集后,将细胞悬浮于SDS样品缓冲液中,用玻璃珠压碎细胞。然后用上清液进行6%SDS聚丙烯酰胺电泳。转化酶经用蔗糖诱导进行检测,然后采用三苯基四氮唑进行活性染色(Ballou,Methods Enzymol.,185,440-470(1990))。结果证实,由TIY3菌株产生的转化酶的迁移率比野生型菌株快。(2)Δmnn1Δmnn4营养缺陷型双重突变体的制备及其特性
MNN4基因位于酵母第11号染色体上,MNN4基因的DNA核苷酸序列注册于GenBank数据库,登录号D83006(Odani等,Glycobiology,6,805-810(1996))。采用引物E(AGATGCATACTAGTGGGCCCATTGTGATTGGAAT:SEQ ID NO:5)和引物F(CCCCCGAATTCGTGTGAAGGAATAGTGACG:SEQ IDNO:6),通过PCR扩增MNN4基因的3’区,而采用引物G(CCCCCGAATTCAAGTCGGAGAACCTGACTG:SEQ ID NO:7)和引物H(ATGGGCCCACTAGTATGCATCTCGCGTGGCATGG:SEQ IDNO:8),通过PCR扩增5’区。将所得的DNA片段掺入到含有HUH盒的pSP73-HUH中的EcoRI位点,以制备pSP73-Δmnn4∷HUH。在SpeI位点切割所述质粒,以将其线性化,然后,采用乙酸锂方法,用所述线型质粒转化TIY3菌株。转化后,将酵母细胞涂布于含有SD-Ura培养基的平板上,于30℃培养2天获得转化子。
用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的MNN4区中掺入尿嘧啶标记。该转化子称为TIY9菌株。
从该菌株,在含5-FOA的YSD培养基中进行选择,获得URA3基因缺陷型菌株。以与上述相同的方式,通过PCR证实缺乏URA3基因的mnn4破坏菌株。含有Δmnn1∷hisGΔmnn4∷hisG的该菌株称为TIY11菌株。
用爱茜蓝染色可以确定糖链中磷酸基团存在与否。爱茜蓝是一种与负电荷结合的正电荷染料。当酵母细胞在pH值为3的缓冲液中悬浮并在其中加入0.1%爱茜蓝8GX(Sigma,编号A3157)时,只有糖链中含有磷酸基团的细胞被染成蓝色,而不含有磷酸基团的细胞为白色。由于细胞表面的糖链基本上不含磷酸基团,Δmnn4破坏菌株不被爱茜蓝染色。在营养培养基中培养野生型菌株、TIY3和TIY11,用爱茜蓝将每种细胞染色。结果证实,仅TIY11不被染成蓝色。(3)Δmnn1Δmnn4Δoch1营养缺陷型三重突变体的制备及其特性
OCH1基因位于酵母第7号染色体上,OCH1基因的DNA核苷酸序列注册于GenBank数据库,登录号D11095(Nakayama等,EMBOJ.,11,2511-2519(1992))。切割已经构建含有全长OCH1基因的pBL-OCH1(Nakayama等,EMBO J.,11,2511-2519(1992))的OCH1基因中的AatII-HpaI位点,然后将其***到得自平端pNKY51的HUH盒中,以制备pBL-Δoch1∷HUH。在SalI和BamHI处切割所述质粒,以切下含Δoch1∷HUH的区域,然后,采用乙酸锂方法,用该区段转化TIY11。含有Δoch1破坏的菌株表现出对低渗透压敏感,因此,转化后,将转化细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Ura培养基的平板上,于30℃培养2天获得转化子。
用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的OCH1区中掺入尿嘧啶标记。该转化子称为TIY17菌株。
从该菌株,在含5-FOA和0.3M KCl的YSD培养基中进行选择,获得URA3基因缺陷型菌株。以与上述相同的方式,通过PCR证实缺乏URA3基因的och1破坏菌株。将含有Δmnn1∷hisGΔmnn4∷hisGΔoch1∷hisG的该菌株称为TIY19菌株。
所述营养缺陷型三重突变体TIY19菌株已于1999年7月27日国际保藏于国立生命科学和人体技术研究所(the NATIONALINSTITUTE OF BIOSCIENCE AND HUMAN-TECHNOLOGY)(1-1-3,Higashi,Tsukuba Ibaraki),保藏号FERM BP-6802。
含有och1破坏的该TIY19菌株产生高甘露糖型糖链,因此,已知所述菌株转化酶的迁移率比野生型菌株、TIY3菌株和TIY11菌株快。为了证实och1破坏菌株对糖链长度的影响,以与上述相同的方式,分别检测野生型菌株、TIY3菌株、TIY11菌株和TIY19菌株的转化酶。结果证实,野生型菌株、TIY3菌株、TIY11菌株和TIY19菌株的迁移率以该顺序增快。[实施例2]能够产生哺乳动物型糖链的酵母突变体(Δmnn1Δmnn4Δoch1Δalg3营养缺陷型四重突变体)的制备及其特性
ALG3基因位于酵母第2号染色体上,ALG3基因的DNA核苷酸序列注册于GenBank数据库,登录号Z35844(Feldmann等,EMBOJ.,13,5795-5809(1994))。采用引物I(GCGGCCGCGAGACCTGAATCTTCGACACGCAAGAAAAA:SEQID NO:9)和引物J(GAATTCGCTTTCGAACAAAATCAAAAGGGGCATAAC:SEQ IDNO:10),通过PCR扩增ALG3基因的5’区,而采用引物K(GAATTCCTATCCACCAAACTCACAAGCAAGCA:SEQ ID NO:11)和引物L(GCGGCCGCCGAGAGGGTGAACGGTGCTAACTCAGGATT:SEQID NO:12),通过PCR扩增3’区。将所得的DNA片段掺入到含有HUH盒的pSP73-HUH的EcoRI位点,以制备pSP73-alg3∷HUH。在NotI位点切割所述质粒,以将其线性化,然后,采用乙酸锂方法,用所述线型质粒转化TIY19菌株。转化后,将酵母细胞涂布于SD-Ura培养基的平板上,于30℃培养2天获得转化子。
用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的ALG3区中掺入尿嘧啶标记。该转化子称为YS134菌株。
从该菌株,在含5-FOA的SD培养基中进行选择,获得URA3基因缺陷型菌株。以与上述相同的方式,通过PCR证实缺乏URA3基因的alg3破坏菌株。含有Δmnn1∷hisGΔmnn4∷hisGΔoch1∷hisGΔalg3∷hisG的该菌株称为YS134-4A菌株。
所述营养缺陷型四重突变体YS134-4A菌株已于1999年7月27日国际保藏于国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3,Higashi,Tsukuba Ibaraki),保藏号FERM BP-6801。
含有alg3破坏的该YS134-4A菌株产生短糖链,因此,已知所述菌株转化酶的迁移率比野生型菌株、TIY3菌株、TIY11菌株和TIY19菌株快。为了证实alg3破坏菌株对糖链长度的影响,以实施例1(1)所述的方法,分别检测野生型菌株、TIY3菌株、TIY11菌株、TIY19菌株和YS134-4A菌株的转化酶。结果证实,野生型菌株、TIY3菌株、TIY11菌株、TIY19菌株和YS134-4A菌株的迁移率以该顺序增快。[实施例3]分离Δmnn1Δmnn4Δoch1营养缺陷型三重突变体细胞表面的甘露糖蛋白并分析其中所含的糖链结构
伴刀豆凝集素A是一种对含有两个或两个以上α-D-Man残基的糖链具有亲和力的凝集素,在α-D-Man中,位置C-3、C-4和C-6上的羟基未被取代。在柱子上固定伴刀豆凝集素A使得能够从酵母细胞壁多糖例如葡聚糖或壳多糖中分离出甘露糖蛋白。首先从TIY19菌株细胞分离出细胞表面的甘露糖蛋白(Peat等,J.Chem.Soc.,29(1961))。
在500-ml Sakaguchi烧瓶中装入50ml含0.3M KCl的YPAD培养基,将TIY19菌株于30℃培养24小时。通过离心收集细胞,然后将其悬浮于10ml 100mM柠檬酸钠缓冲液(pH7.0)中,在高压灭菌锅中于121℃加热1小时。冷却后,进行离心,收集上清液。在残留固体物质中再加入10ml水,以与上述相同的方式,将混合物加热并离心收集上清液。所有提取物合并后,加入3倍体积的乙醇。将所得的白色沉淀干燥后溶于用于伴刀豆凝集素A(ConA)柱的缓冲液(含有0.15M氯化钠和0.5mM氯化钙的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2))。将所述溶液加样到ConA-琼脂糖柱(0.6×2cm,HONENCORPORATION)。用ConA柱用缓冲液洗涤后,用含有0.2M α-甲基甘露糖苷的ConA柱用缓冲液进行洗脱。所得的流分透析后冻干,由此获得甘露糖蛋白。
接下来,用酶处理所获得的甘露糖蛋白,切下Asn-联糖链。也就是说,将冻干样品溶于100μlN-糖苷酶F用缓冲液(含有0.5% SDS和0.35% 2-巯基乙醇的0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH8.0))中,然后煮沸5分钟。将所述产物冷却至室温,然后加入50μl 7.5% Nonidet P-40、138μl H2O以及12μl N-糖苷酶F(Boehringer),所述混合物于37℃处理16小时。用BioRad AG501-X8柱脱盐后,加入等体积的苯酚∶氯仿(1∶1)并剧烈振动,由此去除表面活性剂和蛋白质。于是,获得糖链制品。
所得糖链经过以下操作,以便进行荧光标记(吡啶基氨基化,称为PA(“吡啶基氨基化”下文简称为“PA”))。所述糖链制剂浓缩至干后,加入40μl偶联剂(552mg 2-氨基吡啶的200μl乙酸溶液)。所述混合物密封后于90℃处理60分钟。冷却至室温后,加入140μl还原剂(200mg硼烷-二甲胺络合物的50μl H2O和80μl乙酸的溶液)。所述混合物密封后于80℃处理80分钟。反应后,将200ml氨水加入到反应混合物中,然后再加入等体积的苯酚∶氯仿(1∶1)。剧烈振荡所述混合物后,收集含PA-寡糖的水层。所述方法重复7次,去除未反应的2-氨基吡啶。上清液通过0.22μm滤膜过滤,于是,获得PA-寡糖制品。
根据PA-寡糖的链长,采用酰胺柱的HPLC可以分离PA-寡糖。用TSKGel酰胺-80(4.6×250mm,Tosoh)作为柱子。将200mM乙酸-三乙胺缓冲液(pH7.0)和乙腈的混合溶液(35∶65,溶剂A)以及200mM乙酸-三乙胺缓冲液(pH7.0)和乙腈的混合溶液(50∶50,溶剂B)制成溶剂。
预先以流速为1.0ml/分钟,流过溶剂A来平衡柱子。紧接样品注入后,在25分钟内,将溶剂B的比例线性增加至50%。然后以50∶50固定比例流过溶剂A和溶剂B达5分钟,由此洗脱PA-寡糖。结果示于图6中。用酰胺柱,Δoch1Δmnn1Δmnn4营养缺陷型三重突变体TIY19菌株产生的甘露糖蛋白的糖链主要表现出一个峰。该峰相当于Man8GlcNAc2-PA标准品(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)的洗脱位置。这说明,TIY19菌株产生的甘露糖蛋白中加入了Man8GlcNAc2高甘露糖型糖链。[实施例4]将α-甘露糖苷酶I基因导入Δoch1Δmnn1Δmnn4营养缺陷型三重突变体中
为了在酵母中生物合成更接近于哺乳动物型糖链结构的糖链,可以将α-甘露糖苷酶I(α-1,2-甘露糖苷酶)基因(它控制其起始反应)导入营养缺陷型三重突变体中表达。导入菌株可以生物合成Man5GlcNAc2糖链,该糖链是哺乳动物杂合型糖链或高甘露糖型糖链进一步缩短的复合型糖链的前体。
用源自斋藤曲霉的α-1,2-甘露糖苷酶的ER-挽回型表达质粒pGAMH1(已报道所述质粒具有表达能力(Chiba等,J.Biol.Chem.,273,26298-26304(1998))通过乙酸锂方法转化TIY19菌株。作为对照,使用仅从不含α-1,2-甘露糖苷酶基因的载体pG3制备的转化子。转化后,将细胞涂布于含有SD-Trp培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无色氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。所得的转化子称为TIY19pGAMH1。
如同实施例3一样,从所得转化子制备糖链,进行HPLC分析。
用酰胺柱的分析结果示于图7中。对照载体转化的样品仅主要表现出如同实施例3一样的一个峰(图7,a),所述峰相当于Man8GlcNAc2-PA标准品(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)的洗脱位置。另一方面,含有α-1,2-甘露糖苷酶基因的TIY19pGAMH1主要表现出四个峰(图7,b)。按照洗脱速度即从最快至最慢,4个峰相当于Man5GlcNAc2-PA标准品、Man6GlcNAc2-PA标准品、Man7GlcNAc2-PA标准品和Man8GlcNAc2-PA标准品的洗脱位置。这些糖链称为人高甘露糖型糖链。
接下来,收集最快洗脱的Man5GlcNAc2-PA流分,然后经过反相柱。
采用反相柱的HPLC能够根据PA-寡糖结构分离出PA-寡糖。将TSKGel ODS-80TM(4.6×150mm,Tosoh)用作柱子,100mM乙酸铵缓冲液(pH4.0,溶剂A)以及含0.5% 1-丁醇的100mM乙酸铵缓冲液(pH4.0,溶剂B)制备为溶剂。
预先以流速为1.2ml/分钟,流过溶剂A和溶剂B的混合物(95∶5)来平衡柱子。紧接样品注入后,在20分钟内,将溶剂B的比例线性增加至50%,由此洗脱PA-寡糖。结果示于图8中。用反相柱所收集的糖链流分主要表现出一个峰(图8,a),该峰相当于具有下式(III)表示的结构的Man
5GlcNAc
2-PA标准品(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)的洗脱位置:
其中Man代表甘露糖,GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺,#代表GnT-I作用位点(图8,b)。说明,TIY19pGAMH1菌株产生的甘露糖蛋白含有Man
5GlcNAc
2糖链,该糖链是杂合型和复合型的前体。[实施例5]杂合型糖链(GlcNAcMan
5GlcNAc
2)标准品的合成
首先,为了证实并检测杂合型糖链(GlcNAcMan5GlcNAc2)的生物合成,体外进行GnT-I酶反应,以合成目的糖链。GnT-I的底物特异性非常严格,并且已知GnT-I通过β-1,2-键只将GlcNAc转移到式(III)表示的糖链结构的位置#上的甘露糖残基上。
大鼠GnT-I基因在酵母中的表达已由Yoshida等完成(Yoshida等,Glycobiology,9,53-58(1999))。将该基因与多拷贝质粒pG3的GAP-DH启动子的下游连接后,在SmaI-NaeI处切割,切下含有启动子、启动子下游GnT-ORF和终止子的区域。然后将该片段导入多拷贝质粒pYO354的SmaI位点中。该质粒称为pYOG4。应用乙酸锂方法,使用该质粒转化野生型酵母YPH500菌株。转化后,将细胞涂布于含有SD-Trp培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无色氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。所得的转化子称为YPH500/pYOG4。
在500ml SD-Trp(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无色氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))溶液中,所述转化子经过液体培养后将其收获。用冷水洗涤后,将细胞悬浮于5.7mlSpheroplast培养基(含1M山梨糖醇的50mM磷酸钾(pH7.5))中。将9μl 2-巯基乙醇和12mg酶解酶100T溶于300μl Spheroplast培养基中,然后加入到细胞悬浮液中。所得的混合物于30℃加热45分钟。加入1M山梨糖醇(15ml)后,将混合物离心。此后,再次用15ml 1M山梨糖醇洗涤沉淀,然后收获。向该沉淀中,加入4ml裂解缓冲液(含有250mM山梨糖醇、2μg/ml抗蛋白酶、2μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂、3μg/ml亮抑蛋白酶肽、3μg/ml胃蛋白酶抑制剂、1mM苯甲脒、1mM EDTA、1mM EGTA和1mM PMSF的10mM三乙醇胺(pH7.2)溶液)。细胞经匀浆器破坏,以220×g离心后回收上清液。该上清液再以100,000×g离心后,将沉淀部分悬浮于150μl裂解缓冲液中。于是,获得GnT-I酶溶液。在该标准品中没有发现其它GnT活性。
然后合成目的糖链。将PA-标记的Man5GlcNAc2糖链(购自TAKARA SHUZO CO.,LTD.)用作受体底物,以各200pmol的量装入试管中。试管内容物蒸发至干后,在所述试管中,加入8.2μl上述制备的GnT-I酶溶液、2μl 0.2M MnCl2和9.8μl GnT-I反应缓冲液(0.17M MES(pH6.0)、1.7% Triton X-100、0.34%牛血清白蛋白、8.47mMAMP、1.69mM UDP-GlcNAc和169mM GlcNAc),于37℃温育3小时。通过煮沸5分钟终止所述反应。然后,反应混合物通过0.22μm滤膜过滤后进行HPLC。
将TSKGel ODS-80TM(4.6×250mm,Tosoh)用作柱子,含0.15%1-丁醇的100mM乙酸铵缓冲液(pH6.0)用作溶剂。预先以流速为1.2ml/分钟,流过所述溶剂来平衡柱子。加入样品后,洗脱PA-寡糖。结果示于图9中。用反相柱所述反应产物主要表现出两个峰,较快的洗脱峰相当于Man5GlcNAc2-PA标准品(TAKARA SHUZO CO.,LTD.,其结构示于式(III))的洗脱位置。于是,认为是未反应的受体底物。
另一方面,收集较慢的洗脱峰,纯化后,采用TOF-MS进行质量分析。采用LASERMAT2000(ThermoQuest)和含2.5% 2,5-二羟基苯甲酸和40%乙腈的0.01%磷酸二钠作为基质来进行分析。结果表明,峰流分的质量相当于预期分子量(m/z=1521(H
+);m/z=1541(Na
+))。因为GnT-I的严格底物特异性,所以认为所得型糖链是具有下式(IV)表示的结构的目的杂合型糖链GlcNAcMan
5GlcNAc
2:
其中Man代表甘露糖,GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺。[实施例6]将α-甘露糖苷酶I基因和GnT-I基因导入Δoch1Δmnn1Δmnn4营养缺陷型三重突变体中
为了在酵母中生物合成杂合型糖链,可以进一步将GnT-I基因导入实施例4中制备的酵母菌株表达。导入菌株可以生物合成哺乳动物杂合型GlcNAcMan5GlcNAc2糖链。
在SmaI-NaeI处对实施例4使用的源自斋藤曲霉的α-1,2-甘露糖苷酶的ER-挽回型表达质粒pGAMH1(Chiba等,J.Biol.Chem.,273,26298-26304(1998))进行切割,以切下含有启动子、所述启动子下游的α-1,2-甘露糖苷酶ORF和终止子的区域。然后将该片段导入pYOG4的SmaI位点中。该质粒称为pYOMG4。应用乙酸锂方法,使用该质粒转化TIY19菌株。作为对照,使用仅用pYO354转化的TIY19菌株。转化后,将细胞涂布于含有SD-Trp培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无色氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。所得的转化子称为TIY19pYOMG4。
已导入α-甘露糖苷酶I基因和GnT-I基因以产生杂合型糖链的所述营养缺陷型三重突变体TIY19pYOMG4菌株已于1999年7月2日国际保藏于国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3,Higashi,TsukubaIbaraki),保藏号FERM BP-6775。
如同实施例3一样,从所产生的转化子制备糖链,以进行HPLC分析。
用酰胺柱的分析结果示于图10中。如同实施例3的结果一样,对照载体转化的样品仅主要表现出一个峰,所述峰相当于Man8GlcNAc2-PA标准品(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)的洗脱位置(图10,A)。含有α-1,2-甘露糖苷酶基因和GnT-I基因的TIY19pYOMG4主要表现出五个峰(图10,B)。这五个峰中,其中四个峰(图10,B;a、c、d和e峰)相当于Man5GlcNAc2-PA标准品、Man6GlcNAc2-PA标准品、Man7GlcNAc2-PA标准品和Man8GlcNAc2-PA标准品的洗脱位置。这些糖链称为人高甘露糖型糖链。此外,出现了一个新的峰(图10,B;b峰),当仅导入α-1,2-甘露糖苷酶基因时没有发现所述峰。该峰的洗脱位置相当于实施例5中制备的杂合型GlcNAcMan5GlcNAc2糖链标准真实样品的洗脱位置。此外,收集对应于该峰的流分,经过与实施例3一样的反相柱。柱子、溶剂和条件均按照实施例5所述的柱子、溶剂和条件。用反相柱所收集的糖链流分主要表现出一个峰(图11),并且该峰又相当于GlcNAcMan5GlcNAc2-PA标准品的洗脱位置。因此,清楚地表明,TIY19pYOMG4菌株产生的甘露糖蛋白含有杂合型GlcNAcMan5GlcNAc2糖链。[实施例7]人肝α-甘露糖苷酶II在酵母中的表达
α-甘露糖苷酶II是一种在高尔基体中使杂合型糖链转化成单链复合型糖链的酶。
人肝α-甘露糖苷酶II基因的核苷酸序列注册于GenBank数据库,登录号U31520(Misago等,Proc.Natl.Acad.Sci.,92,11766-11770(1995))。采用人肝Marathon-Ready cDNA(Clontech)为模板,用引物M(CGCCGCCGAGCTCTAAAAAAATGAAGTTAAGCCGCC:SEQID NO:13)和引物N(ATCCCACCACTTTGAAAGGT:SEQ ID NO:14),通过PCR扩增编码α-甘露糖苷酶II N-末端区域的部分,用引物O(GAAGACTCACGGAGGAAGTT:SEQ ID NO:15)和引物P(ATGGCGGTATATGTGCTCGA:SEQ ID NO:16),通过PCR扩增编码中心区域的部分,用引物Q(CGCAGTTTGGGATACAGCAA:SEQID NO:17)和引物R(ATTATTATTAGCGGCCGCCCCTCAACTGGATTCG:SEQ ID NO:18),通过PCR扩增编码C-末端区域的部分。将所得的DNA片段导入pCRScript的SrfI位点中。证实该序列后,在BglII位点进行重组,以制备编码所有区域的适宜序列。该质粒称为pCRMAN2。
为了证实目的蛋白质的表达,制备这样的基因:在所述基因中,将编码流感病毒血细胞凝集素表位的30bp HA标志与α-甘露糖苷酶II基因3’-末端连接,如此重复三次,由此构建载体。也就是说,化学合成包含序列S(SEQ ID NO:19)的双链DNA,并将其导入表达质粒pYEX-BX的BamHI位点知EcoRI位点之间。该质粒称为pYEX-BX-3HA。接下来,在pCRMAN2的BamRI知FcoRI处切下编码α-甘露糖苷酶II的部分,并将其导入pYEX-BX-3HA的SacI位点和NotI位点之间。该质粒称为pYEMAN2-HA。
为了提高酵母中的表达水平,用在酵母中编码α-1,6-甘露糖基转移酶基因的跨膜区取代编码α-甘露糖苷酶II跨膜区的部分。也就是说,化学合成包含序列T(SEQ ID NO:20)的双链DNA,并将其***pBluescript的SacI位点和EcoRI位点之间。该质粒称为pBOCH1。相比之下,采用pYMAN2-HA为模板,采用引物U(TTAGACTACCCATGGAACCCGCGCCGCGAGGGCTCCTTC:SEQID NO:21)和引物V(CAGGAGAACTTTGGTTCGAAAAAGCTTTGACTTCTT:SEQ IDNO:22),扩增编码α-甘露糖苷酶II中的催化区部分。对该序列进行证实,然后在NcoI和HindIII处切割,将其***pBOCH1的NcoI位点和HindIII位点之间。切下该质粒SacI知PstI之间的一个片段,用pYEMAN2-HA的SacI知PstI之间的片段取代。该质粒称为pYEOM2-HA。
用酿酒酵母野生型酵母YPH500作为宿主,应用乙酸锂方法进行转化。用pYEX-BX-3HA作为对照。转化后,将细胞涂布于含有SD-Ura培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、无尿嘧啶的核碱基和氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。
在SD-Ura培养基中于30℃培养所述转化酵母至OD660=0.8。然后加入适量硫酸铜,将混合物再培养2小时。收获后,在SDS样品缓冲液中用玻璃珠破坏细胞。用所得的细胞提取物进行蛋白质印迹分析。在蛋白质印迹分析中,将大鼠抗HA抗体用作第一抗体,而将抗大鼠IgG抗体-过氧化物酶复合物用作第二抗体,采用Super SignalUltra为底物,通过对X光胶片曝光,进行检测。结果表明,对照中全部没有观察到信号,用pYEOM2-HA转化的细胞提取物中于分子量为约140,000的位置观察到信号。
接下来,将实施例5中制备的杂合型糖链(其结构示于式(IV))用作底物,测定α-甘露糖苷酶II的酶活性。将样品试管中的杂合型糖链(100pmol,其结构示于式(IV))干燥,然后在所述试管中加入各2μl的0.2M MnCl
2、1M GlcNAc和1M乙酸钠缓冲液(pH5.6)和8μlH2O。此后,加入8μl细胞提取物起始酶反应。反应混合物于37℃加热过夜,然后煮沸终止反应。将该混合物离心,以去除不溶部分,然后经HPLC进行分析。在实施例5使用条件下,进行HPLC分析。结果表明,当将表达α-甘露糖苷酶II的酵母细胞提取物用作酶源时,与对照相比,对应于40分钟洗脱点的峰显著增加(图13,B)。40分钟的峰相当于由式(V)代表的单链复合型糖链的洗脱位置(Oguri等,J.Biol.Chem.,272,22721-22727(1997)):
其中Man代表甘露糖,GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺,所述糖链得自PA-糖链标准品(PA-糖链022,TAKARA SHUZO CO.,LTD.)的酶消化,由此证实,所述峰相当于α-甘露糖苷酶II活性。[实施例8]制备导入产生双链复合型糖链必需的基因的营养缺陷型三重突变体
Yoshida等已经报道在酵母中表达人GnT-II(Yoshida S.等,Abstracts of the meeting on Yeast Cell Biology,第279页,Cold SpringHarbor Laboratory(1997))。于表达载体pSY114-GnT-II的XbaI处切下含有启动子的GnT-II基因区,将其***到pBluescript SK的XbaI位点中。该质粒称为pBlueGT2。接下来,在实施例6所述质粒pYOG4的BamHI和XbaI处切下含有启动子的GnT-I基因区,将其***到pBlueGT2的BamHI位点和XbaI位点中。于该质短的BssHII处切下目的片段,通过DNA T4聚合酶制成平端,然后将其***到具有ADE2标记的pASZ10质粒的SmaI位点中(Stotz和Linder,Gene,95,91-98(1990))。该质粒称为pASZGN12。将pASZGN12于HpaI处线性化,应用乙酸锂方法转化实施例1中制备的营养缺陷型三重突变体TIY19菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Ade培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、无腺嘌呤的核碱基和氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的ADE2区中掺入GnT-I基因和GnT-II基因。该转化子称为YCY22菌株。用YCY22菌株的细胞提取物测定相应的酶活性,由此证实GnT-I和GnT-II的表达。
另一方面,上述Yoshida等还报道在酵母中表达人β-1,4-GalT(Yoshida S.等,Abstracts of the meeting on Yeast Cell Biology,第279页,Cold Spring Harbor Laboratory(1997))。于表达载体pGalT13C的SalI知XhoI处切下含有启动子的β-1,4-GalT基因区,将其***到pRS403的SalI位点和XhoI位点中。该质粒称为pRSGAL1。Kainuma等已经报道在酵母中表达人UDP-Gal转运蛋白(Ugt2p)(Kainuma等,Glycobiology,9,133-141(1999))。于表达所述基因(UGT2)的质粒YEp352-GAP-UGT2的BamHI处切下含有启动子的基因区,将其***到pRSGAL1的BamHI位点中。该质粒称为pRSGATP1。于NdeI处将pRSGATP1线性化,应用乙酸锂方法转化YCY22菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-His培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无组氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的HIS3区中掺入β-1,4-GalT基因和UGT2基因。该转化子称为YCY42菌株。用YCY42菌株的细胞提取物测定相应的酶活性,由此证实β-1,4-GalT和Ugt2p的表达。
接下来,从用于表达人肝α-甘露糖苷酶II的载体pYEOM2-HA的SacI和SphI处切下含有HA标志的基因片段,通过DNA T4聚合酶将其制成平端。将该片段***到pAUR123的SmaI位点中。证实该片段与其右方向的启动子连接后,于BamHI处切下含有启动子的α-甘露糖苷酶II基因区,将其***到pRS406的BamHI位点中。将该质粒于NdeI处线性化,应用乙酸锂方法转化YCY42菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Ura培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、无尿嘧啶的核碱基和氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的URA3区中掺入所述基因。该转化子称为YCY52菌株。用YCY52菌株的细胞提取物测定所述酶活性,由此证实α-甘露糖苷酶II的表达。
实施例4所述的表达α-1,2-甘露糖苷酶的载体pGAMH1的NaeI和SmaI处切下含有启动子区的α-1,2-甘露糖苷酶基因片段,将其***到pY0325载体的SmaI位点。该质粒称为pYOM5。进一步导入使底物转运到高尔基体上必需的UDP-GlcNAc转运蛋白基因。Ishida等已经报道在酵母中表达人UDP-GlcNAc转运蛋白基因(Ishida等,J.Biochem.,1261,68-77(1999))。采用该表达载体为模板,用引物W(AGAGCGGCCGCAAAATGTTCGCCAACCTAA;SEQ ID NO:23)和引物X(TTTTGTCGACTAGACGCGTGAAGCATGCCC:24),通过PCR扩增UDP-GlcNAc转运蛋白基因区。证实该序列后,在NotI和SalI处切割,用pG3-N的NotI位点和SalI位点之间的序列取代。于该质粒的NaeI和SmaI处切下含有启动子区的UDP-GlcNAc转运蛋白基因片段,将其***到pYOM5的SmaI位点中。该质粒称为pYOMR5。应用乙酸锂方法,采用该质粒转化YCY52菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Leu培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无亮氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。该转化子称为YCY73菌株。用YCY73菌株的细胞提取物测定所述酶活性,由此证实α-1,2-甘露糖苷酶和UDP-GlcNAc转运蛋白的表达。
制备整合msdS知hUGTre12的质粒。于SmaI和NaeI处切割PGAMH,将切下的GAP启动子和msdS序列***到pRS404的PvuII位点。该质粒称为msdS-pRS404。于SmaI和NaeI处切割质粒HUGTre12-pG3(GAP启动子下游***hUGTre12的质粒),切下GAP启动子和hUGTre12序列,以***到msdS-pRS404的Pst I位点。该质粒称为HM-pRS404。于TRP1中的BstX I处切割HM-pRS404,应用乙酸锂方法将其用来转化YCY42菌株。该转化子在5ml YPAD+0.3M KCl中于30℃培养2天,并通过PCR证实所述转化子的染色体TRP1中掺入msdS知hUGTre12。用所述转化子的细胞提取物测定所述酶活性,由此证实两个菌株中的α-1,2-甘露糖苷酶和UDP-GlcNAc转运蛋白的表达。YCY42菌株中已整合msdS知hUGTre12的菌株称为TIY63菌株。
此外,从表达人肝α-甘露糖苷酶II的载体pYEOM2-HA的SacI和SphI处切下含有HA标志的基因片段,通过DNA T4聚合酶将其制成平端。将该片段***到pAUR123的SmaI位点中。证实该片段与其右方向的启动子连接后,于BamHI处切下含有启动子的α-甘露糖苷酶II基因区,将其***到pRS406的BamHI位点中。将该质粒于NdeI处线性化,应用乙酸锂方法将其转化TIY63菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Ura培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、无尿嘧啶的核碱基和氨基酸混合物的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的URA3区中掺入所述基因。该转化子称为MSY3菌株。用MSY3菌株的细胞提取物测定所述酶活性,由此证实α-甘露糖苷酶II的表达。[实施例9]已经导入产生双链复合型糖链必需的基因的营养缺陷型四重突变体的制备
首先,将实施例8中制备的质粒pASZGN12于HpaI处线性化,应用乙酸锂方法将其转化实施例2中制备的营养缺陷型四重突变体YS134-4A菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Ade培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、无腺嘌呤的核碱基和氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的ADE2区中掺入GnT-I基因和GnT-II基因。该转化子称为YCY122菌株。用YCY122菌株的细胞提取物测定相应的酶活性,由此证实GnT-I和GnT-II的表达。
接下来,将实施例8中制备的质粒pRSGATP1于NdeI处线性化,应用乙酸锂方法将其转化YCY122菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-His培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无组氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的HIS3区中掺入β-1,4-GalT基因和UGT2基因。该菌株称为YCY142菌株。用YCY142菌株的细胞提取物测定相应的酶活性,由此证实β-1,4-GalT和Ugt2p的表达。
此外,应用乙酸锂方法,用实施例8中制备的质粒pYOMR5转化YCY142菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Leu培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无亮氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。该转化子称为YCY163菌株。用YCY163菌株的细胞提取物测定所述酶活性,由此证实α-1,2-甘露糖苷酶和UDP-GlcNAc转运蛋白的表达。
评价所述YCY163菌株的凝集素染色性,以便观察酵母细胞表面甘露糖蛋白糖链结构的变化。已知伴刀豆凝集素A与特定的含有三个甘露糖残基的高甘露糖型糖链、杂合型糖链、双链复合型糖链等结合,其对高甘露糖型糖链的亲和力比对杂合型糖链和双链复合型糖链的亲和力高。将德克萨斯红标记的伴刀豆凝集素A溶液与收获的酵母细胞混合后,让其于4℃放置2小时,放置期间不时搅拌。反应产物先用PBS洗涤,然后用含10mMα-甲基甘露糖苷的PBS洗涤,最后在荧光显微镜下进行观察。结果表明,甚至洗涤后,荧光依旧染色YS134-4A菌株细胞的外周,然而,在YCY163菌株的细胞外周上发现的荧光明显减少。这说明,YCY163菌株产生复合型糖链的同时,高甘露糖型糖链减少。[实施例10]用能够产生哺乳动物型糖链并修饰糖链结构的酵母突变体产生人成纤维细胞生长因子(FGF)
FGF6-1嵌合基因(secFGF(N35))由国立生命科学和人体技术研究所的Atsuko Yoneda(Yoneda等,BioTechniques,27,576-590(1999))惠赠。于SmaI和NaeI处切割secFGF(N35)/pBS,切下FGF,将其***到pGEM2-α36的HindIII位点中。该质粒称为pFGFα23。于EcoR I处切割pFGFα23,并切下前原α-因子和FGF区,将其***到pUC119质粒的EcoR I位点中。该质粒称为FGF-pUC119。为了去除α-因子的EAEA序列,用引物Y(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC:SEQID NO:25)和引物Z(ATGGGCCGGCTCTTTTATCCAAAGATAC:SEQ ID NO:26),通过PCR进行扩增。在pUC18的EcoR I位点中掺入该DNA片段,制备pAF02质粒。于Nae I知Sma I处切割pFGF01,以切下FGF,然后***到pAF02的Nae I位点和Sma I位点中。该质粒称为pAF03。于EcoR I处切割pAF03,并切下前原α-因子和FGF区,将其掺入到YEp352GAP质粒的GAP启动子下游,制备质粒pAFF2。于Aat II和Hpa I处切割pAFF2,并切下2μm区域,以构建用于整合酵母的质粒pAFF3。随后,于ApaL I和Acc I处切割pAFF3,切下GAP启动子和FGF的序列,将其***到含有LEU2标记的质粒pY0325的PvuII位点中。又在Spe I处切割该持粒的2μm区域,并取出。该质粒称为pAFF9。于EcoR V处切割pAFF9使其线性化,应用乙酸锂方法将其转化酵母(TIY19菌株、YCY42菌株)。转化后,将细胞涂布于含有SD-Leu培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、核碱基和无亮氨酸的氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得相应的转化子。
将这些转化子在5ml YPAD+0.3M KCl中于30℃培养3天。将50μl柱床体积的肝素-琼脂糖悬液(Pharmacia)加入到培养上清液中,所述混合物于4℃振荡过夜,以使FGF吸附在肝素-琼脂糖上。此后,通过离心回收肝素-琼脂糖,在SDS样品缓冲液中煮沸后,上清液进行SDS-PAGE。采用抗FGF抗体进行蛋白质印迹法,以证实FGF表达。此外,通过PCR证实在染色体的LEU2中掺入FGF。TIY19菌株中已整合FGF的菌株称为TIY48菌株,YCY42菌株中已整合FGF的菌株称为TIY49菌株。
为了稳定而有效地表达所述蛋白质,制备整合msdS的质粒。于EcoR I处切割已经在GAP启动子下游***msdS的质粒pGAMH,以制备去除2μm区域的质粒。该质粒称为pImsdS。在TRP1中的XbaI处切割pImsdS后,应用乙酸锂方法将其转化TIY48(Δmnn1∷hisGΔmnn4∷hisGΔoch1∷hisG FGF∷LEU2)和TIY49(Δmnn1∷hisGΔmnn4∷hisGΔoch1∷hisG FGF∷LEU2 ade2∷[GnT-I & GnT-II]his3∷[β-1,4-GalT & UGT2])。所得的各种转化子在5ml YPAD+0.3MKCl中于30℃培养3天。将50μl肝素-琼脂糖(Pharmacia)加入到培养液中,所述混合物于4℃振荡过夜,以使FGF吸附在肝素-琼脂糖上。此后,回收肝素-琼脂糖。然后,采用抗FGF抗体进行蛋白质印迹法,以证实msdS表达。此外,通过PCR证实在染色体的TRP1中掺入msdS。TIY48菌株中已整合msdS的菌株称为TIY53菌株,YCY49菌株中已整合msdS的菌株称为TIY54菌株。
制备整合msdS和hUGTre12的质粒。于Sma I和Nae I处切割PGAMH,切下GAP启动子和msdS序列,将其***到pRS404的PvuII位点中。该质粒称为msdS-pRS404。于Sma I和Nae I处切割在GAP启动子下游***hUGTre12的质粒hUGTre12-pG3,将切除的GAP启动子和hUGTre12序列***到msdS-pRS404的Pst I位点中。该质粒称为HM-pRS404。于TRP1中的BstX I处切割HM-pRS404,应用乙酸锂方法将其用来转化TIY48菌株和TIY49菌株。将每种转化子在5ml YPAD+0.3M KCl中于30℃培养3天。将50μl柱床体积的肝素-琼脂糖悬液(Pharmacia)加入到培养上清液中,所述混合物于4℃振荡过夜,以使FGF吸附在肝素-琼脂糖上。此后,通过离心回收肝素-琼脂糖,在SDS样品缓冲液中煮沸后,上清液进行SDS-PAGE。采用抗FGF抗体进行蛋白质印迹法,以证实FGF表达。此外,通过PCR证实染色体的TRP1中掺入msdS知hUGTre12。用细胞提取物测定所述酶活性,由此证实两个菌株中的α-1,2-甘露糖苷酶和UDP-GlcNAc转运蛋白的表达。TIY48菌株中已整合msdS和hUGTre12的菌株称为TIY59菌株,TIY49菌株中已整合msdS和hUGTre12的菌株称为TIY60菌株。
为了制备糖链,用染色体的LEU2中已整合FGF的TIY48菌株和TIY53菌株从3L培养液中纯化FGF。在3L YPAD+0.3M KCl中于30℃培养3天后,将2ml肝素-琼脂糖加到通过离心去除细胞的培养液中。所述混合物于4℃振荡过夜,以使FGF吸收附在肝素-琼脂糖上。回收肝素-琼脂糖,然后装入柱子中。用PBS+0.01% CHAPS和PBS+2.5M NaCl+0.01% CHAPS作为溶剂,通过增加盐浓度,从肝素-琼脂糖中洗脱FGF。
使约150μg纯化FGF经过反相柱脱盐。将μRPC C2/C18 PC3.2/3柱(Pharmacia)用作柱子,0.1%三氟乙酸和0.1%三氟乙酸-60%乙腈用作溶剂,以从反相柱进行洗脱。
将从所述柱子中洗脱的样品干燥后,进行肼解。在真空状态下加入2ml肼,该混合物于110℃处理60分钟。此后,让混合物冷却至室温,以进行N-乙酰化。加入250μl 0.2M乙酸铵和25μl乙酸酐,充分搅拌混合物后,让其在室温下放置30分钟。然后,又加入250μl0.2M乙酸铵和25μl乙酸酐,充分搅拌混合物后,让其在室温下放置30分钟。所述反应溶液浓缩至干后制成糖链制品。
将所获得的糖链进行以下操作以进行荧光标记(吡啶基氨基化)。所述糖链制品浓缩至干后,加入20μl偶联剂(300mg 2-氨基吡啶的100μl乙酸溶液)。将混合物密封后于90℃处理60分钟。此后,加入20μl还原剂(10mg硼烷-二甲胺络合物的50μl乙酸溶液)。将混合物密封后于80℃处理60分钟。反应后,加入20μl三乙胺-甲醇并彻底搅拌。此后,加入40μl甲苯并彻底搅拌。在氮气流下,将混合物于60℃浓缩至干达10分钟。此后,在反应溶液中加入20μl甲醇并彻底搅拌。然后,在该反应溶液中加入40μl甲苯并彻底搅拌。在氮气流下,将混合物于60℃浓缩至干达10分钟。这一流程重复三次。将50μl甲苯加到残余物中,在氮气流下,于60℃浓缩至干达10分钟。反应后,进行HW-40凝胶过滤柱处理,以去除未反应的2-氨基吡啶。
采用氨基柱通过HPLC分析糖链结构。Asahipak NH2P-50(4.6mm×250mm)用作柱子,将200mM乙酸-三乙胺缓冲液(pH7.3)和乙腈的混合溶液(7∶3,溶剂A)以及200mM乙酸-三乙胺缓冲液(pH7.3)和乙腈的混合溶液(2∶8,溶剂B)制成溶剂。
预先以流速为1.0ml/分钟,流过溶剂A来平衡柱子。紧接样品注入后,在50分钟内,使溶剂B的比例线性增加至100%,然后保持其比例为100%时,流过溶剂B达20分钟,由此洗脱PA-寡糖。分析结果示于图14中。如同实施例2的结果一样,得自TIY48的样品主要表现出一个峰(图14,顶部),该峰相当于Man8GlcNAc2-PA标准品(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)的洗脱位置。同时,含有α-1,2-甘露糖苷酶基因的TIY53菌株主要表现出一个峰(图14,底部)。该峰相当于Man5GlcNAc2-PA标准品的洗脱位置。这说明,FGF(它是TIY53菌株中表达的人糖蛋白)具有Man5GlcNAc2糖链,该糖链是接近于100%杂合型糖链和复合型糖链的前体。
此外,从用于表达人肝α-甘露糖苷酶II的载体pYEOM2-HA的SacI和SphI处切下含有HA标志的基因片段,通过DNA T4聚合酶将其制成平端,然后将该片段***到pAUR123的SmaI位点中。证实该片段与其右方向的一个启动子连接后,于BamHI处切下含有启动子区的α-甘露糖苷酶II基因区,将其***到pRS406的BamHI位点中。将该质粒于NdeI处线性化,应用乙酸锂方法转化TIY60菌株。转化后,将细胞涂布于含有含0.3M KCl的SD-Ura培养基(2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱w/o氨基酸(Difco)、无尿嘧啶的核碱基和氨基酸的混合物(20-400mg/L))的平板上,于30℃培养2天获得转化子。用所述转化子制备基因组DNA,并通过PCR证实在染色体的URA3区中掺入所述基因。该转化子称为MSY1菌株。用MSY1菌株的细胞提取物测定所述酶活性,由此证实α-甘露糖苷酶II的表达。
Secretary of Agency of Industrial Science and Technology<120>新型酵母变异体以及制备含哺乳动物型糖链的糖蛋白的方法<130>PH-1034-PCT<160>26<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>1GGATCCGAAG AAAACCTAAT ACATTGAAGT 30<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>2GCATGCCCTT TGGTTTAATA TAAATCTCCG GAGTGC 36<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>3GCATGCTACA TAACTCCAAT CAGCAGCAAA TATGTC 36<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>4GCGGCCGCGT GTTCTGTTCG GGTAACGTTT AAACCAAT 38<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>5AGATGCATAC TAGTGGGCCC ATTGTGATTG GAAT 34<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>6CCCCCGAATT CGTGTGAAGG AATAGTGACG 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>30<223>人工序列描述:合成DNA<400>7CCCCCGAATT CAAGTCGGAG AACCTGACTG 30<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>8ATGGGCCCAC TAGTATGCAT CTCGCGTGGC ATGG 34<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>9GCGGCCGCGA GACCTGAATC TTCGACACGC AAGAAAAA 38<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>10GAATTCGCTT TCGAACAAAA TCAAAAGGGG CATAAC 36<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>11GAATTCCTAT CCACCAAACT CACAAGCAAG CA 32<210>12<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>12GCGGCCGCCG AGAGGGTGAA CGGTGCTAAC TCAGGATT 38<210>13<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>13CGCCGCCGAG CTCTAAAAAA ATGAAGTTAA GCCGCC 36<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>14ATCCCACCAC TTTGAAAGGT 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>15GAAGACTCAC GGAGGAAGTT 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>16ATGGCGGTAT ATGTGCTCGA 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>17CGCAGTTTGG GATACAGCAA 20<210>18<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>18ATTATTATTA GCGGCCGCCC CTCAACTGGA TTCG 34<210>19<211>162<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>19GGATCCGAGC TCCACCGCGG TGGCGGCCGC ATGTTTTACC CATACGATGT TCCTGACTAT 60GCGGGCTATC CCTATGACGT CCCGGACTAT GCAGGATATC CATATGACGT TCCAGATTAC 120GCAGCTACTA GTGGGCATGC TTCACGCGTC TAGTGAGAAT TC 162<210>20<211>176<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>20GAGCTCAAAA AGAAAGCAAG TAAAAGAAAG AAGAGATCAT GTCTAGGAAG TTGTCCCACC 60TGATCGCTAC AAGGAAATCA AAAACAATAG TCGTAACCGT ACTTCTTATT TATTCTTTGT 120TGACATTTCA CTTGTCAAAC AAAAGGCTGC TTTCTCAGTT TTACCCATGG GAATTC 176<210>21<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>21TTAGACTACC CATGGAACCC GCGCCGCGAG GGCTCCTTC 39<210>22<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>22CAGGAGAACT TTGGTTCGAA AAAGCTTTGA CTTCTT 36<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>23AGAGCGGCCG CAAAATGTTC GCCAACCTAA 30<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>24TTTTGTCGAC TAGACGCGTG AAGCATGCCC 30<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>25CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成DNA<400>26ATGGGCCGGC TCTTTTATCC AAAGATAC 28