CN1367700A - 用于下调lgE的小肽和方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于下调IgE水平的方法。该方法包括以有效下调IgE的量对患者施用具有通式f－Met－Leu－X的肽,其中X选自:Tyr、Tyr－Phe、Phe－Phe、和Phe－Tyr。

Description

用于下调IgE的小肽和方法

                      发明领域

本发明涉及具有下调IgE活性的小肽，特别是N-甲酰-甲硫氨酰肽，和用于治疗由IgE介导的应答产生的指征的方法。更具体的说，这些肽可用于在使用皮质类固醇的任何应用中取代皮质类固醇。

                    发明背景

免疫球蛋白E(IgE)是人体内存在的五类抗体之一，早在30年前就已经知道它是负责***反应的免疫球蛋白。在变应原侵入人体后，由B细胞生成并分泌IgE。然而IgE只占人血清总抗体的一小部分(为50-300ng/ml，相比之下，IgG为10mg/ml)，因此它的量不足以直接中和抗原。另一方面，它的作用通过靶细胞受体得到了放大，并引起针对抗原的广泛细胞应答，在发炎、发痒、咳嗽、流泪、支气管收缩、粘液分泌、呕吐、和腹泻，即在与变应性紊乱常常有关的所有症状中达到极点。

速发型超敏反应是由在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上发现的高亲和力IgE受体Fc_εRI触发的。结合Fc_εRI结合型IgE的变应原引起细胞膜上受体分子的交联，继而触发细胞的脱粒，随后释放组胺和与变应性应答速发阶段有关的其它介质。肥大细胞脱粒的这些产物引起炎症细胞的激活，并进一步诱导低亲和力IgE受体Fc_εRII(也称为CD23)。在激活的B细胞、多种炎症细胞(巨噬细胞、嗜曙红粒细胞、血小板、天然杀伤细胞)、T细胞、小结树突细胞(follicular dendritic cell，FDC)、朗格汉斯细胞、以及骨髓和胸腺的上皮细胞上可发现Fc_εRII(Delespesse等人，免疫学进展(Adv.Immun.)49：149-190，1991；Delespesse等人，免疫学评论(Immunol.Rev.)125：78-97，1992)。在B细胞表面，Fc_εRII在依赖IgE向T细胞的抗原呈递中起作用，还在B细胞的交联中起作用。在FDC上，Fc_εRII大量表达，由此涉及募集B细胞进入***和脾中的次级滤泡生发中心。当Fc_εRII在炎症细胞上表达时，认为它负责依赖IgE的毒害细胞作用，诸如单核细胞对免疫复合物的吞噬作用。可溶性Fc_εRII(sFc_εRII)还可通过触发浆细胞、T细胞、和嗜碱性粒细胞的前体的生长和分化来发起由体液和细胞介导的免疫应答。

在B细胞分化成分泌IgE的浆细胞的过程中，涉及细胞因子和表面分子的复杂信号级联，据认为这种级联主要发生于***和脾中的次级滤泡生发中心。表面分子对于提供B细胞与T细胞和肥大细胞的物理相互作用是必需的，而这种作用又是触发IgE生成所要求的。这些表面分子是CD40配基(CD40L)和Fc_εRII。当2型T辅助细胞(Th₂)在暴露于抗原呈递细胞(APC)后而被激活时，它们瞬时表达CD40L。CD40L与B细胞上的CD40相互作用，导致B细胞的激活。激活后的Th₂细胞分泌多种细胞因子，诸如IL-4和IL-13，它们作用于激活后的B细胞使之转向IgE生成。IL-4还上调B细胞和炎症细胞上的Fc_εRII表达，为接触刺激和可溶性生长因子提供了更多来源。

肥大细胞和嗜碱性粒细胞也分泌IL-4和表达CD40L，并由此能够在存在IL-4时以与Th₂细胞相似的方式通过与B细胞的物理相互作用来诱导B细胞的IgE合成。考虑到涉及IgE生成的多种细胞类型的组织分布，皮肤、肺、和肠中也可能发生IgE合成。

IgE合成的上调和挽救生发中心B细胞免于凋亡可由B细胞膜结合型IgE与补体受体2(CR2，也称为CD21)经sFc_εRII的交联介导。CR2是在B细胞、FDC、以及有些T细胞和嗜碱性粒细胞上发现的高度糖基化的膜蛋白。sFc_εRII可通过触发B细胞上的CR2来参与IgE合成的正反馈控制，从而增强IgE合成，同时还促进IgE定型B细胞的存活。

IgE生成的激活可导致两种不同的情形。由变应原暴露引起的急性炎症自包括快速激活肥大细胞、呼吸道巨噬细胞、和支气管上皮细胞的早期反应开始，这些细胞释放促炎介质，包括组胺、类二十烷酸、血小板激活因子、无氧自由基、神经肽、和细胞因子。这些介质可诱导呼吸道平滑肌收缩、粘液分泌、和血管舒张。呼吸道炎症引起微血管渗漏增加，导致血浆渗入到呼吸道中，进而导致呼吸道管壁变厚，呼吸道内腔变窄。

在晚期反应中，外周血细胞被募集进入呼吸道，从而形成慢性炎症。这些细胞包括嗜曙红粒细胞、淋巴细胞、和单核细胞，而且募集依赖细胞因子，诸如IL-5和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMC-SF)。趋化因子，诸如RANTES和eotaxin，似乎也增强嗜曙红粒细胞的募集。在炎症位点，这些细胞被激活，而且它们的存活通过由诸如GMC-SF等因子介导的凋亡降低而获得增加。

对哮喘的治疗传统上基于该疾病的严重程度和持续时间。对于急性间歇性症状，治疗通常包括支气管舒张剂。支气管舒张剂包括β-肾上腺素能激动剂、甲基黄嘌呤、和抗胆碱能药。这些试剂可改进哮喘患者中的呼吸道阻塞，但是它们似乎在减小呼吸道炎症或支气管过度反应方面无效。在最近几年中，白三烯抑制剂已经用于治疗轻微至中等哮喘。白三烯是由花生四烯酸经5-脂肪氧化酶代谢途径产生的，且早就知道具有有力的支气管收缩特性。这些所谓的过敏反应慢速反应物质(SRS-A)还诱导多种白细胞向血管迁移、粘附、和聚集，并增加毛细血管通透性，最终引起肺部间质水肿、白细胞趋化性、粘液生成、粘液纤毛机能障碍、和支气管痉挛。特别是白三烯D₄(LTD₄)似乎主要负责呼吸道中的这种作用，并经呼吸道平滑肌细胞上的特异受体发生作用。白三烯(包括半胱氨酰白三烯)是在由IgE介导的肥大细胞脱粒过程中释放的。

白三烯抑制剂包括两种类型：一种通过抑制5-脂肪氧化酶(5-LO)的活性来阻断白三烯的合成，而这种活性是白三烯的合成所需要的；另一种竞争性阻断平滑肌细胞上的LTD₄受体。zileutin是第一种可供利用的5-脂肪氧化酶抑制剂。zafirlukast是第一种待获批准的LTD4受体拮抗剂，而其它试剂，诸如monelukast和pranlukast，目前正在进行临床试验。这些白三烯抑制剂迄今已经用于治疗轻微的持久哮喘，但是尚未证明对哮喘的更严重形式也有效。

目前采用抗炎剂来治疗哮喘中更加严重且持久的形式。分类属于抗炎剂的试剂包括茶碱、皮质类固醇、色甘酸钠、和奈多罗米钠。特别是皮质类固醇似乎在降低支气管过度反应和严重恶化方面更有效。它们通过抑制细胞因子和趋化因子的生成来遏制嗜曙红粒细胞募集，以及通过诱导嗜曙红粒细胞凋亡来发生作用。它们还作用于消除呼吸道水肿和支气管粘液溢，因此吸入型皮质类固醇是用于慢性哮喘患者的最常用治疗。吸入型皮质类固醇包括倍氯米松(beclomethasone)、9-去氟肤轻松(flunisolide)、去炎松(triamcinolone)、氟替卡松(fluticasone)、和布***(budesonide)。对于慢性哮喘，β₂-激动剂是无效的，尽管它们可暂时改善支气管阻塞。因此，最佳治疗可能是联合吸入型皮质类固醇与长期作用的β₂-激动剂。然而，皮质类固醇的潜在副作用包括口咽念珠菌病、发音困难、肾上腺遏制、儿童生长迟滞、皮肤变薄、骨质疏松、青光眼、和白内障。另外，现在还不清楚，这些皮质类固醇的“有效剂量”与“有毒剂量”之间的关系。

除了以IgE信号途径的下游事件为目标，正在开发直接干预IgE及其合成的一些治疗新策略。IgE在导致***反应的复杂网络中的中心地位提示，以消除IgE或阻断IgE结合受体为目标的疗法将有效预防所有变应性应答。虽然仍处于早期阶段，但是针对IgE的单克隆抗体的使用已经获得了一些成功。根据Fahy等人(美国呼吸和病危护理医学杂志(Am.J.Respir.Crit.Care Med.)155：1828-1834，1997)的报告，针对IgE的人源化鼠单克隆抗体降低了游离的IgE，并成功的阻断了对变应原刺激的早期和晚期应答。靶向IgE中结合Fc_εRI必需区域的抗IgE抗体不仅阻断IgE与其受体的结合，还可预防由结合于嗜碱性粒细胞上Fc_εRI的IgE与肥大细胞交联诱导的肥大细胞脱粒和过敏反应。这两种抗IgE抗体目前正在测试(MacGlashan等人，免疫学杂志(J.Immunol.)158：1438-1445，1997；Corne等人，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)99：879-887，1997)。迄今为止，它们似乎可降低血清中的IgE浓度，还可降低嗜碱性粒细胞上的Fc_εRI水平，说明通过调控IgE的循环水平可改变依赖IgE的应答。

迄今为止的治疗通常聚焦于由IgE激活产生的下游事件。因此，需要开发通过调控IgE水平来治疗由IgE介导的应答的治疗方法。已有报导，趋化肽，诸如N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸和抑胃酶肽，可抑制肥大细胞脱粒(炎症(Inflammation)5(1)：13-16，1981)。本发明的肽下调IgE水平，因而可用于调控由IgE介导的多种应答。

                     发明概述

本发明提供了使用在合适制药学载体中含有具有下调IgE活性的N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰(f-Met-Leu)肽的制药学组合物来治疗由IgE介导的应答产生的多种指征的方法。特别有用的肽是那些具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。本发明的肽可用于在使用皮质类固醇的任何应用中取代皮质类固醇。

根据本发明，用于治疗哺乳动物中由IgE介导的应答的方法包括以有效下调IgE的量对哺乳动物施用具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

本发明还提供了用于下调膜结合型和可溶性IgE受体的方法，包括以有效下调IgE受体的量对患者施用具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

本发明还提供了用于抑制浆细胞分泌IgE的方法，包括以有效抑制IgE分泌的量对患者施用具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

根据另一个实施方案，本发明提供了用于下调CD40L表达的方法，包括以有效下调CD40L的量对患者施用具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

在本发明的某些优选实施方案中，患者可受益于本发明肽与第二种活性成份的联合施用。对于本发明的这种联合施用特别有用的其它活性成份是例如抗白三烯、β₂激动剂、皮质类固醇、等等。

                       图的简述

图1是对数剂量应答曲线，图解了多种剂量的HK-X对急性哮喘小鼠中OVA特异血清IgE水平的影响。

图2显示了急性哮喘小鼠在施用50μg HK-X后的肺切片。(A)和(B)中存在有限的细胞渗入，(C)中存在有限的粘液积累。

图3显示了急性哮喘小鼠在施用10μg HK-X后的肺切片。呼吸道中存在很少的细胞(A)和(B)，粘液局限于呼吸道上皮细胞层的表面(C)。

图4显示了急性哮喘小鼠在施用1μg HK-X后的肺切片。治疗效果减小，而细胞渗入增加(A)，分泌到呼吸道中的粘液增加(B)和(C)。

图5显示了用OVA免疫的小鼠在用盐水(A)或载体(0.05％DMSO)(B)刺激后的肺切片。在呼吸道中没有检测到粘液分泌(C)。

图6是图解用于建立慢性哮喘小鼠模型的免疫和治疗方案的示意图。

图7是图解慢性哮喘小鼠肺中肉芽肿数目的柱状图。

图8显示了来自每周一次用OVA免疫达6周并用HK-X或盐水治疗的小鼠的慢性哮喘肺组织的组织学照片。(A)显示了对照小鼠的肺组织学照片，(B)显示了用HK-X治疗的小鼠的组织学照片，(C)显示了用OVA刺激但不治疗的小鼠的组织学照片。

图9显示了慢性哮喘小鼠肺组织积累胶原纤丝的光学显微照片。(A)显示了施用盐水的对照小鼠的肺切片，(B)显示了用HK-X治疗的小鼠的肺切片，(C)显示了用OVA免疫但不治疗的小鼠的肺切片。

图10显示了长期用OVA免疫并用盐水治疗的小鼠的肺切片。

图11显示了长期用OVA免疫并用载体(0.5％DMSO)治疗的小鼠的肺切片。

图12是图解慢性哮喘的组织形态计量法的柱状图。

图13是图解在多种治疗后慢性哮喘小鼠呼吸道中含粘液细胞的频率的柱状图。

图14是图解多种治疗对慢性哮喘小鼠肺中嗜曙红粒细胞和嗜中性粒细胞渗入的影响的柱状图。

图15是图解在急性哮喘小鼠模型中使用HK-X与***的免疫和治疗方案的示意图。

图16是比较鼻内施用***与HK-X对OVA特异性IgE水平的影响的柱状图。

图17是图解在急性哮喘小鼠模型中使用HK-X与对照肽的免疫和治疗方案的示意图。

                     发明详述

根据本发明，发现具有通式f-Met-Leu-X(其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr)的某些小肽具有令人惊讶的活性，即下调IgE水平。作为结果，这些肽可用于治疗由IgE介导的应答产生的多种指征。本发明的肽可用于在使用皮质类固醇的任何应用中取代皮质类固醇。

根据本发明，优选肽可降低血液IgE水平，并阻断淋巴细胞(诸如巨噬细胞、单核细胞、嗜曙红粒细胞、嗜中性粒细胞、TNF、诸如此类)的IgE激活。

在优选的实施方案中，使用本发明的肽进行治疗，还可降低或完全停止肥大细胞的连续脱粒及其释放白三烯、组胺、和其它细胞因子。根据本发明的优选实施方案，本发明的肽还可降低嗜曙红粒细胞、嗜碱性粒细胞、和嗜中性粒细胞渗入炎症组织。淋巴细胞、嗜曙红粒细胞、和嗜中性粒细胞在应答本发明的优选肽时不展示趋化性。因此，淋巴细胞、嗜曙红粒细胞、和嗜中性粒细胞向炎症位点的趋化粘附、迁移、和聚集显著降低，炎症位点的血管通透性同样降低。另外，本发明的优选化合物对重要器官(诸如心、肝、和肺)不展示毒性。

可通过传统的小肽化学合成技术来制备本发明的肽。在施用时，在无菌条件下用制药学可接受的载体或稀释剂配制这些肽。

制药学组合物可方便的以单位剂型存在，并配制用于由IgE介导的应答产生的每一种类型的待治疗指征。可通过制药学领域众所周知的任何方法制备组合物。这些方法通常包括混合本发明活性成份与包含一种或多种附属成份的载体的步骤。

例如，制药学组合物的剂量将随对象待治疗的指征类型和所用具体施用路径而变化。在治疗由IgE介导的急性应答时，活性肽的剂量范围可以为每日0.1-100,000μg/kg，更优选1-10,000μg/kg。最优选的剂量范围是大约1-100μg/kg体重，更优选大约1-20μg/kg，最优选10-20μg/kg。在治疗由IgE介导的慢性应答时，活性肽的剂量范围可以为每日0.1-100,000μg/kg，更优选1-10,000μg/kg。最优选的剂量范围是大约1-1000μg/kg体重，更优选大约1-100μg/kg，最优选50-70μg/kg。根据状况的严重程度，施用频率通常是由每日1次至每4-6小时1次。对于急性状况，优选每4-6小时1次施用肽。对于维持，可能优选每日施用1次或2次。优选的是，根据施用路径和状况的严重程度，每天施用大约0.18-大约16mg肽。只需采用常规实验法，普通技术人员就可确定用于投递特定组合物多份剂量的预期时间间隔。

施用路径包括口服、肠胃外、直肠、***内、局部、鼻、眼、直接注射、等。在优选的实施方案中，以有效下调IgE的量对患者施用本发明的肽。例示性制药学组合物是有效调控IgE的量的本发明肽，该肽可提供下调IgE的效果，且通常包含于制药学可接受的载体中。

当用于此处及下文更完整描述时，术语“制药学可接受的载体”包括适合施用于人或其它动物的一种或多种相容固体或液体填料稀释剂或包囊物质。在本发明中，术语“载体”因而指用于与本发明分子联合以便于应用的天然或合成的有机或无机成份。术语“有效调控IgE的量”指该制药学组合物的量对待治疗的特定状况产生下调IgE的效果。在掺入相同成份的组合物的配制中可使用多种浓度，以适应待治疗患者的年龄、状况的严重程度、治疗的持续时间、和施用的模式中的变化。

载体还必须是相容的。当用于此处时，术语“相容”指制药学组合物的成份能够与本发明小肽混合，而且彼此的混合方式基本上不削弱所需的制药学功效。

本发明的小肽通常以本身(纯的)进行施用。然而，它们可以制药学可接受盐类的形式进行施用。这些制药学可接受的盐类包括但不限于那些由下列酸制备的盐类：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘2-磺酸、和苯磺酸。同样，制药学可接受的盐类可制备成碱性金属或碱土盐类，诸如羧酸基团的钠、钾、或钙盐。由此，本发明提供了包含本发明肽及其一种或多种制药学可接受载体(和任选任何其它制药学成份)以用于医学用途的制药学组合物。

组合物包括那些适用于口服、直肠、***内、局部、鼻、眼、或肠胃外施用的组合物，所有这些施用路径都可用于本发明的物质。含本发明肽的制药学组合物还可包含一种或多种制药学可接受的载体，包括赋形剂，诸如稳定剂(以促进长期储存)、乳化剂、粘合剂、增稠剂、盐类、防腐剂、溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收迟滞剂、诸如此类。这些介质和试剂在制药学活性物质中的使用在本领域是众所周知的。除非与本发明肽不相容，本文涵盖任何传统介质或试剂在制药学制剂中的使用。辅助活性成份也可掺入本发明的组合物。

适用于口服施用的组合物通常配制成吸入型气雾剂、喷雾剂、糖浆、或片剂。适用于局部施用的组合物通常配制成乳膏、油膏、或溶液。对于治疗由IgE介导的急性应答，在这些组合物中肽活性成份的浓度通常低于1000μg/ml，更优选低于500μg/ml，最优选大约200-400μg/ml。对于治疗由IgE介导的慢性应答，在这些组合物中肽活性成份的浓度通常低于3mg/ml，更优选低于2mg/ml，最优选大约1-1.5mg/ml。

适用于吸入施用的本发明组合物可配制成例如气雾剂或吸入液。用于治疗由IgE介导的急性应答的典型气雾剂组合物的范例包括悬浮于三氯一氟甲烷与二氯-二氟甲烷加油酸的混合物中的大约0.1-100μg微晶肽(每剂)。组合物中微晶肽的量更优选1-50μg，最优选10-20μg(每剂气雾剂组合物)。用于治疗由IgE介导的慢性应答的典型气雾剂组合物的范例包括悬浮于三氯-氟代甲烷与二氯-二氟甲烷加油酸的混合物中的大约0.1-1000μg微晶肽(每剂)。组合物中微晶肽的量更优选1-100μg，最优选50-70μg(每剂气雾剂组合物)。典型溶液的范例包括溶解或悬浮于无菌盐水(为了溶解度需要，任选大约5％v/v二甲亚砜(DMSO))、苯扎氯铵、和硫酸(用于调pH)的预期量的肽。

适用于口服施用的本发明组合物还可配制成离散单元，诸如胶囊、扁囊、片剂、或锭剂，每一粒含有根据由IgE介导的待治疗应答预定量的本发明肽，或者可包含于脂质体中，或者作为水溶液或非水溶液中的悬浮液，诸如糖浆、酏剂、或乳剂。片剂配方基底的范例包括玉米淀粉、乳糖、和硬脂酸镁，作为无活性成份。糖浆配方基底的范例包括柠檬酸、染料、调味剂、羟丙基甲基纤维素、糖精、苯甲酸钠、柠檬酸钠、和纯净水。

适用于肠胃外施用的组合物便利的包括本发明分子的无菌水制剂，优选与接受者的血液等渗。可参照已知方法使用那些合适的分散或湿润剂和悬浮剂配制这种水制剂。无菌可注射制剂还可以是无毒性的肠胃外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中，可采用的是水、Ringer氏液、和等渗氯化钠溶液。在水溶液中，高达大约10％v/v DMSO或Trappsol可用于维持有些肽的溶解度。同样，可传统采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用许多不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸(诸如油酸或中性脂肪酸)可用于制备

已经建立了施用卵清蛋白(OVA)作为模型变应原从而在正常Balb/C小鼠中诱导急性变应原特异性肺病的方案。该方案包括第1和14天对小鼠腹膜内(IP)免疫溶于明矾佐剂的100μg OVA，第14、25、26、和27天单剂鼻内(IN)施用溶于标准盐水的50-100μg OVA。对照小鼠通过IP注射只接受明矾，通过IN施用只接受标准盐水。第28天，用OVA免疫的小鼠展示与由变应原诱导的人哮喘惊人相似的疾病。这种动物模型已经用于评价药物在变应性急性肺病中的功效。晚期慢性变应原特异性肺病的小鼠模型

施用卵清蛋白(OVA)作为模型变应原从而在正常Balb/C小鼠中诱导晚期慢性变应原特异性肺病的方案，包括第1和14天对小鼠腹膜内(IP)免疫溶于明矾佐剂的100μg OVA，第14、25、26、和27天单剂鼻内(IN)施用溶于标准盐水的50-100μg OVA，其后每周一次达6个月。对照小鼠通过IP注射只接受明矾，通过IN施用只接受标准盐水。第28天，用OVA免疫的小鼠展示与由变应原诱导的人哮喘惊人相似的疾病。这种动物模型还可用于评价药物在慢性变应性肺病中的功效。材料和方法

特殊试剂：OVA晶体由Pierce化学品公司(Rockford，IL)获得，硫酸铝钾(明矾)由Sigma化学品公司(St.Louis，MO)获得。将OVA(500μg/m1)与等体积的10％(wt/vol)明矾在蒸馏水中混合。用10NNaOH将混合物调至pH6.5，并于室温保温60分钟。将混合物以750g离心5分钟，将沉淀重悬于最初体积的蒸馏水中，并在1小时内使用。

免疫方案：免疫方案包括第1天腹膜内施用溶于明矾的100μgOVA，随后第14天腹膜内施用溶于明矾的100μg OVA，并联合鼻内施用溶于盐水的100μg OVA。第25、26、和27天，对小鼠鼻内刺激溶于盐水的100μg OVA。对于急性哮喘研究，第28天安乐处死动物并切下肺。对于慢性哮喘研究，其后每周一次免疫小鼠达6个月。分析

血清IgE的ELISA方案：用溶于50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)的OVA溶液于4℃包被Immulon2微量滴定板(DynexTechnologies)过夜，并用0.1％酪蛋白于室温(RT)封闭2小时。在与OVA包被板保温前，将所有待测血清用含0.1％酪蛋白的Tris-NaCl缓冲液(pH8.0)1∶100稀释。每一次测定中包括已知含针对OVA的IgE抗体的阳性血清样品和来自未免疫小鼠的正常血清样品作为对照。将血清样品在平板上于室温保温2小时，并用PBS清洗6次。加入适当稀释后的二抗(缀合生物素的绵羊抗小鼠IgE(Binding Site目录号PB 284，批号026917)，于室温保温2小时，并用PBS清洗平板6次。加入OPD、尿素、和过氧化物溶液，于室温保温30分钟。加入2.5M硫酸终止反应。读取490/630nm的OD。所有样品都进行双份。阳性对照的样品间和样品内变化低于平均值的10％。

肺组织学：切下肺和气管，并在10％中性缓冲的***中固定。在石蜡中包埋组织，并切成7μm切片。脱蜡和水合后，将切片用嗜曙红染色液染色，并用亚甲基蓝复染。爱茜蓝、甲苯胺蓝、和过碘酸希夫染色鉴定了呼吸道内的粘液。通过光学显微术检查组织。

支气管肺泡灌洗(BAL)：在支气管主干扎住左肺。用0.4ml标准盐水灌洗右肺3次，并合并流体。使用血细胞计数器测定细胞总数目。通过离心沉淀残余细胞，并将细胞重悬于10％BSA溶液。将细胞滴在显微镜载玻片上，并用嗜曙红染色液染色(曙红与亚甲基蓝复染)。

肺的组织形态计量法分析：在此处报告的实验中测量变应性肺病的下列参数：1.如以前的报告(Henderson等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)184：1483-1494，1996)所述，进行呼吸道栓评分。使用由+至++++的评分***，反映粘液分泌的严重程度。2.通过中型至大型呼吸道(600-1,000μm直径)中每100个上皮细胞中含粘液上皮细胞的随机计数来估计总粘液细胞。对不同肺页中的10个区域计数。3.通过使用由o至++++的评分***来估计位于血管周围区室中或呼吸道毗邻区域中的渗入细胞的细胞密度(嗜中性粒细胞、嗜曙红粒细胞、单核细胞、和淋巴细胞)。+指3-5(不含)个细胞的炎症细胞层；++指5-10个细胞的炎症密度；+++指10-20个细胞的炎症密度；++++指20-40个细胞的炎症密度。4.通过对每个高倍视野(10x by 40x)计数来量化各种细胞类型的数目。5.通过使用评估血管周围流体积累程度的评分***来计算水肿程度。

组织形态计量法数据的统计分析：使用SigmaStat 2.0版进行统计分析。通过ANOVA使用独立平均值的适当posthoc检验来分析显著性(p＜0.05)的差异。采用SigmaPlot 4.0版或GraphPad Prism进行数据图形展示的构建。

                       实施例实施例1：急性哮喘小鼠对HK-X的治疗性剂量的应答

理想的是，演示治疗性功效与药物剂量相关性的实验将显示3个独特的行为区：1)在小剂量，将没有治疗效果；2)在较大剂量，治疗功效将依赖剂量；3)在最大的第3个剂量范围，显示的治疗功效不超过最大中间范围剂量的观察结果。

剂量应答曲线是关于人类应用的剂量安全的重要信息来源。有时，当施用的药物剂量超过最佳治疗剂量时，会观察到毒性应答。在原位施用药物，诸如鼻内时尤其如此。

为了确定在用OVA重复免疫进行诱导的支气管哮喘急性效应阶段(第25、26、和27天)一定剂量范围的f-Met-Leu-Phe-Phe(HK-X)的治疗效力，选择鼻内施用0.1、1.0、10、和50μg剂量的HK-X。在用OVA刺激前30分钟施用HK-X。对照组包括用OVA免疫和用OVA刺激的小鼠，以及用溶于盐水的明矾免疫并只用盐水刺激的动物。第28天最后一次用OVA刺激，次日处死所有动物。测定血清IgE水平，并采集血清和肺组织用于进一步的分析。

为了首先确定在急性哮喘模型中有效下调血清IgE水平的最佳剂量，第25、26、和27天抗原刺激前15-30分钟，将0.1、1.0、10、和50μg剂量的HK-X(溶于40μl盐水)注入肺中。图1描述了血清IgE水平的剂量应答曲线。

图2A-4C描述了不同剂量的HK-X对肺组织应答急性变应性刺激的影响。对急性哮喘小鼠鼻内施用50μg HK-X，针对急性哮喘的作用提供了一定程度的保护(图2A-2C)。图2A和2B显示了血管周围和支气管周围存在有限的炎症细胞积累。图2C显示了存在有限的粘液积累。

10μg HK-X似乎是最有效的剂量(图3A-3C)。图3A和3B显示了血管和呼吸道周围最小量的炎症渗入。图3C显示了呼吸道中的粘液分泌程度，粘液局限于呼吸道上皮细胞的表面。

当HK-X的剂量降低10倍至1μg时，治疗效果消失。血管周围和呼吸道的渗出量增加(图4A)。呼吸道上皮细胞的粘液分泌相应增加(图4B和4C)。

为了对比和对照的目的，图5A-5C显示了经免疫小鼠对施用盐水或HK-X载体(0.05％DMS0)的良性应答。如图5A和5B所示，在肺中血管周围或呼吸道周围区域存在很少量可检测的炎症渗入。相应的，如图5C所示，在呼吸道内腔或呼吸道上皮细胞表面没有粘液积累。

在急性哮喘严重程度的关键组织学测量中，粘液栓、嗜曙红粒细胞数目、和分泌粘液的呼吸道细胞所占比例在用0.1μg-10μg HK-X治疗后显示依赖剂量的改善。10μg HK-X使粘液栓评分降低了70％(p＜0.05)。令人感兴趣的是，50μg HK-X引起的粘液栓降低要低得多(p＜0.05)。在嗜曙红粒细胞数目和分泌粘液的呼吸道细胞所占比例方面观察到相同模式的应答。10μg剂量的HK-X显示间质嗜曙红粒细胞数目下降了57％，显著比0.1μg剂量的效果高(p＜0.05)。由50μg HK-X引起的嗜曙红粒细胞下降比10μg HK-X引起的一半还要少(p＜0.05)。

分泌粘液的呼吸道细胞所占比例由0.1μg至10μg也以依赖剂量的方式受到抑制(降低37％，p＜0.05)。50μg剂量引起少量降低(11％)，并不显著低于0.1μg剂量的HK-X。HK-X对血管周围流体积累的影响在10μg和50μg剂量显示适度降低。然而，没有哪种剂量与0.1μg剂量的HK-X不同。在炎症细胞评分或炎症细胞积累方面显示最大降低的HK-X剂量是10μg。

这些资料证明下面的参数显示剂量应答效果：血清IgE水平和组织病理学特征(细胞渗入、粘液栓形成、和间质中的嗜曙红粒细胞总数)。与较小剂量和一个较大剂量(即50μg)相比，鼻内施用10μg HK-X是最有效的剂量。与对照相比，用10μg HK-X治疗的动物展示血清IgE水平降低60％，肺的细胞渗入降低50％，粘液栓形成降低70％，和嗜曙红粒细胞数目降低67％。实施例2：进行或不进行HK-X干预的慢性哮喘

动物模型还可用于评价药物在慢性变应性肺病中的功效。在这项研究中，6个月的免疫期诱导了持久炎症，并通过每周一次用OVA鼻内刺激进行维持。在20天的时间里用盐水治疗小鼠8次，以评价肺中发生的变化。如图6所示，用HK-X治疗慢性哮喘小鼠。IN施用50μg HK-X(溶于50μ1含低于2.5％DMSO的盐水)，在16天的时间里总共投递了8剂。最后一次服用盐水或HK-X后4天处死动物。在使用与未用HK-X治疗的小鼠之间比较实验结果。

表1显示了使用或未用OVA刺激的小鼠血液中针对OVA的抗体IgE水平。重要的是注意，最初6个月用OVA免疫所有动物，然而，对称为“盐水”的组，在最后20天里鼻内施用盐水但是不用OVA刺激。因此，这些IgE水平来自免疫期，并作为背景值用于校正所有比较。例如，在用盐水或DMSO治疗并用OVA刺激的动物中IgE水平增加了36％，相比之下，在用HK-X治疗并用OVA刺激的动物中IgE水平增加了14％。根据计算，HK-X遏制IgE水平的量为大约60％。

            表1：慢性哮喘小鼠血清中的IgE值

    治疗        平均OD      SE             P值

DMSO/OVA      1.115      0.017      @0.111

盐水/OVA      1.113      0.093      @0.111

HK-X/OVA      0.929      0.033      [email protected]

盐水          0.814      0.079      @0.111

注释：这些数值以来自ELISA测试的OD值表示IgE相对水平。

在鼠模型中慢性哮喘的一个重要特征是肉芽肿结构在肺中的出现。与令其自发降低胶原沉积的动物(盐水或DMSO)相比，HK-X的有效下调IgE剂量50μg显著(p＜0.05)降低经治疗动物肺中这些结构的数目和大小(图7)。

此外，在用OVA免疫小鼠和随后在20天的时间里总共8次用50μg剂量的HK-X进行治疗的过程中，没有观察到不良反应或疾病迹象。在实验期间小鼠是活泼的。来自只用OVA免疫的动物组的肺组织检查揭示了严重的肺病理学变化，与在人慢性哮喘中观察到的特征一致。在呼吸道基底层(间质区)和血管的***边界存在显著的炎症细胞渗入(图8C)。在20天的时间里用8剂每次50μg HK-X治疗动物时，呼吸道和血管周围的炎症细胞数目明显降低(图8B)。用盐水假免疫或对照免疫的小鼠吸入盐水，导致明显呼吸道和血管具有正常外观(图8A)。在用OVA免疫的小鼠中，血管和呼吸道周围的胶原(蓝色)积累继续增加(图9C)。然而，用HK-X治疗的肺展示胶原沉积水平降低(图9B)。在对照小鼠(施用溶于盐水的HK-X)中，肺组织中没有炎症细胞和纤维化胶原沉积(图9A)。相反，在用OVA敏化并只用盐水(图10A-10C)或0.5％DMSO(图11A-11C)治疗的小鼠中，呼吸道中有粘液和分泌粘液的细胞，使用爱茜蓝(pH2.3)对粘液进行显示。血管周围与呼吸道的炎症细胞渗入量是相似的。在这些6月龄慢性哮喘小鼠中，超过60％的呼吸道被粘液栓塞(图10A和10B、图11A和11B)

还通过形态计量法的方法评价了慢性哮喘中的肺组织变化，以量化持久炎症、纤维化胶原沉积、和呼吸道随结构变化而变窄的程度。在图12-14中，左图显示了用OVA免疫达6个月并用多种试剂治疗的动物的应答，而右图显示了用盐水假免疫并治疗的动物。在用HK-X治疗的动物与20天里只给予盐水的动物的粘液栓形成程度之间存在显著差异(p＜0.05)(图12)。用载体(0.5％DMSO)而非HK-X免疫的动物与HK-X相比在粘液栓评分方面也不展示任何改善。结果与盐水治疗相同。对于多种实验性治疗，呼吸道之中和周围的炎症细胞积累的应答模式平行于粘液栓资料(图12)。在16天里鼻内给予8剂每次50μg HK-X(溶于40μl载体)后，显著降低呼吸道中的粘液积累和粘液细胞的发生(图13)。只使用盐水的治疗再次展示没有治疗效果，但是HK-X确实显著降低呼吸道中含粘液细胞的数目(p＜0.05)。这个观察结果进一步证实在用OVA诱导建立了慢性哮喘之后不存在自发修复。在呼吸道相关的渗入性炎症细胞数目的分析中，资料显示单位面积上的嗜曙红粒细胞和嗜中性粒细胞也降低了(图14)。鼻内注入盐水的动物维持高水平的嗜曙红粒细胞，用DMSO治疗的动物也一样(p＞0.05)；然而，与两个对照组相比，HK-X治疗显著降低嗜曙红粒细胞的数目(p＜0.05)。

这些研究显示，在用变应原诱导的慢性哮喘的这种模型中，在呼吸道炎症或粘液细胞分泌中存在非常微弱的甚至没有自发降低，除非施用HK-X。在这种模型中，使小鼠对OVA致敏，并通过鼻内路径每周一次暴露于OVA达5个月，然后在20天的时间里8次鼻内施用HK-X进行治疗。这种变应原免疫和刺激方案导致嗜曙红粒细胞和其它类型的炎症细胞慢性渗入呼吸道，粘液在呼吸道中积累，且分泌粘液的细胞肥大。以有效下调IgE的剂量(即50μg)施用HK-X可降低呼吸道过度分泌、粘液细胞的肥大、以及嗜曙红粒细胞和嗜中性粒细胞的募集。这些结果说明，通过以有效下调IgE水平的量施用HK-X还可下调由IgE介导的应答，诸如在这种由变应原诱导的哮喘模型中发生的呼吸道过度分泌粘液和胶原沉积。实施例3：HK-X和***在急性鼠哮喘中的效果

糖皮质激素是由多种细胞类型生成的炎症介质的有力抑制剂，包括T细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、和嗜曙红粒细胞。可通过吸入或***施用糖皮质激素来有效治疗人哮喘。它们可遏制炎症细胞渗入，并已经证明可降低粘液分泌和肺水肿。这些应答涉及糖皮质激素对支气管上皮细胞的直接作用。同样重要的是，类固醇可降低支气管过度应答。由于它们的功效已获证实，糖皮质类固醇代表了哮喘治疗中的主要治疗物质，而且可无保留的使用，但是由于其已有记录的累积性毒性，限制了它们随时间的价值。由于它们作为哮喘功效当前标准的价值，用于哮喘治疗的新化合物应与糖皮质激素进行比较评价。

这个实验比较HK-X与***(一种广泛使用的糖皮质激素)在这种小鼠模型中调控粘液释放、嗜曙红粒细胞数目、水肿、和变应原特异性IgE水平的效果。在这项研究中使用了HK-X与***的可比较剂量10μg和50μg。对两种药物在所有剂量都进行鼻内施用。根据先前来自慢性哮喘模型的结果，选择50μg HK-X作为大剂量。图15显示了免疫和治疗方案的提纲。

实验参数显示，在降低血清IgE水平方面，鼻内施用10μg HK-X比10μg或50μg***更有效(图16)。10μg HK-X将血清IgE水平降低了28％。在改进下面两种组织病理学特征方面，HK-X也比***更有效：细胞渗入和间质中的嗜曙红粒细胞总数。与OVA对照相比，10μg和50μg剂量的HK-X都将炎症渗入显著降低54％(p＜0.05)，比10μg(13％)和50μg(13％)***显著有效(p＜0.05)。10μg和50μg剂量的HK-X都比10μg***更有效(p＜0.05)。10μg HK-X将嗜曙红粒细胞计数降低了57％，而相同剂量的***将嗜曙红粒细胞计数降低了13％。

在降低下面的组织病理学特征方面，鼻内施用50μg大剂量的HK-X与两种剂量的***一样有效：支气管肺泡灌洗(BronchoalveolarLavage，BAL)中的嗜曙红粒细胞数目、粘液栓形成、分泌粘液的呼吸道细胞所占百分比、间质嗜曙红粒细胞数目、和水肿。这些结果在鼠哮喘模型中确定了HK-X与一种糖皮质激素(即***)的比较性功效。实施例4：HK-X和相关对照肽在急性鼠哮喘中的效果

这个实验在下面的测量中比较HK-X与肽家族相关成员f-Met-Met(称为对照肽)的效力：在急性哮喘小鼠模型中的粘液释放、细胞渗入、嗜曙红粒细胞数目、水肿、变应原特异性IgE水平。在这项研究中使用了HK-X与对照肽的可比较剂量50μg。对两种化合物都进行鼻内施用。图17显示了免疫和治疗方案的提纲。

虽然属于化学化合物的相同家族且分子大小密切相关，但是对照肽不展示HK-X的任何治疗特性。最显著的是，50μg HK-X引起血清中针对变应原OVA的血清IgE水平降低7％(p＞0.05)。50μg对照肽不影响血清IgE水平(p＞0.05)。此外，在载体中投递并施用于对照动物的对照肽在下列参数方面明显促进促炎增加：粘液栓形成、分泌粘液的呼吸道细胞的数目、和间质炎症细胞的程度。在先前的实验中，HK-X在测量的组织学参数方面不展示任何促炎变化。因此，HK-X的独特组成似乎负责其在下调IgE水平和由IgE介导的应答中的功效。实施例5：对长期服用高治疗水平HK-X的肺组织应答

为了确定长期鼻内暴露于HK-X的治疗剂量范围高端值是否存在潜在有毒影响，将小鼠每周一次鼻内暴露于20μg HK-X达3个月。在最后两周中，HK-X的鼻内剂量增加至50μg。最后一次施用HK-X后24小时，采集肺组织用于组织学分析。

每周一次鼻内施用20μg HK-X达3个月，随后施用50μg达2周，不引起肺组织的病理学改变。在粘液栓形成和炎症渗入方面，施用盐水与HK-X没有差异(p＞0.05)。施用HK-X后呼吸道细胞的粘液分泌增加，但是并不认为在生物学上是显著的。在间质嗜曙红粒细胞数目方面观察到相似现象。用HK-X治疗的动物为每2200μ²约2个嗜曙红粒细胞，而用盐水治疗的动物展示低于每单位面积1个细胞(p＜0.05)。对肝、脾、和肾检查病理学变化。除了来自对照和治疗组动物的肝中炎症细胞的偶尔病灶，没有观察到病理学变化。这些数据确定了HK-X的超治疗剂量在小鼠中的耐受性。实施例6：HK-X的免疫原性和抗原性

这项研究的目的是确定在经几种不同路径施用于小鼠时HK-X是否会产生免疫应答(通过抗体生成进行评价)。由此，在这项研究中同时评价了与HK-X有关的免疫原性和抗原性。

HK-X是小型四肽。在大多数情况中，这些小分子的免疫原性很低；然而，在体内，小分子可缀合或吸附(成为半抗原)较大的蛋白质或血细胞(载体)。青霉素、奎尼定、和α-甲基多巴变应性应答就是这种半抗原应答的范例。由于破坏红细胞(载体)，针对半抗原的抗体可引起贫血和免疫复合性疾病。

许多半抗原，诸如实验用途的二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)，共价连接载体分子。载体分子的抗原性越高，则引发针对半抗原的免疫应答的可能性越大。匙孔血蓝蛋白(KLH)是广泛使用的载体，通常支持针对半抗原(像DNP或TNP)的有力抗体应答。

佐剂的使用极大增加了潜在免疫原引发免疫应答的可能性。完全弗氏佐剂(CFA)或细菌肽聚糖已经广泛用于刺激针对免疫原性很低的半抗原的免疫应答。

因此，在首先确定来自正常药物暴露路径的抗体的可利用性后(不具有抗HK-X反应性)，通过偶联KLH并在细菌佐剂中施用，检验了HK-X的潜在免疫原性。这些极端条件可确定HK-X是否具有免疫原性。材料和方法

HK-X的免疫原性缀合物：经添加于羧基末端的12-20个碳的间隔臂使HK-X缀合KLH。经KLH上的赖氨酸残基完成连接。由UnitedBiochemical(西雅图，WA)制备该缀合物。

免疫原的制备：将以0.1mg/ml悬浮于PBS中的HK-X-KLH缀合物在含1.0mg/ml牛结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(CFA)中以1∶1乳化。

佐剂免疫方案：对Balb/C雌性小鼠皮内免疫0.1ml乳剂，4周后加强免疫，6周后采血。

溶液免疫方案：对Balb/C雌性小鼠腹膜内注射100μg不含佐剂的缀合物(体积0.1-0.2ml)。21天后采血。

正常药物暴露路径：在治疗性哮喘研究中由经鼻内路径施用HK-X的动物采集血清。

抗体的测定：通过ELISA分析针对缀合与未缀合HK-X的抗体。用以10μg/ml溶于PBS的下列HK-X或HK-X缀合物于4℃包被Immulon2微量滴定板(Dynex Technologies，目录号3455)过夜：

·仅用HK-X肽

·HK-X-KLH，肽与KLH的缀合物

·HK-X-BSA，肽与BSA的缀合物

·HK-X-间隔臂，含12个碳的线性间隔臂的肽。次日用PBS清洗孔，然后用样品稀释缓冲液(0.1M Tris/0.15M NaCl缓冲液，pH8.0，添加0.1％酪蛋白(ICN，目录号902896，批号99333))于室温封闭30分钟。将小鼠血清样品用相同缓冲液1∶100或1∶200稀释，加到孔中，并于室温保温2小时。然后用PBS清洗孔，并与缀合过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG二抗(Cappel，目录号55554，批号39714)于室温保温2小时。用PBS清洗后，将孔与OPD chromagen(Sigma，目录号P-9187，批号18H82111)于室温反应30分钟。加入50μl 2.5M硫酸终止反应。然后使用BIO-TEK EL800读出器测定490/630nm的OD。结果

来自正常药物暴露路径的HK-X测定：对来自下列几组小鼠的血清测试抗HK-X反应性：用OVA诱导哮喘并用HK-X治疗、用OVA诱导哮喘并用DMSO(载体)治疗的对照、和用盐水免疫并用DMSO(载体)治疗。隔天对小鼠鼻内施用50μg HK-X或载体达16天。

没有观察到针对缀合12C间隔臂(HK-X-间隔臂)、KLH(HK-X-KLH)、或BSA(HK-X-BSA)的HK-X的IgG反应性。在所有用OVA免疫的小鼠中和1只用盐水免疫的对照小鼠中观察到针对OVA的IgG反应性，并作为ELISA的对照。在来自用溶于佐剂的HK-X-KLH免疫的动物的血清中观察到针对HK-X-KLH和HK-X-BSA的IgG反应性，将其作为这些抗原包被到ELISA板上的对照。

溶液免疫偶联载体的HK-X：用溶液形式的HK-X-KLH免疫小鼠，并在21天后采血。ELISA结果显示4/5血清样品与KLH和HK-X-KLH发生反应，但是观察到与HK-X-BSA和HK-X-间隔臂不发生反应，说明在用偶联HK-X的可溶性载体进行免疫后没有生成针对偶联KLH的HK-X的抗体。

佐剂免疫偶联载体的HK-X：为了促使针对HK-X的抗体的生成，用溶于完全弗氏佐剂的KLH或HK-X-KLH免疫小鼠，加强免疫1次，并在6周后采血。ELISA结果显示生成了针对KLH的抗体。还生成了针对HK-X的抗体。这受到下列证据的支持：1)HK-X-KLH血清与HK-X-KLH的抗体反应性比只用KLH免疫的血清高2倍；且2)来自用HK-X-KLH免疫的小鼠的血清与HK-X-BSA发生反应，但是与BSA不发生反应。然而，没有观察到针对偶联12C间隔臂的HK-X的抗体反应性。

根据这些研究的结果，可以得出关于HK-X肽的免疫原性和抗原性的几个结论。首先，在治疗性鼻内施用该肽达16天后，小鼠不生成针对HK-X的抗体。其次，在用缀合免疫原性载体KLH的可溶性肽形式进行免疫时，小鼠不生成抗体。第三，在极端条件下，即在偶联KLH并与完全佐剂一起免疫时，可促使小鼠生成针对HK-X的抗体。然而，甚至在种情况中，产生的抗体反应性可能是针对通过HK-X与KLH的缀合而产生的新表位，因为检测不到针对缀合12C间隔臂的HK-X的抗体反应性。这个结论受到下面的观察结果的支持：在与待测抗原HK-X-KLH保温前，向抗血清中加入游离HK-X达至少30分钟后，不降低针对HK-X-KLH的抗体反应性。

因此，在临床环境中似乎不可能引发针对HK-X的临床相关抗体或其它免疫应答。存在5项观察结果支持这样的想法。这些观察结果是：1)HK-X的大小只有4个氨基酸(小于600Dal)，这使其不太可能具有免疫原性；2)HK-X中的所有氨基酸都是疏水的，它们的特性与免疫原性无关；3)为了具有免疫原性，HK-X必须在体内与较大的免疫原性载体共价或静电相关；4)针对HK-X生成的抗体有可能指向通过联合载体与HK-X而形成的表位(新抗原)；5)指向新抗原的抗体与游离的HK-X即便会发生反应，也只是轻微的(低亲和力)。实施例7：HK-X的灵长类毒理学研究

这项研究是根据GLP标准在一家动物研究机构BIOSUPPORT(Redmond，华盛顿)进行的。研究了由Charles River获得的6只成年雄性和雌性恒河猴。A组，作为对照组，包括2只动物，每天IV给予载体(含3％DMSO的缓冲盐水)达5天。第0-4和7天进行采血，用于CDC和化学法分析。B组，包括3只动物，每天IV服用溶于载体(含3％DMSO的缓冲盐水)的20μg/kg HK-X达5天。第0-4和7天进行采血，用于CDC和化学法分析。C组包括另外3只动物，以相同方案每天IV服用150μg/kg。D组包括B组和C组的所有6只动物，在C组动物完成它们的方案后，使用相同方案每天IV服用1000μg/kg。在整个研究期间，每天观察所有动物，记录体重以及一般健康状况和行为。在D组方案结束时，安乐处死所有动物，尸体剖检，并由下列器官采集代表性组织样品用于组织学分析：肝、肾、脾、肺、心、***、和脑。由获得委员会授权且与BIOSUPPORT有联系的兽医病理学家和与Histatek有联系的组织病理学家独立进行组织病理学评价。

HK-X的这些剂量是根据HK-X在小鼠哮喘模型中的有效治疗剂量10和50μg/kg而选择的。

在任何一天在任何剂量水平都没有记录到白血球、血细胞比容/血红蛋白、或血小板计数的显著异常。相似的，在3种剂量水平都没有记录到化学值的显著异常。在由每天暴露于20或150μg/kg随后1000μg/kg HK-X的动物或载体对照组获得的脾和***代表性组织样品中没有记录到组织学异常。在来自经治疗动物和对照动物的肝、肾、心、和肺组织样品中都记录到最小限度的多灶淋巴细胞渗入，由此判断为与治疗无关。轻度肾小球损伤(在衰老恒河猴中是常见的)并不依治疗而显示差异，由此也认为与治疗无关。其它微小组织学变化被认为不显著。

在暴露于HK-X的剂量水平显著高于治疗所考虑剂量的6只恒河猴的血细胞计数或化学分析中没有可辨别的毒性。在肝、肾、脾、***、心、和肺中记录到的微小组织病理学变化并不依治疗而显示差异，被认为是背景病理学的表现或是与安乐死有关的人为变化。

这项灵长类研究说明HK-X的治疗性剂量可用于治疗人，而无明显毒性或副作用。

本文通过本发明的优选实施方案已经详细描述了本发明。然而，在考虑本说明书及附图后，本领域熟练技术人员将领会，在由权利要求定义的本发明精神和范围内可进行修改和改进。

Claims (6)

1.用于治疗哺乳动物中由IgE介导的应答产生的指征的方法，包括以有效下调IgE的量对哺乳动物施用具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

2.权利要求1的方法，其中与所述肽一起施用另一种活性成份，所述活性成份选自：抗白三烯、β₂激动剂、和皮质类固醇。

3.用于下调IgE受体的方法，包括以有效下调IgE受体的量施用具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

4.权利要求3的方法，其中IgE受体选自：Fc_εRI、Fc_εRII、和可溶性Fc_εRII。

5.用于下调CD40配体由此预防其进一步涉及IgE生成的方法，该方法包括以有效下调CD40配体的量施用具有通式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

6.用于抑制浆细胞分泌IgE的方法，包括使所述浆细胞与能有效抑制IgE分泌的量的具有通式f-Met-Leu-X的肽接触，其中X选自：Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe、和Phe-Tyr。

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