CN1359407A - 制备氟化聚合物吸附剂颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过有机化合物的水不溶性溶液的厌氧反应来制备颗粒的方法,所述有机化合物包括:(a)选自C3－6丙烯酸的C2－4亚烷基二醇酯或二乙烯基苯的单体;(b)多氟化乙烯基单体;(c)选自丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的单体;(d)自由基引发剂;和(e)水不溶性、有机溶剂可溶性孔原材料,所述共聚单体(a)加上(b)加上(c)与孔原材料的重量比为0.5∶1－2∶1。通过该方法制成的吸附剂颗粒可用于进行色谱分离,或用于生产医疗设备。

Description

制备氟化聚合物吸附剂颗粒的方法
本发明的领域
本发明涉及一种制备氟化聚合物吸附剂颗粒的方法及其作为固定相在色谱分离中的应用。
本发明的背景
用于高效液相色谱的载体材料必须机械坚固以经受在高压下的高速流动操作。此外，它们必须宽pH值范围内稳定，所述pH值是这些材料在正常操作和再生过程中所经受的。聚合物颗粒在其环境中的稳定性使得它能够经受降解和分解。对色谱介质特别重要的物理性能是(1)颗粒的球形；(2)高表面积；(3)高孔体积和可得性；(4)宽范围的孔径；和(5)宽范围的粒径。
本发明颗粒相对已知颗粒在许多上述性能上取得改进。此外，本发明某些颗粒的氟化表面具有不寻常且意想不到的极性，这在进行例如用于DNA的色谱分离时有用。
本发明的综述
本发明因此涉及具有吸附性能的改进氟化颗粒的制造，它在作为固定相用于色谱分离时具有优异的性能。
本发明提供了一种制备氟化聚合物吸附剂的多孔球形颗粒的方法，包括以下步骤：
(1)形成有机化合物的水不溶性溶液，所述有机化合物包括选自C3-6丙烯酸的C2-4亚烷基二醇酯或二乙烯基苯的单体；多氟化乙烯基单体；自由基引发剂；和水不溶性、有机溶剂可溶性孔原(porogenic)材料，所述共聚单体与孔原材料的重量比为0.5∶1-2∶1；
(2)形成分散剂在其中已用惰性气体清除所有氧的水中的稀溶液；
(3)在搅拌和惰性气体清除下，将来自步骤(1)的有机化合物的水不溶性溶液快速分散到来自步骤(2)的稀水溶液中，并根据需要将分散体的温度调节至30-90℃以引发单体的共聚合，其中混合能水平足以将有机化合物的水不溶性溶液以平均粒径不超过10-300微米的液滴形式分散在步骤(2)的溶液中，其中至少90％的液滴在平均的平均粒径的上下40％以内；
(4)对来自步骤(3)的分散体继续搅拌和氧清除，其时间足以使单体完全共聚反应且液滴通过其中共聚物的沉淀而以细分聚合物颗粒的形式粒化；
(5)从聚合反应介质中分离出细分共聚物颗粒；
(6)通过用惰性有机溶剂洗涤这些颗粒，从步骤(5)的分离共聚物颗粒中萃取孔原材料，这样在该共聚物内形成孔；和
(7)干燥该多孔共聚物颗粒。
本发明还提供了一种制备氟化聚合物吸附剂的多孔球形颗粒的方法，包括以下步骤：
(1)形成有机化合物的水不溶性溶液，所述有机化合物包括(a)选自C3-6丙烯酸的C2-4亚烷基二醇酯或二乙烯基苯的单体；(b)多氟化乙烯基单体；(c)选自丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的单体；(d)自由基引发剂；和(e)水不溶性、有机溶剂可溶性孔原材料，所述共聚单体(a)加上(b)加上(c)与孔原材料的重量比为0.5∶1-2∶1；
(2)形成分散剂在其中已用惰性气体清除所有氧的水中的稀溶液；
(3)在搅拌和惰性气体清除下，将来自步骤(1)的有机化合物的水不溶性溶液快速分散到来自步骤(2)的稀水溶液中，并根据需要将分散体的温度调节至30-90℃以引发单体的共聚合，其中混合能水平足以将有机化合物的水不溶性溶液以平均粒径不超过10-300微米的液滴形式分散在步骤(2)的溶液中，其中至少90％的液滴在平均的平均粒径的上下40％以内；
(4)对来自步骤(3)的分散体继续搅拌和氧清除，其时间足以使单体完全共聚反应且液滴通过其中共聚物的沉淀而以细分聚合物颗粒的形式粒化；
(5)从聚合反应介质中分离出细分共聚物颗粒；
(6)通过用惰性有机溶剂洗涤这些颗粒，从步骤(5)的分离共聚物颗粒中萃取孔原材料，这样在该共聚物内形成孔；和
(7)干燥该多孔共聚物颗粒。
本发明还提供了通过上述方法制成的吸附剂颗粒。
本发明进一步提供了按照本发明的颗粒作为固定相在色谱技术中的应用。本发明的某些颗粒特别适合其中所要色谱处理的样品是包含核苷酸、核苷或多肽如DNA、RNA或内毒素的大分子的用途。
本发明的详细描述
本发明涉及一种通过悬浮聚合包含常规分散剂的水溶液来制备高品质吸附剂含氟聚合物颗粒的方法。该方法的基本组分是(1)水不溶性聚合反应体系，主要由多氟化单体、两种或多种烯属不饱和单体和自由基引发催化剂组成，和(2)分散介质，它是包含常规分散剂的稀水溶液。水不溶性溶液是指一种足够水不溶性以进行悬浮聚合反应的溶液。优选的烯属不饱和单体是具有二乙烯基官能度的单体。具有二乙烯基官能团的非氟化单体是更优选的。聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮是优选的分散剂。
A.分散剂
用于本发明的多氟化共聚物的聚合反应在包含分散剂，例如聚乙烯醇或聚乙烯基吡咯烷酮的稀水溶液的存在下进行。分散剂的主要作用是调节细分散水不溶性聚合反应组分和连续水性介质相之间的界面表面张力。通过调节溶解在水介质中的分散剂的浓度，可以更细致地控制分散聚合反应体系的液滴尺寸和因此的所得聚合颗粒的尺寸。
只要分散剂基本上完全溶解在水性介质中，本发明可成功地使用宽范围分子量的分散剂。一种优选的分散剂是至少80％水解，更优选至少86％水解的分子量至少约1000的PVA。最大可用分子量是分散剂的室温水溶解度的函数。例如，所用PVA的分子量一般不超过150000且优选不超过100000。
就本发明而言，PVA在水性介质中的浓度应该在1-50毫升PVA/升水的范围内。低于1毫升/升，PVA的改性效果不足，而超过约50毫升/升则没有产生进一步的优点。当然，最好使用较少量的PVA以避免浪费能量的水性介质粘度增加。
B.聚合反应体系
1.多氟化单体：如上所述，含氟共聚单体必须包含多个氟(F)取代基。该氟化共聚单体优选包含至少三个F取代度。除了对其氟化度的这些限制，氟化共聚单体必须在所遇到的聚合反应温度下基本上完全不溶于水并基本上完全可溶于分散聚合反应体系的其它组分。
合适的多氟化共聚单体是包含活性乙烯基位的那些如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基化合物、马来酸酯和衣康酸酯。这些种类的许多化合物是五氟苯乙烯、衣康酸双六氟异丙基酯、马来酸双六氟异丙基酯、丙烯酸十七氟癸基酯、甲基丙烯酸全氟辛基酯、甲基丙烯酸2，2，3，3-四氟丙基酯、衣康酸单三氟乙基酯、马来酸2，2，2-三氟乙基酯、全氟辛酸乙烯基苄基酯和三氟乙酸乙烯基酯。
2.乙烯基其聚单体：用于本发明的多氟化共聚物的共聚单体组分优选为C3-6丙烯酸的非氟化C2-4亚烷基二醇酯(交联性共聚单体)。交联性共聚单体必须具有至少两个乙烯基。具有这种组成的合适的共聚单体是二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸1，3-丙二醇酯、二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯、衣康酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、和二马来酸乙二醇酯。二乙烯基苯也可用于此。
非氟化共聚单体的混合物也可使用，其中一种非氟化共聚单体具有至少两个乙烯基，即交联性共聚单体，且第三单体，即共聚单体(c)是丙烯酸、甲基丙烯酸、或丙烯酸或甲基丙烯酸的酯。典型的酯是这些酸的甲基、乙基、和羟乙基酯、包含这些酸的酯的环氧化物和这些酸的胺酯。因此可在合成中使用选自共聚单体(c)的第四共聚单体。
通过避免例如按照美国专利5773587和6046246所述使用PVA作为全氟化颗粒与配体之间的连接剂，共聚单体(c)的存在有助于连接上用于色谱分离的配体。单体(c)的加入对本发明的改进颗粒的性能，如颗粒或孔径的稳定性的影响不大。
我们发现，1-30％的交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯可被选自共聚单体(c)的第三或第四单体替代。这些共聚单体可根据所需的官能度而选择。例如，可以加入丙烯酸和甲基丙烯酸的官能酯如可以使用包含羟基、环氧化物、胺、季铵、磺酸等的那些。
3.自由基引发剂：聚合反应体系的一个基本组分是自由基源。尤其是，该体系必须包含一种或多种在聚合反应条件下热分解形成自由基物质的化合物。优选的自由基试剂是偶氮二异丁腈(AIBN)和过氧化苯甲酰(BPO)的混合物。此目的需要约10-50毫克/升。可以看出，较高的浓度在功能上是可操作的。但优选使用尽可能少的量以减少外来物质在所得聚合物颗粒中的量。
C.孔原
合适的孔原材料是具有以下性能的有机化合物：(1)相对聚合反应相中的其它组分化学惰性，(2)完全可溶于聚合反应体系，(3)完全不溶于连续水相和(4)可容易在较低温度下用低分子量有机溶剂从聚合颗粒中萃取。通过用二氯甲烷洗涤聚合物颗粒而容易去除的邻苯二甲酸二丁酯是一种优选用于本发明的孔原。其它的合适孔原包括甲苯、异丙基苯、2-甲基-4-戊酮、2-甲基-4-戊醇和氯苯。
D.聚合反应工艺
聚合反应应该在基本上完全不存在空气或任何其它氧污染源的情况下进行，否则可能导致与聚合反应体系的任何组分，尤其是单体、交联剂和自由基引发剂的不利反应。已经发现，去除并防止向聚合反应体系中引入氧的最实际方式是在完成聚合反应工艺之前、过程中和之后用惰性气体连续清洗该聚合反应体系。当然任何惰性气体都适用于此。但氩气和氮气是最便宜的并在大多数情况下优选。由于聚合反应在非常高能量的混合条件下进行，引入清洗气体的方法并不特别关键，只要它具有足够的体积。
分散剂主要用于更精确地控制分散的单体液滴与连续水性介质之间的界面张力。液滴尺寸更主要由用于分散聚合反应体系的混合能的量来控制。因此，在水性介质中仅需要较低浓度的PVA作为分散剂，例如为1-100克/升的数量级。优选0.5-40克/升的PVA浓度。尽管可以采用较高浓度，但它们不会提高功能性。由于在聚合反应过程中需要形成非常小的液滴，当然最好避免较高的PVA浓度，否则使水性介质更加粘稠。
输入到聚合反应体系的能量数值主要是所需聚合物粒径的函数。即，如果需要较大的颗粒，混合的程度(能量输入)下降。如果需要较小的颗粒，混合程度升高。优选在聚合反应过程中控制液滴尺寸以得到5-300微米范围内的聚合物颗粒，其中20-100微米是特别优选的。
F.颗粒性能
理想的色谱介质需要具有以下性能：(1)球形；(2)高表面积；(3)可得到宽范围的(3)孔径和(4)粒径；(5)高孔体积；(6)高机械强度；和(7)在该介质使用时所暴露的整个pH值范围内的化学和机械稳定性。
颗粒的球形比起不规则的微粒形状有利地提供流过这些颗粒填充床时的最低阻抗和最低反压。这种规则形状的颗粒在使用过程中不太容易致密化。
粒径和粒径分布也是本发明颗粒的重要性能。一般来说，大于约20微米的颗粒有助于降低填充柱中的反压。此外，较大颗粒所得到的色谱峰宽度和峰形状通常比粒径为3-15微米的颗粒所得到的峰宽度和形状要宽。窄峰形状对于许多种分离通常是理想的。
通过本发明方法制成的多氟化颗粒的可得表面积通常优选为至少约200米2/克，以在微粒媒质上得到较高的抗原加载量。然而，具有明显较低表面积的媒质通过改变用于聚合反应体系的孔原的量和降低颗粒的尺寸而容易地由本发明制成。同时，为了得到高表面积，需要至少为0.5毫升/克的大孔体积。
对于不同的色谱工艺，必须可得到宽范围的孔径。大孔对于有效捕获较大分子如蛋白质是必需的，而小孔则是有效捕获小分子所必需的。一般来说，孔径范围可由低于60埃扩大至高达1000埃，优选为300-800埃。该尺寸范围使用本发明方法，通过调节孔原在所得聚合物颗粒中的相对量和种类而十分容易获得。
由于使用色谱介质时的pH值范围宽且在清洁和再生它们时通常遇到非常高的pH值范围，它们必需在该pH值暴露的整个范围内化学惰性。尤其是，色谱介质必须经受使用氢氧化钠清洁介质颗粒时所遇到的高pH值(12或更高)，通常0.1-1当量浓度。
G.颗粒的应用
本发明吸附剂颗粒用途非常广泛且可用作进行各种各样色谱分离时的固定相。可考虑的色谱分离的例子包括反相分离、亲和性分离、膨胀床分离、离子交换色谱、凝胶过滤、色谱组分分离、固相萃取、过滤和其它用于区分、测定或收集化学、生物或物理混合物的组分的公知技术方法。这些颗粒可用作载体以接枝不同种类的配体。某些颗粒特别适合其中所要色谱处理的样品为DNA、RNA或多肽的用途。
本发明的多氟化颗粒可在有或没有亲水聚合物如聚乙烯醇的涂层的情况下用于色谱分离。
实施例3和4的未涂覆颗粒的表面是憎水的，但稍有极性，这是反相色谱分离的理想性能的组合。反相色谱法包括将相对非极性的固定相与通常为水的非常极性的流动相结合使用。该技术用于分离较低极性的溶质。反相色谱法通常使用涂有有机硅烷以提供憎水性的硅石来进行。但憎水化硅石的严重局限性在于，它不能在大于11的pH值下使用，而且不能在不溶解颗粒的情况下用浓苛性苏打溶液清洗。本发明多氟化颗粒的一个显著优点在于，它们没有这种局限。
用于反相色谱的未涂覆本发明颗粒的应用由实施例28说明，且本发明颗粒对碱性溶液的稳定性由以下实施例29中所得的数据表明。
适用于涂布本发明多氟化颗粒的亲水聚合物是未带电的、水溶性、非环状的并具有多个羟基的那些。尽管许多这类的亲水聚合物都可用于这种特定功能，但聚乙烯醇是优选的。
有利地，本发明的多氟化化合物可在表面上有或没有配体的情况下用于医疗设备以进行不属于色谱法的分离。例如，血液的组分可使用其中将血液抽吸经过一个体外筒并返回至身体的医疗设备进行分离。毒素之类的组分可去除且不返回至身体。
由于本发明多氟化颗粒的稳定性，可通过γ射线进行消毒而不会破坏颗粒。这种性能使得这些颗粒特别适用于必须进行卫生处理的医疗设备。
H.颗粒的衍生
如果需要，实施例5和6的PVA涂覆多氟化颗粒可通过将合适的分子与PVA的羟基进行反应而官能化。即，强阳离子的离子交换官能度可通过在表面上设置磺酸基团而赋予颗粒表面。同样，强阴离子的离子交换官能度可通过施用季胺而得到。弱阳离子官能度可通过使用羧酸基团而得到，且弱阴离子官能度可通过使用伯胺而得到。
实施例
实施例1：二甲基丙烯酸乙二醇酯、五氟苯乙烯和甲基丙烯酸羟乙基酯的多孔共聚物的生产
将490毫升蒸馏水加入容器中并在800rpm下用高效桨式混合器进行搅拌。在连续搅拌下，加入氩气以清除水中的氧并向水中加入3.9克聚乙烯醇。继续搅拌和清除30分钟，在此过程中通过改变搅拌器的角度来减少该混合物的涡旋。将二甲基丙烯酸乙二醇酯(50.1克)、五氟苯乙烯(39.8克)和甲基丙烯酸羟乙基酯(5.6克)混合在一起并向该混合物中加入127毫升邻苯二甲酸二丁酯，然后加入0.48克偶氮二异丁腈(AIBN)和0.45克过氧化苯甲酰(BPI)。随后搅拌该混合物直到匀质。将该匀质混合物随后迅速加入聚乙烯醇水溶液并将所得聚合反应混合物加热至约80℃。继续在800rpm下搅拌和氩气清除，直到聚合反应完成。
在从聚合反应介质中分离出所得含氟聚合物颗粒之后，顺序用(1)60℃下的200毫升蒸馏水，(2)60℃下的200毫升丙酮，和(3)70℃下的热水和丙酮的200毫升30/70％体积混合物将它们进行洗涤。在完成洗涤步骤之后，将颗粒在70℃炉中干燥过夜。
将洗涤和干燥的含氟聚合物颗粒随后用10％重量二氯甲烷在50℃下回流6-7小时以去除颗粒中的孔原材料。将无孔原的颗粒放在烧结玻璃漏斗上并用50毫升丙酮/克颗粒进行漂洗，然后将漂洗颗粒在70℃下干燥过夜。
该洗涤多氟化颗粒的平均粒径为51微米，表面积为300米2/克且孔体积为1.0毫升/克。该工艺非常有效地制备出可在色谱分离中经受2000psi压力的多孔球形珠粒。
该实施例也可进行如下变化。在30分钟内向490毫升蒸馏水中加入氮气以清除水中的氧，制备出二甲基丙烯酸乙二醇酯和五氟苯乙烯与甲基丙烯酸环氧乙基酯的多孔共聚物。加入聚乙烯醇(3.9克)。将五氟苯乙烯(30.9克)、二乙烯基苯(35.7克)、甲基丙烯酸环氧乙基酯(20.0克)和邻苯二甲酸二丁酯(127毫升)在单独的容器中混合在一起。向该混合单体中加入偶氮二异丁腈(0.40克)和过氧化苯甲酰(0.30克)。将单体和过氧化物催化剂的混合物加入水和PVA的搅拌混合物中。将该混合物加热至80℃，同时用马达驱动的搅拌桨进行800rpm搅拌。将该混合物在4小时内进行聚合，然后认为该聚合反应已完成。从水中分离出聚合物颗粒并洗涤和干燥。如上所述去除孔原。
按照实施例1进行聚合反应，只是用聚乙烯基吡咯烷酮替代PVA分散剂。聚合反应按照实施例1进行，只是颗粒在干燥之后更加细分。在实施例1中，颗粒通常在干燥时结块在一起但用机械或超声波法容易破碎开。聚乙烯基吡咯烷酮的使用防止了结块。
多孔全氟化离子交换颗粒也可通过用官能共聚单体替代交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯而制成。一个例子是，用20.0克甲基丙烯酸替代二甲基丙烯酸乙二醇酯。所得聚合物可用作弱阳离子交换剂。
实施例2：二甲基丙烯酸乙二醇酯、全氟甲基丙烯酸2-(N-乙基全氟辛烷磺基酰氨基)酯和甲基丙烯酸的多孔共聚物的生产
二甲基丙烯酸乙二醇酯、全氟甲基丙烯酸2-(N-乙基全氟辛烷磺基酰氨基)酯和甲基丙烯酸的多孔共聚物按照以下方式制备：
准备：
配有“E型”搅拌器(Cole Palmer，6厘米直径和10厘米高度)、回流冷凝器、气体入口管和浸没温度探头的1升圆柱状反应器。将搅拌器定位使得其顶部叶轮片刚好在水相的液位之上。
水相：
3.9克PVA(Aldrich，85000-146000道尔顿，97-99％水解)，在490毫升去离子(DI)水中
有机相：
1.7克聚苯乙烯(Aldrich，90000MW标准)
171毫升异丙基苯(Aldrich，99％)
68.5克二甲基丙烯酸乙二醇酯(Aldrich，98％，100ppm的对苯二酚的甲基醚(MEHQ))
85.6克甲基丙烯酸2-(N-乙基全氟辛烷磺基酰氨基)乙基酯(Monomers，Polymers and Dajack)
17.1克甲基丙烯酸
0.57克AIBN(Aldrich，99％)
1.14克BPO(Aldrich，98％)
水相通过在约50℃下将PVA预溶于水中而制成。将水相装入反应器并用氮气喷射25分钟。
将聚苯乙烯预溶于异丙基苯。随后加入这三种单体的混合物，然后加入引发剂。在搅拌1小时之后，有机相仍表现浑浊并如此加入反应器中。在氮气吹扫下，将该混合物在800rpm下搅拌并在30分钟内加热至80℃。在达到反应温度之后，大多数有机相聚集成一种在25分钟之后再次破碎成单独珠粒的单一物质。
在反应温度下9小时之后，将该体系冷却，虹吸出水相，然后用500毫升DI水、500毫升丙醇、500毫升丙酮水(30∶70)、500毫升热水和2×500毫升丙酮洗涤树脂珠粒。
空气干燥之后，树脂重量为168克。
将树脂在1升二氯甲烷中回流5小时，用1升丙酮洗涤并空气干燥。
将洗涤和干燥的含氟聚合物颗粒随后用10％重量二氯甲烷在50℃下回流6-7小时以去除颗粒中的孔原材料。将无孔原的颗粒放在烧结玻璃漏斗上并用50毫升丙酮/克颗粒进行漂洗，然后将漂洗颗粒在70℃下干燥过夜。所得多孔珠粒的粒径为50μm且表面积为300米/克。
实施例3：二甲基丙烯酸乙二醇酯与五氟苯乙烯的多孔共聚物的生产
二甲基丙烯酸乙二醇酯与五氟苯乙烯的多孔共聚物按照实施例1所述，通过将55.7克二甲基丙烯酸乙二醇酯和39.8克五氟苯乙烯混合在一起而制备。没有向该混合物中加入甲基丙烯酸乙酯。该工艺步骤也非常有效地制备出五氟苯乙烯的球形多孔颗粒。
实施例4：二甲基丙烯酸乙二醇酯与全氟甲基丙烯酸2-(N-乙基全氟辛烷磺基酰氨基)酯的多孔共聚物的生产
二甲基丙烯酸乙二醇酯与全氟甲基丙烯酸2-(N-乙基全氟辛烷磺基酰氨基)酯的多孔共聚物按照实施例2来制备，只是有机相组成如下：
1.7克聚苯乙烯(Aldrich，90000MW标准)
171毫升异丙基苯(Aldrich，99％)
85.6克二甲基丙烯酸乙二醇酯(Aldrich，98％，100ppm的对苯二酚的甲基醚(MEHQ))
85.6克甲基丙烯酸2-(N-乙基全氟辛烷磺基酰氨基)乙基酯(Monomers，Polymers and Dajack)
0.57克AIBN(Aldrich，99％)
1.14克BPO(Aldrich，98％)
该工艺步骤非常有效地制备出全氟甲基丙烯酸酯的多孔球形颗粒。
实施例3和4进行的变化用于说明制备具有各种孔形态的颗粒时的工艺灵活性，如下表所述：
    孔原 在五氟苯乙烯混合物中的乙二醇％ 孔径A 在甲基丙烯酸酯混合物中的乙二醇％ 孔径A
    甲苯     50   37
    甲苯     40   122
  邻苯二甲酸二丁酯     50   105     50   184
  邻苯二甲酸二丁酯     40   73     40   261
  邻苯二甲酸二丁酯     30   78
    2-甲基-4-戊酮     50   339     50   46
上表说明所选孔原的种类和数量在不同单体体系中可能具有的影响。
实施例5：用PVA涂覆苯乙烯系含氟聚合物颗粒
使用按照实施例3的方式制成的干燥含氟聚合物颗粒，将50克这种颗粒在甲醇中通过声波作用进行解聚集并在150毫升甲醇中浸渍过夜。该解聚集步骤在2克树脂在20毫升甲醇中的单独批料中进行。
将甲醇树脂淤浆放在3升圆底烧瓶中并虹吸出足够的甲醇使得它刚好覆盖珠粒。将事先在50℃下溶解PVA而制成的80克PVA(31000-50000道尔顿，98％水解)在1升去离子水中的溶液随后加入该烧瓶并将所得淤浆在室温下搅拌24小时。在收集用于PVA含量分析的样品之后，通过倾析从珠粒中分离出加载溶液。将珠粒转移到烧结漏斗并在10分钟内用500毫升去离子水洗涤两次，然后通过抽吸去除水。将水洗液合并并保留样品用于PVA含量分析。将洗涤珠粒返回至圆底烧瓶，并加入1升去离子水。重新进行搅拌，并加入1毫升50％戊二醛水溶液，然后立即加入8毫升5N盐酸。在室温下再搅拌24小时之后，将珠粒转移到烧结漏斗，排水，用1升去离子水洗涤3次，然后放置在一边作为湿淤浆。
该实施例说明，按照本发明的球形多氟化颗粒可容易按照该方式涂以聚乙烯醇。
实施例6：用PVA涂覆苯乙烯系含氟聚合物颗粒
同样使用按照实施例3的方式制成的干燥含氟聚合物颗粒，将50克颗粒浸渍在甲醇中并按照实施例5的方式涂以PVA，只是PVA在水溶液中的浓度升至20克/升。
实施例7：用PVA涂覆甲基丙烯酸系含氟聚合物颗粒
在该实施例中，按照实施例5的方式将按照实施例4的方式制成的50克含氟聚合物颗粒涂以PVA。
实施例8：含氟聚合物颗粒上的PVA涂层的测量
PVA的浓度这样测定：在690纳米下测定PVA/碘/硼酸复合物的吸光率并将它与使用标准PVA溶液制成的校正曲线进行比较。量热分析的线性范围为最高1毫克PVA/毫升。吸附在树脂上的PVA的量由起始涂布溶液浓度减去最终溶液浓度的差值而确定。结果以毫克或克PVA/克干树脂记录。
对于9.31毫克/毫升PVA涂布溶液，用蒸馏水稀释样品100倍。将在1)中制备的2.0毫升样品与0.5毫升0.6M硼酸溶液和0.1毫升KI/I2溶液一起移液至比色杯。混合并在黑暗中放置30+5分钟，然后测定在690纳米下的吸光率。由以下关系计算吸附到含氟聚合物珠粒上的PVA的重量：
Figure A0080966600161
其中：
Ci＝起始PVA涂布溶液的浓度(毫克/毫升)
Vi＝PVA涂布溶液的体积(毫升)
Cf＝PVA涂布溶液在涂布过程结束时的浓度(毫克/毫升)
Vf＝涂布溶液的最终体积(毫升)
Vf可由于来自润湿溶剂的贡献而大于Vi
W＝用于涂布过程的干含氟聚合物的重量(克)
通过使用该方法，吸附到全氟化聚合物上的PVA的量测定为每克按照实施例5制成的干含氟聚合物0.4克PVA、和每克按照实施例7制成的干含氟聚合物1.51克PVA。
该实施例说明，本发明的多氟化聚合物被聚乙烯醇涂覆良好。
实施例9：PVA涂覆含氟聚合物颗粒的HSA容量的测定
测试按照实施例5的方式制备并涂有高含量PVA的含氟聚合物颗粒的人血清白蛋白(HSA)容量。尤其是，将4毫升的HSA在20mM磷酸盐缓冲剂(在pH值7.4下)中的4毫克/毫升溶液加入0.5克按照实施例5制备的PVA涂覆珠粒，然后将所得淤浆在室温下在平板床混合器上旋转16小时。HSA在上层清液中的浓度随后使用Bradford分析来测定。非特定键接到树脂上的蛋白质的量为2毫克/克干含氟聚合物，由差值计算。
该实施例清楚地说明，蛋白质更有效地连接到未涂覆本发明基底上，这是与连接到相应的涂覆基底上相比。
实施例10：PVA涂覆含氟聚合物颗粒的HSA容量的测定
按照实施例9的相同步骤，测试按照实施例5的方式制备并涂有低含量PVA的含氟聚合物颗粒的HSA容量。吸附的HAS量经测定为12.5mg/g干树脂。
该实施例表明，如果将聚乙烯醇涂覆到本发明的多氟化颗粒上，它是一种均匀的有效涂覆。
实施例11：PVA涂覆含氟聚合物颗粒的溶菌酶容量的测定
按照实施例9的相同步骤，测试按照实施例6的方式制备并涂有高含量PVA的含氟聚合物颗粒的溶菌酶容量。尤其是，将4毫升的溶菌酶在20mM碳酸盐缓冲剂(在pH值9.0下)中的4毫克/毫升溶液加入0.5克按照实施例6制备的PVA涂覆珠粒。将所得淤浆在室温下在平板床混合器上旋转16小时。溶菌酶在上层清液中的浓度随后根据上层清液在280纳米处的吸收值来测定。非特定键接到含氟聚合物珠粒上的蛋白质的量为5毫克/克干树脂，由差值计算。
实施例12：蛋白质的尺寸排斥色谱
用按照实施例5制成并用20nM磷酸盐缓冲剂(在pH值7.0下)平衡的含氟聚合物颗粒填充一个10毫升Pharmacia HR 10/30柱。柱空隙体积(Vo)通过测定Blue Dextran 2000(0.5毫升注射量，4毫克/毫升，在pH值7.0下的20mM磷酸盐缓冲剂)的洗脱体积(Ve)来测定。0.05毫升的10毫克/毫升核糖核酸酶A、卵白蛋白和醛缩酶分别加载到柱上并以0.02毫升/分钟的速率用平衡缓冲剂洗脱。类似地，将胰凝乳蛋白酶原A和牛血清白蛋白的溶液加载到柱上并以0.02毫升/分钟的流速用平衡缓冲剂洗脱。各种蛋白质的洗脱体积由色谱(UV检测)及其相应分配系数(Kav)来确定，所述分配系数使用以下等式计算：
                  Kav＝(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
其中Vt是柱的总体积。
汇总于下表1的结果给出了分配系数与球状蛋白质的分子量之间的预期反比关系。表1
    蛋白质     分子量(道尔顿)    分配系数
    核糖核酸酶A     13,700     1
    胰凝乳蛋白酶原A     25,000     0.36
    卵白蛋白     43,000     0.18
    白蛋白     67,000     0.13
    醛缩酶     158,000     0.07
实施例13：蓝色染料对PVA涂覆含氟聚合物颗粒的连接
该实施例涉及蓝色染料在低浓度下在PVA涂覆含氟聚合物颗粒上的连接作用。
向按照实施例5制成的1毫升PVA涂覆含氟聚合物珠粒中加入50微摩尔(40毫克)Cibacron Blue F3G-A在8.4毫升水和250微升2M氯化钠中的溶液。在平板床混合器上混合30分钟之后，加入500微摩尔碳酸钠并将淤浆在80℃下滚动混合16小时。随后在玻璃烧结漏斗分别用50毫升的水、1M氯化钠、二甲基甲酰胺、水、3％(体积/体积)甲醇/水、水、甲醇、水、1M氢氧化钠和最后100毫升的多份水洗涤这些珠粒，保留滤液，直到滤液变澄清。连接到树脂上的Cibacron BlueF3G-A的量-15微摩尔/毫升通过测定洗涤溶液中的染料浓度(由620纳米处的吸光率确定)并计算连接量差值而确定。
实施例14：蓝色染料对PVA涂覆含氟聚合物颗粒的连接
该实施例涉及，用高浓度的蓝色染料将Cibacron Blue F3G-A染料连接到PVA涂覆苯乙烯系含氟聚合物颗粒上。按照实施例6的相同方式用PVA涂覆树脂，只是用于溶解50毫摩尔蓝色染料的水的量为1毫升。按照实施例13的方式施用该染料。所得配体密度为25微摩尔/毫升含氟聚合物颗粒。
实施例15：亲和聚合物的溶菌酶容量
使用按照实施例13的方式制成的含氟聚合物进行该实施例，其中包含键接有低密度配体的蓝色染料。将按照实施例13制成并用磷酸钠缓冲剂(20mM，pH值7.0)平衡的树脂填充一个1毫升Pharmacia HR5/10柱。以1毫升/分钟的速率将溶菌酶在平衡缓冲剂中的4毫升5毫克/毫升溶液加载到树脂上。溶菌酶随后使用在20mM磷酸钠缓冲剂(pH值7.4)中的1M氯化钠从树脂中洗脱。洗脱的溶菌酶的量为18毫克/毫升含氟聚合物，通过测定洗脱液在280纳米处的吸收值而确定。
该实施例应该与其中没有将蓝色染料连接至聚乙烯醇的实施例11比较。
实施例16：亲和聚合物的溶菌酶容量
使用按照实施例14的方式制成的含氟聚合物进行该实施例，但具有高配体密度。洗脱的溶菌酶的量为20毫克/毫升树脂。
实施例17：亲和聚合物对肌红蛋白的非吸附作用
使用按照实施例14的步骤制备出含氟聚合物，其中使用肌红蛋白作为蛋白质。没有检测到聚合物对蛋白质的吸附。
实施例18：床膨胀
在该试验中，使用按照实施例14的方式制成并随后筛选至63-82微米粒径范围的含氟聚合物颗粒填充一个40厘米×1厘米柱。将水在该柱中抽吸上流并在各种流速下测定床膨胀比率(在给定流速下的床深度相对没有流动时的床深度的比率)He/Ho。结果汇总于表2。
表2
    流速(厘米/小时)      8     25      40     55     68
    床膨胀比率(He/Ho)     1.2    1.7    1.75    1.9    2.1
这些数据说明了本发明颗粒的有利用途，因为它们具有较高的密度，即，1.2克/毫升相对已有技术聚合物颗粒的仅1.09克/毫升。
实施例19-27：树脂的化学稳定性
进行一系列试验以确定按照实施例3制成的吸附剂树脂的化学稳定性。对于该系列，将200毫克按照实施例14制成的含氟聚合物颗粒浸渍在2毫升所给溶剂中。通过监控上层清液在620纳米处的吸收值，检查Cibacron Blue F3G-A在整个过程中的泄漏。在37天之后在上层清液中测定的染料浓度汇总表3。表3
    溶剂(微摩尔)     染料浓度
    实施例19     25％甘油水溶液     0.008
    实施例20   1％十二烷基硫酸钠水溶液     0.008
    实施例21     8M尿素     0.004
    实施例22     1M的NaSCN     0.01
    实施例23     5M HCl     0.002
    实施例24     二甲基甲酰胺     0.01
    实施例25     甲醇     未测定
    实施例26     丙酮     未测定
    实施例27     水     0.002
实施例28：本发明未涂覆多氟化颗粒在反相色谱中的应用
将按照实施例3和4的方式制成的聚合物颗粒在1600psi下填充到250厘米长和0.46厘米内径的不锈钢柱中。淤浆溶剂为50/50体积的甲醇/异丙醇。梯度测试混合物溶剂为具有0.1％TFA的50/50体积的乙腈/水。流动相为A＝具有0.1％TFA的水，B＝具有0.1％TFA的乙腈。测试混合物为维生素B-12(1.0毫克)、牛胰岛素(3.0毫克)、核糖核酸酶A(3.0毫克)、人白蛋白(3.0毫克)和甲状腺球蛋白(3.0毫克)。表4给出了保留时间(分钟)，其中比较甲基丙烯酸系颗粒与本发明五氟苯乙烯聚合物颗粒的效力。
                     表4五氟苯乙烯聚合物和氟化甲基丙烯酸系聚合物基底在反相色谱中
                    的效力
    溶质      五氟苯乙烯聚合物    氟化甲基丙烯酸系聚合物
              (保留时间，分钟)
  维生素B-12        1.00                  1.00
  牛胰岛素          1.59                  1.75
  核糖核酸酶A       1.83                  2.02
  人白蛋白          2.08                  2.32
  甲状腺球蛋白      2.40                  2.72
数据的相互关系表明，得到了光滑的对称的、非重叠的曲线。因此，数据清楚地表明，未涂覆五氟苯乙烯聚合物和未涂覆氟化甲基丙烯酸系聚合物颗粒是有效用于色谱分离蛋白质之类物质的混合物的媒质。
实施例29：
使用填充有未涂覆多氟化树脂颗粒的实施例28柱，将柱用60柱体积的5.0当量氢氧化钠溶液，然后用60柱体积的去离子水进行洗涤。随后再注入溶质并观察到与实施例28结果相同的梯度。尤其是，苛性物洗涤树脂表现出与未进行该洗涤的树脂相同的保留时间，因此说明了该颗粒的坚固性。
实施例30：合成变量的改变以生产各种不同粒径的聚氟苯乙烯颗粒
                               表5
          工艺变量的改变以制备各种不同粒径
    粒径，微米     16     120
    反应物
    去离子水，毫升     660     490
    聚乙烯醇，克     16     3.9
    五氟苯乙烯，克     10     39.8
    二甲基丙烯酸乙二醇酯，克     14     55.7
    邻苯二甲酸二丁酯，克     32     127
    偶氮二异丁腈，克     0.12     0.48
    过氧化苯甲酰，克     0.12     0.49
    月桂基硫酸钠，克     0.06     无
    搅拌器速度，rpm     900     395
通过参阅本发明吸附剂的性能特性并将这些特性与其它广泛使用的吸附剂材料的性能进行比较，由以上表5中的数据显然看出，本发明的多氟化吸附剂在所有物理和化学性能上一致地高，这对其功能是重要的。
表6
本发明与其它市售色谱载体的比较
    基质 化学稳定性(ph) 机械稳定性   对大分子(maccro)的渗透性   非特定吸附 衍生的容易性 耐5N NaOH性
    琼脂糖     4-9     低     优异     低     良好     差
    交联的     2-14     低     优异     低     良好     差
    交联葡聚糖     72     低     差     低     良好     差
    交联聚丙烯酰胺     2-10     中等     差     低     良好     差
    聚丙烯酰胺/葡聚糖     3-11     低     优异     中等     良好     差
    聚丙烯酰胺/琼脂糖     3-10     中等     良好     中等     良好     差
交联甲基丙烯酸羟乙基酯     1-14     高     良好     高     差   非常差
    硅石     2-9     高     良好     高     差   非常差
  聚苯乙烯/二乙烯基苯     1-14     高     良好     高     良好   良好
具有亲水表面涂层的本发明多氟化颗粒     1-14     高     优异     低     优异   优异
从表6数据可以容易地看出，本发明的吸附剂在非常宽的pH值范围内化学稳定并具有高机械稳定性。本发明吸附剂还具有优异的大分子渗透性且十分理想地具有低的非特定吸附性能。此外，所要求保护的吸附剂具有优异的衍生容易性和对5N氢氧化钠溶液的腐蚀作用的优异耐受性。其它的熟知吸附剂无一在所列的所有功能上重要的性能方面具有这种均一的突出性能。
实施例31：本发明多氟化颗粒在分离质粒的组分中的应用。
将质粒(Amp耐受的)转化宿主(DH5-α)在浓介质中生长至高密度并将细菌粒料进行碱性溶解工艺。过滤溶菌产物并随后用0.7体积的冰冷异丙醇(IPA)通过在8000×g下离心处理45分钟而沉淀。使用离心得到的液体作为待色谱处理的样品。
用包含约90毫升实施例3所述颗粒(50μm，表面积300米2/克，非PVA涂覆)的乙醇淤浆填充一个Vantage-L系列柱(4.4厘米id)。该柱以约20毫升/分钟(约80厘米/小时线性流速)填充并在16毫升/分钟下操作。柱流出物在260纳米下监控并在图形记录器上检测吸收值。该柱用EQB(0.1M磷酸钾，pH值7，2mM磷酸四丁基铵(TBAP)和1％乙醇)平衡，并在流出物的pH值低于9时加载上述待色谱处理的样品(30毫克质量)。洗涤缓冲剂WB1为93％氯化钠/TRIS/EDTA，pH值8，和7％乙醇。洗脱缓冲剂如下：EL1(洗脱缓冲剂1)为0.1M磷酸钾，2mMTBAP，10％乙醇；EL2(洗脱缓冲剂2)为0.1M磷酸钾，2mM TBAP，12.5％乙醇；和EL3(洗脱缓冲剂3)为0.1M磷酸钾，2mM TBAP，10％乙醇。
颗粒分析：
样品1在加载和再平衡步骤过程中收集。在填充柱中的颗粒上不存在DNA。
样品2在WB1经过该柱的同时收集，并包含许多RNA和少量的缺刻开环DNA。
样品3和4在WB1过程中收集。样品3包含少量的超螺旋DNA、更多缺刻/开环DNA和RNA的末端。样品4包含少量DNA。
DNA损失可通过减少WB1的乙醇含量或增加TBAP浓度而减少，后者是优选的，因为这仍然使得能够通过样品4、5和7的乙醇浓度进行种类选择。
样品5(EL1)包含超螺旋DNA和痕量的非超螺旋DNA。
样品6(EL2)包含许多DNA，其中90％以上是超螺旋的。
样品7(EL3)包含残余DNA，其中至少25％是非超螺旋的。
实施例32：二乙烯基苯、五氟苯乙烯的多孔共聚物按照以下方式制备
在30分钟内向490克蒸馏水中加入氮气以清除水中的氧。加入聚乙烯醇(3.9克)。将五氟苯乙烯(30.9克)、二乙烯基苯(55.0克)和邻苯二甲酸二丁酯(127毫升)混合在一起。向该混合单体中加入偶氮二异丁腈(0.40克)和过氧化苯甲酰(0.30克)。将单体和过氧化物催化剂的混合物加入水和PVA的搅拌混合物中。该混合物加热至80℃，其中用马达驱动的搅拌桨在800rpm下搅拌。将该混合物聚合4小时，然后认为该聚合反应已完成。从水中分离出聚合物颗粒并洗涤和干燥。按照实施例1所述去除孔原。所得颗粒是多孔的且粒径为50μm。

Claims (16)

1.一种制备氟化聚合物吸附剂的多孔球形颗粒的方法，包括以下步骤：
(1)形成有机化合物的水不溶性溶液，所述有机化合物包括(a)选自C3-6丙烯酸的C2-4亚烷基二醇酯或二乙烯基苯的单体；(b)多氟化乙烯基单体；(c)选自丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的单体；(d)自由基引发剂；和(e)水不溶性、有机溶剂可溶性孔原材料，所述共聚单体(a)加上(b)加上(c)与孔原材料的重量比为0.5∶1-2∶1；
(2)形成分散剂在其中已用惰性气体清除所有氧的水中的稀溶液；
(3)在搅拌和惰性气体清除下，将来自步骤(1)的有机化合物的水不溶性溶液快速分散到来自步骤(2)的稀水溶液中，并根据需要将分散体的温度调节至30-90℃以引发单体的共聚合，其中混合能水平足以将有机化合物的水不溶性溶液以平均粒径不超过10-300微米的液滴形式分散在步骤(2)的溶液中，其中至少90％的液滴在平均的平均粒径的上下40％以内；
(4)对来自步骤(3)的分散体继续搅拌和氧清除，其时间足以使单体完全共聚反应且液滴通过其中共聚物的沉淀而以细分聚合物颗粒的形式粒化；
(5)从聚合反应介质中分离出细分共聚物颗粒；
(6)通过用惰性有机溶剂洗涤这些颗粒，从步骤(5)的分离共聚物颗粒中萃取孔原材料，这样在该共聚物内形成孔；和
(7)干燥该多孔共聚物颗粒。
2.根据权利要求1的方法，其中所述C3-6丙烯酸的C2-4亚烷基二醇酯选自二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸1，3-丙二醇酯、二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯、衣康酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、和二马来酸乙二醇酯。
3.根据权利要求1的方法，其中所述多氟化单体是全氟化的。
4.根据权利要求1的方法，其中所述多氟化共聚单体是选自五氟苯乙烯、衣康酸双六氟异丙基酯、马来酸双六氟异丙基酯、丙烯酸十七氟癸基酯、甲基丙烯酸全氟辛基酯、甲基丙烯酸2，2，3，3-四氟丙基酯、衣康酸单三氟乙基酯、马来酸2，2，2-三氟乙基酯、全氟辛酸乙烯基苄基酯和三氟乙酸乙烯基酯的化合物。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)的单体(c)是一种或多种选自丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸或甲基丙烯酸的甲基-、乙基-、和羟乙基酯、包含丙烯酸或甲基丙烯酸的酯的环氧化物、以及丙烯酸或甲基丙烯酸的胺酯的化合物。
6.根据权利要求1的方法，其中所述孔原材料选自邻苯二甲酸二丁酯、异丙基苯、甲苯、2-甲基-4-戊酮、2-甲基-4-戊醇、氯苯及其混合物。
7.根据权利要求1-6中任何一项的方法，其中所述方法在70-90℃下进行。
8.一种通过权利要求1-7中任何一项的方法制成的颗粒。
9.根据权利要求8的颗粒，所述颗粒涂有亲水聚合物。
10.根据权利要求9的颗粒，其中所述亲水聚合物是聚乙烯醇。
11.一种用于分离液体溶液的色谱可分离组分的方法，包括，将该液体溶液经过一个根据权利要求8的吸附剂颗粒的床，其中第一组分通过吸附到吸附剂颗粒的表面上而分离，且第二组分则在该吸附剂颗粒上的吸附过程的同时经过该柱。
12.根据权利要求11的方法，它用于进行反相分离。
13.根据权利要求11的方法，它用于进行亲和分离。
14.根据权利要求11的方法，它用于进行膨胀床分离。
15.根据权利要求11的方法，其中所述第一组分是由核苷酸、核苷或多肽组成的大分子。
16.一种医疗设备，包括根据权利要求9的颗粒。
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