CN1328603A - 鉴定一种药物多个初始靶标的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对细胞中药物作用的特征进行描述的方法和***。尤其是本发明提供了鉴定多个初始靶标的方法,一种药物、候选药物或其它目标化合物通过这些初始靶标作用于细胞。这样,本发明还有关于基于所公开方法的药物设计的方法,说明方法用于鉴定一种药物的多个初始靶标。本发明的方法涉及:(ⅰ)测量细胞成分对于细胞梯度暴露于一种感兴趣的药物产生的反应。(ⅱ)鉴定该药物对于每种测量的细胞成分的“反应浓度”;和(ⅲ)从反应浓度的分布鉴定出细胞成分的“表达组”。每一个表达组对应于该药物的一个特定的初始靶标。本发明还提供了计算机***,它能通过执行所公开的方法来鉴定一种药物的多个靶标。

Description

鉴定一种药物多个初始靶标的方法
                     1.发明领域
本发明的领域涉及对细胞中药物作用的特征进行描述的方法和***。尤其，本发明的方法和***涉及确定一种药物、候选药物或其他目标化合物是否改变细胞中的多个初始靶标(primary target)，同时有关于应用这些方法去发现药物。
                         2.背景
鉴定一种药物或候选药物多个初始靶标是药物发现过程中非常重要的一个问题。尤其在药物发现中的一个大问题是鉴定对于特定初始靶标有选择性作用的化合物。
现在寻找新药主要有两种方法占优势。第一种方法首先筛选对于细胞(如，诱导凋亡)或生物体(如，抑制血管生成)具有预期作用的化合物，这些作用通过特定的生物试验进行测量。具有预期作用的化合物然后可以通过修饰提高效力、稳定性或其他特性并对修饰的化合物在试验中再次测试。这样，在一种小鼠肿瘤模型中测试可以鉴定出一种起抑制血管生成作用的化合物，合成结构相关的化合物并在相同的试验中测试，这一方法的一个主要限制是这种作用的机制，例如受这种化合物影响的分子靶标和细胞通道，经常是未知的并且不能通过筛选确定。另外，该添加物可能不能提供有关该药物基于靶或通道的效果特异性的信息。不同的，第二种筛选药物的方法涉及对已知分子靶标使用大量的化合物测试以获得特定的效果。该分子靶标一般是一种分离的酶或蛋白的克隆基因序列。例如，可以进行高通量分析试验大量的化合物以获得它们改变从特定启动子转录的水平或者结合已知蛋白的能力。
使用高通量筛选对于鉴定候选药物是一种强有力的方法，然而它也有缺陷，尤其是试验提供很少或无法提供有关化合物在细胞或生物体水平上的效果的信息。为了把一种导向化合物开发成成功的药物，不仅需要找到能与被筛选的初始靶标良好结合的化合物，还要保证该化合物不能同时与细胞内的其他靶标互相作用。必须把该药物置于一系列细胞生物学和完整动物研究中进行测试以确定其在体内的副作用毒性。实际上，分析候选药物的特异性和毒性可以占掉药物开发过程很大一部分(参见，例如，Olfiietal.，1997，“药物开发的分子靶标，”in DeVita et al.，Cancer：Principles&Proctice ofOncology，5th Ed.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA)。
若干基因表达试验现在已适用于定量药物对于细胞培养物中大部分基因和蛋白的作用(参见，例如，Schena et al.，1995，Science270：267～270；Lockhort et al.，1996，Nature Biotechnology14：1695～1680；Blanchard et al.，1996，Nature Biotechnology14：1649；Ashby et al.，1996年10月29日授权的美国专利5,569,588 29，1996)。从这些基因表达试验得到的原始数据经常很难连贯地解释。这样的测量技术一般会得到大量的因药物反应而改变表达的基因，一般50～100，也可能多至1000或少至10。在一般情况下，如果不进一步分析就不可能仅仅从这些数据中分辨出原因和结果。许多基因中的一个或一些基因在一对相关的生物状态下表达发生改变，这一事实无法使人们了解是什么导致了这一变化和这一变化所起的作用是什么。这些数据不能告诉研究者有关被影响的通道或药物初始靶标的信息。它们无法表明哪些效果是由于作用于某一特定初始靶标(例如，在高通量试验中筛选出的靶标)而产生的，而哪些效果是药物其他初始靶标而产生的。
知道所有的初始靶标对于理解药效，副作用毒性，药效可能的失败，代谢反应的激活等都是必要的。另外，鉴定一种药物的所有初始靶标有利于发现替代的初始靶标，该靶标可以适于产生最初的治疗反应。然而，没有有效的分析方法，就需要做特别的进一步实验以使用生物通道和机制来解释这些基因表达结果，需要***的方法来指导解释这些数据和实验。
这样就存在着对鉴定细胞中多个初始靶标改善的(如，更快更便宜)的***和方法的需求。这些***和方法基于对这些基因表达数据的有效解释。
这里被讨论和引用的参考文献不应被理解为承认这些参考文献是本发明的现有技术。
                       3.发明概述
本发明涉及测试和确定初始靶标数目的方法和***，药物或其他感兴趣的化合物通过这些初始靶标作用于细胞。本发明还涉及鉴定受到一种药物或其他感兴趣的化合物每一个初始靶标影响的蛋白和基因的方法和***。另外，本发明还涉及药物开发的方法，该方法基于测试和确定初始靶标数目的方法，药物或候选药物通过这些初始靶标作用于细胞。
本发明方法的原理涉及分析对细胞成分对，如RNA或蛋白丰度或活性，对于变化的药物暴露强度的反应的测量。这些反应被分析用于确定每一个单独测量的细胞成分的药物浓度，在该药物浓度上该细胞成分被激活(即表达或活性的增加)或失活(即表达或活性的降低)。这样确定的药物浓度的分布被分析以鉴定在某一特定药物浓度上被激活的细胞成分族或组。由于一种药物对于不同的初始靶标一般有不同的效力，确定这些细胞成分“表达组”是鉴定一种药物或感兴趣的化合物初始靶标存在的关键因子。
本发明基于至少部分基于以下发现：一种药物的单独的初始靶标参与多个二级和三级基因表达变化，它们形成连贯的“表达组”。这些连贯的“表达组”在一种药物的特定浓度下被激活或失活。这样，根据本发明的方法，可以通过鉴定在某特定药物浓度下被激活(或失活)的独立的表达组来确定该药物的独立的初始靶标。该方法不需要鉴定一种药物通路中的独立的成分，例如，使用遗传或药物表现型。而仅仅是，相应于一种药物独立初始靶标的表达组可以通过对于不同药物暴露强度下RNA或蛋白丰度或活性的简单分析而鉴定出来。
本发明通过提供鉴定一种药物在细胞中的多个初始靶标的方法克服了现有技术的缺陷。这样，本发明的方法适用于，例如，药物发现或筛选，不仅能鉴定出对于某一特定初始靶标有很高亲和性的化合物，同时能够保证该化合物不能同时在细胞内与其他靶标相互作用。更具体一些，本发明提供鉴定一种药物在细胞内的一个或多个初始靶标的方法和***，通过：(i)测量细胞成分对于感兴趣的药物梯度暴露而发生的反应；(ii)为每一个测量的细胞成分确定其对该药物的“反应浓度”；和(iii)从反应药物浓度的分布确定细胞成分的“表达组”。该药物初始靶标的数目就是鉴定出来的表达组的数目。
在不同的方案中，细胞成分的反应可以通过测量基因表达(即RNA水平)、蛋白丰度、蛋白活性或这些测量的组合而得到。在不同的方案中，反应浓度可通过以下两种方式确定：从细胞成分对药物梯度暴露反应的最大(或最小)斜率或者反应是渐近线一半数值时的药物暴露。
在第一种方案中本发明提供了鉴定一种药物在一种细胞类型中一个或多个初始靶标的方法，该方法包括鉴定一个或多个表达组，其中：(a)每一个表达组包含多个细胞成分，每一个细胞成分有一个与该药物相关的反应浓度；(b)一种细胞成分的反应浓度是通过特定的药物暴露水平而确定的，在该水平上细胞成分由于药物而被激活或失活；和(c)药物反应是通过以下方法确定的，该方法包括测量该细胞类型中一个细胞的多个细胞成分在多个药物暴露水平下的反应。每一个表达组对应于该药物的一个初始靶标。在第一种方案的不同方面，一种细胞成分的反应浓度可能是，例如，药物暴露水平，其中该细胞成分药物反应的绝对斜率最大或者药物反应为它的渐近线值的一半。在第一种方案的不同方面，表达组从多数细胞成分反应浓度的分布图或直方图进行鉴定，其中每一个表达组对应于直方图中的一个众数(mode)。直方图中的众数可以通过视觉检查或对象统计分析进行鉴定。在第一种方案的某一特定方面，该对象统计分析基于Fisher Distance。
本发明在第二种方案中还提供了根据本发明第一种方案所描述的方法鉴定一种细胞类型物理环境变化中的一个或多个初始靶标。
在另一种方案中，本发明提供了比较2种或多种药物或药物组合物(composition)的众数的方法。该方案的方法涉及根据第一种方案的方法鉴定每种药物或药物组合物的初始靶标并比较这样鉴定出来的初始靶标。在方案的一个特定方面，二种或多种药物或药物组合物包括同一药物的不同组合。
在另一种方案中，本发明提供了鉴定一个或多个初始靶标的计算机***。本发明这一方案的计算机***包括：(a)一个处理器；(b)一个与处理器相连的存贮器和(c)由存贮器编码的一个或多个程序。这些程序使处理器能够鉴定一个或多个表达组，其中：(i)每个表达组包含多种细胞成分，每种细胞成分都有与该药物相关的反应浓度；(ii)每种细胞成分的反应浓度确定于鉴定的药物暴露水平，在该水平上该细胞成分被药物激活或失活；和(iii)药物反应由一种方法提供，该方法包括在多种药物暴露水平下测量该细胞类型一个细胞的多种成分。每个由处理器鉴定出来的表达组相应于该药物的一个初始靶标。在第二种方案的不同方面，反应浓度可能在计算机***的存贮器获得。例如，由用户装入存贮器。在第二种方案的不同方面，反应分布图可以在计算机***的存贮器中获得，例如，由用户装入存贮器在一个特定的方案中，该计算机***的程序进一步使得处理器能够由存在于存贮器中的药物反应确定反应浓度。
4.附图简述
图1显示了药物D对生物体系使用的假设示范通道。
图2显示了药物D通过作用于两个初始靶标：P1和P2对生物体系发生作用的假设示范通道。
图3显示了本发明计算机***的示例方案。
图4显示了啤酒糖酵母大概6000个被测基因中的50个基因的药物反应数据。它们对于药物FD506有着最大的表达比例变化；实线显示的转录效果是通过钙调磷酸酶蛋白；虚线显示的转录效果是通过Gcn4转录因子。
图5显示了啤酒糖酵母基因YAP6对图4中显示的FK506药物的反应的Hill函数拟合；对于Hill函数(方程2)的最小平方拟合有如下参数：振幅参数a＝0.4，幂指数n＝1，和u0＝4.6(或者log10(u0)＝0.66)。
图6显示了反应浓度X0的分布，它是由对图4显示的反应进行Hill函数拟合而得到的；反应浓度的分布很明显是双峰的。
图7显示了酵母菌株R1446中ERG11基因转录被调控抑制的反应数据。该菌株含有一个受脱氧土霉素调控的Tet-启动子构建体；因此转录反应都是通过一个单独的初始靶标：ERG11蛋白介导的；ERG11转录本身的降低显示于下面的曲线。
图8显示了反应浓度X0的单峰分布。X0是通过对图7中显示的反应进行Hill函数拟合而得到的。
图9显示了酵母菌株R1918中HMG2基因转录被调控抑制的反应数据，该菌株含有受脱氧土霉素调控的tet-启动子构建体；转录反应都是通过一个单独的初始靶标：HMG2蛋白介导的。
图10显示了反应浓度X0的分布，X0是通过对图9中显示的反应进行Hill函数拟合而得到的。
图11显示了对于图6中显示的直方图Fisher Distance的计算。
图12显示了图6中FK506药物滴定实验直方图最大FisherDistance FDmax的计算图12A显示了图6的直方图，竖线代表分割位置γ的值，此时Fisher Distance最大；图12B是Fisher Distance随γ变化的平面图。
图13显示了反应药物浓度单峰分布的Monte Carlo实现的最大Fisher Distance统计值分布；图13A显示了均匀分布的Monte Carlo实现的最大Fisher Distance统计值分布；图13B显示了三角分布的Monte Carlo实现的最大Fisher Distance统计值分布(即，从最左侧的0处陡升至右侧任意大)。
图14显示了图8中特定ERG11蛋白扰乱实验直方图的最大Fisher Distance FDmax的计算；图14A显示了图8的直方图。垂直线表示分区位置γ的值，此时的Fisher Distance最大；图14B是FisherDistance相对于γ的平面图。
                        5.发明详述
这一部分对本发明及其在药物发现中的应用进行了详细的描述。这些描述通过若干范例说明的方式以提高本发明一般方法的细节和明确性。这些实例是非限制性的，对于本领域的研究人员很明显的变体包含在附加的权利要求中，这些实施例之后是伴随着一般方法的数据收集步骤的特定方案描述。
                         5.1简介
本发明涉及在细胞中鉴定一种药物，候选药物或其他感兴趣的化合物的一个或多个初始靶标的方法和***。尤其是，本发明的方法和***能够确定细胞中受药物影响的初始靶标的数目。这些方法涉及分析细胞对于药物梯度暴露反应中生物状态的变化值，以便确定每种细胞成分的药物浓度，在该浓度下该细胞成分会变激活或失活。这些“反应药物浓度”的分布，尤其是这些分布的形式(即单峰、双峰、三峰等)确定了细胞中受药物影响的初始靶标的数目。
这一部分首先描述一些初步的概念，包括药物作用、细胞生物状态、生物通道，根据本发明，它们在细胞中描述药物作用。接下来，描述了本发明方法的***的非限制的概要。再接下来的部分更详细地描述本发明的方法。
虽然为了说明的方便，本说明经常提到单一的细胞(例如，“RNA是从一种在单个基因被微扰的细胞中提取的”)，而本领域的技术人员会这样理解：更多的时候，本发明的任何特定步骤都是使用多数遗传相似的细胞，例如，来自一种培养的细胞系而进行的。这些相似的细胞在这里被称作一种“细胞类型”。这些细胞要么来源于自然的单细胞生物体，或者来源于多细胞高等生物体。
具体的，5.1节描述了一些初步的概念，它们会用于本发明的进一步描述中。5.2节描述本发明的方法。5.3节描述本发明的一个优选分析方案。5.4节描述了测量细胞成分的方法。
                5.1.1药物作用和生物状态
根据本发明，药物是任何复杂程度的化合物。它能微扰生物体系，不管是通过已知还是未知的机制，不管是否应用于治疗。这样药物就包括：典型的研究或治疗用小分子；自然生成的因子，如内分泌，旁分泌或自分泌因子或者与所有类型细胞受体互相作用的因子；细胞内因子，如细胞内信号通道元素；从其它天然来源分离的因子；农药；除草剂；杀虫剂等。一种药物的生物效果可能是由以下药物介导的变化而引起的：一种或多种RNA转录或降解的速率，一种或多种多肽的翻译速率或程序或翻译后加工，一种或多种蛋白降解的速率或程度，一种或多种蛋白的作用或活性的抑制或激活，等等。实际上，大多数药物通过与蛋白的相互作用发挥它们的作用。能够提高蛋白速率或激发其活性或水平的药物在这里被称作“激活药物”。而降低蛋白速率或抑制其活性或水平的药物在这里被叫做“抑制药物”。本领域的技术人员可以知道，虽然本发明在这里描述为鉴定“药物”的初始靶标。它同样适用于鉴定一种特定组合物的初始靶标，该组合物包含一种药物，但它的初始靶标与另一种包含同样药物但还含有另外不同成分的组合物的初始靶标可能不同。
鉴定药物在细胞内初始靶标的方法可用于，例如，确定治疗效率(例如，如果一种或多种具体的治疗细胞成分是主要药物靶标)；确定副作用和/或毒性的可能(例如，如果存在其他主要药物靶标)；通过测试是否存在相同的作用众数来比较两种或多种不同的药物或药物混合物的药物作用众数。例如，在ANDA加工期间，最后一点，不同的药物可能包含，例如同一药效基团的不同组合物或成药。
除了药物，本发明同样适用于自然环境的变化以靶向方式微扰生物体系。这些环境变化可以包括温度的温和变化(例如，温度升高10℃)或者暴露于温和剂量的辐射中。其它环境方面包括营养环境，如只存在特定的糖、氨基酸等。
在本发明中一种药物(或自然环境变化)所引起的生物反应是通过观察细胞生物状态的改变而测量的。该细胞可以是任何类型的，例如，原核的、真核的、哺乳动物的、植物的或者动物的。这里所说的细胞生物状态是指细胞成分总体的状态，它是以为了一定的目的对细胞进行鉴定，如鉴定药物的效果。对于这些细胞成分状态的测量和/或观察可以是它们的丰度(即细胞中的量或浓度)，或它们的活性，或它们修饰的状态(如磷酸化)，或其他与药物作用鉴定相关的测量。在不同的方案中，本发明包括对不同细胞成分的总体进行这些的测量和/或观察。这些不同的细胞成分的总体又叫做细胞生物状态的方面。这里所用的术语“细胞成份”不是指已知的亚细胞细胞器，如线粒体、溶酶体等。
本发明中测量的细胞生物状态的一个方面是它的转录状态。细胞的转录状态包括在一系列给定条件下组成RNA种类的本身和丰度，尤其是mRNA。最好是细胞中所有组成RNA种类的大部分都被测量，但至少测量足够的部分以鉴定药物的作用。转录状态是本发明现在优选测量的生物状态方面。它很容易通过使用若干存在的基因表达技术测量cDNA丰度而得以确定。
本发明中测量的细胞生物状态的另一方面是它的翻译状态。细胞的翻译状态包括在一系列给定条件下组成蛋白种类的本身及其丰度。最好是细胞中所有组成蛋白种类的大部分都被测量，但至少测量足够的部分以鉴定药物作用，本领域的技术人员知道，转录状态经常代表着翻译状态。
细胞生物状态的其他方面在本发明中也是有用的。例如，细胞的活性状态，该术语在这里包括在一系列给定条件下组成蛋白种类(可以是具有催化活性的核酸种类)的活性。本领域的技术人员知道，翻译状态经常代表着活性状态。
本发明还适用于细胞生物状态的“混合”方面，即把不同细胞生物状态的方面组合在一起。例如，在一种混合方面中，一些RNA种类和一些蛋白种类的丰度与一些其他蛋白的活性测量结合到一起。另外，从下文可以理解到，本发明还适用于其他可测量的细胞生物状态方面。
在本发明的具体方案中，药物暴露一般会改变被测量和/或观察的细胞生物状态某一方面的许多成分。例如，作为已知存在于细胞中的调控、体内平衡和补偿网络和体系的结果，即使是一种“理想药物”，即，一种只直接影响细胞中单独成分的药物，而对任何其他成分没有直接影响，也会造成复杂的经常不可预料的非直接影响。一种特异性完全抑制一种单一假设蛋白，蛋白P活性的药物在这里被作为一个例子。虽然药物本身只会直接改变蛋白P的活性，但是那些被蛋白P抑制或激活的另外的细胞成分，或者因补偿蛋白P活性丧失而提高或减少的细胞成分也会受到影响。并且二阶成分水平或活性的变化又会影响其他细胞成分，以此类推。因此，该药物对它的靶标，蛋白P的直接作用隐藏于蛋白P下游的大量非直接影响。这些蛋白P的下游效果在这里被称作起源于蛋白P的生物通道。
相应地，一种“非理想”药物直接影响不止一种分子靶标，可能有更复杂的下游效果。根据本发明，在一方面，对于这些效果的分析提供了有关该药物的大量信息，例如，鉴定该药物所影响的生物通道，可以解释该药物在细胞中的作用和毒性副作用。在相关的方面，本发明提供了进行这一分析的方法。
在本发明中，测量细胞转录状态作为优选不仅仅是因为测量相对容易，还因为，虽然药物可能通过一种转录后机制发生作用(如抑制蛋白的活性或改变它的降解速率)，对细胞用药总能通过直接或间接的影响使转录状态产生可测量的改变。药物暴露改变细胞转录状态的一个原因是前面提到的反馈***或网络，它们以一种补偿方式对于感染、遗传改变、环境变化(包括用药)等作出反应，主要是通过改变基因表达或转录的方式。作为内部补偿的结果，许多对于生物体系的微扰，虽然对体系的外部行为只有很微弱的影响，然而能够对于细胞内的单独元素，例如，基因表达的内部反应产生深刻的影响。
                      5.1.2生物通道
在本发明中，对于细胞的药物作用，不管是理想的或是非理想的药物，不管在具体的操作中如何测量，都是由单独的生物通道的药物作用的组合完成的。例如，图1显示药物D通过与生物通道101，102和103(通道103的细节没有显示)互相作用而作用于细胞。药物D与这些通道之间的弧线代表着药物D对这些通道可能的作用。药物D对细胞的全部作用被认为是药物D对这三个通道中的一个或多个发生作用的组合。
这里所说的生物通道一般认为是一些相互联系的细胞成分的总体。该总体中的每一个细胞成分都由于某些生物机制而受到该总体中其他一个或多个细胞成分的影响。组成一条具体的通道的细胞成分可以从一个细胞的生物状态和任何方面得到。例如，从转录状态或者翻译状态，或者活性状态，或者生物状态的混合方面。因此，通道的细胞成分可以包含mRAN水平，蛋白丰度，蛋白活性，蛋白或核糖修饰程度(例如磷酸化或甲基化)，这些细胞成分类型的组合，等等。总体中的每一个细胞成分通过某些生物机制至少受到该总体中其他一个细胞成分的影响，这些生物机制无需指明甚至理解。这里的附图说明中，一种细胞成分对另一种的影响，不管是直接的还是间接的都用两细胞成分之间的弧线表示，整个通道由连结通道中细胞成分的弧线网络表示因此一个生物通道指的是从一些生物状态方面获得的细胞成分的总体和这些细胞成分间影响的网络。
例如，在图1中，生物通道101包括蛋白P1(例如P1的丰度或活性)和基因G1，G2和G3(例如，它们的转录mRNA水平)以及蛋白P1对这三个基因直接或间接的影响，用从P1到这三个基因的弧线表示。这种影响的机制可能是，例如，由于P1能够与这些基因的启动子结合而提高它们的转录体的丰度。
这里所理解的生物通道的具体例子为本领域所熟知，它们依靠不同的生物机制实现细胞成分间的作用。生物通道包括熟知的生化合成通道，其中例如分子被打断以提供细胞能量或者分子建成以提供能量储备或者其中合成蛋白或核酸的前体。合成通道中的细胞成分包括酶和合成媒介物。前体分子对后继分子的影响通过直接酶介导的转变生物通道还包括信号和调控通道，它们中的许多例子也为人们熟知。这些通道的细胞成分一般包括，主要或媒介信号分子，和参与信号或调控级联的蛋白，它们常用于鉴定这些通道。在信号通道中，信号分子与受体结合通常直接影响媒介信号分子的丰度并间接影响通道蛋白磷酸化(或其他修饰)的程度。这两种影响接下来影响细胞蛋白的活性，例如通过影响细胞的转录状态，而这些细胞蛋白是由该信号启动的细胞过程的主要受动器。调控通道与此类似，例如调控细胞周期时间和发生的调控通道。这里，多个，经常是进行中的，细胞行为是时间上协调的，经常带有反馈调控，以获得调和的结果。例如细胞***与染色体分离。这种协调是通道作用的结果，该通道经常由蛋白间互相影响磷酸化(或其它修饰)的程度来介导。同时，面对波动的环境，熟知的调控通道寻求维持细胞代谢的最佳水平。基于已知机制的细胞通道操作的其他例子为本领域的技术人员所已知。
本发明中特定兴趣的通道被定义为“起始”于特定细胞成份的通道。一种起始于特定细胞成分的通道包括那些直接受到该特定细胞成分影响的第二组细胞成分，还有受到第二组细胞成分直接影响的第三组细胞成份等等，和这些组内的细胞成分间影响的网络。这些细胞成分之间的影响可以基于任何生物机制，例如，一种信号机制，或者一种调控或体内平衡控制机制，或者一种综合机制。在图1中，通道101，包括一个蛋白和几种基因，起始于蛋白P1。通道102包括2个蛋白和几种基因，起始于蛋白P2和P3。
生物通道可以是阶梯式的或是非阶梯式的。一般情况下，一种阶梯式生物通道没有反馈圈。更具体一些，阶梯通道中的细胞成分可以安排在标有数字水平的阶梯里以致于属于特定数字水平的细胞成分只能受到属于低一些数字水平的细胞成分的影响。阶梯通道起始于标有最低数字的细胞成分。在图1中，通道101和102是阶梯式的。通道101很显然是阶梯式的。在通道102中，处于最低数字水平的P2和P3共同(直接)影响处于中间数字水平的基因G。接着，基因G(可能是间接地)影响处于最高数字水平的基因G4、G5和G6。不同地，非阶梯式通道有一个或多个反馈圈。生物通道中的反馈圈是通道细胞成分的一个子集。反馈圈中的每个成分影响同时受影响于反馈圈中的其他成分。例如在图1中的通道102中，如果基因G6(可能是间接地)影响蛋白P3，则一个包含基因G和G6和蛋白P3的反馈圈就形成了。
因此综上所述，这里所说的生物通道包括细胞成分的总体，这些细胞成分通过任何生物机制相互作用。该机制已知或未知，如通过细胞的合成、调控、体内平衡或控制网络。一种细胞成分对另一细胞成分的影响可以通过一种细胞成分到另一种的合成转化，两细胞成分间直接的物理相互作用，由中间生物行为介导的两细胞成分间的间接互相作用，或通过其他机制。另外，本发明中的一些特定兴趣的通道可称作起始于特定细胞成分的通道，该特定细胞成分影响，但不受影响于通道中的其他细胞成分，并且在这些通道中，那些没有反馈圈的被称为阶梯式的。
本发明涉及鉴定药物的多个初始靶标。因此，一些类型的通道尤其重要。药物作用于细胞最理想的方式是直接与一种且仅一种细胞成分相互作用。然而，药物作用于细胞一般通过直接与5到10至50或更多的细胞成分互相作用。药物作用于细胞的其他效果来源于药物的直接靶标，直接或间接地影响其他的细胞成分。
例如，图2显示了一个示范的生物通道。它包括药物D、作用于两个初始靶标：P1和P2。接着，每种初始靶标与多个其他细胞成分，如转录RNA水平，相互作用，用起源于P1和P2的弧线表示(单独的细胞转录体没有显示)。因此，本发明中用于鉴定一种药物多个初始靶标的重要通道包括阶梯式通道。如图2中所示显示的，它起始于一种药物或感兴趣的化合物或起始于作为该药物初始靶标的细胞成分。由于大部分的药物靶标是蛋白，起始于细胞蛋白的通道在呈递药物作用中具有特别的意义。阶梯式通道在呈递药物作用中是有利的，因为在非阶梯式通道中所存在的反馈圈能够通过在细胞成分中导致补偿作用减弱药物的影响。
                  5.2本发明的方法概览
本发明的***和方法使用户能够鉴定细胞中药物的初始靶标。尤其，本发明的方法通过分析由于梯度水平的药物暴露而引起的细胞生物状态的数值变化确定药物初始靶标的数目。
细胞生物状态的方面，例如转录状态、翻译状态、或者活性状态对于不同强度药物暴露所引起的反应可由下面5.4节的描述测量。在鉴定环境变化初始靶标的方案中，测量是围绕不同水平的环境变化而展开的，例如在一段温度范围内。最好的药物暴露强度为从没有药物递增至完全药物作用这些测量值的总体在这里被叫做“药物反应”或“反应分布图”，它可选择用图表表示。然后每一个药物反应变化的被测细胞成分被分析以确定其特定的药物浓度。在该浓度上该细胞成分根据一些客观的标准被认为激活或失活(对于那些在药物反应中被抑制的细胞成分)。这样确定的每个细胞成分的特定药物浓度在这里被叫做“反应点”，或者“反应浓度”或者“反应药物浓度”。
一种细胞成分的反应浓度是根据一些客观的标准确定的。一般情况下，一种细胞成分的药物反应表现的行为是(对于激活)斜率首先上升，达到最大值，然后下降在这样的情况下，反应药物浓度最好是药物反应有最大斜率时的药物浓度相应的，在细胞成份受药物抑制的情况下，药物反应一般表现出以下的行为：斜率首先降低(即变得更负)，达到最小值(即最负)，然后上升，在这些情况下，反应药物浓度最好是药物反应斜率最低时的药物浓度。本领域的技术人员会认识到这两个标准本质上是一样的。尤其是，两者的反应浓度都是药物反应绝对斜率(即斜率值的绝对值)最大时的药物浓度。
另外，反应浓度还可以由细胞成分药物反应为它的渐近线值一半时的药物浓度得到。其他确定反应浓度的客观标准可以被本领域的技术人员认识。事实上，因为本发明的方法仅仅涉及根据反应浓度对于细胞成分进行分组，所以使用的明确标准对于应用本发明并不重要。然而重要的是，对于所有的细胞成分要使用同一客观标准确定反应药物浓度。
因为一种特定的药物对于不同的初始靶标经常有着不同的效力(即每一个初始靶标倾向于在不同的药物浓度上被抑制)。这样就能鉴定出不同的细胞成分组，它们分离于药物浓度的不同反应点上。这些细胞成分组在这里被称作“表达组”，每个表达组中的细胞成份有着相近的反应浓度。
一个特定表达组的单独成员(即细胞成分)相应于药物反应通道中特定主要药物靶标下游的细胞成分。这样，每一个表达组对应于药物的一个特定初始靶标并特异地鉴定该初始靶标。
                      5.3.分析方案
本发明的方法的分析方案包括，第一，用连续的药物反应曲线代表被测的药物反应数据的方案。第二，确定药物反应曲线上的“反应点”或“反应药物浓度”。最后，在确定了多个细胞成分的反应药物浓度后，本发明的分析方案涉及对于反应药物浓度的分布进行统计分析。尤其是确定该分布的“形态”，最好使用某种客观统计方法。
分析方法在以下的小节5.3.1至5.3.3中详细地进行了描述。本发明还提供了体系，它接受例如用户输入的药物反应数据并执行本发明的分析方法以确定多个主要药物靶标。该体系描述于下面的小节5.3.4。
                   5.3.1药物反应表示
确定药物多个初始靶标最好开始于测量药物反应数据。在许多情况下，对于特定药物或感兴趣的化合物的梯度水平暴露所引起的药物反应数据已经测得。在另一些情况下，在进行本发明后面的步骤以前必须先测量这些反应数据。如上所述，这些数据是通过测量不同水平的药物暴露(这里又叫做“药物滴定水平”)下细胞成分特征的变化而获得的。该药物暴露(或“药物滴定”)水平最好在一定区域内有5个或更多，最好是10个或更多的暴露值，在该区域内细胞成分的特征由天然水平快速变化至饱和暴露水平。
在下文中，变量“t”一般用来指药物暴露(或“滴定”)水平，变量“D”一般用来指药物反应数据。更详细一些，第一个测量的药物暴露水平记作“t1”，第k个细胞成分的药物反应是“Dk”。因此，Dk(t1)是第k个细胞成分在第一个药物暴露水平上的药物反应。
在这些方法的后续步骤中，可能需要一些在药物暴露数值上的药物反应数值，但这些数值可能没有被测量。尤其是，为了精确地确定任何特定细胞成分的药物反应反应点，最好使提供了的药物反应分布数据光滑或至少分段地连续。因此最好提供***药物反应数据以便于确定每种药物反应Dk的反应药物浓度。这一插值法最好通过曲线(spline)拟合或模型拟合来完成。
在曲线拟合中，药物反应数据通过一个合适的曲线插值函数S与测量的数据数值的乘积求和得到，如下面的方程所示。 D k ( x ) = Σ 1 S ( x - t 1 ) D k ( t 1 ) - - - ( 1 ) 变量“x”指药物暴露水平的任意值，在该水平上估计药物反应数据。一般情况下，S可以是任何平滑的或至少分段连续的有限支持值的函数，它有一个宽度相应于反应函数中预计的结构。一个示范的宽度可以是一段距离，在该距离内被***的反应函数从它的渐近值的10％升至90％。不同的S函数可能适合于该药物和通道反应数据，甚至适合于不同通道的反应数据。示范的S函数包括线性的和Gaussaian插值法。
在模型拟合中，药物反应数据通过使用一个单参数函数估计得到。一个适于估计转录状态数据的示范模型-拟合函数是Hill函数如以下的方程2所示： H ( x ) = a ( x / x 0 ) n 1 + ( x / x 0 ) n - - - ( 2 ) 方程式2中的Hill函数包括的可校正参数有：振幅参数a，指数n和反应点参数X0。这些可校正参数是为药物反应的每一个细胞成分独立选择的。最好的情况是，所选的可校正参数使得对于药物反应的每一种细胞成分来说，H(t1)和Dk(t1)的距离的平方和最小。这一优选的参数校正方法在本领域内叫做H()到Dk()的最小平方拟合。这样的拟合可以使用许多可获得的数字计算方法完成(参见，例如，Pressetal.，1996，Numerical Recipes in C，2nd Ed.，Cambridge Univ.Press，Chs.10，14；Branch et al.，1996，Matlab OptimizationToolbox User’s Guide，Mathworks，Natick，MA)。
用Hill函数的模型拟合在图4和5中举例说明。图4显示了一个用药物FK506滴定的例子。这个图表明酵母啤酒糖酵母基因组中的大概6000个基因中有50个基因的RNA表达水平对于FK506梯度水平暴露发生反应而发生了最大的表达变化。图5显示了用Hill函数对这些基因表达水平中的一个所作的拟合。具体地，酵母基因YAP6用Hill函数拟合。参数为a＝0.4，n＝1和Log10(u0)＝0.66(或者u0＝4.6)，这些参数是通过前面描述的最小平方法选择的。
由于对FK506有着最大反应的50个基因的行为都很单调，即当增大药物暴露时，这些反应中没有一个从它的最大振幅大量下降(或者从最小振幅大量上升)。说明Hill函数是一个合适的模型拟合函数。如果发生非-单调行为，则Hill函数就不是一个合适的模型拟合函数。其他可能的模型函数基于多项式拟合，例如通过不同的已知类型的多项式。
                   5.3.2反应药物浓度
在选择了一种反应数据插值法之后，鉴定主要药物靶标的下一步就是确定每个细胞成分药物反应的反应点(即反应药物浓度)。一般情况下，反应药物浓度可以由插值药物反应的导数的绝对最大值得到，即表达式： max ( x ) | d D k ( x ) dx | - - - ( 3 )
在其他可选择的方案中，反应浓度可定义为药物反应(例如，转录水平)为其渐近值一半时的药物浓度。当反应数据以Hill函数拟合时，该方法尤其适用。在这样的方案中，反应药物浓度就是在反应数据最小平方拟合中的反应点参数X0的数值。其他确定反应浓度的定义和方法也为本领域的技术人员熟知这些定义和方法属于本发明的范畴之内。
                     5.3.3统计分析
根据本发明，单个的药物初始靶标参与多个二阶和三阶的基因表达变化。它们形成统一的表达组并在特定的药物浓度“启动”。这样，在本发明中通过鉴定统一的细胞成分组就可以同时鉴定一种药物的多个初始靶标。这些细胞成分组在特定的药物浓度“启动”即有反应点。这样的细胞成分“表达组”可以很容易地由确定的反应药物浓度数值，X0的直方图中鉴定出来。例如，图6为当用药物FK506滴定啤酒糖酵母时50种最大基因反应的反应药物浓度数值，X0的直方图在许多方案中，细胞成分的表达组可以很容易地通过视觉观察直方图而鉴定出来。例如，图6中所示显示的反应浓度直方图明显聚集于2个不同药物浓度附近：～0.3μg/ml和～20μg/ml。
本领域的技术人员会认识到象图6中所显示的这样的直方图代表着一些数量的分布尤其是，象图6中所显示的这样的直线图代表了一些数量的统计分布，例如，多种细胞成分的反应药物浓度。相应的，对于本领域的技术人员很容易理解，为了描述和称呼的目的，名词“分布”，“统计分布”和“直方图”可以被替换使用。
图6中所显示的统计分布在本领域内称作“双峰”分布。换句话说，图6中反应药物浓度的分布有2个不同的“众数”：一个在～0.3μg/ml，另一个在～20μg/ml。这样，每个表达组对应于由药物反应确定的药物浓度分布中(即直方图中)的众数。对于不同的药物，其他类型的分布是可能的，甚至预计的。例如，分布可能是“单峰的”，“三峰的”等(即可能分布中含1个，3个众数)。一般情况下，含有不止一个分布众数的统计分布被称作“多峰的”。
在其他的方案中，统计分布的多峰性。尤其是反应浓度的分布，仅通过对于直方图的视觉观察是不明显的。在这样的情况下，分布的形态可以通过使用本领域内熟知的对象统计检验进行确定(参见，例如Phillips，T.Y.et al.，1989，Pattern Recognition 22：741～746)。用于确定多峰形态的对象统计检验最好不受模型的约束。因此会更加稳定，如指数分布的形状，它在优选的X0数值上会发生。例如，在一个特定的方案中，双峰形态统计检验基于Fisher Distance。
在确定一个分布的Fisher Distance时，分布本身在某一任意值被分开，通过一个二进制参数v指定这样被分割的分布包括含有n1个元素的“左部分”和含有n2个元素的“右部分”，其中N＝n1＋n2是整个分布中元素的数目。尤其在本发明中n是包含于本分布中的细胞成分的数目。
这样分割的分布的每一部分(即左和右部分)都会有其自身的平均值(μ1和μ2)以及二次距(σ1和σ2)这些都可由本领域技术人员所熟知的表达式得以确定。根据方程4就可以由分割分布左、右部分的平均值和二次矩确定Fisher Distance FD。 FD 2 ( γ ) = N [ μ 1 ( γ ) - μ 2 ( γ ) ] 2 n 1 σ 1 2 ( γ ) + n 2 σ 2 2 ( γ ) - - - ( 4 )
为了评估宣称分布为双峰形态的“置信度”，Fisher Distance FD最好通过选择binning参数γ进行优化或最大化，以使 FD max = max ( γ ) FD ( γ ) - - - ( 5 )
FDmax的值越大表明一个特定分布为双峰形态的置信度越高。在另一种方案中，宣称一种分布为双峰形态的置信度是通过比较FDmax的真实值和一种经验确定的(例如，通过真实数据的Monte Carlo实现)FDmax值分布而定量确定的。FDmax的真实值为了反应浓度的特定分布而确定，而它的经验分布产生于单峰形态的虚假说。从大多数单峰直方图人口分布形状得到的直方图实现与FDmax的分布非常相拟。这样，在不同的可选方案中，单峰分布可能有多种形状。例如，在可选方案中，单峰分布形态可能是，例如，均匀的，三角的或者Guassian，经验确定的FDmax值最好用与实际反应数据相同的元素数目和二进制分辨率进行确定。然而，发现单峰分布的Monte Carlo结果对于元素的数目以及二进制分辨率均不敏感。这样，在其他的方案中，经验FDmax分布可以用与实际反应数据不同的元素数目和/或不同的二进制分辨进行确定。
从这样的单峰结果，可能给定一个可能性数值，由反应浓度分布确定的实际FDmax是否真的来源于一个单峰分布。具体的这一可能性，P1就是在FDmax的经验单峰分布中的FDmax数值的分数，该值要比确定的FDmax大。本领域的技术人员会认识到这样的分数对应于实际确定的FDmax数值右侧FDmax经验单峰分布直方图的区域。这样，宣称双峰形态的置信度是从总体中减去FDmax是源自单峰分布的可能性，即1-P。
在其他方案中，可以在反应药物浓度分布中测试更高水平的形态。在这些方案中，可以把直方图的间隔分成小间隔，小间隔被怀疑含有两个不同的众数，然后使用以上描述的方法对每个小间隔进行双峰形态测试。
                   5.3.4.实施***和方法
在以上小节中描述的方法最好通过使用计算机***来实施。相应的，本发明还提供了一个计算机***该***依据以下的程序和方法实施本发明的方法。图3显示了一个示范的适用于实施本发明分析方法的计算机***。计算机***301显示为包括内部组件，它们与外部组件相连。该计算机***的内部组件包括处理器元件302，它与存贮器303内部相连。例如，计算机***301可以是基于Intel Pentium的200MHz或更高时钟频率的处理器和32M或更长的主存贮器。
外部组件包括大容积累存贮器304。该大容量存贮器一块或多块硬盘(它们一般与处理器和存储器包装在一起)。这样的硬盘一般为1GB或更大存贮容量。其他外部组件包括用户界面设备305，它可以是一台显示器和键盘还有指向设备306，它可以是一支“鼠标”或者其他的图形输入设备(没有举例)一般情况下，计算机***301还与网络线307相连该网线可以是Ethernet连结，其他本地计算机***、远程计算机***或者广域通迅网络如Internet的一部分。该网线使计算机***301与其它计算机***共享数据和处理任务。该计算机***的组件还可能包括显示数据的方法、如显示药物反应数据、反应药物浓度和/或表达组的方法。这些方法可能包括，但不仅限于一台显示器或是打印机或是绘图仪。
几种软件组件在该***操作过程中被加载到存储器中，它们在本领域内是标准的同时对本发明又是特殊的。这些软件组件共同导致计算机***根据本发明的方法发挥作用。这些软件组件一般存储在大容量存储器304中，软件组件310代表操作***，它负责管理计算机***301和它的网络连接。该操作***可以是，例如，MicrosoftWindowsTM家族，如Windows95，Windows98或者Windows NT，一种Macintosh操作***，和OS/2操作***或是Unix操作***软件组件311代表公用语言和该***方便提供的函数以辅助程序实施本发明的方法。用于编写本发明分析方法的语言包括C，和C++和不是很合意的JAVA最好本发明的方法在数字软件包中编程。该软件包允许等式的字符输入和运算的高度规范，包括可用的算法，借此使用户无需编写单独的方程或算法。这样的软件包包括Matlab fromMathworks(Natick，MA)，Mathematica from Wolfram Research(Champaign，Illinois)或者S-Plus from Math Soft(Seattle，Washington)。
软件组件312和313和314代表本发明的分析方法。它们用程序语言或字符程序包编写，组件312代表实施上面小节5.3.1中描述的药物反应表示方法的程序或子程序。组件313代表实施确定每种药物反应(即，每种细胞成分的药物反应)反应药物浓度的方法的程序或子程序。组件314代表实施确定反应药物浓度分布包括小节5.3.3中描述的双峰或多峰形态目标统计检验的方法的程序或子程序。
在一个示范实施中，为了使用计算机***实施本发明的方法，一位用户把药物反应数据加载到存储器303中。这些数据可以由用户从显示器和键盘305中直接输入或者从网络连接307相连的计算机***，或者在可移动存储媒介上(没有显示)。接下来，用户执行药物反应表示软件312。再执行软件组件313，它依据小节5.3.2的方法由一个或多个药物反应确定反应浓度。最后执行组件314，它依据上面小节5.3.3中的方法确定反应浓度的统计分布。
在一种可替代的实施中，为了使用计算机***实施本发明的方法，一位用户把由药物反应数据确定的多种细胞成分的反应浓度数值加载到计算机存储器303中。这些数据可以依据以上描述的输入、药物反应数据的方法进行输入。在这种方案中，软件组件312和313未被使用而无需包含于计算机***中。另外，软件组件314被执行以确定被加载的反应浓度数值的分布和形态。
用于实施本发明分析方法的其他可选***和方法为本领域的技术人员所了解并意在包含于附加的权利要求中。尤其是，附加的权利要求想要包括用于实施本发明方法的程序结构，这些方法很容易为本领域的技术人员所理解。
                      5.4测量方法
药物反应通过测量细胞成分由于药物暴露或通道微扰而发生的变化获得并用于本发明。这些细胞特征可以是细胞生物状态的任何方面。它们可以是，例如，转录状态，测量RNA丰度，翻译状态，测量蛋白丰度，活性状态，测量蛋白活性。细胞特征还可以是混合的方面，假如测量起始一种特定生物通道的一种或多种蛋白的活性，同时测量通道中起始蛋白下游细胞成分的RNA丰度(基因表达)。这一节描述了在药物或通道反应中测量细胞成分的示例方法，本发明适用于这些测量的其他方法。
本发明的方案优选基于测量药物和通道反应的转录状态的方案。转录状态可以通过以下方法商量：在下一小节中描述的杂交核酸陈列或核酸模拟探计技术，或者在后面的小节中描述的其他基因表达技术。然而无论如何测量，结果都是包括代表RNA丰度比数值的反应数据，它们通常反应了DNA表达比(去除RNA降解速率的不同)这样的测量方法描述于5.4.1小节。
在本发明的不同可选方案中，还可以测量除了转录状态之外的生物状态方面，如翻译状态、活性状态、或者混和状态。这些方案的细节描述于这一节，这样的测量方法描述于5.4.2小节。
                  5.4.1测量药物反应数据
为了测量药物反应数据，细胞暴露于药物或感兴趣的候选药物梯度水平中。如果细胞生长于体外，这些化合物通常加入它们的培养基。以酵母为例，如啤酒糖酯母，最好在对数期早期收集细胞，因为那对表达方式对于收集的时间相对不太敏感。依据药物的特殊性质把药物按梯度量加入，但通常介于1ng/ml至100mg/ml之间。在一些情况下药物会溶于一种溶剂如DMSO。
根据任何以下描述的方法测量暴露于药物和未暴露于药物的细胞的生物状态。最好使用转录体或微阵列来寻找由于药物暴露而导致表达变化的mRNA。然而，还可以测量生物状态的其他方面以确定，例如由于药物暴露导致翻译和活性变化的蛋白。
在以下描述的双色差异杂交中，测量药物反应最好带有反向标记。同时，使用的药物暴露水平最好能够在药物反应快速变化的区域提供足够的分辨率，例如，通过使用大约10个水平的药物暴露。
                   5.4.2转录状态测量
一般情况下，使用任何包含一段核苷酸序列的探针，该探针固定在一个固相支持物或表面上，就可以进行转录状态的测量。例如，探针可能包括DNA序列，RNA序列或者DNA和RNA序列的共聚物。该探针的多核苷酸序列还可以包含DNA和/或RNA类似物或者其组合。例如，探针的多核苷酸序列从细胞中提取出来的基因组DNA的全长或部分序列，cDNA或mRNA序列。探针的多核苷酸序列还可以是合成的核苷酸序列，如合成寡核苷酸序列。这些探针序列可以在体内酶法合成，在体外酶法合成(例如，通过PCR)或者在体外非酶法合成。
本发明方法中所使用的探针最好固定在固相支持物或表面上，它们可以是多孔的或是无孔的。例如，本发明的探针可能是吸附于硝化纤维或尼龙膜或滤膜上的多核苷酸序列。这样的杂交探针在本领域内为人们熟知(参见，例如，Sambrook et al.，Eds.1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Vols1～3，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。另外，该固相支持物或表面可以是玻璃或塑料表面。
                   5.4.2.1微阵列概述
在特别优选的方案中，转录状态的测量是通过杂交探针的微阵列来完成的。该微阵列包括一个固相，固相表面固定着大量多核苷酸，如大量DNA或DNA模拟物或者还可以是大量的RNA。具体地，一个微阵列是一个大小小于6.25cm2的排列。微阵列可以用于，例如，分析细胞的转录状态，如暴露于药物梯度水平的细胞的转录状态。
在优选的方案中，一个微阵列包括一个结合(例如杂交)位点有序排列的表面，这些位点用于细胞或生物体基因组中许多基因，最好是全部或大部分基因的产物。微阵列可以有许多方法完成，以下描述其中的几种无论如何制得。微阵列都有一些共同的特征：排列是可重复的，允许制作给定阵列的多个拷贝而方便地相互比较。最好，该微阵列较小，一般小于5cm2。并且使用在结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制成。最好，微阵列中的一个给定的结合位点或一套特异的结合位点特异性地结合(例如，杂交)细胞内一个单一基因的产物(例如，结合一个特异的mRNA或由其而来的特异的cDNA)。然而如以上所述，一般情况下，其他相关或相似的序列会交叉杂交到给定的结合位点。虽然每个特定RNA或DNA可能有一个以上的物理结合位点，为了下文讨论的清晰，假定只存在一个单一的完全互补的结合位点。
本发明的微阵列包括一种或多种测试探针，它们含有一段与被探测RNA或DNA亚序列互补的多核苷酸序列。每个探针最好有不同的核酸序列，它们在固相表面上的位置最好是已知的。在一种方案中，微阵列是一种高密度排列，密度最好大于每1cm260个不同的探针。在一种方案中，微阵列排列(即矩阵)的每个位置代表一个基因(即mRNA或由其产生的cDNA)编码产物的单独结合位点，而且存在与生物基因组中大部分或几乎全部基因的产物对应的结合位点。例如，该结合位点可以是一个DNA或DNA类似物，特定的RNA或特异性地与之杂交。该DNA或DNA类似物可以是，例如，一种合成的低聚物一种全长的cDNA，非合长cDNA或者一种基因片段。
虽然在优选方案中微阵列包括与靶标生物基因组所有或几乎所有基因产物相对应的结合位点，但这种广泛性不一定是必需的。通常微阵列包括至少与基因组中50％基因相对应的结合位点，经常达到大约75％，更常见的是至少85％，更加常见的是90％左右，最常见的是至少大概99％。优选地，微阵列包括相应于部分基因的结合位点。这些基因与感兴趣的药物或生物通道的作用有关。一个“基因”是作为一个开放阅读框架(ORF)被鉴定出来的，ORF最好编码一段至少50，75，或99个氨基酸的序列，在生物体或多细胞生物体的一些细胞中一种信使RNA由ORF转录而来。基因组中基因的的数目可由该生物体所表达的mRNA的数目推断，或者由基因组鉴定了的部分推断。当感兴趣的生物体的基因组完成测序，就可以确定ORF的数目，通过分析DNA序列可鉴定mRNA编码区域。例如，啤酒糖酵母的基因组已被完全测序。报道其含有大约6275个长于99个氨基酸的ORF。对于ORF的分析表明其中的5885个ORF可能编码蛋白产物(Goffeau et al.，1996，Science 274：546～567)。不同的是，人类的基因组估计含有大约105个基因。
                 5.4.2.2制备微阵列的探针
如上面提到的，根据本发明与一特定的多核苷酸分子特异性杂交的“探针”通常是一段互补的多核苷酸序列。在一种方案中，微阵列中的探针是对应于一种生物体基因组内至少一部分基因的DNA或DNA“模拟物”(如，衍生物和类似物)。在另一方案中，微阵列的探针是互补的RNA或RNA模拟物。
DNA模拟物是由亚基组成的多聚体，这些亚基能够与DNA进行特异性的，Watson-Crick式的杂交或者与RNA进行特异性的杂交。核酸可以在碱基部分、在糖基部分或在磷酸主链上发生修饰。示例的DNA模拟物包括，例如，硫代磷酸。
DNA可以获得，例如，通过聚合酶链式反应(“PCR”)对来自基因组DNA，cDNA(例如，通过RT-PCR)或者克隆序列进行基因片段扩增。PCR的引物要基于产生特异片段(即微阵列上与其他任何片段都没有多于连续10个碱基相同的片段)扩增的已知基因或cDNA序列进行优选。本领域内为人们熟知的计算机程序可用于设计带有所需特异性和最佳扩增属性的引物，如Oligo Version 5.0(NationalBiosciences)一般情况下，微阵列的每个探针在20个碱基到12000个碱基之间，通常长度为300碱基到2000碱基，更多情况下长度为300碱基到800碱基。PCR方式在本领域内为人们熟知，描述于，例
如lnnis等.，编辑.，1990，PCR方法：方法和应用指南，学术出版公司，圣地亚哥，加利福尼亚。本领域的技术人员可以清楚地认识到，自动化控制***对于分离和扩增核酸有用。
另一种制备微阵列多核苷酸的可选方法是通过合成多核苷酸或寡核苷酸。例如，使用N-磷酸酯或亚磷酰胺反应(Froehler等.，1986，核酸研究.14：5399～5407；McBrid等.，1983，Tetrahedron Lett.24：246～248)。合成的序列长度一般在大约15至500个碱基内，更通常的情况是在20至50个碱基内。在一些方案中，合成的核酸包括非天然碱基，如，但不限于肌苷。如上面提到的，核酸类似物可以用作杂交结合位点。一种合适的核酸类似物的例子是多肽核酸(参见，例如，Egholm等.，1993，Nature 363：566～568；美国专利号5,539,083)。
在可选方案中，杂交位点(即探针)可以从基因的质粒或噬菌体克隆，cDNA(例如，表达序列标签)，或由其产生的***制得(Nguyen等.，1995，Genomics 29：207～209)。
              5.4.2.3把探针附着到固体表面
探针被吸附于固体支持物或表面，它们由玻璃、塑料(例如，聚丙烯，尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维或其它材料制成。把核酸附着到表面的一种优选方法是通过在玻璃平板上打印，概述地描述于Schena等.，1995，科学270：467～470。这一方法对于制备cDNA微阵列尤其有用(参见，DeRisi等.，1996，自然遗传学14：457～460；Shalon等.，1996，基因组研究.6：689～645；和Schena等.，1995，美国国家科学院院刊.93：10539～11286)。Blanchard说明了使用喷墨打印机进行寡核苷酸合成(美国专利申请系列号09/008,120，申请日，1998年1月16日)。
第二种制备微阵列的优选方法是制做高密度寡核苷酸排列。用于制备含有成千上万与指定序列互补的寡核苷酸的排列的技术已知，它们位于表面固定的位置上，使用照相平印技术进行原位合成(参见，Foder等.，1991，科学251：767～773；Pease等.，1994，美国国家科学院院刊91：5022～5026；Lockhart等.，1996，自然生物技术14：1675；美国专利号5,578,832；5,556,752；和5,510,270)或者使用其他的方法进行快速合成和指定寡核苷酸沉积(Blanchard等.，生物传感器和生物电子仪器11：687～690)。如果使用了这些方法，已知序列的寡核苷酸(例如，20-聚体)直接在表面如复合玻璃薄片上进行合成。通常制得的排列是赘余的，每个RNA对应几个寡核苷酸分子寡核苷酸探针可选择用于检测可被剪切的mRNA。
其他制做微阵列的方法，例如，通过掩蔽(Maskos and Southern，1992，核酸研究20：1679～1684)，也可以被使用。原则上，任何类型的排列，例如，在尼龙杂交膜上的点杂交(参见Sambrook等.，上文)都可以使用。然而，本领域的技术人员知道，经常需要优选很小的排列因为杂交量会更小。
5.4.2.4目标多核苷酸分子
如上所述，可由本发明分析的多核苷酸分子可以是任何来源，包括天然发生的核酸分子，还有合成的核酸分子。在一种优选的方案中，被本发明分析的多核苷酸分子含RNA，包括但绝不限于，总细胞RNA，poly(A)+信使RNA(mRNA)及其片段，或从cDNA转录而来的RNA。制备总RNA和poly(A)+RNA的方法在本领域内熟知，概述于以上的Sambrook et al.，在一种方案中，使用硫氰酸胍裂解把RNA从不同种类的细胞中提取出来。接着进行CsCl离心(chirgwin等.，1979.生物化学18：5294～5299)Poly(A)+RNA使用寡聚dT纤维素进行选择、感兴趣的细胞包括但决不限于，野生型细胞、药物暴露细胞、修饰的细胞、病变细胞尤其是癌症细胞。
在一种方案中，RNA可以用本领域已知的方法打成片段。例如，通过与ZnCl2共培养生成RNA片断。在一种方案中，在存在标记的dNTPs条件下，分离手mRNA可以通过全外双链cDNA转录而转变为合成的RNA(Lockhart等.，1996，自然生物技术.14：1675)。
在其它方案中，用于分析的多核苷酸分子可以是DNA分子，如片段基因组DNA。从mRNA反转录而来的cDNA第一链或者扩增mRNA或cDNA的PCR产物。
5.4.2.5与微阵列杂交
选择核酸杂交和洗脱条件以使本发明分析的多核苷酸分子“特异性结合”或“特异性杂交”到排列的互补多核苷酸序列上，最好是特定的排列位点，其中存在被分析核酸分子的互补DNA。
在其上含有双链探针DNA的阵列与目标多核苷酸分子接触之前，最好经过变性条件处理以产生单链DNA。含有单链探针DNA(例如，合成寡聚脱氧核糖核酸)的阵列在与目标多核苷酸分子接触之前可能也要变性，例如，去除由于自身互补序列而产生的发夹或二聚物。
最佳杂交条件取决于探针的长度(例如，寡聚体相对多于200碱基的多核苷酸)和种类(例如，RNA或DNA)以及目标核酸。特异(即严格)杂交条件的一般参数描述于Sambrook等.，(上文)，和Ausubel等.，1987，现代分子生物学技术，Greene Publishing andWiley-Inter science，New York.当使用Schena等.oDNA微阵列时，典型的杂交条件是5×SSC加0.2％SDS 65℃杂交4小时，然后在25℃用高度严格洗脱缓冲液(0.1×SSC加0.2％SDS)洗脱(Shena等.，1996，美国国家科学院院刊.93：10614)。有用的杂交条件提供于，例如，Tijessen，1993，与核酸探针的杂交，Elsevier SciencePublishers B.V.；和Kricka，1992，非同位素DNA探针技术，学术出版社，圣地亚哥，CA。
5.4.2.6信号检测和数据分析
能够理解当制备了与细胞中RNA互补的cDNA，并在合适的杂交条件下使之与微阵列杂交。阵列中相应于任何特定基因的位点上的杂交程度反映了由该基因转录的mRNA在细胞中的广泛程序。例如，当与总细胞mRNA互补的且做了检测标记(例如，用荧光团)的cDNA与微阵列杂交后，阵列上相应于一个基因的位点(即能够特异性结合该基因的产物)，会出现以下两种情况：若该基因在细胞内没有转录，则该位点上有很少或根本没有信号(例如，荧光信号)，而那些所编码的mRNA很广泛的基因则会有相对较强的信号。
在优选方案中，从二个不同的细胞而来的cDNA杂交到微阵列的结合位点上。在药物反应的情况下，一个细胞暴露于药物，而同类型的另一个细胞未暴露于药物。来源于二不同细胞的cDNA标记不同以把它们区别开来。例如，在一种方案中，来自药物处理细胞的cDNA使用荧光素标记的dNTP进行合成，而来源于第二个未经药物暴露的细胞的cDNA则使用蓝光硷性蕊青细标记的dNTP合成。把两种cDNA混和并与微阵列杂交，在阵列的每个位点上来自每个cDNA组的信号相对强度被确定，借此检测出特定mRNA丰度的任何相对差异。
在上面所述的例子中，来自药物处理细胞的cDNA当荧光团被激发时会发出绿色荧光，而来自未处理细胞的cDNA会发出红色荧光。结果是，如果药物处理对于细胞中特定mRNA的相对丰度没有影响，不管是直接的还是间接的，则在两细胞中mRNA同样广泛。经过反转录后，红色标记和绿色标记的cDNA会同样广泛当与微阵列杂交后，该种类RNA结合位点会发射出两种荧光团的特征波长。不同地，如果经药物处理的细胞所使用的药物能够直接或间接地增加该mRNA在细胞中的广泛性。则绿色与红色荧光的比例就会增大。若药物降低该mRNA的广泛性，则比例下降。
使用双色荧光标记和检测方法确定基因表达的改变描述于，例如Shena等.，1995，科学270：467～470。使用两种不同荧光团标记的cDNA的优点是可以对两细胞中对应于每个排列基因的mRNA水平进行直接的和内部控制的比较，由于实验条件(例如，杂交条件)微小差异所引起的变化不会影响后来的分析。然而，应该认识到使用来自一个单独细胞的cDNA，比较药物处理或通道-微扰的细胞中和未经处理的细胞中特定mRNA的绝对量也是可能的。
当使用荧光标记的探针时，每个转录体阵列位点上的荧光发射可以优选地使用扫描共焦激光显微镜检测。在一种方案中，使用合适的激发线，对使用的两种荧光团进行分别扫描。另外，可以使用能使样品在两荧光团特异波长上同时发光的激光并且来自两荧光团的发射能同时被分析(参见Shalon等.，1996，基因组研究.6：639～645)。在一种优选的方案中，阵列使用一种激光荧光扫描仪进行扫描。该扫描仪带有一个计算机控制的X-Y层和一个显微镜物镜使用多线混合气体激光对两荧光团进行顺序激发，发射的光根据波长分割并使用二只光电倍增管检测。这样的荧光激光扫描设备描述于，例如Sohena等.，1996基因组研究6：639～645。另外，描述于Ferguson等.，1996，自然生物技术.14：1681～1684的光纤束可用于同时监测大量位点上的mRNA丰度水平。
信号被记录，在优选方案中，并用计算机分析，例如，使用一个12位模拟到数字板。在一种方案中，使用一种图象程序(例如，HijaakGraphics Suite)对扫描的影像进行去斑。然后再使用影像网络程序进行分析产生一个电子表格，该表格反应每个位点上每个波长上的平均杂交。如果必需的话，可对两频道间的“串扰”(或重叠)进行实验确定的纠正。对于转录体阵列上的任何特定杂交位点，可以计算出两荧光团的发射比例。该比例与同种基因的绝对表达水平无关，但对于那些表达受到用药、基因缺失或任何其他测试事件明显调控的基因，这个比例是有用的。
根据本发明的方法，两细胞或细胞系中一种mRNA的相对丰度被记为微扰并确定其量值(即在两被测mRNA来源中丰度不同)或者没有微扰(即相关丰度相同)。正如这里所用的，两RNA来源间的差异至少为25％(即，RNA在一种来源中的丰度比另一来源多出25％)，更常见的是50X，更加常见的是2(即2倍丰度)，3(3倍丰度)，或者5(5倍丰度)被记录为微扰。现在的检测方法可以可靠地检测3倍至5倍的量级，且更加灵敏的方法即将问世。
优选地，除了鉴定微扰为阳性或阴性，最好能够确定微扰的量值。如上面所提到的，这可以通过计算用于不同标记的荧光团的发射比例得到或者通过本领域内的技术人员很容易理解的类似方法。
             5.4.2.7.转录状态测量的其他方法
细胞的转录状态可以通过本领域内已知的其他基因表达技术进行测量。若干这样的技术产生用于电泳分析的有限复杂性的限制性片段库，如把双限制性酶切与定相引物结合的方法(参见，例如，欧洲专利0534856A1，申请日，1992年9月24日，申请人为Zabeau等.，)或者选择含有最接近一个确定mRNA端的位点的限制性片段的方法(参见，例如，Prashar等.，1996，美国国家科学院院刊93：659～663)。其它的方法统计抽样cDNA库，如通过在cDNA中测定足够碱基(例如，20～50碱基)的序列以鉴定每一个cDNA，或者通过短标签(例如9～10碱基)测序，短标签产生于相对于确定的mRNA端的已知位置(参见，例如，Velculescu，1995，科学270：484～487)。
这些测量转录状态的方法和***，虽然与微阵列相比不太合意，然而却可以在本发明中应用。
               5.4.3.生物状态其他方面的测量
虽然监测mRNA丰度之外的细胞成分现在发现了一些在监测mRNA(即转录)时所没有遇到的问题。对于本领域的技术人员很容易理解，使用本发明的方法适用于任何可被监测的细胞成分。
在本发明的不同方案中，除了转录状态之外的细胞状态方面，如翻译状态，活性状态或者其混和方面都可以被测量以获取本发明的药物反应，这一部分描述了这些方案的细节。
                   5.4.3.1翻译状态测量
翻译状态的测量可以按照若干方法进行。例如，蛋白的全基因组监测(即“蛋白组”，Gofla等.，上文)可以通过构建一种微阵列实现。该微阵列上的结合位点包括固定的最好是单克隆的抗体。这些抗体对于由细胞基因组编码的多数蛋白种类具有特异性。优选地，应存在相对于大部分编码蛋白的抗体，或至少存在相对于那些与药物作用相关的蛋白的抗体。制备单克隆抗体的方法熟知(参见，例如，Harlowand Lane，1988，抗体：实验指南，冷泉港，纽约)在一种优选方案中，单克隆抗体是针对含成肽片段生成的，这些片段的设计基于细胞的基因组序列拥有这样一个抗体阵列，细胞中的蛋白与阵列接触，使用本领域已知的鉴定方法对它们的结合进行分析。
另外，蛋白可以通过二维凝胶电泳***进行分离。二维凝胶电泳在本领域内熟知，一般涉及第一个方向上的等电聚焦，接着在第二个方向上进行SDS-PAGE电泳。参见，例如Hames等.，1990，蛋白质的凝胶电泳：实践操作，IRL出版，纽约；Shevchenko等.，1996，美国国家科学院院刊93：1440～1445；Sagliocco等.，1996，酵母12：1519～1533；and Lander，1996，科学274：536～539。得到的电泳图可以通过许多技术进行分析，包括质谱技术，western杂交，和使用单克隆和多克隆抗体进行免疫杂交分析，和内部和N-末端微-测序。使用这些技术，就有可能鉴定出在给定生理条件下，包括暴露于药物的细胞中(例如，酵母)或者通过特定基因缺失或过量表达的修饰的细胞中，所产生的所有蛋白中的大部分。
                  5.4.3.2.活性状态测量
只要有关鉴定药物作用的蛋白的活性可以测量，本发明的方案就可以基于这些测量。活性的测量可以通过使用适合于被鉴定的具体活性的功能、生化或者物理方法来完成。当活性涉及化学构象时，细胞蛋白可与天然底物接触，测量构象的速率。当活性涉及多亚基单位联合时，例如一种激活的DNA结合化合物与DNA联合，可以测量联合的蛋白的量或者联合的二阶结果，如转录的mRNA的量。另外，当只知道功能活性时，例如，在细胞周期调控中，可以观察功能的表现。
无论怎么知道或者测量，可以使用本发明前面的方法对反应数据中蛋白活性的变化进行分析。
              5.4.3.3.生物状态的混合方面
在可选的非限制性方案中，反应数据可以由细胞生物状态的混合方面形成。反应数据可由以下变化的组合构建而成：例如，某种mRNA丰度的变化，某种蛋白丰度的变化和某种蛋白活性的变化。
                        6.实施例
以下确定多个药物靶标的实施例是为了举例说明前面所描述的发明而不是对上述描述进行限制。
                  6.1双初始靶标的鉴定
这一实施例说明了本发明的方法应用于鉴定一种特定的药物：FK506的两个不同的初始靶标。具体地，FK506已知在啤酒糖酵母中通过两条单独的蛋白通道发生作用；第一条是通过神经碱蛋白，第二条是通过Gcn4转录因子。这样，FK506在酵母中有两个初始靶标。
使用渐变水平的FK506滴定培养的啤酒糖酵母，根据以上5.4节中描述的方法测量转录水平。图4绘出了50种在对FK506反应中有着最大表达变化的基因的药物反应。垂直轴是表达比例的常用对数，即用药物处理测量得到的mRNA水平与未用药物处理测量得到的mRNA水平的比例转录反应的二个组可以在图中区别开来。一组在FK506大约0.3μg/ml时饱和，而另一组在大约20μg/ml处启动。
图4中所显示的50个药物反应中的每一个都用Hill函数拟合)上面的方程2)，由拟合参数X0确定它们的反应药物浓度。图6显示了反应药物浓度的直方图，只要对直方图进行简单的视觉观察就可以明显看出反应浓度的双峰分布。具体地，反应药物浓度聚集在2个不同的值左右；一个在0.3μg/ml附近，另一个20μg/ml附近。
这些族对应于细胞成分的特定“组”，它们受到FK506的不同初始靶标的影响。具体地，那些激活(或失活)于较低药物浓度(即反应浓度在0.3μg/ml附近)的细胞成分是通过神经碱蛋白激活(或失活)的。而那些激活(或失活)于较高药物浓度(即反应浓度在20μg/ml附近)的细胞成分则是通过Gcn4转录因子激活(或失活)的。这样，图6中显示的每个“组”或众数鉴定了药物FK506的一个特定初始靶标。
                6.2.单一初始靶标的鉴定
与上面部分6.1描述的实施例相对应，这一实施例说明了应用本发明的方法鉴定通过单一初始靶标的药物作用。具体地，构建了两种酵母菌株，它们含有Tet启动子***调控下的基因(参见Brachmann，C.B.，et al.，1998，Yeast 14：115-132；Gari，E.，et al.，1997，Yeast 13：837～848；Jones，J.S.and Prakash，L.，1990，Yeast6：363～366；and Wach，A.A.；et al.，1994，Yeast 10：1793～1808)。第一种酵母菌株，R1918包含Tet启动子调控下的HMG2。第二种酵母菌株R1446包含Tet启动子***调控下的ERG11。
酵母菌株R1918的构建
酵母菌株R1918的质粒如下构建。为了酵母中的基因中断，KanR显性选择标记(参见Wach et al.，上文)从PUCKanR中扩增出来，PUCKan包括一段来自PFA-KanMX6的1.5kb EcoRI-BamHI KanR片段克隆到PUC18的EcoRI-BamHI位点上。KamR-tet07启动子替换载体pKantet07通过用一个接头修饰PUCKanR得以构建。该接头在KanR基因的邻近处引入XhoI和BamHI位点，产生PUCKanXB。一段来自PCM159(参见，Gari et al.，上文)的700 bp XhoI-BamHI片段，包括ADHI终止子，tet07操纵子和来自CYC1的TATA元件，该片段克隆到PUCKanXB的XhoI-BamHI位点上，产生pKantet07。载体PURA3tTA包含一段1.9kb的XhoI-EcoRI片段，包含CMV(巨细包病毒)启动子和tTA-转录激活子(Gari et al.，上文)该片段克隆到pJJ242的SalI-EcoRI位点，pJJ242包含克隆于PUC18的URA3基因(Johes and Prakash，上文)。
酵母菌株R198构建如下，hmg1：KanR/HMG1杂合二倍体菌株通过用一段PCR扩增的KanR片段转化二倍体菌株By4743(Brachmann et al.，上文)得以构建。该KanR片段的两侧都有556p的HMG1同源物以致通过在HMG1位点上的重组，整个编码区域，包括起始和终止密码子，都被KanR基因替换R535形成饱子，四分体分开导致MAT2hmg1：KanR二倍体菌株R1012的分离。
表达tTA转录激活子的MATa双倍体菌株R1200的构建如下。通过PCR介导的基因替换把3.2kb的URA3-CMVp-tTA构建体(从PURA3tTA PCR扩增)定位到二倍体菌株BY4741(Brachmann et al.，上文)的ura3-0位点。为了用tet07启动子替换内源的HMG2启动子，用两侧为HMG2同源物的PCR扩增的2.2kb KanR-tet07片段转化R1200。该片段在HMG2启动子区域的同源整合导致了紧挨着ATG上游的352bp被KanR-tet07替换。这便产生了菌株R1159(MATa.URA3-CMVp-tTA，tet07-HMG2)。
R1159和R1012进行杂交产生二倍体菌株R1525，它带有基因型MAT a/α；hmg1：：KanR/HMG1；KanR-tet07-HMG2/HMG2；URA3-CMVp-tTA/ura3-0。形成孢子和四分体分开导致一种MATa二倍体菌株R1918的分离，它带有基因型humg1：：KanR；KanR-tet07-HMG2；URA3-CMVp-tTA。该菌株在不含有脱氧土霉素的平板上生长得很好，在含有100μg/ml脱氧土霉素的平板上生长得很差。
构建酵母菌株R1446：
菌株R1158，包括在ura3-0位点整合的URA3-CMVp-tTA，的构建与R1200相似。用两侧为ERG11同源物的PCR扩增KanR-tet07片段转化R1158以构建菌株R1446。通过在ERG11位点上的整合，替换以紧挨ERG11起始密码子上游的450bp的序列该菌株在不含脱氧土霉素的平板上生长得很好，在含有1μg/ml脱氧土霉素的平板上生长得很差。
转录状态测量
使用阵列机器人把代表来自啤酒糖酵母基因组的6065ORF的PCR产物点样到用聚赖氨酸处理的显微镜薄片上。打印之后，阵列被处理以把DNA共价结合到聚赖氨酸层上，中和未结合薄片表面的反应性并使结合的DNA链变性。处理过的阵列用荧光标记的cDNA杂交。这些eDNA是在被测RNA样品反转录反应过程中引入Cy3-或Cy5-dUTP而制得的。63℃时在22×30mm的玻璃盖片下，22μl杂交溶液中(3×SSC，0.75μg/ml polyA DNA 0.2％SDS)荧光标记的cDNA与阵列杂交6小时。然后用主要冲脱溶液(1.5×SSC)快速地洗脱阵列，扫描前在离心机中干燥。
结果：
酵母菌株R1918和R1446的药物反应是通过用渐变水平的脱氧土霉素滴定每个菌株的细胞培养物而获得的，然后按上文的描述测量转录水平。在这些菌株中所用的Tet启动子***以前有过描述(参见，例如，Gari et al.，1997，Yeast 13：837～848)。该启动子受到抗生素四环素的浓度和结构相关的化合物脱氧土霉素的调控。这样，在没有脱氧土霉素的条件下，启动子诱导高水平的表达。加入的脱氧土霉素水平的增加导致启动子活性受抑制的增加。通过加入中等水平的药物可在稳定状态下获得中等水平的基因表达。另外，能够对启动子活性产生最大抑制的脱氧土霉素水平(10μg/ml)对于野生型酵母细胞的生长速率没有明显的影响(参见Gari et al.，上文)。这样，脱氧土霉素在以上描述的酵母菌株中含有单一的初始靶标：HMG2(在酵母菌株R1918中)，和ERG11(在酵母菌株R1446中)。
图7显示了菌株R1446中对脱氧土霉素反应有最大表达变化的那些基因的药物反应。下面的曲线显示了ERG11转录自身的下降。图7中显示的每个药物反应都根据Hill函数(方程2)拟合并且从拟合参数X0确定它们的反应药物浓度。图8显示了反应药物浓度的最终直方图，当中去除了ERG11转录自身的反应。正如料想的一样，反应药物浓度是单峰的；图中的两个峰是反应数值的统计被动，在统计学上不显著。这样，该分布与生物知识一致：这一反应是单一蛋白抑制，即，只有一个初始靶标。
图9显示了菌株R1918中对脱氧土霉素反应有最大表达变化的那些基因的药物反应。图10显示了反应药物浓度的直方图，去除了HMG2转录体的反应X0的分布又一次是单峰的。对于该单一蛋白介导通道的激活，这一点正如料想的一样。
                6.3评估双峰形态的置信度
这一实施例说明了使用描述于以上5.3.3节中本发明的统计方法以评估反应药物浓度的分布并确定分布众数的数目。具体地，FisherDistance FD被最大化并用于评估描述于6.1和6.2节中的反应药物浓度的分布(分别图6和8)由每个分布获得的FDmax的值与不同形状的单峰分布的FDmax值的分布进行比较。后者通过对于“父本”分布(即，实际分布数据)进行Monte Carlo实现产生。描述于6.1节中的直方图(图6)获得的置信度＞99.9％，验证了该分布是真正的双峰分布。并且因此，药物FD506在酵母中通过二个初始靶标作用。不同的是，图8(6.2节)中显示的直方图的双峰形态置信度仅为30％。这一结果与该直方图的视觉外观一致，而且与生物知识一致：滴定是一种单一蛋白抑制。
更加具体一些，图11显示了图6中显示的直方图的FisherDistance FD的计算，它作为分割位置γ的一个函数。对于γ的每个选择，计算平均数和二次矩以获得左分区的数据(μ1和γ1)和右分区的数据(μ2和σ2)。然后根据以上5.3.3节中的方程4这些单独的数据被用来计算FD。
图12B为图6中的直方图绘出了FD相对于分割位置γ的图。直方图本身在图12A中再现，垂直线标记了γ的数值，此时FD有最大值。图12B中由垂直线指示的FDmax的最大值是113.78。这一数值比由单峰分布估计的FDmax数值大得多，它本身极大地暗示了一种真正的双峰分布。
为了给予由实际数据获得的FDmax的数值一个量化的意义，把它与在单峰形态虚假说下经验性一产生的FDmax数值的分布相比较。更具体一些，使用实际数据的1000个Monte Carlo实现产生单峰均匀分布、单峰三角分布(即从左到右陡升)，和单峰guasian分布的FDmax直方图，每个实现中有100个直方图元素，使用与图6中实际数据直方图相同的分辨率。对于单峰均匀分布这样获得的的FDmax数值直方图显示于图13A中。对于单峰三角分布的FDmax数值直方图显示于图13B中。虽然它们由形状非常不同的分布产生，这两个直方图很相似，单峰Guassian分布(数据没有显示)的结果也非常相似。另外，单峰分布的Monte Carlo结果也被发现对于元素数目和二进制分辨率(数据没有显示)不敏感。
可能性数值P是观察的FDmax数值真的来自单峰分布，它通过确定图13A或13B中的FDmax数值的分数进行分析。即通过评估图13A或13B中直方图的面积相对于观察的FDmax右侧的分数。具体地，图13A的均匀分布用于评估P因为它是一种有些较宽的分布，这样能够产生更加谨慎的可能性数值。图12A-B中数据这样获得的可能性是P＜0.1％这样数据实际上是双峰而不是单峰的置信度被确定为1-P＞99.9％。
图14B为图8中的分布绘出了Fisher Distance相对于分割位置v的图。图8来自特异的ERG11蛋白微扰、分布本身在图14A中再现，垂直线标记了v的数值，此时FD有最大值。在这种情形下，FDmax＜12，远远小于以上从FK506滴定双峰分布确定的FDmax的数值。由ERG11蛋白微扰所获得的FDmax数值与均匀单峰分布比较。该分布按上文的描述用实际数据的Monte Carlo实现产生。由此确定的双峰形态置信度仅为30％(P＝0.7)。这样，在这一例子中，没有双峰形态的统计学证据。
最后，根据以上描述的用于FD506和ERG11特定微扰的方法还确定了图10中分布的双峰形态置信度。图10来自特定HMG2蛋白微扰。该直方图的双峰形态置信度仅为10％，再次与这一单一蛋白微扰的预想一致。
                     7.引用的参考文献
本文所引用的参考文献在此全文引入以供参考，类似的，公开出版物或专利或专利申请也全文引入作参考。
在不偏离其精神和范围的情况下，本发明可以做出许多修饰和变化。这里描述的特定方案仅作为实施例举出，本发明仅受附加权利要求中术语的限制和使权利要求具有资格的等价物的全部范围限制。

Claims (45)

1.在一种细胞类型中鉴定一种药物或药物组合物的一个或多个初始靶标的方法，该方法包括鉴定一个或多个表达组，其中：
(a)每个表达组包括多个细胞成分，每个细胞成分都有一个与药物或药物组合物相关的反应浓度；
(b)一个细胞成分的反应浓度通过暴露于药物或药物组合物的特定水平确定，在该水平上，该细胞成分在药物反应中被药物或药物组合物激活或失活；和
(c)药物反应通过一种方法提供，该方法包括在药物或药物组合物的多个暴露水平上测量该细胞类型一个细胞中的多个细胞成分；其中每个表达组对应于一个药物或药物组合物的初始靶标。
2.权利要求1的方法，其中一种细胞成分的反应浓度是药物或药物组合物的暴露水平，在该水平上该细胞成分的药物反应的斜率绝对值最大。
3.权利要求1的方法，其中一种细胞成分的反应浓度是药物或药物组合物的暴露水平，在该水平上该细胞成分的药物反应为其渐近值的一半。
4.权利要求1的方法，其中一种细胞成分的药物反应是用插值法求出的。
5.权利要求4的方法，其中一种细胞成分的药物反应通过曲线拟合用插值法求出的。
6.权利要求4的方法，其中一种细胞成分的药物反应通过对一个参数函数的模型拟合用插值法求出。
7.权利要求6的方法，其中参数函数是Hill函数。
8.权利要求7的方法，其中一种细胞成分的反应浓度是Hill函数的反应点参数。
9.权利要求1的方法，其中表达组是从多种细胞成分的反应浓度的直方图中鉴定出来，每个表达组对应直方图中的一个众数。
10.权利要求9的方法，其中直方图中的众数是通过对直方图的视觉观察鉴定出来的。
11.权利要求9的方法，其中直方图中的众数是通过对直方图进行对象统计检验而鉴定出来的。
12.权利要求11的方法，其中对象统计检验基于FisherDistance。
13.权利要求12的方法，其中基于Fisher Distance的对象统计检验用于检验直方图的双峰形态。
14.权利要求13的方法，其中基于Fisher Distance的对象统计检验包括确定直方图的最大Fisher Distance，该最大值越高，则该直方图为双峰形态的置信度就越大。
15.权利要求14的方法，其中基于Fisher Distance的对象统计检验进一步包括确定直方图双峰形态的置信度，它通过一种方法确定，该方法包括比较确定的直方图的最大Fisher Distance和单峰形态假设下的最大Fisher Distance数值的经验分布。
16.权利要求15的方法，其中最大Fisher Distance数值的经验分布是一种均匀分布。
17.权利要求15的方法，其中最大Fisher Distance数值的经验分布是一种三角分布。
18.权利要求15的方法，其中最大Fisher Distance数值的经验分布是一种Guassian分布。
19.权利要求15的方法，其中直方图双峰形态置信度进一步由直方图的确定最大Fisher Distance来自单峰分布的可能性确定。
20.权利要求19的方法，其中可能性是最大Fisher Distance数值经验分布的分数，该数值比确定的最大的Fisher Distance要大。
21.权利要求19或20的方法，其中直方图双峰形态的置信度是从总体中减去确定的直方图最大Fisher Distance来自一个单峰分布的可能性。
22.权利要求12的方法，其中基于Fisher Distance的对象统计检验用于检验多于双峰形态的多峰形态水平。
23.权利要求22的方法，其中基于Fisher Distance的对象统计检验包括：
(a)把直方图分割成怀疑含有2个众数的小间隔；和
(b)测试直方图小间隔的双峰形态。
24.权利要求1的方法，其中细胞成份包括多种RNA种类的丰度。
25.权利要求24的方法，其中通过一种方法测量一种细胞中的多种细胞成分，该方法包括使一个或多个基因转录体阵列与如下物质接触：
(i)来自一种细胞类型的细胞的RNA或由其而来的cDNA，该细胞类型暴露于药物或药物组合物暴露水平中，和
(ii)来自一种细胞类型的细胞的RNA或由其而来的cDNA，该细胞类型没有暴露于药物或药物组合物暴露水平中。
26.权利要求1的方法，其中细胞成分包括多种蛋白种类的丰度。
27.权利要求26的方法，其中多种蛋白种类的丰度通过一种方法测量，该方法包括用来自一种细胞类型的细胞的蛋白接触抗体阵列，其中抗体阵列包括一个附有抗体的表面，这些抗体能够与多种蛋白类结合。
28.权利要求26的方法，其中多种蛋白种类的丰度通过一种方法测量，该方法包括对来自一种细胞类型的细胞的蛋白进行二维电泳。
29.权利要求1的方法，其中细胞成分包括细胞类型中存在的多种蛋白种类的活性。
30.一种在一种细胞类型中鉴定一种药物或药物组合物的一个或多个初始靶标的方法，该方法包括：
(a)用一种方法提供药物反应，该方法包括在暴露于药物或药物组合物的多个水平下测量一种类型细胞的多种细胞成分；
(b)确定多种细胞成分中每种细胞成分的反应浓度，它就是药物或药物组合物暴露水平，在该水平上，该细胞成分在药物反应中被激活或失活；和
(c)鉴定细胞成分的一个或多个表达组，每个表达组中细胞成分的反应浓度簇集在一个特定的药物或药物组合物暴露水平附近；其中每个表达组对应于药物或药物组合物的一个初始靶标。
31.一种鉴定一种细胞类型自然环境变化的一个或多个初始靶标的方法，该方法包括鉴定一个或多个表达组，其中：
(a)每个表达组包括多种细胞成分，每个细胞成分都有一个与自然环境变化相关的反应浓度；
(b)每种细胞成分的反应浓度是由自然环境变化的一个特定水平确定的，在该水平上细胞成分在反应分布中由于自然环境的变化而被激活或失活；
(c)反应分布图由一种方法提供，该方法包括在自然环境变化的多种水平上测量一种细胞类型细胞的多种细胞成分；其中每个表达组对应于自然环境变化的一个初始靶标。
32.一种比较两种或多种不同药物或药物组合物一或多个众数的方法，该方法包括：
(a)根据权利要求1的方法鉴定每种药物或药物组合物的初始靶标；和
(b)比较鉴定出来的每种药物或药物组合物的初始靶标。
33.权利要求32的方法，其中2种或多种药物组合物被比较，该2种或多种药物组合物包括同一药物的不同组合。
34.一种用于在一种细胞类型中鉴定一种药物或药物组合物的一个或多个初始靶标的计算机***，包括：
(a)一个处理器；
(b)一个与处理器相连的存储器；和
(c)由存储器编码的一个或多个程序；该一个或多个程序导致处理器鉴定一个或多个表达组，其中
(i)每个表达组包括多种细胞成分，每种细胞成分都有一个与药物或药物组合物相关的反应浓度；
(ii)每种细胞成分的反应浓度是由暴露于药物或药物组合物的特定水平确定的，在该水平上细胞成分在药物反应中被药物或药物组合物激活或失活；和
(iii)药物反应由一种方法提供，该方法包括在暴露于药物或药物组合物的不同水平上测量一种细胞类型细胞中的多种细胞成分；其中每个表达组对应于药物或药物组合物的一个初始靶标。
35.权利要求34的计算机***，该***进一步包含显示反应浓度的装置。
36.权利要求34的计算机***，该***进一步包含显示表达组的装置。
37.权利要求34的计算机***，其中反应浓度可以在存储器中获得。
38.权利要求37的计算机***，该***进一步包含把反应浓度输入存储器的方法。
39.权利要求37的计算机***，其中反应浓度由用户加载到存储器中。
40.权利要求34的计算机***，其中在存储器编码的一个或多个程序包括药物反应表示软件。
41.权利要求34的计算机***，其中在存储器中编码的一种或多种程序包括软件组件，它能从一个或多个药物反应确定反应浓度。
42.权利要求34的计算机***，其中药物反应可在存储器中获得。
43.权利要求42的计算机***，该***进一步包括把药物反应输入存储器的方法。
44.权利要求42的计算机***，其中药物反应由用户加载到存储器中。
45.权利要求42的计算机***，其中程序进一步导致处理器确定药物反应的反应浓度。
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