CN1324134C - 对大肠杆菌o81型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O81型(Escherichia coli O81)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O81型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12200个碱基；或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O81型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O81型的方法。

Description

对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O81型(Escherichia coli O81)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O81型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O81型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1981)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1981年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification ofthe Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；变位酶基因即Gne基因或与Gne有相似功能的基因；单糖缀合物合成基因orf2、orf4；糖基转移酶基因，包括orf5，orf7，orf8，orf9基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O81型源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O81型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O81型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O81型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O81型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O81型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12200个碱基；或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸，其由9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；变位酶基因即Gne基因或与Gne有相似功能的基因；单糖缀合物合成基因orf2、orf4；糖基转移酶基因，包括orf5、orf7、orf8、orf9基因。其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的3407至4567碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的6516至7745碱基的核苷酸；orf1是SEQ ID NO：1中的1415至2434碱基的核苷酸；orf2是SEQ ID NO：1中的2800至3171碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4551至5723碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO：1中的5720至6526碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO：1中的8021至8755碱基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO：1中的8800至9846碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的9843至10631碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf5、orf7、orf8、orf9基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的3441至3458碱基的核苷酸和4084至4101碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4054至4071碱基的核苷酸和4281至4298碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的6791至6808碱基的核苷酸和7517至7534碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6823至6840碱基的核苷酸和7136至7153碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过***表达可提供表达大肠杆菌O81型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O81型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液再用等体积的***抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O81型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O81型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的***抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积***抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的***片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选***片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的***片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O81型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O81型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O81型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长12200个碱基；或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf5，orf7、orf8、orf9)和细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O81型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf5、orf7、orf8、orf9基因。它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O81型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O81型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的3407至4567碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的6516至7745碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O81型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O81型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O81型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测***物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O81型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O81型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过***表达可产生表达大肠杆菌O81型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O81型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的***抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O81型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O81型的基因组为模板通过LongPCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGATTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的***抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积***抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的***片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选***片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的***片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O81型的基因组作5个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O81型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1编码的蛋白与Yersinia O-抗原基因簇中Gne基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(56％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1编码的蛋白与已知的Gne的共有序列的同源性预期值非常高(2.8×e^-148)。Gne负责将UDP-GlcNac转变成UDP-GalNac，UDP-GalNac是O-抗原中的一种稀有单糖。其前体UDP-GlcNac是O-抗原中的常见单糖，负责其合成的酶由基因组其他位置的基因编码，因此在O-抗原基因簇中这些基因不重复出现。而UDP-GalNac变位酶则只出现于有UDP-GalNac的菌的表面抗原基因簇中。我们命名orf1为Gne，并推测大肠杆菌O81的O-抗原中有UDP-GalNac的存在。

Orf3和orf6是大肠杆菌O81种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf3编码的蛋白与Yersinia pestis C092的O-抗原转移酶有29％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf3为wzx。Orf6编码的蛋白与大肠杆菌O6的O-抗原聚合酶有37％的一致性，48％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf6为wzy。

orf 5，7，8，9四个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有24-36％的序列一致性和44-53％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这四个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e^-12至5×e^-17，因此我们推测这四个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O81的O-抗原的寡糖单位可能由五个单糖组成。由于这四个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf5，orf7，orf8和orf9

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O81型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O81型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O81型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O81型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O81型中筛选到对大肠杆菌O81型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和三个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O81型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O81型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O81型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇的结构，共由9个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O81型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                       SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>对大肠杆菌O81型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O81型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>12220

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

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attattcttt taatgcatat tttttacgaa gcatgttatc cgcggttttt ttaattaatg    7080

cctttttgtt tatttctaaa aaaaagtatg tgtattattt ttttgcaatt atatcgcatt    7140

tgtcatccgt cctatatata ggagtatggg aatatttaag ggcaagaaat aaaaaattaa    7200

aaatatgggt tgctagtatg gcaactgtaa ctattatatg ttgttttatt tttttgcgag    7260

ataggattga attttattta tttaaaagct ctggaaattc gatggggtat gtacaagttg    7320

taaccattgc ttttaattat attttgtgtt tgttgttatt attcttttca aatgcaagaa    7380

aagaattgtc aactcaaaga ataatattgt ttttgacttt tttctttatc ttggccttgg    7440

taatttataa aataccacaa aattttggga taagaatctc tattttgctt tacgcactat    7500

caccgttttt cttgtatcca cttcttacct cctgcaatgt aacaatatta aataagatca    7560

aatcgttgtc tctttatatg attgttaact gttgctttct ctttgttgtg ttatataagg    7620

gcgatgatat ttcaaatcac atgcgttcaa atccattaga tactagtttt attgatttat    7680

taataaagga catagattat tttgttaaag gatattatcc agtaatatat tctagagacg    7740

aataagggac attgtttaga tgtgcaaggt ggaaatgtat caaaggaaat tgtagttact    7800

acagtaacag ttactttgta aagtatattt cggtaaaacc tgcaataacc aagggcgcta    7860

aactccctaa caactccgct aatggaatta gaattagaga gtgacgagtt taaatatgag    7920

agtttagggt aatagaacaa atttttaagt ttatagagta agaacagatt aagttaagtt    7980

tgcttatttt ataataagct ctttcttaaa ccatatatag tattatctac aattgagtga    8040

tatcaaattg aatattgaga tcggtttatc agcgctgaat tcaggaattt ataaaattaa    8100

atttcgtaat gattataatt atcttattat tcatcagatt actgatgaat gtgattactc     8160

tgattatgtg gcatctttcc ctgaaaatgt tagatacata tcttcatatg agtctgggtt     8220

gtccaaaagt cgaaatatgg ccattgaaaa tgcaaaatac gattatcttt ggttaatgga     8280

tgatgatatg gaaatagatg atgcggcttg ggattatctg acgaaattta ttagtgatta     8340

taaaaatagt cctttgctgg ttgtttctca ttcattggca aaaaagtata ataatgaaaa     8400

agagaggatt aaaagattga atcctataac tgctgcggga atttgttctg tagatatgat     8460

attaaaaatt tcagcactgg acggtattag atttaactca gattttgggt taggagctaa     8520

atatccttcc ggtgaggaat atatttttgc atgtgatttg atgagagctg gaaaaaaaat     8580

atataaatct aataaaattt gctcgaatca tcctgacacg acttctagtg ataaaacata     8640

tccaaataaa gacgctttta gtacgaagaa gaaaatgttt aaagtcgcaa atgggaaata     8700

cttagggagc attttgtata ttgcttttgt tgtcaaaaaa ttactatata aataataatt     8760

tacataattt tatttttata taatctattt attgtctaga tgcctatgaa aaaagtatat     8820

atttttattg atgatatatc ccgttccggt ggcacagaac gagttgcgac atttctctct     8880

aatcaaatgt ttttatccgg attttcagtc acactaatat cattagcatt agaaggaggg     8940

aatacatact atccgctgca acccggagtc aagttagagg ttttaagtga atcaacatta     9000

tacgaattgt ttcttttttt aagaaaaaat tcatgtgatg tgttgatttc tgtttccatg     9060

ggtagtttat cgtttaagct tgcatgttta cattttctat tacgattaaa atctcgtctt     9120

attttaagtg agcatgtggc ttttgaatcc tcatcaaagt tcattcgttc tctaaaatgg     9180

ttaagctatc aattcgctga tgatcttgta ttattgacaa agcatgatta taaattgctt     9240

aagtcaaatg ttagggctca tactcacgtt atcaataatg ctagtggttt cgaacaatta     9300

tctgaatctg ttcttattca aaagcaaaag atagtattag cagtgggacg tttaacttat     9360

cagaaggggt ttgataggtt aattcgtatt tgggcttcca tatcggacaa tcacggttgg     9420

gttttacgga tcgtagggga tggagaattg cgttcagaac tacaaaaaat gattgttgac     9480

ctgaatgtta cacataatgt ccaacttata ccagcaacaa aatgtataga acaagaatat     9540

actaatgcag ctatattagc tatgacttct cgctatgaag gactaccatt ggttcttata     9600

gaggctaaat cttttggatt agcagcagtc gcttttgatt gtaaaacagg tcctgctgaa     9660

attattcatc acaaaaaaga tgggttcttg attactgaag ataatgaacc tgaattttca     9720

tatcgtcttc agtctttaat gatcgatgat gtttatcgaa acaaaataca aagtatggcc     9780

ttaagaaatg ctaatgatta ttctgttgaa aaaataagtc ggcagtggtt ggagttaata     9840

tcatgagtag ttatgaaaca gtatctataa tcatgcctac gtttaatgct gcatcttata     9900

tttcgtatag catcatttct gtaattgaac aatcatataa tgattggcat ttatatataa     9960

tagatgatgg ttcaactgac aataccgcac atgaaatatc taattttacc gatctgcgaa    10020

taacatatgt aatgcttcct atcaatagtg gagttgcaaa tgctagaaat ataggtatta    10080

aaatggcaaa agggaaattt attgcgtttc ttgatagtga tgacatttgg gaaaaagaaa    10140

aattatcctt gcaaatccct ttactcgaaa aaggatatga tgtagtttgt tcaaattatg    10200

ccatttttaa aaatgaacca aaaaaaataa tcggttctcg aactgcacca caacagatca    10260

cctattcgcg tttgttacgc ggtaattgta tcggcaattt aacggggatt tataaccgag    10320

aacgactagg taaatgctta caggaagaat gtggacatga agactatcta atgtggttac    10380

agttggtaaa gctttctggt agcgcttatt gcatacagaa aaatttagcc cggtatcgag    10440

ttacggaaca ttcagtatca tcaaataaat taaaagcagc attttggcaa tggaatatat    10500

atcgtaaaaa actcaagctt aatattttga gcagtatata ttactggtgt aattattctt    10560

tttacgcatt tatgcacatg ttaaaaatga agtttcatgt gaataaaagt aatctaatat    10620

ataagagata acaagatata tagtgttaat tgtcaccttc attatataaa gtagattaat    10680

ttgcgatggt gacttttaca ttaacatcga agtaaatatt gagataaata ttatacaata    10740

ttaataatat gttatgaatt taaattttat tttgaattgc ccaataatat ttttttaaat    10800

tattacttta agtagtcatt ttaggttaat atattaccgt taagcaaacc atgcagtata    10860

ttactgacag gagtaaacaa tgtcaaagca acagattggc gtcgtcggta tggcagtgat    10920

ggggcgcaac cttgcgctca acatcgaaag ccgtggttat accgtctcta ttttcaaccg    10980

ttcccgtgag aagacggaag aagtgattgc cgaaaatcca ggcaagaaat tggttcctta    11040

ctttacggta aaagagtttg ttgaatctct ggaaacgcct cgtcgcatcc tgttaatggt    11100

gaaagcaggt gcaggcacgg atgctgctat tgattctctc aagccatacc tcgataaagg    11160

tgacatcatc attgatggtg gtaacacctt cttccaggac accattcgtc gtaaccgtga    11220

gctgtctgca gaaggtttta actttatcgg tactggtgtt tccggtggtg aagaaggtgc    11280

actgaaagga ccttccatca tgcctggtgg ccagaaagaa gcctatgaac tggttgcacc    11340

gatcctgacc aaaatcgccg cagtggctga agatggggag ccatgtgtta cctatattgg    11400

tgccgatggt gctggtcact atgtgaagat ggttcacaac ggtattgaat acggagatat    11460

gcaactgatt gctgaagcct attctctgct aaaaggtggc ctgaacctca ccaacgaaga    11520

actggcgcag acctttaccg agtggaataa cggtgaactg agcagctacc tgatcgacat    11580

caccaaagat atcttcacca aaaaagatga agacggtaac tacctggttg atgtgattct    11640

ggatgaagct gcaaacaaag gtacgggtaa atggaccagc cagagtgcgc tggatctcgg    11700

cgaaccgctg tcgctgatta ccgagtctgt gtttgcacgt tatatctctt ctctgaaaga    11760

tcagcgcgtt gccgcatcta aagttctctc tggcccgcaa gcgcagccag caggcgacaa    11820

aggtgagttc atcgaaaaag ttcgccgtgc gttgtatctg ggcaaaatcg tttcttacgc    11880

ccagggcttc tctcagctgc gtgcggcgtc tgaagagtac aactgggatc tgaactacgg    11940

cgaaatcgcg aagattttcc gtgctggctg catcatccgt gcgcagttcc tgcagaaaat    12000

caccgatgct tataccgaaa atccgcagat cgctaacttg ctgttggctc catacttcaa    12060

gcaaattgcc gatgactatc agcaggcgct gcgtgatgtt gttgcttatg cagtacagaa    12120

cggtatcccg gttcccacct tcgccgctgc ggttgcctat tatgacagct accgtgccgc    12180

tgttctgcct gcgaacctga ccaggcacag cgcgactaag                          12220

表1 大肠杆菌O81型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								Wzx	O-抗原转运酶	3407-4567	3441-3424	4094-4101	661bp	0*	56.5
			4054-4071	4281-4298	245bp	0*	58
								Wzy	O-抗原聚合酶	6516-7745	6791-6808	7517-7534	744bp	0*	56
			6823-6840	7136-7153	331bp	0*	58

^*只在大肠杆菌O81型中得到正确的一条带

表2  166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号               该组中含有的菌株                                             来源

1、野生型大肠杆菌  O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，   IMVS^a

                   O21，O22，O23，O24，O59

2、野生型大肠杆菌  O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37，      IMVS^a

                   O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌  O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，      IMVS^a

                   O57，O58，O60，O61，O62

4、野生型大肠杆菌  O63，O65，O66，O69，O70，O71，O72，O74，O75，O76，O77，O78， IMVS^a

                   O79，O80，O82，O83

5、野生型大肠杆菌  O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，     IMVS^a

                    O102，O103，O104，O106

6、野生型大肠杆菌   O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，                     IMVS^a

                    O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128

7、野生型大肠杆菌   O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，                    IMVS^a

                    O138，O139，O140，O141，O142，O143，O144，O145

8、野生型大肠杆菌   O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，                    IMVS^a

                    O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166                                  b

9、野生型大肠杆菌   O168，O169，O170，O171，O172，O173，                                      c

                    D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12                         d

10、野生型大肠杆菌  B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，            d

                    B16，B17，B18

11、野生型大肠杆菌  F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，F_X变，F_Y变，DS，DR，d

12、野生型大肠杆菌  O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，                 IMVS^a

                    O155，O124

13、第4组菌株加上大肠杆菌标准菌株O81                                                          IMVS

^*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3  大肠杆菌O81型O抗原基因结构图

                  Escherichia coli type 81 O-antigen gene cluster

galF        orf1       orf2    wzx      orf4      orf5    wzy       orf7    orf8    orf9      gnd

G+C％       32.8       34.7    29.3     29.0      29.7    27.6      30.2    34.1    31.8

表4  大肠杆菌O81型O抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ATGCGTCCAA GAACGCGGTC     60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTGAAGCGT    120

CAACTGCTGG CGGAAGTACA GTCTATCTGT CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT    180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC    240

AACCCATTTG TCGTGGTACT GCCGGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGTGC CGACCCGCTG    300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGT TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG    360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTTTCTGAA TACTCCGTTA TTCAGACCAA AGAGCCGCTG    420

GATCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG    480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG    540

GAACTTGAAC GCACTCAACC TGGTGCATGG GGACGTATCC AACTGACTGA TGCCATTGCT    600

GAACTGGCGA AGAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC    660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTGCGCAA CCTGAAAGAA      720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG      780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGTGAA AGTAATTTGT      840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG      900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT      960

AGCGTTTGAA TTTTTCGAGT TTAGCGCGAG TAGGTAACGC TAGTCACATC GTAGACATGT     1020

AAGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCA TTGTTCTTGA TATTTTTAAG     1080

TATAAAAATG ACACATAAAA ATAAAATAAT TAGTTATCGG TATGTTTTTA ATTGTGTTAT     1140

TATTGAAAAA TATCACCATT AATTATTTAA TGCGATAAAG GCCAAATAAA TCACTCATTT     1200

ATTTCTACAT AGGATAGGGG ACTATCAGAT GGGAATTAAA TAAAAATCCA AGTGCTAAAT     1260

ATTTCAATCT TAAATTCCAT TGTAAAAAGT TTAAGGGATT TTATTCTAAA AAAGAATTGG     1320

ATGAATTGAA AGTTATTTTG AGCTTAATTT ATTAAACTTG AAGTTTTTTT ACTGAGTTTT     1380

                                  orf1起始

TCTGGAAAAT AATTTATTGT TAATGGAGCC ATAT ATGTCA ATTTTAGTTA CCGGAGGTTG   1440

TGGTTATATA GGTGTCCACA CAATTTATAC GTTAATTTCT CAGGGCTACG ATGTTATTGT     1500

ACTGGATAAC CTGACTAACT CATCAATAGA GTCATTAGAG AGAGTCAAGT TAATGACAAA     1560

TCATAACATA CCCTTTTATA AAGGAGATGT GGGGAATAAA AAAATATTGG TAGACATATT     1620

CAATGAGCAT CAAATAAAAG CGGTTATGCA TTTTGCAGGC TTGAAATCAG TAAGTGAATC     1680

TATAAAAAAA CCGATTGAAT ATTATTCAAG TAACGTAATG CAAACGTTAT CACTAATATC     1740

TACAATGATA GAGTATAACG TAAAAAGCTT TATCTTTAGT TCATCTGCTA CTGTATATGG     1800

TAAACCAAAG TTATGCCCTA TAAATGAAAC TCATCCTATT GGCAAAACTA CAAATCCTTA     1860

TGGAACATCA AAATTAATGA TGGAGTTAAT GTTGTCTGAT TTGTGTAATG CATATGATGA     1920

TTTTAATGTG ACAATTTTAC GATATTTTAA TCCAATTGGT GCTCATGAAT CAGGTAATAT     1980

TGGTGAACAT CCAAACGGTA TACCAAATAA CCTATTTCCT TATCTTACAA AAGTTGCTAT     2040

TGGAGAGTAT CCTTATTTAA AAGTGTATGG TTGTGATTAC CCAACGTCTG ATGGTTCTGG     2100

TGTTCGAGAT TATATTCATG TAGTTGATCT TGCTGAAGCA CATGTAAAAG CTTTATCAAA     2160

AAATTCAGAG TCGACTGGGC TAAAAATTTA TAATTTAGGA ACCGGAAAAG GATATTCTGT     2220

ACTCGAAGTT ATAGAAGCTT TTGAAAAGAT AACTGGAATC AAAATACCAT ATAAAATTAT     2280

GCCTCGAAGG GATGGTGATG TTGCGGAGTG TTGGTCTGAT AGCACGAAGG CAAATGATAA     2340

ATTAGAATGG AAAGCAAACA GAGAATTATA TGACATGATT AGAGACGCTT GGAATTGGCA     2400

                                 orf1终止

ATCAAAAAAT CCTCATGGTT ATGATAATAC A TGATGTTAT AGTATATTCA ATGAATATAA   2460

TTTATGCTTT GGAGTAAAAG TTGTCACAGC GTTTTCTTGC AGAACTAAGA TGTTTTTAGC     2520

ATAATTAGAC ACAGAATTAA AAATATTATC AGGCCGTATC AGTACATATC TTCAGTATGC     2580

ACTATCATAT ATTAATATGA GAAAATATTT GTATTTAAAA TATGATGTTC TAATAAGATT     2640

AAATTAACTG CCTAGGATAT TAAAAGCTAA TTTGGACTAG CTTTATTAGA TAAGTAAATC     2700

TAACAAAATA TTACTATGTC CGATATGTTA TACCACTATT AATGACATCA TGTAATATTA     2760

                                         orf2起始

TTTTAATAAA CTATTTTTTG ATCGCAGAGG TAATTATAA A  TGAGAAGAGT TATCACCTTT 2820

GGAACATTCG ACGTGTTTCA TATTGGACAT GTTAATATAT TAAAAAGGGC GAAGGAGTTT     2880

GGTGATTTGC TGATTGTGGG AGTTTCATCC GATTCATTAA ATTTTTCTAA AAAACAACGT     2940

TATCCAATCT ATAGCCAGGA GGAGCGCATT GAGATTATAT CCTCACTTAA GTTTGTAGAT     3000

CATGTCTTTA TAGAAGAATC TTTAGATCTT AAGTTAGAAT ATATTAGAAA GTATGAGGCA     3060

AATTTACTTG TAATGGGAGA TGATTGGAAG GGCAGATTTG ACTGGGTAAA GATGAGTGCG     3120

                                                  orf2终止

AAGTTATTTA TTTGCCCAAA ACACCATCGA TATCAACTAC CGAGATTA TA  GAAATTGTCC 3180

GGAGAATAAA ATGATAACTC ATTTGTTGAT AGTGATTTAT ATTGTATAAC TAATACTAGG    3240

TAAATGATAT ATATGCAAAT ACAAATGACG TCATGTAATA ACTTTAAAAG TATAAAACAT    3300

TATCTTTATA TCCGTTGGTT TATCCTCTAT TCGTGTCTTT TTGGGGCCAA TAACATTACT    3360

                                                 orf3起始

TGTACTAGCC AAAAACCTTT TCCACTGAGG AACTAGGATT TTTATT ATGC TTTTTTTTTC  3420

GTTAACAGCA ATGGCACAGT TGCTGGAAGT TGGGATGTCT AGCGTATTGA AACAGTATTA    3480

TAGCCATTCT TATGCTATTC ATGATATCAG TGAAAAAAAT ATAAAAATAT CGAACTATTT    3540

TAACTTTTCA ATCTATTGGT ATTTAATATT ATCAATACTT TTTTTTATAT TGGGAGGGGG    3600

GGTGTCATAT GTTATGTTTA ATGATTATAA CGGAATAGTT AACTGGAAAT TACCATGGTT    3660

TTTTTTGCTT TTTGTTTCAT GTACTAATTT ATTAGTATTG CCCTTAAATG CAATGCTTGA    3720

TGGAACACAA AGGCAACAAT TATTGATGAA AGCTAATATT GTTAGTCAGT TAATGATAGC    3780

GATATCATTA TGGCTGACAA TTTATTTAGG CTTGGGGCTA TATTCTCTTG GTCTATCACA    3840

ATTGGTAGGA ATATTATTTT TTTTACTGTC AGTTTTTATA TTTAATAAAT GTAGATTCCA    3900

GTTCATAGAA ATACATAAAA AAAACTTTTC ATTTAAAACA GTATTTAATG AGTTGTGGCC    3960

GTTATTGAAA AAAACTAGTA TCGTATGGTT TCTTGGTTAT TTCTACTGGA ACGGTTTTAA    4020

TATAATATCA TTTAAATATC TTGGTGCAGA GATCGCAGGC TTCGTTGGTA TGTCGATGTC    4080

AATTATGCGA GCGGGACAGA ATATAGCAAT ATCTATTTTG AATTCTCAGA TGACATTGTA    4140

TGCAAGCAAT ATTGCGATGG GAAAGATTGA TGAAGCAAGA AGAGTATTTA AGAAATATTT    4200

TATCATTTCA TTTTTGTTAT TAATTTCTGG TTACTCAATA TTTTATATTT TCTATTATGT    4260

TAAGCCTGAT TTTTTCTTGT TTAAGAAGGT CCTGCCCTTA GAACAAATGA TTTATGTGTC    4320

AATATTTTTT GCCTTTACAT TTATAATATC AGGAACTGAA ACTTTTATTC GTTGTTTTAA    4380

AGTGGAGAAG TTCGTTATCA CTCAGACAAT CAATTCAATT TTAACTCCAT TCTTATTTGT    4440

TTTGGGGCTT AACTTGCATT ATCAATATTT TTGTTTACCA ATAATATCTG TACTGATAGT    4500

                                                      orf1起始

GTCAATCTTA ACGTTATATA TAAGTCGACG TTTTTACACG GGGTATTCGA  ATGCAAAAAA  4560

     orf3终止

TACT TAAGTA TATAATGAAA TTAATGATGT GGAGTATTTA TCCTATCGGC TTTTTAATTA  4620

AAAGGGATAA AAGCATTTGG CTTTTCGGTA GTTATAGCGG TTTTACTGAT AATAGTCGAT    4680

ATTTATTTGA ATCTACCACT AAAAAGAATG ATGTAAGATG CATTTGGATA TCTGATGATA    4740

TAAAGCTGAT AAAAAAAATT AGATGTAAAG GTTATGAGGC ATATTACAAA TATAGTGTTA    4800

AAGGTATATA TTTTTGTTAT ATTGCAAAGG TGTATATATA TTCAAATTAT GTATCAACGA    4860

TAAACTTTTA TACATCTGCA GGCGCGGTAT TGGTAAATTT ATGGCATGGG ACGCCACTTA    4920

AAAAAATCGA ATATGATATA TCTAAATCTC CTTTATTTAA TTATTTTAAA GGAGCCTCAT    4980

TTATAATTAA AATATTGATG CCTGAGAAAC ATAAAAAGTG TAATTTCATT CTTGCTCCGA    5040

GTCAATTTGT TTATGATTAT TCATTTAAAA GTGCATTTAG GGTGTATGAT ATGCAATATG    5100

CCATTATTGC TGATCCACCT AGGATATCTA ATCCCTTATC AAGAGCCTAT CACAAAGTGA    5160

ATAATGATAA GAATTCAATT AAAAAAACAA AGAAAACATT TTTATATGCA CCAACATGGA    5220

GAGATGATCG CTCGGATTTT ATAAGTATTT CAGGTTTAAA TTTCAACGAA ATTAATAATT    5280

TTCTATTAAA AAATAACGCG TATTTACAAA TCAGGTTGCA TCCTAATACA ACTTTAAATA    5340

TTGATATGAG TGAAATGGAA AATATTCACA TTGTTGATAA TTATGAACCA GCTGAAGATA    5400

GTATGCTAAA TTCTGATTTT CTCATAACTG ATTACTCTTC AATATATTTT GACTACCTCT    5460

ATCTTAATAG ACCTATAATC TTCTTCCCAT TTGATCTTGA AAAATATACC GCATCGCGTG    5520

ATTTTTATTT GAGTTATAAC GAAGCAACTC CAGGGGTTAA AGTATATAAT CAAGGTGAAT    5580

TAATCCAGGA GATGGATAAC CTATTGAAGG GCATTGACAA TTGGATGAAC TATCGAAAGG    5640

AGCTTGCTGA AAAATTCTGT TCGCTCGAAA GACGTAACGA TGATTATATC ATAAAAAAAA    5700

                 orf5起始  orf4终止

TTAAAAAAGG TGTATCTGA A  TGAATCTTGG TAAAATTATA AATTATATAG AGTCTAAGGT 5760

TATTAGTATA AATTTTGATT TCAATCATTT AGCTGGCTAT TTAAGTCGTG ATGAGCGAGA     5820

TAAAATAACC TTAAAACATC TAAGCAGTAT TATTGATAGA AGAAAAAAAC ATCCATCTGT     5880

TTCTGCTATA TACAGAGTGA AAAATGGAGC TCAATTTATT GAACTATCTA TTCTTTCAAT     5940

AGCTGCATTT TGTCGTGAAA TAATTATTGT AGACAATAAT TCAACAGATG ATACTTTACT     6000

AATAGTAGAA CGTCTTAAAA GCGAACTTCA GGAAATATGT GAAATTAAAA TCTATCAGTA     6060

TACTAGTCAG GTCGCTTTGG CGGGTAAGAA TTATAATGAT GAAATCAGAA AATATCCTGA     6120

GCGGTCATTG GCAAAATATT ATAACTATGC TTTTTCATTG GCAACATCGG AATTCTTAAT     6180

GAAGTGTGAT GCTCATTGTA TATTCACACC TGCGGGTATA GATAGTATAC AACGAAAATT     6240

AATTTCAAAT CATAAGTCAG TTGATGTTAT ATGTTATCGT GGCACCGAAG TATTTGGAGC     6300

CATGTTAGAT TGTGAACCCT ATCTAATACG GAAAAATAGT TTTAAATATT ACGACACTCA     6360

ATATTTTGAA CGTTTGACAT TAAACAAGAA GAGAAGTTTT ATTCAAAAAA TTAAAGGGAG     6420

AATTTCATCA CCTTGCTTTA TACATGTTAA ACGTTTGAGT TATGTTAAGT CAGTTCATCT     6480

                                   orf6起始     orf5终止

ATGTGAAATA AACCCTGTGG AGTATATGTA TAAAA ATGAT AAT TAAATTA CATAATATTT 6540

GCGTAACTGG GAAGAATGAT AATCATGACG GGTCTTTTCG CCTACAAATA TACTATTTCC     6600

TATGTATTTT AATATCTATT CTATTTTTCA GTGCATACCC TTTGGTATCG TTACCTCTTA     6660

TAGCTCTTTC AAGTCCATTT GTTAATAACT ATGCAAGATG GACTATGTCA CTATTAATGA     6720

TTTTTTATTT TATTTTATTA TACTCATCTA TTACGCCTTT TTCAGACATA GCAGAGTATA     6780

TGCTTATCTA TAGAGGAGTA ACCGATGTTG ATATATTTAG TTTTGGTAGG TTTGGTGGTG     6840

GAATCGAGAT CTTCATATTA GCTCTCATGC GCTTGGTGTA TTTTATATCC GATGGCAATG     6900

AATATCTTTT TTTATTTTTT TGCTTTACTA TTATTCAAAT ATTTCTTTTT GTATTTTGTT     6960

ATCGTGTTAA TCGTCGTTTA TCATGTTTAT ATTTTTTAGT ATTTAATCTT TCATATGCTT     7020

ATTATTCTTT TAATGCATAT TTTTTACGAA GCATGTTATC CGCGGTTTTT TTAATTAATG     7080

CCTTTTTGTT TATTTCTAAA AAAAAGTATG TGTATTATTT TTTTGCAATT ATATCGCATT     7140

TGTCATCCGT CCTATATATA GGAGTATGGG AATATTTAAG GGCAAGAAAT AAAAAATTAA     7200

AAATATGGGT TGCTAGTATG GCAACTGTAA CTATTATATG TTGTTTTATT TTTTTGCGAG     7260

ATAGGATTGA ATTTTATTTA TTTAAAAGCT CTGGAAATTC GATGGGGTAT GTACAAGTTG     7320

TAACCATTGC TTTTAATTAT ATTTTGTGTT TGTTGTTATT ATTCTTTTCA AATGCAAGAA     7380

AAGAATTGTC AACTCAAAGA ATAATATTGT TTTTGACTTT TTTCTTTATC TTGGCCTTGG     7440

TAATTTATAA AATACCACAA AATTTTGGGA TAAGAATCTC TATTTTGCTT TACGCACTAT     7500

CACCGTTTTT CTTGTATCCA CTTCTTACCT CCTGCAATGT AACAATATTA AATAAGATCA     7560

AATCGTTGTC TCTTTATATG ATTGTTAACT GTTGCTTTCT CTTTGTTGTG TTATATAAGG     7620

GCGATGATAT TTCAAATCAC ATGCGTTCAA ATCCATTAGA TACTAGTTTT ATTGATTTAT     7680

TAATAAAGGA CATAGATTAT TTTGTTAAAG GATATTATCC AGTAATATAT TCTAGAGACG     7740

  orf6终止

AA TAAGGGAC ATTGTTTAGA TGTGCAAGGT GGAAATGTAT CAAAGGAAAT TGTAGTTACT   7800

ACAGTAACAG TTACTTTGTA AAGTATATTT CGGTAAAACC TGCAATAACC AAGGGCGCTA     7860

AACTCCCTAA CAACTCCGCT AATGGAATTA GAATTAGAGA GTGACGAGTT TAAATATGAG     7920

AGTTTAGGGT AATAGAACAA ATTTTTAAGT TTATAGAGTA AGAACAGATT AAGTTAAGTT     7980

                                            orf7起始

TGCTTATTTT ATAATAAGCT CTTTCTTAAA CCATATATAG  TATTATCTAC AATTGAGTGA   8040

TATCAAATTG AATATTGAGA TCGGTTTATC AGCGCTGAAT TCAGGAATTT ATAAAATTAA     8100

ATTTCGTAAT GATTATAATT ATCTTATTAT TCATCAGATT ACTGATGAAT GTGATTACTC     8160

TGATTATGTG GCATCTTTCC CTGAAAATGT TAGATACATA TCTTCATATG AGTCTGGGTT     8220

GTCCAAAAGT CGAAATATGG CCATTGAAAA TGCAAAATAC GATTATCTTT GGTTAATGGA     8280

TGATGATATG GAAATAGATG ATGCGGCTTG GGATTATCTG ACGAAATTTA TTAGTGATTA      8340

TAAAAATAGT CCTTTGCTGG TTGTTTCTCA TTCATTGGCA AAAAAGTATA ATAATGAAAA      8400

AGAGAGGATT AAAAGATTGA ATCCTATAAC TGCTGCGGGA ATTTGTTCTG TAGATATGAT      8460

ATTAAAAATT TCAGCACTGG ACGGTATTAG ATTTAACTCA GATTTTGGGT TAGGAGCTAA      8520

ATATCCTTCC GGTGAGGAAT ATATTTTTGC ATGTGATTTG ATGAGAGCTG GAAAAAAAAT      8580

ATATAAATCT AATAAAATTT GCTCGAATCA TCCTGACACG ACTTCTAGTG ATAAAACATA      8640

TCCAAATAAA GACGCTTTTA GTACGAAGAA GAAAATGTTT AAAGTCGCAA ATGGGAAATA      8700

                                                       orf7终止

CTTAGGGAGC ATTTTGTATA TTGCTTTTGT TGTCAAAAAA TTACTATATA AA TAATAATT    8760

                                           orf8起始

TACATAATTT TATTTTTATA TAATCTATTT ATTGTCTAG A  TGCCTATGAA AAAAGTATAT  8820

ATTTTTATTG ATGATATATC CCGTTCCGGT GGCACAGAAC GAGTTGCGAC ATTTCTCTCT      8880

AATCAAATGT TTTTATCCGG ATTTTCAGTC ACACTAATAT CATTAGCATT AGAAGGAGGG      8940

AATACATACT ATCCGCTGCA ACCCGGAGTC AAGTTAGAGG TTTTAAGTGA ATCAACATTA      9000

TACGAATTGT TTCTTTTTTT AAGAAAAAAT TCATGTGATG TGTTGATTTC TGTTTCCATG      9060

GGTAGTTTAT CGTTTAAGCT TGCATGTTTA CATTTTCTAT TACGATTAAA ATCTCGTCTT      9120

ATTTTAAGTG AGCATGTGGC TTTTGAATCC TCATCAAAGT TCATTCGTTC TCTAAAATGG      9180

TTAAGCTATC AATTCGCTGA TGATCTTGTA TTATTGACAA AGCATGATTA TAAATTGCTT      9240

AAGTCAAATG TTAGGGCTCA TACTCACGTT ATCAATAATG CTAGTGGTTT CGAACAATTA      9300

TCTGAATCTG TTCTTATTCA AAAGCAAAAG ATAGTATTAG CAGTGGGACG TTTAACTTAT      9360

CAGAAGGGGT TTGATAGGTT AATTCGTATT TGGGCTTCCA TATCGGACAA TCACGGTTGG      9420

GTTTTACGGA TCGTAGGGGA TGGAGAATTG CGTTCAGAAC TACAAAAAAT GATTGTTGAC      9480

CTGAATGTTA CACATAATGT CCAACTTATA CCAGCAACAA AATGTATAGA ACAAGAATAT      9540

ACTAATGCAG CTATATTAGC TATGACTTCT CGCTATGAAG GACTACCATT GGTTCTTATA      9600

GAGGCTAAAT CTTTTGGATT AGCAGCAGTC GCTTTTGATT GTAAAACAGG TCCTGCTGAA      9660

ATTATTCATC ACAAAAAAGA TGGGTTCTTG ATTACTGAAG ATAATGAACC TGAATTTTCA      9720

TATCGTCTTC AGTCTTTAAT GATCGATGAT GTTTATCGAA ACAAAATACA AAGTATGGCC      9780

TTAAGAAATG CTAATGATTA TTCTGTTGAA AAAATAAGTC GGCAGTGGTT GGAGTTAATA      9840

orf9起始orf8终止

TC ATGAGTAG TTATGAAACA GTATCTATAA TCATGCCTAC GTTTAATGCT GCATCTTATA    9900

TTTCGTATAG CATCATTTCT GTAATTGAAC AATCATATAA TGATTGGCAT TTATATATAA      9960

TAGATGATGG TTCAACTGAC AATACCGCAC ATGAAATATC TAATTTTACC GATCTGCGAA     10020

TAACATATGT AATGCTTCCT ATCAATAGTG GAGTTGCAAA TGCTAGAAAT ATAGGTATTA     10080

AAATGGCAAA AGGGAAATTT ATTGCGTTTC TTGATAGTGA TGACATTTGG GAAAAAGAAA     10140

AATTATCCTT GCAAATCCCT TTACTCGAAA AAGGATATGA TGTAGTTTGT TCAAATTATG     10200

CCATTTTTAA AAATGAACCA AAAAAAATAA TCGGTTCTCG AACTGCACCA CAACAGATCA     10260

CCTATTCGCG TTTGTTACGC GGTAATTGTA TCGGCAATTT AACGGGGATT TATAACCGAG     10320

AACGACTAGG TAAATGCTTA CAGGAAGAAT GTGGACATGA AGACTATCTA ATGTGGTTAC     10380

AGTTGGTAAA GCTTTCTGGT AGCGCTTATT GCATACAGAA AAATTTAGCC CGGTATCGAG     10440

TTACGGAACA TTCAGTATCA TCAAATAAAT TAAAAGCAGC ATTTTGGCAA TGGAATATAT     10500

ATCGTAAAAA ACTCAAGCTT AATATTTTGA GCAGTATATA TTACTGGTGT AATTATTCTT     10560

TTTACGCATT TATGCACATG TTAAAAATGA AGTTTCATGT GAATAAAAGT AATCTAATAT     10620

       orf9终止

ATAAGAGA TA  ACAAGATATA TAGTGTTAAT TGTCACCTTC ATTATATAAA GTAGATTAAT 10680

TTGCGATGGT GACTTTTACA TTAACATCGA AGTAAATATT GAGATAAATA TTATACAATA     10740

TTAATAATAT GTTATGAATT TAAATTTTAT TTTGAATTGC CCAATAATAT TTTTTTAAAT     10800

TATTACTTTA AGTAGTCATT TTAGGTTAAT ATATTACCGT TAAGCAAACC ATGCAGTATA    10860

TTACTGACAG GAGTAAACAA TGTCAAAGCA ACAGATTGGC GTCGTCGGTA TGGCAGTGAT    10920

GGGGCGCAAC CTTGCGCTCA ACATCGAAAG CCGTGGTTAT ACCGTCTCTA TTTTCAACCG    10980

TTCCCGTGAG AAGACGGAAG AAGTGATTGC CGAAAATCCA GGCAAGAAAT TGGTTCCTTA    11040

CTTTACGGTA AAAGAGTTTG TTGAATCTCT GGAAACGCCT CGTCGCATCC TGTTAATGGT    11100

GAAAGCAGGT GCAGGCACGG ATGCTGCTAT TGATTCTCTC AAGCCATACC TCGATAAAGG    11160

TGACATCATC ATTGATGGTG GTAACACCTT CTTCCAGGAC ACCATTCGTC GTAACCGTGA    11220

GCTGTCTGCA GAAGGTTTTA ACTTTATCGG TACTGGTGTT TCCGGTGGTG AAGAAGGTGC    11280

ACTGAAAGGA CCTTCCATCA TGCCTGGTGG CCAGAAAGAA GCCTATGAAC TGGTTGCACC    11340

GATCCTGACC AAAATCGCCG CAGTGGCTGA AGATGGGGAG CCATGTGTTA CCTATATTGG    11400

TGCCGATGGT GCTGGTCACT ATGTGAAGAT GGTTCACAAC GGTATTGAAT ACGGAGATAT    11460

GCAACTGATT GCTGAAGCCT ATTCTCTGCT AAAAGGTGGC CTGAACCTCA CCAACGAAGA    11520

ACTGGCGCAG ACCTTTACCG AGTGGAATAA CGGTGAACTG AGCAGCTACC TGATCGACAT    11580

CACCAAAGAT ATCTTCACCA AAAAAGATGA AGACGGTAAC TACCTGGTTG ATGTGATTCT    11640

GGATGAAGCT GCAAACAAAG GTACGGGTAA ATGGACCAGC CAGAGTGCGC TGGATCTCGG    11700

CGAACCGCTG TCGCTGATTA CCGAGTCTGT GTTTGCACGT TATATCTCTT CTCTGAAAGA    11760

TCAGCGCGTT GCCGCATCTA AAGTTCTCTC TGGCCCGCAA GCGCAGCCAG CAGGCGACAA    11820

AGGTGAGTTC ATCGAAAAAG TTCGCCGTGC GTTGTATCTG GGCAAAATCG TTTCTTACGC    11880

CCAGGGCTTC TCTCAGCTGC GTGCGGCGTC TGAAGAGTAC AACTGGGATC TGAACTACGG    11940

CGAAATCGCG AAGATTTTCC GTGCTGGCTG CATCATCCGT GCGCAGTTCC TGCAGAAAAT    12000

CACCGATGCT TATACCGAAA ATCCGCAGAT CGCTAACTTG CTGTTGGCTC CATACTTCAA    12060

GCAAATTGCC GATGACTATC AGCAGGCGCT GCGTGATGTT GTTGCTTATG CAGTACAGAA    12120

CGGTATCCCG GTTCCCACCT TCGCCGCTGC GGTTGCCTAT TATGACAGCT ACCGTGCCGC    12180

TGTTCTGCCT GCGAACCTGA CCAGGCACAG CGCGACTAAG                          12220

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1、一种对大肠杆菌O81型的O-抗原特异的引物对，其特征在于所述引物对选自：SEQ ID NO：1中的3441至3458碱基的正向引物和4084至4101碱基的反向引物、SEQ ID NO：1中的4054至4071碱基的正向引物和4281至4298碱基的反向引物、SEQ ID NO：1中的6791至6808碱基的正向引物和7517至7534碱基的反向引物或者SEQ ID NO：1中的6823至6840碱基的正向引物和7136至7153碱基的反向引物。

2、权利要求1所述的引物对在检测环境中大肠杆菌O81型中的应用。