CN1324133C - 对大肠杆菌o71型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O71型(Escherichia coli O71)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O71型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13743个碱基；或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O71型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O71型的方法。

Description

对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O71型(Escherichia coli O71)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O71型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O71型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1935)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O71 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，and D)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1935年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；鼠李糖合成酶基因，包括rmlBDAC基因或与rmlBDAC有相似功能的基因；一种稀有单糖合成酶基因，包括orf6和orf7或与orf6和orf7有相似功能的基因；乙酰基转移酶基因orf12或与乙酰基转移酶有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf11基因；一个未知功能的基因orf9。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O71型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O71型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O71型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O71型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O71型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13743个碱基；或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸，其由12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：wzx是SEQ ID NO：1中的6987至8261碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的9666至10955碱基的核苷酸；rmlBDAC分别是SEQ ID NO：1中的1137至2222，2222至3121，3179至4051，4925至5473碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4078至4887碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO：1中的5466至5864碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO：1中的5884至6990碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的8248至9666碱基的核苷酸；orf11是SEQ ID NO：1中的10948至11775碱基的核苷酸；orf712是SEQ ID NO：1中的11778至12248碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7515至7533碱基的核苷酸和7839至7859碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7139至7157碱基的核苷酸和8051至8069碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的10332至10350碱基的核苷酸和10581至10609碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9981至9999碱基的核苷酸和10670至10688碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过***表达可提供表达大肠杆菌O71型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O71型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液再用等体积的***抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O71型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O71型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的***抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积***抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的***片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选***片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的***片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O71型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O71型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O71型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长13743个碱基；或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；鼠李糖合成酶基因(rmlBDAC基因或与rmlBDAC有相似功能的基因)；一种单糖合成酶基因(orf6，7基因和orf6，7基因有相似功能的基因)；一种未知功能基因；糖基转移酶基因(orf4、orf11基因)；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括orf6，7，12基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O71型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因寡核苷酸，鼠李糖合成没基因(rmlBDAC基因或与rmlBDAC有相似功能的基因)；一种单糖合成酶基因(orf6，7基因和orf6，7基因有相似功能的基因)；一种未知功能基因；糖基转移酶基因(orf4、orf11基因)；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括orf6，7，12基因它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O71型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O71型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是SEQ ID NO：1中的6987至8261碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从wzy是SEQ ID NO：1中的9666至10955碱基的核苷酸)源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O71型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O71型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O71型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测***物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O71型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O71型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过***表达可产生表达大肠杆菌O71型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O71型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的***抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O71型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O71型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGATTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的***抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积***抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的***片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选***片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的***片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O71型的基因组作5个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O71型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1，2，3编码的蛋白与Shigella boydi抗原基因簇中rmlBDA基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1，2，3编码的蛋白与已知的rmlBDA的共有序列的同源性预期值非常高。rmlBDA负责合成鼠李糖O-抗原中的一种稀有单糖。Orf5和orf4编码的蛋白与沙门氏菌的rmlC和糖基转移酶基因编码的蛋白有较高的相似性。orf6，7编码的蛋白与Aneurinibacillus thermoaerophilus中合成一种单糖的基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性，orf6，7也应该合成一种单糖，命名为orf6，7。orf12编码的蛋白与Listonella anguillarum中编码乙酰基转移酶的基因有63％的相同性，推测orf12是乙酰基转移酶基因，命名为orf12。

Orf8和orf10是大肠杆菌O71种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf1编码的蛋白与大肠杆菌的O-抗原转移酶有28％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf8为wzx。Orf10编码的蛋白与Streptococcus pneumoniae O-抗原聚合酶有20％的一致性，42％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf10为wzy。

orf4，11两个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有24-36％的序列一致性和44-53％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这两个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e^-12至5×e^-17，因此我们推测这两个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O71的O-抗原的寡糖单位可能由三个单糖组成。由于这三个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf4，orf11。一个未知功能的基因orf9。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O71型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O71型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O71型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O71型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O71型中筛选到对大肠杆菌O71型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O71型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O71型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O71型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                     SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>对大肠杆菌O71型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O71型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>13743

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

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aaacaaatag cttataagca gtttaattcc atttctttgc cattgacaga aaaaatccat    6900

aatgaggttt tgtctttgcc aatggatcca actctttctg aagaggagat acaaaaggtt    6960

gtcaatgcgg taaatggttt tactctatga gttcattttt taagatatca ttctttagtg    7020

gttgtttgac attattcaag atgttaatgg gctttttaat tgctaaagta atcgctattt    7080

atacagggcc atctggtatg gccttacttg gtcagcttca aagtttagtc acaggtatta    7140

atgggatcgt aaatgcacct gtaggaaatg gtatcgttaa atatactgca gagtttaaac    7200

tagaaggtgc agaatgttgc tctagatggt ggaaaccagc aatcggcttt tcattccttt    7260

tttgtttggt tttatcgata gtttttatac catttgcaaa taaaatatca tttattttat    7320

ttggctctta tgaatatgat tatgtggtta ttatagcagt atgtaactta ccttttgcag    7380

ctttcggtac tatgataatg tctattgtca atggaatggg gaagtataga ctttatatat    7440

tatatgggtt tatttctaat cttataacgt cgataataat gttacttatg ctaataaaat    7500

atggtattgt tggtgcatta ttagccactt caatacaata tggtcttatt ggtataattt    7560

tgatatgttt gaattataat caggaatggt tcaaacataa ttatttttat ccctacgata    7620

gtatttttaa ttcagaagca aaggatattt tagcttatat attgatggct ataacaagtg    7680

caattagctt acccttgact ttaatcgtaa ttagaaaaat tctcctaaat atgacggata    7740

taactaccgt tggacaatgg caggcggtat ggaaaatatc tgaagtatat ataggagtcg    7800

tgactattgc acttagtact tattttttgc ctaagttgtc tgctctaaat gatacggcta    7860

aaataaaaaa tgaaattggt attgtcctta aatatactat tccatttgtt tgtgttgccg    7920

cggttctcat tttcgctttt cgcgatctga taataacgct cttattcacg aatgagtttt    7980

atcctgcacg tgatcttttt tttattcaac ttgtaggtga tataattaaa ataataagtt    8040

ggatttatgc attcactatg ttggcttcaa aagcaactag gtggtatgtt ggatctgaat    8100

tatttttttg tatttcatgg tgtttaatta gttttgttct tgttaatata tataaggcgc    8160

aaggaattaa tatagcatat tgcattagct atgttatgta ttttttaata atttatctca    8220

acctaaataa gattataaag aaaaagaatg aacctcattg aaattattaa actccaaatt    8280

atcaaaactt ctgatattaa taagaaaata agactgctca aggagttggg gggaatgcta    8340

tgggccaata acgttggcat atacaactta aattcacttg aaagggcagt tatcgaagat    8400

gtagcaagag attatacgcc acaaattggt agtcaatata aaaagaaaaa aaataatgta    8460

tttgtgatta ctataggcta catgtctggt gggcatacaa ggttaatgga aaatcttgca    8520

aatatgctag ataataaatg tgaccttata attactggaa acgcatctgt tacgctaaaa    8580

aaaaggcttg aaaaatattt caatgaaatt tttgaaattc ctgtttacaa tgacactaac    8640

attaatgaac tttataagtt aagcgctaat cttgagagat acgaaaatat aatacttaat    8700

atacaccctg atgatattgc gagcgttatt gcagctggtc ttgcaaaaaa aaatataaac    8760

acatacgttc actttgttaa tcatgcagat catgttttta gcttcggtcc gaccgtagca    8820

gatgtctggt atcaaattag ccaattcggg gctaaacttg atcaattaag agagctaagt    8880

ggtaaaacta cattcttggg gataccgatt gcgataaatg atgatcattt atctaataat    8940

atgatttcca ctaatgatga agtgaaatgt attatcactg ctggctctgc aaataaatac    9000

aagccgcata aaggctattc tctcataaaa aaaattcctg aaatattata tcaatttcca    9060

gaagcatcaa taatagtagt aggtactaac atcctatttt gctattggtg gtggggaact    9120

tttttaaaat tcagaaagcg tattaaattc tataaagcac ttaatcattc tgaatatctt    9180

ttacttatgc aaaatgctga tatttatttg gatagttatc ctattcccgg ggggacggca    9240

tttgttgagc agtcctttct gggtaaaaaa tgtgccgggt atatttcacc gcaacaaggg    9300

tatacaccac ttgaaaacat aaaatgcgac atcacaagtt ctgagttaaa caaaataaat    9360

aacgttgata taattgagaa aataaaatat gttcatcctt ttgataatgt aaaaaataga    9420

cttttaagcg ccatcaacaa acaagtgatg actactataa actgggatta ttattacaaa    9480

tggactggtg acattaactt ttttaaactc gaaaaaataa gagaaattcc attatattta    9540

ttgctggaat gtgtgaaaga aaattctagc ttaaaatgta taatatcaca atataaattt    9600

ataactatta tttctttaat taaaaatttt atcaggctct atgtcagtaa actaaagggg    9660

aaataatgga atatactatt attattattt tttttgttct gttgtatttt acatctaaag    9720

ttacgtggcc ctttagtgga aaaaatgcac atccaattaa ctttgtttta ttcacgcaaa    9780

tatttatatt aacgctgcca ggtgttctta ttttaacatt ttttaaagag tgcgcgggat    9840

ctataacatg tgagataata gctgaaaaca tcaaaataaa cgtgatgttg gattatttta    9900

ctgtgctctg ttttatcctt ttgggggtgc tttcttcatt tttcttgtta aaaggtaaaa    9960

ctgattttcg gccagcatcg aatgcccata gacgatatct aaatacgtgc tttatattaa    10020

ctctacttat ttttttggta aaaattattt ctgttaatca agttcctcta tttcttacat    10080

tacttggtca taaagatgct gcagagattc aaaaagctga gatccttaga ggggaagatg    10140

ggttttcatt tccggtaata aattttctaa taaaatattt tcctttgtat ttttattaca    10200

gtacgttgat tggtttgttt aaacgcaaag ttactatagt ttactttgta atggcttttc    10260

ttgtcacgtc tgtgacaatg ctttacgatt tacaaaaagg tccggttgtt attatgatta    10320

ttggctcatt ttggctttat tgggcttata ccggaaaagc aaaaatgata gtagtaggtg    10380

ggatattcag tttattttta gtaggtgttc tattttatat ctccttcgat tttggtgatg    10440

atacccaata ttttattacc gctgtgttaa ataggacctt cattgctcag aatgatggaa    10500

tgtattgggt atatcaatat tataatatat taccaaataa agaactgtat tctttatggg    10560

gggtcccact tgcacaacag tttggtatcc cgcagattga cccattaagt gatattattg    10620

gtgttgtttt tcctcaagct aaggatagtt gggttaatac aacgacattt ttgttaggtg    10680

aggcaaaggc aattttcggt gactatagtt ccattatctc atctttagta gtatttatta    10740

atgtgtttgt tgtatgtgtg ctatcaacac ttttagtaag agtatcaaaa aatatttttt    10800

atcccgcaat attcgttatg attcaaacta taccatttgc aaacaatttg actgacttat    10860

tatatggtag atttattttt ggttttttag tctttatgtt atttccagtg cttatatgtt    10920

ttttgtgtta tggaaaatta aaaaatgatg aatagaaaag tgcttattat aatggttacc    10980

tataatcctg attggagtaa ggtaattaat aaagtgaagt ctttttgtgt tgcaggaaca    11040

gtttttgttt ctgataatag cgattctgat tcctcatcat tgataaacta tgaaaatgtt    11100

atatacagat ataatcatgg taatgtaggc atagcaaaag ctcagaattt aggtattgaa    11160

tatgcgatgc agtataatta tgagtttgta gcttttgttg atgatgatag taatctgagc    11220

gggggtaaaa ttacacagtt aacaaataat ttatgtaaat taggcagtct tggtgaaaat    11280

attgcagcat tttgcgctta ccctagtgaa agaggtggtt ttgacaagac aaaaaaaact    11340

tcgcttggta gacaattatt gttaactaag aatttaatga gttcaggatc tttaacaaag    11400

gttgatgtat ttaaaaagat aggtttattt gatgaagatt tatttattga ctatgtggat    11460

tatgaatggg gctggagagc actggaaaaa aattttttaa tcgtaattga tacatcagta    11520

gaatttgaac attcacttgg tcaggggcgc tcaaaaattg gattagggat cccctctcct    11580

atccgacatt tttatcaaac tagaaatctt ttatggatat caaggctaaa ttatgtacca    11640

atatattgga aacttaaaca gtttttactt cttccaattc gctatttcta ttttggtttt    11700

ttttataatc actctaaatt acggcgaacc cattttctca aagggtttgc cgcagggtta    11760

aaatttaaat catagtttta tgagataata tcatcaacgg gacgaataat tttagctgga    11820

ttgccagcaa caattacatt atccggaata tccttcgtaa ctacggagcc tgcgccaata    11880

attgaatttt caccgatgat aatacccggc aaaattgttg cgttcgcacc aatagaagca    11940

ttctttttaa tatgtatcgt tggataataa tctgggtatt ttttagatct tggataaata    12000

tcatttgtaa atgtaacatt tggacctata aaaacattat cttcaattat gactccatcc    12060

catatataga ctccagattt tatagtgaca ttatcgccaa taataacttt attttcgatt    12120

aaagtatgtg cgcaaatatt gcagttatta ccaattacag cgccttcaaa aataatgctg    12180

tattgccaaa tggttgtatt tagaccgatt tttacagttt ttacatcact taatggatga    12240

attttcataa attctaccct tcatttttaa aacaataata ttgtaaatga tatcatttag    12300

tattaatgat atcattagac gcctgaatag taaaaagttt tccctttggt tataaagtca    12360

aaagttaagt agcgtaaatc ggtattctga caggagtaaa acatgtcaaa gcaacagatc    12420

ggcgtcgtcg gtatggcagt gatggggcgc aaccttgcgc tcaacatcga aagccgtggt    12480

tataccgtct ctattttcaa ccgttcccgt gaaaagacgg aagaagtgat tgccgaaaat    12540

ccaggcaaga aactggttcc ttactatacg gtgaaagagt ttgttgaatc tctggaaacg    12600

cctcgtcgca tcctgttaat ggtgaaagca ggtgcaggca cggatgctgc tattgattcc    12660

ctcaagccgt acctcgataa aggtgacatc atcattgatg gtggtaacac cttcttccag    12720

gacaccattc gtcgtaaccg tgagctttct tcagaaggct ttaacttcat cggtaccggt    12780

gtttccggcg gagaagaggg ggcgctgaaa gggccgtcca tcatgcctgg tggccagaaa    12840

gaagcctatg aactggttgc gccgatcctg accaaaatcg ccgcagtagc tgaagacggt    12900

gagccatgcg ttacctatat tggtgccgat ggcgcaggtc actatgtgaa gatggttcac    12960

aacggtattg aatacggaga tatgcaactg attgctgaag cctactctct gcttaaaggt    13020

ggcctgaacc tcaccaacga agaactggcg cagacgttta ccgagtggaa taacggtgaa    13080

ctgagcagct acctgatcga catcaccaaa gacatcttca ctaaaaaaga tgaagacggt    13140

aactacctgg ttgatgtgat cctggatgaa gcggctaaca aaggtaccgg taaatggacc    13200

agccagagcg cgcttgatct cggcgaaccg ctgtcgctga ttaccgagtc tgtgtttgca    13260

cgatacatct cttctctgaa agagcagcgt gttgccgcat ctaaagttct ttctggtccg    13320

caagcgcagc ctgctggcga caaaggtgaa ttcatcgaaa aagttcgccg tgcgctgtat    13380

ctgggtaaaa tcgtttctta cgctcagggc ttctctcagc tacgcgctgc gtctgaagag    13440

tacaactggg atctgaacta cggtgaaatc gcgaagattt tccgtgctgg ctgcatcatc    13500

cgtgcgcagt tcctgcagaa aatcaccgat gcttatgccg aaaatccgca gatcgctaac    13560

ctgttgctgg ctccttactt caagcaaatt gccgatgact accagcaggc gctgcgcgat    13620

gtcgtcgctt acgcagtaca gaacggtatc ccggtgccga ccttcgccgc tgctgttgcc    13680

tattacgaca gctaccgcgc cgctgttctg cctgcgaacc taattcaggc acagcgcgac    13740

taa                                                                  13743

表1大肠杆菌O71型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								WzxWzy	O-抗原转运酶O-抗原聚合酶	6987-82619666-10955	7515-75337139-715710332-103509981-9999	7839-78598051-806910581-1060910670-10688	345bp931bp278bp708bp	0*0*0*0*	56555654

^*只在大肠杆菌O71型中得到正确的一条带

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
			1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌志贺氏菌10、野生型志贺氏菌11、野生型志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、第4组菌株加上大肠杆菌标准菌株O71	O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24，O59O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62O63，O65，O66，O69，O70，O72，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O106O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，O138，O139，O140，O141，O142，O143，O144，O145O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，FX变，FY变，DS，DR，O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124	IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcdddIMVSaIMVS

^*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3大肠杆菌O71型O抗原基因结构图

orf#    galF    rmlB  rmlD  rmlA  orf4rmlC    orf6   orf7    wzx    orf9     wzy orf11   orf12   gnd

G+C％content    44     46    42   31 34       36     35     30      31       31  32       32

                          E.coli O71 O-antigen gene cluster

表4大肠杆菌O71型O抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC        60

GAAAACCACT TCGACACCTC ATATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT       120

CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT       180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC       240

AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTA       300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAAGTGCTG       360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACCAA AGAACCGCTG       420

GACCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATCG AAAAACCGGA TCAGCCACAC       480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTGGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG       540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATTGCC       600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTACGACTGC       660

GGTAAAAAAA TGGGGTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTCAAAGAA       720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG       780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT       840

TGCGAATATT CCTGCCGTTA TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG       900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT       960

AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGCAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC      1020

ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTCTTAA      1080

                                                        orf1的起始

TCAAACTAAG AGCCGCTAAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAAAAA GTGA     1140

AGATACTTGT TACTGGTGGC GCAGGATTTA TTGGTTCTGC TGTAGTTCGT CACATTATAA      1200

ATAATACGCA GGATAGTGTT GTTAATGTCG ATAAATTAAC GTACGCCGGA AACCTGGAAT      1260

CACTTGCTGA TGTTTCTGAT TCTGAACGCT ATGTTTTTGA ACATGCGGAT ATTTGCGATG      1320

CTGCTGCAAT GGCGCGGATT TTTGCTCAGC ATCAGCCGGA TGCAGTGATG CACCTGGCTG      1380

CTGAAAGCCA TGTTGACCGT TCAATTACAG GTCCTGCGGC ATTTATTGAA ACCAATATTG      1440

TTGGTACTTA TGTCCTTTTG GAAGCCGCTC GCAATTACTG GTCTGCTCTT GATAGCGACA      1500

AGAAAAATAG CTTCCGTTTT CATCATATTT CTACTGACGA AGTCTATGGC GATCTGCCTC      1560

ATCCTGACGA AGTAAATAAT AAAGAAGAAT TACCCCTCTT TACTGAGACG ACAGCTTACG      1620

CGCCAAGCAG CCCATATTCT GCTTCTAAAG CATCCAGCGA TCATTTAGTC CGCGCGTGGA      1680

AACGTACCTA TGGTTTACCG ACCATTGTGA CTAACTGTTC GAATAACTAC GGCCCTTATC    1740

ACTTTCCGGA AAAATTGATT CCGTTGGTAA TTCTTAATGC TCTGGAAGGT AAGGCATTAC    1800

CTATTTATGG CAAAGGGGAT CAAATTCGTG ACTGGCTGTA TGTTGAAGAT CATGCGCGTG    1860

CGTTATATAC CGTCGTAACC GAAGGTAAAG CGGGTGGAAC TTATAACATT GGTGGACACA    1920

ACGAAAAGAA AAACATCGAT GTAGTGCTCA CTATTTGTGA TTTGTTGGAT GAGATTGTAC    1980

CGAAAGAGAA ATCTTACCGC GAGCAAATCA CTTATGTTGC CGATCGTCCG GGACACGATC    2040

GCCGTTATGC CATTGATGCT GAGAAGACTG GTCGCGAATT GGGATGGAAA CCACAGGAAA    2100

CGTTTGAGAG CGGGATTCGG AAGACAGTGG AATGGTACCT GTCCAATACA AAATGGGTTG    2160

                                                           orf1的终止

TTAATGTGAA AAGTGGTGCC TATCAATCGT GGATTGAACA GAACTATGAG GGCCGCCAG T   2220orf2的起始

AATGAATATT CTCCTTTTCG GCAAAACAGG GCAGGTAGGT TGGGAACTAC AGCGTGCTCT    2280

GGCACCTTTG GGTAATTTGA TTGCTCTTGA TGTTCACTCC ACTGATTATT GTGGTGATTT    2340

TAGTAATCCT GAAGGTGTGG CTGAAACCGT CAAAAAAATT CGCCCTGATG TTATTGTTAA    2400

TGCTGCGGCT CATACTGCAG TAGATAAGCT GAGTCAGAAC CCGAATTTGC ACAATTACTC    2460

AATGCGACCA GCGTTGAATC AATTGCAAAA GCGGCCAATG AAAGTTGGGG CTTGGGTAAT    2520

TCATTACTCA ACTGACTACG TATTTCCGGG AACCGGTGAA ATACCATGGC TGGAGACGGA    2580

TGCAACCGCA CCGCTAAATG TTTACGGTGA AACCAAGTTA GCCGGAGAAA AAGCGTTACA    2640

GGAAAATTGC GCGAAGCATC TTATTTTCCG TACCAGCTGG GTATACGCAG GTAAAGGAAA    2700

TAACTTCGCC AAAACGATGT TGCGTCTGGC AAAAGAGCGC GAAGAACTGG CTGTGATTAA    2760

TGATCAATTT GGTGCGCCAA CAGGTGCTGA GCTGCTGGCA GATTGTACGG CACATGCTAT    2820

TCGTGTGGCA CTGAATAAAC CAGAAGTCGC AGGCTTGTAT CATCTGGTAG CCAGTGGTAC    2880

CACAACTTGG CACGATTATG CTGCGCTGGT TTTTGAAGAG GCGCGCAAAG CAGGCATTCC    2940

CCTTGCACTC AACAAGCTCA ACGCAATATC AACAACAGCC TATCCTACAC CAGCTCGTCG    3000

CCCACATAAC TCTCGCCTTA ATACAGAAAA ATTTCAGCAG AACTTTGCGC TTGTCTTGCC    3060

                                                        orf2的终止

TGACTGGCAG GTTGGCGTGA AACGAATGCT CAACGAATTA TTTACGACTA CAGCAATT TA   3120

                                                          orf3的起始

ATTGTTTTTG CATCTTGTTC GTGATGATGG TGCAAGATGA ATTAAAAGGA ATGATGAA AT  3180

GAAAACGCGT AAAGGTATTA TTTTAGCGGG TGGTTCTGGT ACTCGTCTTT ATCCTGTGAC   3240

TATGGCCGTG AGTAAACAAC TTCTGCCTAT TTATGATAAG CCTATGATTT ATTACCCGCT    3300

CTCAACCCTG ATGCTGGCGG GTATTCGTGA TATTTTGATT ATTAGTACGC CACAAGACAC    3360

ACCACGTTTT GAGCAATTAC TGGGCGACGG TAGCCAGTGG GGGCTTAATC TTCAGTACAA    3420

AGTGCAACCT AGTCCAGATG GTCTGGCACA AGCTTTCATT ATTGGAGAAG ATTTTATTGG    3480

TGGTGATGAT TGTGCGTTGG TCTTGGGTGA TAATATCTTT TACGGTCATG ACCTACCAAA    3540

ATTAATGGAT ACAGCTGTTA ATAGAGAGAG TGGCGCAACG GTATTTGCCT ATCACGTTAA    3600

TGATCCAGAA CGTTATGGTG TGGTGGAGTT TGATAAAAAC GGCACGGCAA TAAGCTTGGA    3660

AGAAAAACCG CTTCAACCGA AAAGCAATTA TGCAGTTACA GGACTTTATT TCTATGATAA    3720

TGATGTCGTG GAAATGGCAA AAAAACTGAA ACCATCTGCC CGTGGCGAAG TCGAAATCAC    3780

AGATATTAAC CGTATTTATA TGGAACAGGG GCGTTTGTCT GTAGCCATGA TGGGGCGTGG    3840

TTATGCTTGG TTGGACACGG GTACACATCA AAGTCTTATT GAGGCAAGTA ACTTCATTGC    3900

AACAATAGAA GAACGCCAGG GGCTGAAAGT TTCCTGTCCA GAAGAGATTG CTTACCGTAA    3960

AGGGTTTATT GGAAAAGAGC AACTAGAGCT ATTAGCTAAG TCGCTTATGA AAAATCAATA    4020

                           orf3的终止                     orf4的起始

TGGAAAATAT CTTCTTAAAA TGATCGGG TA AATAATAATA CTTTTTCAGG AAATGAA ATG  4080

AATTTCAGTG TATTGATGTC TCTTTATATT AAAGAGAAGC CCGAATATCT ACATGAATGC    4140

TTAAAAAGTC TATATGAACA AACAAAGCAA GCTGATGAGA TAGTGCTTGT CTATGATGGA    4200

CCAATTACAA ACGAATTAGA TAAAGTAGTT AATTATTGGT TAAATAGTTT GCCAATAAAG    4260

ATAATAAAAT TAAGCAAAAA TGTCGGTTTG GGTCAGGCCC TGAATAAGGG GTTAGCTCAA    4320

TGTGAAAATG ATTATGTCGC TAGAATGGAT ACGGATGATA TATGCCATCC CAAGAGATTT    4380

GAAATTCAAA TTGATTTTTT AAATAAAAAC AAGAATATAA GTGTTGTTGG TTCATATATA    4440

GAGGAGTTTT CAGAAACTAT AGAAAACAGG TTGTCGCAAA AAATTGTACC GACAACGCAC    4500

AATGAGATAA TGAAAAATAT AGGAAAACGA AATCCATTTA ACCACATGAC AGTTGTGTTC    4560

AATAAGAGTG AAATAATAAA GGTGGGTGGA TATGAACATC ATTATTTAAT GGAAGATTAT    4620

AATTTATGGT TGCGGCTTTT AAAAAATAAT ATTCAGGCAG CCAATTTGCC TTTAACATTA    4680

GTTTATGCCA GAGGTGGGGA TGGCATGATT TATAGGAGGT CCGGTTTACG TTATATTAAA    4740

AGTGAATATA AATTGTATAA GTTAAAACAA AGATTAGGAT ATCAAAATTA TATTATATCC    4800

TCATTGGTGT TTTTTTTAAG GAGTGTACCA AGGGTTTTTC CTCCTTACAT TTTAAAAGCA    4860

                        orf4的终止

ATTTATAGAT TCTTGCGAAA GAAA TAACAG TATAAAAATG CATTATATTA TTTAGAGGGG   4920

  orf5的起始

GCTT ATGAAA TATTCAAGAA CAACAATACA AGATGCTATA GTGATTACAC CTGAAGTATT   4980

TGCTGATTCT AGGGGGTATT TTTTTGAAAG CTTTAATTAT CGGGATTTTC AAAGGATTAT    5040

TAATCGAGAG ATAGTTTTTT GTCAAGATAA CCAATCATTA TCGCATAAGG GAGTTGTCAG    5100

GGGACTACAT TTTCAAGTAA ATCCAAAGGA ACAGGCAAAA TTGGTAAGAT GTATAAATGG    5160

TTCGGTGTAT GATGTGATTG TAGACTTGCG CAAAAACTCC CCTTCTTATA AGTGTTGGTT    5220

CGGAATTTTA TTATCGTCTG ATAATAAAAA ACAGTTATGG ATTCCAGAGG GATGTGCTCA    5280

TGGTTTTATC TCATTAGAGG ACAATACGGA ATTATTATAT AAGACTACTG AATTTTATTC    5340

TCCTGACCAT GAACGCTGCA TCATTTGGAA TGATCCTGAC TTAGGAATAA GTTGGCCAGA    5400

ATATAGCTAT ATAATTTCCG ATAAAGATAA GAATGGAATT TCCTTCGCTG AATGGGAGAG    5460

orf6的起始  orf5的终止

CTTAG GTGAT  TAAGGTGAAA TTAATTCCAC TTCAAACGCA TGGTGACGAT AGAGGTTCGC  5520

TTGTTGCTTT AGAAGAGGGG TATAATATAC CATTTCAAAT TAAACGCGTT TATTATATTT    5580

TTAACACAAA GAAAGGAGTC ATGAGAGGTT TTCATGCACA TAAAAACTTA AAACAGGTTG    5640

CAATAGCTGT TAGAGGAAGT TGTAAGTTTA AATTAGACAA TGGTACCGAT AGTGTTGAGG    5700

TTCTACTGAA TGATCCTGCG CAAGGTCTAT TGATAGAATC ATTTATTTGG AGAGAAATGT    5760

ATGACTTTTC CGAGGACTGC GTATTAATGG TTTTAGCCGA CTCTCATTAC GATGAGAACG    5820

                                         orf6的终止

ATTACGTTAG AGACTACAAT GCTTTCTTAA ATCTGGTGGC T TAATAATAA TAAGGATACA   5880

 orf7的起始

ATA ATGTTA ATTTCTTAAG TTTAAAAAAT ATAAACTCAC GCTATAATGA GGAATTAAAA    5940

AAAGCATGTG CAAGAGTTAT TGACTCTGGC TGGTATGTAA TGGGGGAGGA ATTACACCAG    6000

TTCGAAAACG AGTTCGCTAA ATATTGTGGT GTAAAAGGTT CTCTGGGGGT GGCGAATGGG    6060

CTAGATGCTT TGATTCTTTC ATTAAGAGCT TGGCGTGAAA TGGGGAAAAT TAAGCCGGGT    6120

GATGAGGTAC TTGTTCCAGC TAATACATAT ATAGCTTCAA TTATTGCAAT TACAGAAAAT    6180

AATCTGGTGC CTGTATTTGT TGAGCCGGAT TATAATACTT ATAATTTAGA TCCAGATAAA    6240

ATTGAATCTG CGATTACTGA AAAAACAAAA GTGATTTTAC CTGTTCATTT GTATGGACGA    6300

ATTTGTCCTA TGGAAGAAAT ATTATCATTG GCGAAAAAAT ATAATCTTCT TGTGTTAGAG    6360

GATTGTGCTC AGGCGCATGG TGCATCTCTT AATGGCAGAA AAACAGGGGG GTGGGGAGAT    6420

GCGGGGGCTT TTAGTTTTTA TCCAGGTAAA AATTTGGGGG CCCTTGGTGA TTCTGGGGCT    6480

ATTACTAGCA ATGATTTAGA TTTTCTGAAT GTAATTCAAG CTTTAAGAAA TTATGGGTCA    6540

CACCAAAAAT ATGTAAATCA ATATATTGGT GTGAATAGTC GATTAGATGA AATTCAAGCA    6600

GCTATGCTAA GGGTTAAATT AAAATACCTG GATAGTGATA ACAAAAGAAG GAAAGAAATT    6660

GCTCAATATT ACATTGATTC AATAATAAAT CCTTTAGTCC AATTGCCGAA ATCATGCAGT    6720

AATTATGATG AAAATGTTTG GCATTTATTT GTTGTTAAAA CTCGATATAG AGAGTATCTT    6780

CAAAAATTCC TGAGTAAACA GAGTATTCAA ACATTAATTC ACTATCCACA CCCTCCACAT    6840

AAACAAATAG CTTATAAGCA GTTTAATTCC ATTTCTTTGC CATTGACAGA AAAAATCCAT    6900

AATGAGGTTT TGTCTTTGCC AATGGATCCA ACTCTTTCTG AAGAGGAGAT ACAAAAGGTT    6960

                  orf8的起始  orf7的终止

GTCAATGCGG TAAATGGTTT TACTCT ATGA GTTCATTTTT TAAGATATCA TTCTTTAGTG   7020

GTTGTTTGAC ATTATTCAAG ATGTTAATGG GCTTTTTAAT TGCTAAAGTA ATCGCTATTT    7080

ATACAGGGCC ATCTGGTATG GCCTTACTTG GTCAGCTTCA AAGTTTAGTC ACAGGTATTA    7140

ATGGGATCGT AAATGCACCT GTAGGAAATG GTATCGTTAA ATATACTGCA GAGTTTAAAC    7200

TAGAAGGTGC AGAATGTTGC TCTAGATGGT GGAAACCAGC AATCGGCTTT TCATTCCTTT    7260

TTTGTTTGGT TTTATCGATA GTTTTTATAC CATTTGCAAA TAAAATATCA TTTATTTTAT    7320

TTGGCTCTTA TGAATATGAT TATGTGGTTA TTATAGCAGT ATGTAACTTA CCTTTTGCAG    7380

CTTTCGGTAC TATGATAATG TCTATTGTCA ATGGAATGGG GAAGTATAGA CTTTATATAT    7440

TATATGGGTT TATTTCTAAT CTTATAACGT CGATAATAAT GTTACTTATG CTAATAAAAT    7500

ATGGTATTGT TGGTGCATTA TTAGCCACTT CAATACAATA TGGTCTTATT GGTATAATTT    7560

TGATATGTTT GAATTATAAT CAGGAATGGT TCAAACATAA TTATTTTTAT CCCTACGATA    7620

GTATTTTTAA TTCAGAAGCA AAGGATATTT TAGCTTATAT ATTGATGGCT ATAACAAGTG    7680

CAATTAGCTT ACCCTTGACT TTAATCGTAA TTAGAAAAAT TCTCCTAAAT ATGACGGATA    7740

TAACTACCGT TGGACAATGG CAGGCGGTAT GGAAAATATC TGAAGTATAT ATAGGAGTCG    7800

TGACTATTGC ACTTAGTACT TATTTTTTGC CTAAGTTGTC TGCTCTAAAT GATACGGCTA    7860

AAATAAAAAA TGAAATTGGT ATTGTCCTTA AATATACTAT TCCATTTGTT TGTGTTGCCG    7920

CGGTTCTCAT TTTCGCTTTT CGCGATCTGA TAATAACGCT CTTATTCACG AATGAGTTTT    7980

ATCCTGCACG TGATCTTTTT TTTATTCAAC TTGTAGGTGA TATAATTAAA ATAATAAGTT    8040

GGATTTATGC ATTCACTATG TTGGCTTCAA AAGCAACTAG GTGGTATGTT GGATCTGAAT    8100

TATTTTTTTG TATTTCATGG TGTTTAATTA GTTTTGTTCT TGTTAATATA TATAAGGCGC    8160

AAGGAATTAA TATAGCATAT TGCATTAGCT ATGTTATGTA TTTTTTAATA ATTTATCTCA    8220

                        orf9的起始    orf8的终止

ACCTAAATAA GATTATAAAG AAAAAGA ATG AACCTCAT TG AAATTATTAA ACTCCAAATT  8280

ATCAAAACTT CTGATATTAA TAAGAAAATA AGACTGCTCA AGGAGTTGGG GGGAATGCTA    8340

TGGGCCAATA ACGTTGGCAT ATACAACTTA AATTCACTTG AAAGGGCAGT TATCGAAGAT    8400

GTAGCAAGAG ATTATACGCC ACAAATTGGT AGTCAATATA AAAAGAAAAA AAATAATGTA    8460

TTTGTGATTA CTATAGGCTA CATGTCTGGT GGGCATACAA GGTTAATGGA AAATCTTGCA    8520

AATATGCTAG ATAATAAATG TGACCTTATA ATTACTGGAA ACGCATCTGT TACGCTAAAA    8580

AAAAGGCTTG AAAAATATTT CAATGAAATT TTTGAAATTC CTGTTTACAA TGACACTAAC    8640

ATTAATGAAC TTTATAAGTT AAGCGCTAAT CTTGAGAGAT ACGAAAATAT AATACTTAAT    8700

ATACACCCTG ATGATATTGC GAGCGTTATT GCAGCTGGTC TTGCAAAAAA AAATATAAAC    8760

ACATACGTTC ACTTTGTTAA TCATGCAGAT CATGTTTTTA GCTTCGGTCC GACCGTAGCA    8820

GATGTCTGGT ATCAAATTAG CCAATTCGGG GCTAAACTTG ATCAATTAAG AGAGCTAAGT    8880

GGTAAAACTA CATTCTTGGG GATACCGATT GCGATAAATG ATGATCATTT ATCTAATAAT    8940

ATGATTTCCA CTAATGATGA AGTGAAATGT ATTATCACTG CTGGCTCTGC AAATAAATAC    9000

AAGCCGCATA AAGGCTATTC TCTCATAAAA AAAATTCCTG AAATATTATA TCAATTTCCA    9060

GAAGCATCAA TAATAGTAGT AGGTACTAAC ATCCTATTTT GCTATTGGTG GTGGGGAACT    9120

TTTTTAAAAT TCAGAAAGCG TATTAAATTC TATAAAGCAC TTAATCATTC TGAATATCTT    9180

TTACTTATGC AAAATGCTGA TATTTATTTG GATAGTTATC CTATTCCCGG GGGGACGGCA    9240

TTTGTTGAGC AGTCCTTTCT GGGTAAAAAA TGTGCCGGGT ATATTTCACC GCAACAAGGG    9300

TATACACCAC TTGAAAACAT AAAATGCGAC ATCACAAGTT CTGAGTTAAA CAAAATAAAT    9360

AACGTTGATA TAATTGAGAA AATAAAATAT GTTCATCCTT TTGATAATGT AAAAAATAGA    9420

CTTTTAAGCG CCATCAACAA ACAAGTGATG ACTACTATAA ACTGGGATTA TTATTACAAA    9480

TGGACTGGTG ACATTAACTT TTTTAAACTC GAAAAAATAA GAGAAATTCC ATTATATTTA    9540

TTGCTGGAAT GTGTGAAAGA AAATTCTAGC TTAAAATGTA TAATATCACA ATATAAATTT    9600

ATAACTATTA TTTCTTTAAT TAAAAATTTT ATCAGGCTCT ATGTCAGTAA ACTAAAGGGG    9660orf9的终止 orf10的起始

AAA TAATGGA ATATACTATT ATTATTATTT TTTTTGTTCT GTTGTATTTT ACATCTAAAG   9720

TTACGTGGCC CTTTAGTGGA AAAAATGCAC ATCCAATTAA CTTTGTTTTA TTCACGCAAA    9780

TATTTATATT AACGCTGCCA GGTGTTCTTA TTTTAACATT TTTTAAAGAG TGCGCGGGAT    9840

CTATAACATG TGAGATAATA GCTGAAAACA TCAAAATAAA CGTGATGTTG GATTATTTTA    9900

CTGTGCTCTG TTTTATCCTT TTGGGGGTGC TTTCTTCATT TTTCTTGTTA AAAGGTAAAA    9960

CTGATTTTCG GCCAGCATCG AATGCCCATA GACGATATCT AAATACGTGC TTTATATTAA    10020

CTCTACTTAT TTTTTTGGTA AAAATTATTT CTGTTAATCA AGTTCCTCTA TTTCTTACAT    10080

TACTTGGTCA TAAAGATGCT GCAGAGATTC AAAAAGCTGA GATCCTTAGA GGGGAAGATG    10140

GGTTTTCATT TCCGGTAATA AATTTTCTAA TAAAATATTT TCCTTTGTAT TTTTATTACA    10200

GTACGTTGAT TGGTTTGTTT AAACGCAAAG TTACTATAGT TTACTTTGTA ATGGCTTTTC    10260

TTGTCACGTC TGTGACAATG CTTTACGATT TACAAAAAGG TCCGGTTGTT ATTATGATTA    10320

TTGGCTCATT TTGGCTTTAT TGGGCTTATA CCGGAAAAGC AAAAATGATA GTAGTAGGTG    10380

GGATATTCAG TTTATTTTTA GTAGGTGTTC TATTTTATAT CTCCTTCGAT TTTGGTGATG    10440

ATACCCAATA TTTTATTACC GCTGTGTTAA ATAGGACCTT CATTGCTCAG AATGATGGAA    10500

TGTATTGGGT ATATCAATAT TATAATATAT TACCAAATAA AGAACTGTAT TCTTTATGGG    10560

GGGTCCCACT TGCACAACAG TTTGGTATCC CGCAGATTGA CCCATTAAGT GATATTATTG    10620

GTGTTGTTTT TCCTCAAGCT AAGGATAGTT GGGTTAATAC AACGACATTT TTGTTAGGTG    10680

AGGCAAAGGC AATTTTCGGT GACTATAGTT CCATTATCTC ATCTTTAGTA GTATTTATTA    10740

ATGTGTTTGT TGTATGTGTG CTATCAACAC TTTTAGTAAG AGTATCAAAA AATATTTTTT    10800

ATCCCGCAAT ATTCGTTATG ATTCAAACTA TACCATTTGC AAACAATTTG ACTGACTTAT    10860

TATATGGTAG ATTTATTTTT GGTTTTTTAG TCTTTATGTT ATTTCCAGTG CTTATATGTT    10920

                    orf11的起始   orf10的终止

TTTTGTGTTA TGGAAAATTA AAAAATG ATG AA TAGAAAAG TGCTTATTAT AATGGTTACC  10980

TATAATCCTG ATTGGAGTAA GGTAATTAAT AAAGTGAAGT CTTTTTGTGT TGCAGGAACA    11040

GTTTTTGTTT CTGATAATAG CGATTCTGAT TCCTCATCAT TGATAAACTA TGAAAATGTT    11100

ATATACAGAT ATAATCATGG TAATGTAGGC ATAGCAAAAG CTCAGAATTT AGGTATTGAA    11160

TATGCGATGC AGTATAATTA TGAGTTTGTA GCTTTTGTTG ATGATGATAG TAATCTGAGC    11220

GGGGGTAAAA TTACACAGTT AACAAATAAT TTATGTAAAT TAGGCAGTCT TGGTGAAAAT    11280

ATTGCAGCAT TTTGCGCTTA CCCTAGTGAA AGAGGTGGTT TTGACAAGAC AAAAAAAACT    11340

TCGCTTGGTA GACAATTATT GTTAACTAAG AATTTAATGA GTTCAGGATC TTTAACAAAG    11400

GTTGATGTAT TTAAAAAGAT AGGTTTATTT GATGAAGATT TATTTATTGA CTATGTGGAT    11460

TATGAATGGG GCTGGAGAGC ACTGGAAAAA AATTTTTTAA TCGTAATTGA TACATCAGTA    11520

GAATTTGAAC ATTCACTTGG TCAGGGGCGC TCAAAAATTG GATTAGGGAT CCCCTCTCCT    11580

ATCCGACATT TTTATCAAAC TAGAAATCTT TTATGGATAT CAAGGCTAAA TTATGTACCA    11640

ATATATTGGA AACTTAAACA GTTTTTACTT CTTCCAATTC GCTATTTCTA TTTTGGTTTT    11700

TTTTATAATC ACTCTAAATT ACGGCGAACC CATTTTCTCA AAGGGTTTGC CGCAGGGTTA    11760

        orf11的终止 orf12的终止

AAATTTAAAT CA TAGTT TTA TGAGATAATA TCATCAACGG GACGAATAAT TTTAGCTGGA  11820

TTGCCAGCAA CAATTACATT ATCCGGAATA TCCTTCGTAA CTACGGAGCC TGCGCCAATA    11880

ATTGAATTTT CACCGATGAT AATACCCGGC AAAATTGTTG CGTTCGCACC AATAGAAGCA    11940

TTCTTTTTAA TATGTATCGT TGGATAATAA TCTGGGTATT TTTTAGATCT TGGATAAATA    12000

TCATTTGTAA ATGTAACATT TGGACCTATA AAAACATTAT CTTCAATTAT GACTCCATCC    12060

CATATATAGA CTCCAGATTT TATAGTGACA TTATCGCCAA TAATAACTTT ATTTTCGATT    12120

AAAGTATGTG CGCAAATATT GCAGTTATTA CCAATTACAG CGCCTTCAAA AATAATGCTG    12180

TATTGCCAAA TGGTTGTATT TAGACCGATT TTTACAGTTT TTACATCACT TAATGGATGA    12240

   orf12的起始

ATTTT CATAA ATTCTACCCT TCATTTTTAA AACAATAATA TTGTAAATGA TATCATTTAG   12300

TATTAATGAT ATCATTAGAC GCCTGAATAG TAAAAAGTTT TCCCTTTGGT TATAAAGTCA    12360

AAAGTTAAGT AGCGTAAATC GGTATTCTGA CAGGAGTAAA ACATGTCAAA GCAACAGATC    12420

GGCGTCGTCG GTATGGCAGT GATGGGGCGC AACCTTGCGC TCAACATCGA AAGCCGTGGT    12480

TATACCGTCT CTATTTTCAA CCGTTCCCGT GAAAAGACGG AAGAAGTGAT TGCCGAAAAT    12540

CCAGGCAAGA AACTGGTTCC TTACTATACG GTGAAAGAGT TTGTTGAATC TCTGGAAACG    12600

CCTCGTCGCA TCCTGTTAAT GGTGAAAGCA GGTGCAGGCA CGGATGCTGC TATTGATTCC    12660

CTCAAGCCGT ACCTCGATAA AGGTGACATC ATCATTGATG GTGGTAACAC CTTCTTCCAG    12720

GACACCATTC GTCGTAACCG TGAGCTTTCT TCAGAAGGCT TTAACTTCAT CGGTACCGGT    12780

GTTTCCGGCG GAGAAGAGGG GGCGCTGAAA GGGCCGTCCA TCATGCCTGG TGGCCAGAAA    12840

GAAGCCTATG AACTGGTTGC GCCGATCCTG ACCAAAATCG CCGCAGTAGC TGAAGACGGT    12900

GAGCCATGCG TTACCTATAT TGGTGCCGAT GGCGCAGGTC ACTATGTGAA GATGGTTCAC    12960

AACGGTATTG AATACGGAGA TATGCAACTG ATTGCTGAAG CCTACTCTCT GCTTAAAGGT    13020

GGCCTGAACC TCACCAACGA AGAACTGGCG CAGACGTTTA CCGAGTGGAA TAACGGTGAA    13080

CTGAGCAGCT ACCTGATCGA CATCACCAAA GACATCTTCA CTAAAAAAGA TGAAGACGGT    13140

AACTACCTGG TTGATGTGAT CCTGGATGAA GCGGCTAACA AAGGTACCGG TAAATGGACC    13200

AGCCAGAGCG CGCTTGATCT CGGCGAACCG CTGTCGCTGA TTACCGAGTC TGTGTTTGCA    13260

CGATACATCT CTTCTCTGAA AGAGCAGCGT GTTGCCGCAT CTAAAGTTCT TTCTGGTCCG    13320

CAAGCGCAGC CTGCTGGCGA CAAAGGTGAA TTCATCGAAA AAGTTCGCCG TGCGCTGTAT    13380

CTGGGTAAAA TCGTTTCTTA CGCTCAGGGC TTCTCTCAGC TACGCGCTGC GTCTGAAGAG    13440

TACAACTGGG ATCTGAACTA CGGTGAAATC GCGAAGATTT TCCGTGCTGG CTGCATCATC    13500

CGTGCGCAGT TCCTGCAGAA AATCACCGAT GCTTATGCCG AAAATCCGCA GATCGCTAAC    13560

CTGTTGCTGG CTCCTTACTT CAAGCAAATT GCCGATGACT ACCAGCAGGC GCTGCGCGAT    13620

GTCGTCGCTT ACGCAGTACA GAACGGTATC CCGGTGCCGA CCTTCGCCGC TGCTGTTGCC    13680

TATTACGACA GCTACCGCGC CGCTGTTCTG CCTGCGAACC TAATTCAGGC ACAGCGCGAC    13740

TAA                                                                  13743

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1、一种对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的引物对，其特征在于所述引物对选自：SEQ ID NO：1中的7515至7533碱基的正向引物和7839至7859碱基的反向引物、SEQ ID NO：1中的7139至7157碱基的正向引物和8051至8069碱基的反向引物、SEQ ID NO：1中的10332至10350碱基的正向引物和10581至10609碱基的反向引物或者SEQ ID NO：1中的9981至9999碱基的正向引物和10670至10688碱基的反向引物。

2、权利要求1所述的引物对在检测环境中大肠杆菌O71型中的应用。