CN1324133C - 对大肠杆菌o71型的o-抗原特异的核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种对大肠杆菌O71型(Escherichia coli O71)的O-抗原特异的核苷酸,它是大肠杆菌O71型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列,如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸,全长13743个碱基;或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸;还包括源于大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸;本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O71型的O-抗原都有高度的特异性;本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O71型的方法。
Description
技术领域
本发明涉及大肠杆菌O71型(Escherichia coli O71)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列,特别是涉及大肠杆菌O71型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸,可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O71型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分,它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚:先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上,然后在内膜的内侧合成寡糖单位,O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧,而后通过聚合酶聚合成多糖,再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield,C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3:178-185;Schnaitman,C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews,57(3):655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列,形成一个基因簇[Reeves,P.R.,et al.(1935)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology,4:495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中,O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci:implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity,11:6923-6930;Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O71 gene clusters:gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182:5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因:糖合成路径基因,糖基转移酶基因,寡糖单位处理基因,其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖;糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位;寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因,它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧,再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同,单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性,而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着,所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成,也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原,是大肠杆菌重要的致病因素之一,同时它又具有极强的多样性,这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定,是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清,而抗血清一般种类不全,数量不足,大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差,所以,现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年,Luk,J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk,J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A,B,C2,and D)”,J.Clin.Microbiol.31:2118-2123]。Luk,et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1,D1,A,B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1935年,Paton,A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34:1622-1627],但是后来的研究表明Paton,A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves,P.R.认为,这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves,P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164:17-23],而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖,所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的
志贺氏菌有46种血清型,但只有33种不同的O-抗原,大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves,P.R(1992)“Variation in O antigens,niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett,100:509-516],二者亲缘关系非常近,并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing,W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers,Amsterdam,The Netherlands;T.cheasty,et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac,O112ac,O124,O136,O143,O144,O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol,17(4):681-684]
发明内容
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的核苷酸,是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的基因:转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因;聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因;鼠李糖合成酶基因,包括rmlBDAC基因或与rmlBDAC有相似功能的基因;一种稀有单糖合成酶基因,包括orf6和orf7或与orf6和orf7有相似功能的基因;乙酰基转移酶基因orf12或与乙酰基转移酶有相似功能的基因;糖基转移酶基因,包括orf4、orf11基因;一个未知功能的基因orf9。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸,它们分别源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因它们是上述基因内的寡核苷酸,长度在10-20nt;它们对大肠杆菌O71型的O-抗原是特异的;尤其是表1中列出的寡核苷酸,它们对大肠杆菌O71型的O-抗原是高度特异的,而且这些寡核苷酸还可重新组合,组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O71型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应,或者作为探针用于杂交反应,或者用于制造基因芯片或微阵列,从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O71型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O71型。
本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列,也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸,其是如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸,全长13743个碱基;或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸,其由12个基因组成,都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸,其中所述的基因是:wzx是SEQ ID NO:1中的6987至8261碱基的核苷酸;wzy是SEQ ID NO:1中的9666至10955碱基的核苷酸;rmlBDAC分别是SEQ ID NO:1中的1137至2222,2222至3121,3179至4051,4925至5473碱基的核苷酸;orf4是SEQ ID NO:1中的4078至4887碱基的核苷酸;orf6是SEQ ID NO:1中的5466至5864碱基的核苷酸;orf7是SEQ ID NO:1中的5884至6990碱基的核苷酸;orf9是SEQ ID NO:1中的8248至9666碱基的核苷酸;orf11是SEQ ID NO:1中的10948至11775碱基的核苷酸;orf712是SEQ ID NO:1中的11778至12248碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸,其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸,其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是:SEQ ID NO:1中的7515至7533碱基的核苷酸和7839至7859碱基的核苷酸;SEQ ID NO:1中的7139至7157碱基的核苷酸和8051至8069碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是:SEQ ID NO:1中的10332至10350碱基的核苷酸和10581至10609碱基的核苷酸;SEQ ID NO:1中的9981至9999碱基的核苷酸和10670至10688碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子,而且通过***表达可提供表达大肠杆菌O71型的O-抗原,并成为细菌疫苗。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的应用,其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列,检测人体和环境中的细菌。
前述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法,其特征在于,其包括下述步骤:
(1)基因组的提取:在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O71型,离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul 10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟,加等体积酚抽提混合物,取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次,取上清液再用等体积的***抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,将DNA重悬于30ul TE中;基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测;
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O71型中的O-抗原基因簇:以大肠杆菌O71型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇,首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C);用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟;然后94℃变性10秒,60℃退火15秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环,最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性,合并5管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物;
(3)构建O-抗原基因簇文库:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库,反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行,酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次,再用等体积的***抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中,随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃ 30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积***抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时,总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶,最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物;用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞,取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后,转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒至6.0毫秒,电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏,然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上,在37℃过夜培养,次日得到蓝白菌落,将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒,并用EcoRI酶切鉴定其中的***片段的大小,得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇文库;
(4)对文库中的克隆测序:从文库中挑选***片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的***片段进行测序,序列达到100%的覆盖率,从而获得O-抗原基因簇的所有序列;
(5)核苷酸序列的拼接及分析:用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列;序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O71型的基因组作5个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库,2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率,在得到大肠杆菌O71型O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information,NCBI)的orffinder发现基因,找到12个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构;
(6)特异基因筛选:针对痢大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物;在每个基因内各设计了两对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方,以确保其特异性;用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR,除在第13组中得到了预期大小的一条带外,在其他组中都没有扩增到任何产物,所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O71型的O-抗原都是高度特异的。
也就是,本发明的第一个方面,提供了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列,它的全序列如SEQ ID NO:1所示,全长13743个碱基;或者具有一个或多个***、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构,如表3所示,它总共由12个基因组成,都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面,提供了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的基因,即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因);聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因);鼠李糖合成酶基因(rmlBDAC基因或与rmlBDAC有相似功能的基因);一种单糖合成酶基因(orf6,7基因和orf6,7基因有相似功能的基因);一种未知功能基因;糖基转移酶基因(orf4、orf11基因);细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因,包括orf6,7,12基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中;本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因,因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的,对细菌的O-抗原并不是很特异的,而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O71型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面,提供了源于大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因寡核苷酸,鼠李糖合成没基因(rmlBDAC基因或与rmlBDAC有相似功能的基因);一种单糖合成酶基因(orf6,7基因和orf6,7基因有相似功能的基因);一种未知功能基因;糖基转移酶基因(orf4、orf11基因);细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因,包括orf6,7,12基因它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是,优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对,在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小,这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外,在其他组中都没有扩增到任何产物,所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O71型的O-抗原都是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤:1)基因组的提取;2)PCR扩增大肠杆菌O71型中的O-抗原基因簇;3)构建O-抗原基因簇文库;4)对文库中的克隆测序;5)核苷酸序列的拼接及分析;6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用,“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子,它们在长度上可改变,一般在10到20个核苷酸范围内改变;更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是SEQ ID NO:1中的6987至8261碱基的核苷酸);wzy基因(核苷酸位置是从wzy是SEQ ID NO:1中的9666至10955碱基的核苷酸)源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O71型是高度特异的。
此外,有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原,从而产生新的细菌类型,新的突变株。在这种环境中,需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此,本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物,它们源于糖基转移酶基因;源于转运酶和聚合酶基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的,从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说,这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面,本发明涉及寡核苷酸的鉴定,它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法,这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交,这些基因是:(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交,这些细菌是大肠杆菌O71型。可用PCR方法检测,更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明设计者考虑到以下情况:当单个的特异的寡核苷酸检测无效时,寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的,这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O71型表达的。
另一方面,本发明涉及到一种检测***物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法,这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交,这些基因是:(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O71型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品,也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交,但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上,另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此,当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时,至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交,或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时,此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸,在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因,这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的,这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面,本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交,这些基因是:(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交,这些细菌是大肠杆菌O71型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品,也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说,以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时,其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外,当两个寡核苷酸都能杂交上时,它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即,当交叉反应出现问题时,可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原,而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且,由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性,本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的全长序列,而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子,通过***表达可产生表达大肠杆菌O71型的O-抗原,并成为有用的疫苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件。
实施例1:基因组的提取:
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O71型,离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul 10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次,取上清液再用等体积的***抽提以除去残余的酚,上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2:通过PCR扩增大肠杆菌O71型中的O-抗原基因簇:
以大肠杆菌O71型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGATTA AGT TCG C);用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟;然后94℃变性10秒,60℃退火15秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环。最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3:构建O-抗原基因簇文库:
首先是连接产物的获得:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次,再用等体积的***抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃ 30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积***抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时,总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备:参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中,180rpm培养10小时后,取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中,37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右,然后冰浴冷却20分钟,于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液,用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体,于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体,于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10%的甘油悬浮细胞,4℃ 6000rpm离心10分钟,弃上清液,最后沉淀用1ml冰预冷的10%的甘油悬浮细胞,即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管,-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞:取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养,次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的***片段的大小,得到白色克隆群构成了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇文库。
实施例4:对文库中的克隆测序:
从文库中挑选***片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的***片段单向进行测序,使序列达到100%的覆盖率,从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5:核苷酸序列的拼接及分析:
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O71型的基因组作5个LongPCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O71型O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)的orffinder发现基因,找到12个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构,如表3所示。
通过检索和比较,发现orf1,2,3编码的蛋白与Shigella boydi抗原基因簇中rmlBDA基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性,通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索,发现orf1,2,3编码的蛋白与已知的rmlBDA的共有序列的同源性预期值非常高。rmlBDA负责合成鼠李糖O-抗原中的一种稀有单糖。Orf5和orf4编码的蛋白与沙门氏菌的rmlC和糖基转移酶基因编码的蛋白有较高的相似性。orf6,7编码的蛋白与Aneurinibacillus thermoaerophilus中合成一种单糖的基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性,orf6,7也应该合成一种单糖,命名为orf6,7。orf12编码的蛋白与Listonella anguillarum中编码乙酰基转移酶的基因有63%的相同性,推测orf12是乙酰基转移酶基因,命名为orf12。
Orf8和orf10是大肠杆菌O71种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf1编码的蛋白与大肠杆菌的O-抗原转移酶有28%的序列一致性,通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段,这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf8为wzx。Orf10编码的蛋白与Streptococcus pneumoniae O-抗原聚合酶有20%的一致性,42%的相似性,通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段,并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop),这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf10为wzy。
orf4,11两个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有24-36%的序列一致性和44-53%的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索,这两个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e-12至5×e-17,因此我们推测这两个基因编码糖基转移酶,而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键,因此我们推测大肠杆菌O71的O-抗原的寡糖单位可能由三个单糖组成。由于这三个基因的确切功能还不能确定,因此我们将这四个基因暂命名为orf4,orf11。一个未知功能的基因orf9。
实施例6:特异基因的筛选:
针对大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物,这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了大肠杆菌O71型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O71型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内,我们各设计了两对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO:1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR,得到了相应的PCR产物,其大小也列于表中。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源,为了检测的方便,我们将它们每8-10个菌分为一组,总共13组,它们的来源都列于表中。
在第13组中含有大肠杆菌O71型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板,用表1中的每对引物按如下条件做PCR:在95℃预变性5分钟后,95℃变性30秒,退火时间是30秒,温度见表1,72℃延伸2分钟,这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟,反应体系是25ul。模板为1∶20稀释,取1μl。反应完毕后,取10ulPCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因,每个基因都有两对引物被检测,每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外,在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带,也就是说,在大多数组中没有得到任何PCR产物带,所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O71型及其O-抗原是高度特异的。
最后,通过PCR从大肠杆菌O71型中筛选到对大肠杆菌O71型的O-抗原高度特异的基因:wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O71型的O-抗原是特异的,尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O71型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O71型,并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构表,在表中列出了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇的结构,共由12个基因组成,每个基因用方框表示,并在方框内写入基因的名称,数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因,它们不属于O-抗原基因簇,我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的基因的位置图,在图中列出了大肠杆菌O71型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置,在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个:ATG和GTG。
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>对大肠杆菌O71型的O抗原特异的核苷酸
<130>对大肠杆菌O71型的O抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>13743
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60
gaaaaccact tcgacacctc atatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt 120
caactgcttg cggaagtgca gtccatctgt ccaccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180
cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac 240
aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgacg atgccagcgc cgacccgcta 300
cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaagtgctg 360
gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca tccagaccaa agaaccgctg 420
gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacac 480
acgctggact cagacatcat ggccgtgggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540
gaacttgaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgcc 600
gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctacgactgc 660
ggtaaaaaaa tggggtatat gcaggcattt gtgaagtatg gactacgcaa cctcaaagaa 720
ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780
atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt 840
tgcgaatatt cctgccgtta ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900
gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt 960
agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag tgggcaacgc tcgtcacatc gtagacatgc 1020
atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgcattaata cctctcttaa 1080
tcaaactaag agccgctaat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aaaaaagtga 1140
agatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt cacattataa 1200
ataatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga aacctggaat 1260
cacttgctga tgtttctgat tctgaacgct atgtttttga acatgcggat atttgcgatg 1320
ctgctgcaat ggcgcggatt tttgctcagc atcagccgga tgcagtgatg cacctggctg 1380
ctgaaagcca tgttgaccgt tcaattacag gtcctgcggc atttattgaa accaatattg 1440
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agaaaaatag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggc gatctgcctc 1560
atcctgacga agtaaataat aaagaagaat tacccctctt tactgagacg acagcttacg 1620
cgccaagcag cccatattct gcttctaaag catccagcga tcatttagtc cgcgcgtgga 1680
aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaactgttc gaataactac ggcccttatc 1740
actttccgga aaaattgatt ccgttggtaa ttcttaatgc tctggaaggt aaggcattac 1800
ctatttatgg caaaggggat caaattcgtg actggctgta tgttgaagat catgcgcgtg 1860
cgttatatac cgtcgtaacc gaaggtaaag cgggtggaac ttataacatt ggtggacaca 1920
acgaaaagaa aaacatcgat gtagtgctca ctatttgtga tttgttggat gagattgtac 1980
cgaaagagaa atcttaccgc gagcaaatca cttatgttgc cgatcgtccg ggacacgatc 2040
gccgttatgc cattgatgct gagaagactg gtcgcgaatt gggatggaaa ccacaggaaa 2100
cgtttgagag cgggattcgg aagacagtgg aatggtacct gtccaataca aaatgggttg 2160
ttaatgtgaa aagtggtgcc tatcaatcgt ggattgaaca gaactatgag ggccgccagt 2220
aatgaatatt ctccttttcg gcaaaacagg gcaggtaggt tgggaactac agcgtgctct 2280
ggcacctttg ggtaatttga ttgctcttga tgttcactcc actgattatt gtggtgattt 2340
tagtaatcct gaaggtgtgg ctgaaaccgt caaaaaaatt cgccctgatg ttattgttaa 2400
tgctgcggct catactgcag tagataagct gagtcagaac ccgaatttgc acaattactc 2460
aatgcgacca gcgttgaatc aattgcaaaa gcggccaatg aaagttgggg cttgggtaat 2520
tcattactca actgactacg tatttccggg aaccggtgaa ataccatggc tggagacgga 2580
tgcaaccgca ccgctaaatg tttacggtga aaccaagtta gccggagaaa aagcgttaca 2640
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taacttcgcc aaaacgatgt tgcgtctggc aaaagagcgc gaagaactgg ctgtgattaa 2760
tgatcaattt ggtgcgccaa caggtgctga gctgctggca gattgtacgg cacatgctat 2820
tcgtgtggca ctgaataaac cagaagtcgc aggcttgtat catctggtag ccagtggtac 2880
cacaacttgg cacgattatg ctgcgctggt ttttgaagag gcgcgcaaag caggcattcc 2940
ccttgcactc aacaagctca acgcaatatc aacaacagcc tatcctacac cagctcgtcg 3000
cccacataac tctcgcctta atacagaaaa atttcagcag aactttgcgc ttgtcttgcc 3060
tgactggcag gttggcgtga aacgaatgct caacgaatta tttacgacta cagcaattta 3120
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gaaaacgcgt aaaggtatta ttttagcggg tggttctggt actcgtcttt atcctgtgac 3240
tatggccgtg agtaaacaac ttctgcctat ttatgataag cctatgattt attacccgct 3300
ctcaaccctg atgctggcgg gtattcgtga tattttgatt attagtacgc cacaagacac 3360
accacgtttt gagcaattac tgggcgacgg tagccagtgg gggcttaatc ttcagtacaa 3420
agtgcaacct agtccagatg gtctggcaca agctttcatt attggagaag attttattgg 3480
tggtgatgat tgtgcgttgg tcttgggtga taatatcttt tacggtcatg acctaccaaa 3540
attaatggat acagctgtta atagagagag tggcgcaacg gtatttgcct atcacgttaa 3600
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agaaaaaccg cttcaaccga aaagcaatta tgcagttaca ggactttatt tctatgataa 3720
tgatgtcgtg gaaatggcaa aaaaactgaa accatctgcc cgtggcgaag tcgaaatcac 3780
agatattaac cgtatttata tggaacaggg gcgtttgtct gtagccatga tggggcgtgg 3840
ttatgcttgg ttggacacgg gtacacatca aagtcttatt gaggcaagta acttcattgc 3900
aacaatagaa gaacgccagg ggctgaaagt ttcctgtcca gaagagattg cttaccgtaa 3960
agggtttatt ggaaaagagc aactagagct attagctaag tcgcttatga aaaatcaata 4020
tggaaaatat cttcttaaaa tgatcgggta aataataata ctttttcagg aaatgaaatg 4080
aatttcagtg tattgatgtc tctttatatt aaagagaagc ccgaatatct acatgaatgc 4140
ttaaaaagtc tatatgaaca aacaaagcaa gctgatgaga tagtgcttgt ctatgatgga 4200
ccaattacaa acgaattaga taaagtagtt aattattggt taaatagttt gccaataaag 4260
ataataaaat taagcaaaaa tgtcggtttg ggtcaggccc tgaataaggg gttagctcaa 4320
tgtgaaaatg attatgtcgc tagaatggat acggatgata tatgccatcc caagagattt 4380
gaaattcaaa ttgatttttt aaataaaaac aagaatataa gtgttgttgg ttcatatata 4440
gaggagtttt cagaaactat agaaaacagg ttgtcgcaaa aaattgtacc gacaacgcac 4500
aatgagataa tgaaaaatat aggaaaacga aatccattta accacatgac agttgtgttc 4560
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agtgaatata aattgtataa gttaaaacaa agattaggat atcaaaatta tattatatcc 4800
tcattggtgt tttttttaag gagtgtacca agggtttttc ctccttacat tttaaaagca 4860
atttatagat tcttgcgaaa gaaataacag tataaaaatg cattatatta tttagagggg 4920
gcttatgaaa tattcaagaa caacaataca agatgctata gtgattacac ctgaagtatt 4980
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ataatggtta atttcttaag tttaaaaaat ataaactcac gctataatga ggaattaaaa 5940
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ttcgaaaacg agttcgctaa atattgtggt gtaaaaggtt ctctgggggt ggcgaatggg 6060
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attgaatctg cgattactga aaaaacaaaa gtgattttac ctgttcattt gtatggacga 6300
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gtcaatgcgg taaatggttt tactctatga gttcattttt taagatatca ttctttagtg 7020
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tgatatgttt gaattataat caggaatggt tcaaacataa ttatttttat ccctacgata 7620
gtatttttaa ttcagaagca aaggatattt tagcttatat attgatggct ataacaagtg 7680
caattagctt acccttgact ttaatcgtaa ttagaaaaat tctcctaaat atgacggata 7740
taactaccgt tggacaatgg caggcggtat ggaaaatatc tgaagtatat ataggagtcg 7800
tgactattgc acttagtact tattttttgc ctaagttgtc tgctctaaat gatacggcta 7860
aaataaaaaa tgaaattggt attgtcctta aatatactat tccatttgtt tgtgttgccg 7920
cggttctcat tttcgctttt cgcgatctga taataacgct cttattcacg aatgagtttt 7980
atcctgcacg tgatcttttt tttattcaac ttgtaggtga tataattaaa ataataagtt 8040
ggatttatgc attcactatg ttggcttcaa aagcaactag gtggtatgtt ggatctgaat 8100
tatttttttg tatttcatgg tgtttaatta gttttgttct tgttaatata tataaggcgc 8160
aaggaattaa tatagcatat tgcattagct atgttatgta ttttttaata atttatctca 8220
acctaaataa gattataaag aaaaagaatg aacctcattg aaattattaa actccaaatt 8280
atcaaaactt ctgatattaa taagaaaata agactgctca aggagttggg gggaatgcta 8340
tgggccaata acgttggcat atacaactta aattcacttg aaagggcagt tatcgaagat 8400
gtagcaagag attatacgcc acaaattggt agtcaatata aaaagaaaaa aaataatgta 8460
tttgtgatta ctataggcta catgtctggt gggcatacaa ggttaatgga aaatcttgca 8520
aatatgctag ataataaatg tgaccttata attactggaa acgcatctgt tacgctaaaa 8580
aaaaggcttg aaaaatattt caatgaaatt tttgaaattc ctgtttacaa tgacactaac 8640
attaatgaac tttataagtt aagcgctaat cttgagagat acgaaaatat aatacttaat 8700
atacaccctg atgatattgc gagcgttatt gcagctggtc ttgcaaaaaa aaatataaac 8760
acatacgttc actttgttaa tcatgcagat catgttttta gcttcggtcc gaccgtagca 8820
gatgtctggt atcaaattag ccaattcggg gctaaacttg atcaattaag agagctaagt 8880
ggtaaaacta cattcttggg gataccgatt gcgataaatg atgatcattt atctaataat 8940
atgatttcca ctaatgatga agtgaaatgt attatcactg ctggctctgc aaataaatac 9000
aagccgcata aaggctattc tctcataaaa aaaattcctg aaatattata tcaatttcca 9060
gaagcatcaa taatagtagt aggtactaac atcctatttt gctattggtg gtggggaact 9120
tttttaaaat tcagaaagcg tattaaattc tataaagcac ttaatcattc tgaatatctt 9180
ttacttatgc aaaatgctga tatttatttg gatagttatc ctattcccgg ggggacggca 9240
tttgttgagc agtcctttct gggtaaaaaa tgtgccgggt atatttcacc gcaacaaggg 9300
tatacaccac ttgaaaacat aaaatgcgac atcacaagtt ctgagttaaa caaaataaat 9360
aacgttgata taattgagaa aataaaatat gttcatcctt ttgataatgt aaaaaataga 9420
cttttaagcg ccatcaacaa acaagtgatg actactataa actgggatta ttattacaaa 9480
tggactggtg acattaactt ttttaaactc gaaaaaataa gagaaattcc attatattta 9540
ttgctggaat gtgtgaaaga aaattctagc ttaaaatgta taatatcaca atataaattt 9600
ataactatta tttctttaat taaaaatttt atcaggctct atgtcagtaa actaaagggg 9660
aaataatgga atatactatt attattattt tttttgttct gttgtatttt acatctaaag 9720
ttacgtggcc ctttagtgga aaaaatgcac atccaattaa ctttgtttta ttcacgcaaa 9780
tatttatatt aacgctgcca ggtgttctta ttttaacatt ttttaaagag tgcgcgggat 9840
ctataacatg tgagataata gctgaaaaca tcaaaataaa cgtgatgttg gattatttta 9900
ctgtgctctg ttttatcctt ttgggggtgc tttcttcatt tttcttgtta aaaggtaaaa 9960
ctgattttcg gccagcatcg aatgcccata gacgatatct aaatacgtgc tttatattaa 10020
ctctacttat ttttttggta aaaattattt ctgttaatca agttcctcta tttcttacat 10080
tacttggtca taaagatgct gcagagattc aaaaagctga gatccttaga ggggaagatg 10140
ggttttcatt tccggtaata aattttctaa taaaatattt tcctttgtat ttttattaca 10200
gtacgttgat tggtttgttt aaacgcaaag ttactatagt ttactttgta atggcttttc 10260
ttgtcacgtc tgtgacaatg ctttacgatt tacaaaaagg tccggttgtt attatgatta 10320
ttggctcatt ttggctttat tgggcttata ccggaaaagc aaaaatgata gtagtaggtg 10380
ggatattcag tttattttta gtaggtgttc tattttatat ctccttcgat tttggtgatg 10440
atacccaata ttttattacc gctgtgttaa ataggacctt cattgctcag aatgatggaa 10500
tgtattgggt atatcaatat tataatatat taccaaataa agaactgtat tctttatggg 10560
gggtcccact tgcacaacag tttggtatcc cgcagattga cccattaagt gatattattg 10620
gtgttgtttt tcctcaagct aaggatagtt gggttaatac aacgacattt ttgttaggtg 10680
aggcaaaggc aattttcggt gactatagtt ccattatctc atctttagta gtatttatta 10740
atgtgtttgt tgtatgtgtg ctatcaacac ttttagtaag agtatcaaaa aatatttttt 10800
atcccgcaat attcgttatg attcaaacta taccatttgc aaacaatttg actgacttat 10860
tatatggtag atttattttt ggttttttag tctttatgtt atttccagtg cttatatgtt 10920
ttttgtgtta tggaaaatta aaaaatgatg aatagaaaag tgcttattat aatggttacc 10980
tataatcctg attggagtaa ggtaattaat aaagtgaagt ctttttgtgt tgcaggaaca 11040
gtttttgttt ctgataatag cgattctgat tcctcatcat tgataaacta tgaaaatgtt 11100
atatacagat ataatcatgg taatgtaggc atagcaaaag ctcagaattt aggtattgaa 11160
tatgcgatgc agtataatta tgagtttgta gcttttgttg atgatgatag taatctgagc 11220
gggggtaaaa ttacacagtt aacaaataat ttatgtaaat taggcagtct tggtgaaaat 11280
attgcagcat tttgcgctta ccctagtgaa agaggtggtt ttgacaagac aaaaaaaact 11340
tcgcttggta gacaattatt gttaactaag aatttaatga gttcaggatc tttaacaaag 11400
gttgatgtat ttaaaaagat aggtttattt gatgaagatt tatttattga ctatgtggat 11460
tatgaatggg gctggagagc actggaaaaa aattttttaa tcgtaattga tacatcagta 11520
gaatttgaac attcacttgg tcaggggcgc tcaaaaattg gattagggat cccctctcct 11580
atccgacatt tttatcaaac tagaaatctt ttatggatat caaggctaaa ttatgtacca 11640
atatattgga aacttaaaca gtttttactt cttccaattc gctatttcta ttttggtttt 11700
ttttataatc actctaaatt acggcgaacc cattttctca aagggtttgc cgcagggtta 11760
aaatttaaat catagtttta tgagataata tcatcaacgg gacgaataat tttagctgga 11820
ttgccagcaa caattacatt atccggaata tccttcgtaa ctacggagcc tgcgccaata 11880
attgaatttt caccgatgat aatacccggc aaaattgttg cgttcgcacc aatagaagca 11940
ttctttttaa tatgtatcgt tggataataa tctgggtatt ttttagatct tggataaata 12000
tcatttgtaa atgtaacatt tggacctata aaaacattat cttcaattat gactccatcc 12060
catatataga ctccagattt tatagtgaca ttatcgccaa taataacttt attttcgatt 12120
aaagtatgtg cgcaaatatt gcagttatta ccaattacag cgccttcaaa aataatgctg 12180
tattgccaaa tggttgtatt tagaccgatt tttacagttt ttacatcact taatggatga 12240
attttcataa attctaccct tcatttttaa aacaataata ttgtaaatga tatcatttag 12300
tattaatgat atcattagac gcctgaatag taaaaagttt tccctttggt tataaagtca 12360
aaagttaagt agcgtaaatc ggtattctga caggagtaaa acatgtcaaa gcaacagatc 12420
ggcgtcgtcg gtatggcagt gatggggcgc aaccttgcgc tcaacatcga aagccgtggt 12480
tataccgtct ctattttcaa ccgttcccgt gaaaagacgg aagaagtgat tgccgaaaat 12540
ccaggcaaga aactggttcc ttactatacg gtgaaagagt ttgttgaatc tctggaaacg 12600
cctcgtcgca tcctgttaat ggtgaaagca ggtgcaggca cggatgctgc tattgattcc 12660
ctcaagccgt acctcgataa aggtgacatc atcattgatg gtggtaacac cttcttccag 12720
gacaccattc gtcgtaaccg tgagctttct tcagaaggct ttaacttcat cggtaccggt 12780
gtttccggcg gagaagaggg ggcgctgaaa gggccgtcca tcatgcctgg tggccagaaa 12840
gaagcctatg aactggttgc gccgatcctg accaaaatcg ccgcagtagc tgaagacggt 12900
gagccatgcg ttacctatat tggtgccgat ggcgcaggtc actatgtgaa gatggttcac 12960
aacggtattg aatacggaga tatgcaactg attgctgaag cctactctct gcttaaaggt 13020
ggcctgaacc tcaccaacga agaactggcg cagacgttta ccgagtggaa taacggtgaa 13080
ctgagcagct acctgatcga catcaccaaa gacatcttca ctaaaaaaga tgaagacggt 13140
aactacctgg ttgatgtgat cctggatgaa gcggctaaca aaggtaccgg taaatggacc 13200
agccagagcg cgcttgatct cggcgaaccg ctgtcgctga ttaccgagtc tgtgtttgca 13260
cgatacatct cttctctgaa agagcagcgt gttgccgcat ctaaagttct ttctggtccg 13320
caagcgcagc ctgctggcga caaaggtgaa ttcatcgaaa aagttcgccg tgcgctgtat 13380
ctgggtaaaa tcgtttctta cgctcagggc ttctctcagc tacgcgctgc gtctgaagag 13440
tacaactggg atctgaacta cggtgaaatc gcgaagattt tccgtgctgg ctgcatcatc 13500
cgtgcgcagt tcctgcagaa aatcaccgat gcttatgccg aaaatccgca gatcgctaac 13560
ctgttgctgg ctccttactt caagcaaatt gccgatgact accagcaggc gctgcgcgat 13620
gtcgtcgctt acgcagtaca gaacggtatc ccggtgccga ccttcgccgc tgctgttgcc 13680
tattacgaca gctaccgcgc cgctgttctg cctgcgaacc taattcaggc acagcgcgac 13740
taa 13743
表1大肠杆菌O71型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据
基因 | 功能 | 基因的碱基位置 | 正向引物 | 反向引物 | PCR产物的长度 | 产生正确大小电泳带的组数 | PCR的退火温度(℃) |
WzxWzy | O-抗原转运酶O-抗原聚合酶 | 6987-82619666-10955 | 7515-75337139-715710332-103509981-9999 | 7839-78598051-806910581-1060910670-10688 | 345bp931bp278bp708bp | 0*0*0*0* | 56555654 |
*只在大肠杆菌O71型中得到正确的一条带
表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号 | 该组中含有的菌株 | 来源 |
1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌志贺氏菌10、野生型志贺氏菌11、野生型志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、第4组菌株加上大肠杆菌标准菌株O71 | O1,O2,O5,O7,O12,O13,O14,O15,O16,O17,O19ab,O20,O21,O22,O23,O24,O59O25,O26,O27,O28,O29,O30,O32,O33,O35,O36,O37,O38,O40,O41,O42,O43O44,O45,O46,O48,O49,O50,O51,O52,O54,O55,O56,O57,O58,O60,O61,O62O63,O65,O66,O69,O70,O72,O74,O75,O76,O77,O78,O79,O80,O81,O82,O83O84,O85,O86,O87,O88,O89,O91,O92,O98,O99,O101,O102,O103,O104,O106O107,O108,O109,O110,O111,O112ab,O112ac,O113,O115,O116,O118,O120,O123,O125,O126,O128O129,O130,O131,O132,O133,O134,O135,O136,O137,O138,O139,O140,O141,O142,O143,O144,O145O146,O147,O148,O150,O152,O154,O156,O157,O158,O159,O160,O161,O163,O164,O165,O166O168,O169,O170,O171,O172,O173,D1,D2,D3,D4,D5,D6,D7,D8,D9,D10,D11,D12B1,B2,B3,B4,B6,B7,B8,B9,B10,B11,B12,B13,B14,B15,B16,B17,B18F1a,F1b,F2a,F2b,F3,F4b,F5(v:4),F5(v:7),F6,FX变,FY变,DS,DR,O3,O11,O39,O59,O64,O73,O96,O95,O100,O114,O151,O155,O124 | IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcdddIMVSaIMVS |
*为了检测的方便,我们将每13-17个菌分为一组,总共13组
a.Institude of Medical and Veterinary Science,Anelaide,Australia
b.Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark,其余来自于IMVS
d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3大肠杆菌O71型O抗原基因结构图
orf# galF rmlB rmlD rmlA orf4rmlC orf6 orf7 wzx orf9 wzy orf11 orf12 gnd
G+C%content 44 46 42 31 34 36 35 30 31 31 32 32
E.coli O71 O-antigen gene cluster
表4大肠杆菌O71型O抗原基因簇基因位置
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60
GAAAACCACT TCGACACCTC ATATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT 120
CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180
CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240
AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTA 300
CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAAGTGCTG 360
GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACCAA AGAACCGCTG 420
GACCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATCG AAAAACCGGA TCAGCCACAC 480
ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTGGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540
GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATTGCC 600
GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTACGACTGC 660
GGTAAAAAAA TGGGGTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTCAAAGAA 720
GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780
ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT 840
TGCGAATATT CCTGCCGTTA TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900
GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960
AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGCAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC 1020
ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTCTTAA 1080
orf1的起始
TCAAACTAAG AGCCGCTAAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAAAAA
GTGA 1140
AGATACTTGT TACTGGTGGC GCAGGATTTA TTGGTTCTGC TGTAGTTCGT CACATTATAA 1200
ATAATACGCA GGATAGTGTT GTTAATGTCG ATAAATTAAC GTACGCCGGA AACCTGGAAT 1260
CACTTGCTGA TGTTTCTGAT TCTGAACGCT ATGTTTTTGA ACATGCGGAT ATTTGCGATG 1320
CTGCTGCAAT GGCGCGGATT TTTGCTCAGC ATCAGCCGGA TGCAGTGATG CACCTGGCTG 1380
CTGAAAGCCA TGTTGACCGT TCAATTACAG GTCCTGCGGC ATTTATTGAA ACCAATATTG 1440
TTGGTACTTA TGTCCTTTTG GAAGCCGCTC GCAATTACTG GTCTGCTCTT GATAGCGACA 1500
AGAAAAATAG CTTCCGTTTT CATCATATTT CTACTGACGA AGTCTATGGC GATCTGCCTC 1560
ATCCTGACGA AGTAAATAAT AAAGAAGAAT TACCCCTCTT TACTGAGACG ACAGCTTACG 1620
CGCCAAGCAG CCCATATTCT GCTTCTAAAG CATCCAGCGA TCATTTAGTC CGCGCGTGGA 1680
AACGTACCTA TGGTTTACCG ACCATTGTGA CTAACTGTTC GAATAACTAC GGCCCTTATC 1740
ACTTTCCGGA AAAATTGATT CCGTTGGTAA TTCTTAATGC TCTGGAAGGT AAGGCATTAC 1800
CTATTTATGG CAAAGGGGAT CAAATTCGTG ACTGGCTGTA TGTTGAAGAT CATGCGCGTG 1860
CGTTATATAC CGTCGTAACC GAAGGTAAAG CGGGTGGAAC TTATAACATT GGTGGACACA 1920
ACGAAAAGAA AAACATCGAT GTAGTGCTCA CTATTTGTGA TTTGTTGGAT GAGATTGTAC 1980
CGAAAGAGAA ATCTTACCGC GAGCAAATCA CTTATGTTGC CGATCGTCCG GGACACGATC 2040
GCCGTTATGC CATTGATGCT GAGAAGACTG GTCGCGAATT GGGATGGAAA CCACAGGAAA 2100
CGTTTGAGAG CGGGATTCGG AAGACAGTGG AATGGTACCT GTCCAATACA AAATGGGTTG 2160
orf1的终止
TTAATGTGAA AAGTGGTGCC TATCAATCGT GGATTGAACA GAACTATGAG GGCCGCCAG
T 2220orf2的起始
AATGAATATT CTCCTTTTCG GCAAAACAGG GCAGGTAGGT TGGGAACTAC AGCGTGCTCT 2280
GGCACCTTTG GGTAATTTGA TTGCTCTTGA TGTTCACTCC ACTGATTATT GTGGTGATTT 2340
TAGTAATCCT GAAGGTGTGG CTGAAACCGT CAAAAAAATT CGCCCTGATG TTATTGTTAA 2400
TGCTGCGGCT CATACTGCAG TAGATAAGCT GAGTCAGAAC CCGAATTTGC ACAATTACTC 2460
AATGCGACCA GCGTTGAATC AATTGCAAAA GCGGCCAATG AAAGTTGGGG CTTGGGTAAT 2520
TCATTACTCA ACTGACTACG TATTTCCGGG AACCGGTGAA ATACCATGGC TGGAGACGGA 2580
TGCAACCGCA CCGCTAAATG TTTACGGTGA AACCAAGTTA GCCGGAGAAA AAGCGTTACA 2640
GGAAAATTGC GCGAAGCATC TTATTTTCCG TACCAGCTGG GTATACGCAG GTAAAGGAAA 2700
TAACTTCGCC AAAACGATGT TGCGTCTGGC AAAAGAGCGC GAAGAACTGG CTGTGATTAA 2760
TGATCAATTT GGTGCGCCAA CAGGTGCTGA GCTGCTGGCA GATTGTACGG CACATGCTAT 2820
TCGTGTGGCA CTGAATAAAC CAGAAGTCGC AGGCTTGTAT CATCTGGTAG CCAGTGGTAC 2880
CACAACTTGG CACGATTATG CTGCGCTGGT TTTTGAAGAG GCGCGCAAAG CAGGCATTCC 2940
CCTTGCACTC AACAAGCTCA ACGCAATATC AACAACAGCC TATCCTACAC CAGCTCGTCG 3000
CCCACATAAC TCTCGCCTTA ATACAGAAAA ATTTCAGCAG AACTTTGCGC TTGTCTTGCC 3060
orf2的终止
TGACTGGCAG GTTGGCGTGA AACGAATGCT CAACGAATTA TTTACGACTA CAGCAATT
TA 3120
orf3的起始
ATTGTTTTTG CATCTTGTTC GTGATGATGG TGCAAGATGA ATTAAAAGGA ATGATGAA
AT 3180
GAAAACGCGT AAAGGTATTA TTTTAGCGGG TGGTTCTGGT ACTCGTCTTT ATCCTGTGAC 3240
TATGGCCGTG AGTAAACAAC TTCTGCCTAT TTATGATAAG CCTATGATTT ATTACCCGCT 3300
CTCAACCCTG ATGCTGGCGG GTATTCGTGA TATTTTGATT ATTAGTACGC CACAAGACAC 3360
ACCACGTTTT GAGCAATTAC TGGGCGACGG TAGCCAGTGG GGGCTTAATC TTCAGTACAA 3420
AGTGCAACCT AGTCCAGATG GTCTGGCACA AGCTTTCATT ATTGGAGAAG ATTTTATTGG 3480
TGGTGATGAT TGTGCGTTGG TCTTGGGTGA TAATATCTTT TACGGTCATG ACCTACCAAA 3540
ATTAATGGAT ACAGCTGTTA ATAGAGAGAG TGGCGCAACG GTATTTGCCT ATCACGTTAA 3600
TGATCCAGAA CGTTATGGTG TGGTGGAGTT TGATAAAAAC GGCACGGCAA TAAGCTTGGA 3660
AGAAAAACCG CTTCAACCGA AAAGCAATTA TGCAGTTACA GGACTTTATT TCTATGATAA 3720
TGATGTCGTG GAAATGGCAA AAAAACTGAA ACCATCTGCC CGTGGCGAAG TCGAAATCAC 3780
AGATATTAAC CGTATTTATA TGGAACAGGG GCGTTTGTCT GTAGCCATGA TGGGGCGTGG 3840
TTATGCTTGG TTGGACACGG GTACACATCA AAGTCTTATT GAGGCAAGTA ACTTCATTGC 3900
AACAATAGAA GAACGCCAGG GGCTGAAAGT TTCCTGTCCA GAAGAGATTG CTTACCGTAA 3960
AGGGTTTATT GGAAAAGAGC AACTAGAGCT ATTAGCTAAG TCGCTTATGA AAAATCAATA 4020
orf3的终止 orf4的起始
TGGAAAATAT CTTCTTAAAA TGATCGGG
TA AATAATAATA CTTTTTCAGG AAATGAA
ATG 4080
AATTTCAGTG TATTGATGTC TCTTTATATT AAAGAGAAGC CCGAATATCT ACATGAATGC 4140
TTAAAAAGTC TATATGAACA AACAAAGCAA GCTGATGAGA TAGTGCTTGT CTATGATGGA 4200
CCAATTACAA ACGAATTAGA TAAAGTAGTT AATTATTGGT TAAATAGTTT GCCAATAAAG 4260
ATAATAAAAT TAAGCAAAAA TGTCGGTTTG GGTCAGGCCC TGAATAAGGG GTTAGCTCAA 4320
TGTGAAAATG ATTATGTCGC TAGAATGGAT ACGGATGATA TATGCCATCC CAAGAGATTT 4380
GAAATTCAAA TTGATTTTTT AAATAAAAAC AAGAATATAA GTGTTGTTGG TTCATATATA 4440
GAGGAGTTTT CAGAAACTAT AGAAAACAGG TTGTCGCAAA AAATTGTACC GACAACGCAC 4500
AATGAGATAA TGAAAAATAT AGGAAAACGA AATCCATTTA ACCACATGAC AGTTGTGTTC 4560
AATAAGAGTG AAATAATAAA GGTGGGTGGA TATGAACATC ATTATTTAAT GGAAGATTAT 4620
AATTTATGGT TGCGGCTTTT AAAAAATAAT ATTCAGGCAG CCAATTTGCC TTTAACATTA 4680
GTTTATGCCA GAGGTGGGGA TGGCATGATT TATAGGAGGT CCGGTTTACG TTATATTAAA 4740
AGTGAATATA AATTGTATAA GTTAAAACAA AGATTAGGAT ATCAAAATTA TATTATATCC 4800
TCATTGGTGT TTTTTTTAAG GAGTGTACCA AGGGTTTTTC CTCCTTACAT TTTAAAAGCA 4860
orf4的终止
ATTTATAGAT TCTTGCGAAA GAAA
TAACAG TATAAAAATG CATTATATTA TTTAGAGGGG 4920
orf5的起始
GCTT
ATGAAA TATTCAAGAA CAACAATACA AGATGCTATA GTGATTACAC CTGAAGTATT 4980
TGCTGATTCT AGGGGGTATT TTTTTGAAAG CTTTAATTAT CGGGATTTTC AAAGGATTAT 5040
TAATCGAGAG ATAGTTTTTT GTCAAGATAA CCAATCATTA TCGCATAAGG GAGTTGTCAG 5100
GGGACTACAT TTTCAAGTAA ATCCAAAGGA ACAGGCAAAA TTGGTAAGAT GTATAAATGG 5160
TTCGGTGTAT GATGTGATTG TAGACTTGCG CAAAAACTCC CCTTCTTATA AGTGTTGGTT 5220
CGGAATTTTA TTATCGTCTG ATAATAAAAA ACAGTTATGG ATTCCAGAGG GATGTGCTCA 5280
TGGTTTTATC TCATTAGAGG ACAATACGGA ATTATTATAT AAGACTACTG AATTTTATTC 5340
TCCTGACCAT GAACGCTGCA TCATTTGGAA TGATCCTGAC TTAGGAATAA GTTGGCCAGA 5400
ATATAGCTAT ATAATTTCCG ATAAAGATAA GAATGGAATT TCCTTCGCTG AATGGGAGAG 5460
orf6的起始 orf5的终止
CTTAG
GTGAT
TAAGGTGAAA TTAATTCCAC TTCAAACGCA TGGTGACGAT AGAGGTTCGC 5520
TTGTTGCTTT AGAAGAGGGG TATAATATAC CATTTCAAAT TAAACGCGTT TATTATATTT 5580
TTAACACAAA GAAAGGAGTC ATGAGAGGTT TTCATGCACA TAAAAACTTA AAACAGGTTG 5640
CAATAGCTGT TAGAGGAAGT TGTAAGTTTA AATTAGACAA TGGTACCGAT AGTGTTGAGG 5700
TTCTACTGAA TGATCCTGCG CAAGGTCTAT TGATAGAATC ATTTATTTGG AGAGAAATGT 5760
ATGACTTTTC CGAGGACTGC GTATTAATGG TTTTAGCCGA CTCTCATTAC GATGAGAACG 5820
orf6的终止
ATTACGTTAG AGACTACAAT GCTTTCTTAA ATCTGGTGGC T
TAATAATAA TAAGGATACA 5880
orf7的起始
ATA
ATGTTA ATTTCTTAAG TTTAAAAAAT ATAAACTCAC GCTATAATGA GGAATTAAAA 5940
AAAGCATGTG CAAGAGTTAT TGACTCTGGC TGGTATGTAA TGGGGGAGGA ATTACACCAG 6000
TTCGAAAACG AGTTCGCTAA ATATTGTGGT GTAAAAGGTT CTCTGGGGGT GGCGAATGGG 6060
CTAGATGCTT TGATTCTTTC ATTAAGAGCT TGGCGTGAAA TGGGGAAAAT TAAGCCGGGT 6120
GATGAGGTAC TTGTTCCAGC TAATACATAT ATAGCTTCAA TTATTGCAAT TACAGAAAAT 6180
AATCTGGTGC CTGTATTTGT TGAGCCGGAT TATAATACTT ATAATTTAGA TCCAGATAAA 6240
ATTGAATCTG CGATTACTGA AAAAACAAAA GTGATTTTAC CTGTTCATTT GTATGGACGA 6300
ATTTGTCCTA TGGAAGAAAT ATTATCATTG GCGAAAAAAT ATAATCTTCT TGTGTTAGAG 6360
GATTGTGCTC AGGCGCATGG TGCATCTCTT AATGGCAGAA AAACAGGGGG GTGGGGAGAT 6420
GCGGGGGCTT TTAGTTTTTA TCCAGGTAAA AATTTGGGGG CCCTTGGTGA TTCTGGGGCT 6480
ATTACTAGCA ATGATTTAGA TTTTCTGAAT GTAATTCAAG CTTTAAGAAA TTATGGGTCA 6540
CACCAAAAAT ATGTAAATCA ATATATTGGT GTGAATAGTC GATTAGATGA AATTCAAGCA 6600
GCTATGCTAA GGGTTAAATT AAAATACCTG GATAGTGATA ACAAAAGAAG GAAAGAAATT 6660
GCTCAATATT ACATTGATTC AATAATAAAT CCTTTAGTCC AATTGCCGAA ATCATGCAGT 6720
AATTATGATG AAAATGTTTG GCATTTATTT GTTGTTAAAA CTCGATATAG AGAGTATCTT 6780
CAAAAATTCC TGAGTAAACA GAGTATTCAA ACATTAATTC ACTATCCACA CCCTCCACAT 6840
AAACAAATAG CTTATAAGCA GTTTAATTCC ATTTCTTTGC CATTGACAGA AAAAATCCAT 6900
AATGAGGTTT TGTCTTTGCC AATGGATCCA ACTCTTTCTG AAGAGGAGAT ACAAAAGGTT 6960
orf8的起始 orf7的终止
GTCAATGCGG TAAATGGTTT TACTCT
ATGA GTTCATTTTT TAAGATATCA TTCTTTAGTG 7020
GTTGTTTGAC ATTATTCAAG ATGTTAATGG GCTTTTTAAT TGCTAAAGTA ATCGCTATTT 7080
ATACAGGGCC ATCTGGTATG GCCTTACTTG GTCAGCTTCA AAGTTTAGTC ACAGGTATTA 7140
ATGGGATCGT AAATGCACCT GTAGGAAATG GTATCGTTAA ATATACTGCA GAGTTTAAAC 7200
TAGAAGGTGC AGAATGTTGC TCTAGATGGT GGAAACCAGC AATCGGCTTT TCATTCCTTT 7260
TTTGTTTGGT TTTATCGATA GTTTTTATAC CATTTGCAAA TAAAATATCA TTTATTTTAT 7320
TTGGCTCTTA TGAATATGAT TATGTGGTTA TTATAGCAGT ATGTAACTTA CCTTTTGCAG 7380
CTTTCGGTAC TATGATAATG TCTATTGTCA ATGGAATGGG GAAGTATAGA CTTTATATAT 7440
TATATGGGTT TATTTCTAAT CTTATAACGT CGATAATAAT GTTACTTATG CTAATAAAAT 7500
ATGGTATTGT TGGTGCATTA TTAGCCACTT CAATACAATA TGGTCTTATT GGTATAATTT 7560
TGATATGTTT GAATTATAAT CAGGAATGGT TCAAACATAA TTATTTTTAT CCCTACGATA 7620
GTATTTTTAA TTCAGAAGCA AAGGATATTT TAGCTTATAT ATTGATGGCT ATAACAAGTG 7680
CAATTAGCTT ACCCTTGACT TTAATCGTAA TTAGAAAAAT TCTCCTAAAT ATGACGGATA 7740
TAACTACCGT TGGACAATGG CAGGCGGTAT GGAAAATATC TGAAGTATAT ATAGGAGTCG 7800
TGACTATTGC ACTTAGTACT TATTTTTTGC CTAAGTTGTC TGCTCTAAAT GATACGGCTA 7860
AAATAAAAAA TGAAATTGGT ATTGTCCTTA AATATACTAT TCCATTTGTT TGTGTTGCCG 7920
CGGTTCTCAT TTTCGCTTTT CGCGATCTGA TAATAACGCT CTTATTCACG AATGAGTTTT 7980
ATCCTGCACG TGATCTTTTT TTTATTCAAC TTGTAGGTGA TATAATTAAA ATAATAAGTT 8040
GGATTTATGC ATTCACTATG TTGGCTTCAA AAGCAACTAG GTGGTATGTT GGATCTGAAT 8100
TATTTTTTTG TATTTCATGG TGTTTAATTA GTTTTGTTCT TGTTAATATA TATAAGGCGC 8160
AAGGAATTAA TATAGCATAT TGCATTAGCT ATGTTATGTA TTTTTTAATA ATTTATCTCA 8220
orf9的起始 orf8的终止
ACCTAAATAA GATTATAAAG AAAAAGA
ATG AACCTCAT
TG AAATTATTAA ACTCCAAATT 8280
ATCAAAACTT CTGATATTAA TAAGAAAATA AGACTGCTCA AGGAGTTGGG GGGAATGCTA 8340
TGGGCCAATA ACGTTGGCAT ATACAACTTA AATTCACTTG AAAGGGCAGT TATCGAAGAT 8400
GTAGCAAGAG ATTATACGCC ACAAATTGGT AGTCAATATA AAAAGAAAAA AAATAATGTA 8460
TTTGTGATTA CTATAGGCTA CATGTCTGGT GGGCATACAA GGTTAATGGA AAATCTTGCA 8520
AATATGCTAG ATAATAAATG TGACCTTATA ATTACTGGAA ACGCATCTGT TACGCTAAAA 8580
AAAAGGCTTG AAAAATATTT CAATGAAATT TTTGAAATTC CTGTTTACAA TGACACTAAC 8640
ATTAATGAAC TTTATAAGTT AAGCGCTAAT CTTGAGAGAT ACGAAAATAT AATACTTAAT 8700
ATACACCCTG ATGATATTGC GAGCGTTATT GCAGCTGGTC TTGCAAAAAA AAATATAAAC 8760
ACATACGTTC ACTTTGTTAA TCATGCAGAT CATGTTTTTA GCTTCGGTCC GACCGTAGCA 8820
GATGTCTGGT ATCAAATTAG CCAATTCGGG GCTAAACTTG ATCAATTAAG AGAGCTAAGT 8880
GGTAAAACTA CATTCTTGGG GATACCGATT GCGATAAATG ATGATCATTT ATCTAATAAT 8940
ATGATTTCCA CTAATGATGA AGTGAAATGT ATTATCACTG CTGGCTCTGC AAATAAATAC 9000
AAGCCGCATA AAGGCTATTC TCTCATAAAA AAAATTCCTG AAATATTATA TCAATTTCCA 9060
GAAGCATCAA TAATAGTAGT AGGTACTAAC ATCCTATTTT GCTATTGGTG GTGGGGAACT 9120
TTTTTAAAAT TCAGAAAGCG TATTAAATTC TATAAAGCAC TTAATCATTC TGAATATCTT 9180
TTACTTATGC AAAATGCTGA TATTTATTTG GATAGTTATC CTATTCCCGG GGGGACGGCA 9240
TTTGTTGAGC AGTCCTTTCT GGGTAAAAAA TGTGCCGGGT ATATTTCACC GCAACAAGGG 9300
TATACACCAC TTGAAAACAT AAAATGCGAC ATCACAAGTT CTGAGTTAAA CAAAATAAAT 9360
AACGTTGATA TAATTGAGAA AATAAAATAT GTTCATCCTT TTGATAATGT AAAAAATAGA 9420
CTTTTAAGCG CCATCAACAA ACAAGTGATG ACTACTATAA ACTGGGATTA TTATTACAAA 9480
TGGACTGGTG ACATTAACTT TTTTAAACTC GAAAAAATAA GAGAAATTCC ATTATATTTA 9540
TTGCTGGAAT GTGTGAAAGA AAATTCTAGC TTAAAATGTA TAATATCACA ATATAAATTT 9600
ATAACTATTA TTTCTTTAAT TAAAAATTTT ATCAGGCTCT ATGTCAGTAA ACTAAAGGGG 9660orf9的终止 orf10的起始
AAA
TAATGGA ATATACTATT ATTATTATTT TTTTTGTTCT GTTGTATTTT ACATCTAAAG 9720
TTACGTGGCC CTTTAGTGGA AAAAATGCAC ATCCAATTAA CTTTGTTTTA TTCACGCAAA 9780
TATTTATATT AACGCTGCCA GGTGTTCTTA TTTTAACATT TTTTAAAGAG TGCGCGGGAT 9840
CTATAACATG TGAGATAATA GCTGAAAACA TCAAAATAAA CGTGATGTTG GATTATTTTA 9900
CTGTGCTCTG TTTTATCCTT TTGGGGGTGC TTTCTTCATT TTTCTTGTTA AAAGGTAAAA 9960
CTGATTTTCG GCCAGCATCG AATGCCCATA GACGATATCT AAATACGTGC TTTATATTAA 10020
CTCTACTTAT TTTTTTGGTA AAAATTATTT CTGTTAATCA AGTTCCTCTA TTTCTTACAT 10080
TACTTGGTCA TAAAGATGCT GCAGAGATTC AAAAAGCTGA GATCCTTAGA GGGGAAGATG 10140
GGTTTTCATT TCCGGTAATA AATTTTCTAA TAAAATATTT TCCTTTGTAT TTTTATTACA 10200
GTACGTTGAT TGGTTTGTTT AAACGCAAAG TTACTATAGT TTACTTTGTA ATGGCTTTTC 10260
TTGTCACGTC TGTGACAATG CTTTACGATT TACAAAAAGG TCCGGTTGTT ATTATGATTA 10320
TTGGCTCATT TTGGCTTTAT TGGGCTTATA CCGGAAAAGC AAAAATGATA GTAGTAGGTG 10380
GGATATTCAG TTTATTTTTA GTAGGTGTTC TATTTTATAT CTCCTTCGAT TTTGGTGATG 10440
ATACCCAATA TTTTATTACC GCTGTGTTAA ATAGGACCTT CATTGCTCAG AATGATGGAA 10500
TGTATTGGGT ATATCAATAT TATAATATAT TACCAAATAA AGAACTGTAT TCTTTATGGG 10560
GGGTCCCACT TGCACAACAG TTTGGTATCC CGCAGATTGA CCCATTAAGT GATATTATTG 10620
GTGTTGTTTT TCCTCAAGCT AAGGATAGTT GGGTTAATAC AACGACATTT TTGTTAGGTG 10680
AGGCAAAGGC AATTTTCGGT GACTATAGTT CCATTATCTC ATCTTTAGTA GTATTTATTA 10740
ATGTGTTTGT TGTATGTGTG CTATCAACAC TTTTAGTAAG AGTATCAAAA AATATTTTTT 10800
ATCCCGCAAT ATTCGTTATG ATTCAAACTA TACCATTTGC AAACAATTTG ACTGACTTAT 10860
TATATGGTAG ATTTATTTTT GGTTTTTTAG TCTTTATGTT ATTTCCAGTG CTTATATGTT 10920
orf11的起始 orf10的终止
TTTTGTGTTA TGGAAAATTA AAAAATG
ATG AA
TAGAAAAG TGCTTATTAT AATGGTTACC 10980
TATAATCCTG ATTGGAGTAA GGTAATTAAT AAAGTGAAGT CTTTTTGTGT TGCAGGAACA 11040
GTTTTTGTTT CTGATAATAG CGATTCTGAT TCCTCATCAT TGATAAACTA TGAAAATGTT 11100
ATATACAGAT ATAATCATGG TAATGTAGGC ATAGCAAAAG CTCAGAATTT AGGTATTGAA 11160
TATGCGATGC AGTATAATTA TGAGTTTGTA GCTTTTGTTG ATGATGATAG TAATCTGAGC 11220
GGGGGTAAAA TTACACAGTT AACAAATAAT TTATGTAAAT TAGGCAGTCT TGGTGAAAAT 11280
ATTGCAGCAT TTTGCGCTTA CCCTAGTGAA AGAGGTGGTT TTGACAAGAC AAAAAAAACT 11340
TCGCTTGGTA GACAATTATT GTTAACTAAG AATTTAATGA GTTCAGGATC TTTAACAAAG 11400
GTTGATGTAT TTAAAAAGAT AGGTTTATTT GATGAAGATT TATTTATTGA CTATGTGGAT 11460
TATGAATGGG GCTGGAGAGC ACTGGAAAAA AATTTTTTAA TCGTAATTGA TACATCAGTA 11520
GAATTTGAAC ATTCACTTGG TCAGGGGCGC TCAAAAATTG GATTAGGGAT CCCCTCTCCT 11580
ATCCGACATT TTTATCAAAC TAGAAATCTT TTATGGATAT CAAGGCTAAA TTATGTACCA 11640
ATATATTGGA AACTTAAACA GTTTTTACTT CTTCCAATTC GCTATTTCTA TTTTGGTTTT 11700
TTTTATAATC ACTCTAAATT ACGGCGAACC CATTTTCTCA AAGGGTTTGC CGCAGGGTTA 11760
orf11的终止 orf12的终止
AAATTTAAAT CA
TAGTT
TTA TGAGATAATA TCATCAACGG GACGAATAAT TTTAGCTGGA 11820
TTGCCAGCAA CAATTACATT ATCCGGAATA TCCTTCGTAA CTACGGAGCC TGCGCCAATA 11880
ATTGAATTTT CACCGATGAT AATACCCGGC AAAATTGTTG CGTTCGCACC AATAGAAGCA 11940
TTCTTTTTAA TATGTATCGT TGGATAATAA TCTGGGTATT TTTTAGATCT TGGATAAATA 12000
TCATTTGTAA ATGTAACATT TGGACCTATA AAAACATTAT CTTCAATTAT GACTCCATCC 12060
CATATATAGA CTCCAGATTT TATAGTGACA TTATCGCCAA TAATAACTTT ATTTTCGATT 12120
AAAGTATGTG CGCAAATATT GCAGTTATTA CCAATTACAG CGCCTTCAAA AATAATGCTG 12180
TATTGCCAAA TGGTTGTATT TAGACCGATT TTTACAGTTT TTACATCACT TAATGGATGA 12240
orf12的起始
ATTTT
CATAA ATTCTACCCT TCATTTTTAA AACAATAATA TTGTAAATGA TATCATTTAG 12300
TATTAATGAT ATCATTAGAC GCCTGAATAG TAAAAAGTTT TCCCTTTGGT TATAAAGTCA 12360
AAAGTTAAGT AGCGTAAATC GGTATTCTGA CAGGAGTAAA ACATGTCAAA GCAACAGATC 12420
GGCGTCGTCG GTATGGCAGT GATGGGGCGC AACCTTGCGC TCAACATCGA AAGCCGTGGT 12480
TATACCGTCT CTATTTTCAA CCGTTCCCGT GAAAAGACGG AAGAAGTGAT TGCCGAAAAT 12540
CCAGGCAAGA AACTGGTTCC TTACTATACG GTGAAAGAGT TTGTTGAATC TCTGGAAACG 12600
CCTCGTCGCA TCCTGTTAAT GGTGAAAGCA GGTGCAGGCA CGGATGCTGC TATTGATTCC 12660
CTCAAGCCGT ACCTCGATAA AGGTGACATC ATCATTGATG GTGGTAACAC CTTCTTCCAG 12720
GACACCATTC GTCGTAACCG TGAGCTTTCT TCAGAAGGCT TTAACTTCAT CGGTACCGGT 12780
GTTTCCGGCG GAGAAGAGGG GGCGCTGAAA GGGCCGTCCA TCATGCCTGG TGGCCAGAAA 12840
GAAGCCTATG AACTGGTTGC GCCGATCCTG ACCAAAATCG CCGCAGTAGC TGAAGACGGT 12900
GAGCCATGCG TTACCTATAT TGGTGCCGAT GGCGCAGGTC ACTATGTGAA GATGGTTCAC 12960
AACGGTATTG AATACGGAGA TATGCAACTG ATTGCTGAAG CCTACTCTCT GCTTAAAGGT 13020
GGCCTGAACC TCACCAACGA AGAACTGGCG CAGACGTTTA CCGAGTGGAA TAACGGTGAA 13080
CTGAGCAGCT ACCTGATCGA CATCACCAAA GACATCTTCA CTAAAAAAGA TGAAGACGGT 13140
AACTACCTGG TTGATGTGAT CCTGGATGAA GCGGCTAACA AAGGTACCGG TAAATGGACC 13200
AGCCAGAGCG CGCTTGATCT CGGCGAACCG CTGTCGCTGA TTACCGAGTC TGTGTTTGCA 13260
CGATACATCT CTTCTCTGAA AGAGCAGCGT GTTGCCGCAT CTAAAGTTCT TTCTGGTCCG 13320
CAAGCGCAGC CTGCTGGCGA CAAAGGTGAA TTCATCGAAA AAGTTCGCCG TGCGCTGTAT 13380
CTGGGTAAAA TCGTTTCTTA CGCTCAGGGC TTCTCTCAGC TACGCGCTGC GTCTGAAGAG 13440
TACAACTGGG ATCTGAACTA CGGTGAAATC GCGAAGATTT TCCGTGCTGG CTGCATCATC 13500
CGTGCGCAGT TCCTGCAGAA AATCACCGAT GCTTATGCCG AAAATCCGCA GATCGCTAAC 13560
CTGTTGCTGG CTCCTTACTT CAAGCAAATT GCCGATGACT ACCAGCAGGC GCTGCGCGAT 13620
GTCGTCGCTT ACGCAGTACA GAACGGTATC CCGGTGCCGA CCTTCGCCGC TGCTGTTGCC 13680
TATTACGACA GCTACCGCGC CGCTGTTCTG CCTGCGAACC TAATTCAGGC ACAGCGCGAC 13740
TAA 13743
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1、一种对大肠杆菌O71型的O-抗原特异的引物对,其特征在于所述引物对选自:SEQ ID NO:1中的7515至7533碱基的正向引物和7839至7859碱基的反向引物、SEQ ID NO:1中的7139至7157碱基的正向引物和8051至8069碱基的反向引物、SEQ ID NO:1中的10332至10350碱基的正向引物和10581至10609碱基的反向引物或者SEQ ID NO:1中的9981至9999碱基的正向引物和10670至10688碱基的反向引物。
2、权利要求1所述的引物对在检测环境中大肠杆菌O71型中的应用。
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JPH11332600A (ja) * | 1998-05-29 | 1999-12-07 | Shimadzu Corp | 病原性大腸菌o157検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
-
2003
- 2003-12-22 CN CNB200310117861XA patent/CN1324133C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
JPH11332600A (ja) * | 1998-05-29 | 1999-12-07 | Shimadzu Corp | 病原性大腸菌o157検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
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