CN1318424C - 芳杂环羧酸衍生物，制备方法及在药学上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及芳杂环羧酸衍生物，制备方法和在药学上的应用。本发明化合物通过在人淋巴细胞上体外抗HIV试验，结果表明具有与阳性对照药AZT相当甚至略强的抗HIV活性。毒理学研究(LD50试验)结果显示他们毒性小(LD50＞2500mg/kg)。微生物的回复突变试验(Ames试验)显示其无致突变作用。本发明化合物芳杂环羧酸衍生物显示很好的抗HIV活性和较小的毒副作用，可研制为抗HIV新药。

Description

芳杂环羧酸衍生物，制备方法及在药学上的应用
技术领域：
本发明属药物合成领域，具体涉及芳杂环羧酸衍生物，制备方法和在药学上的应用。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合症，又称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的，位于T淋巴细胞上的CD4分子是HIV病毒的受体。
自1981年发现第一例艾滋病至今，全世界范围艾滋病毒感染呈直线上升趋势，全球艾滋病患者和病毒携带者总人数达到了3430万。据预测世界上将有1亿以上HIV感染者，而且第三世界感染的发病率将明显上升，亚洲将占42％，非洲占31％。据***艾滋病规划署统计，亚洲的艾滋病患者5年后将从目前的600万人增加到800万人。我国艾滋病的流行经过散发期、局部流行期，已转入广泛流行期。近几年发现的艾滋病患者几乎达到前10年的总和，流行范围也迅速扩大，疫情涉及全国31个省、自治区、直辖市。目前全国已有31个省、自治区、直辖市报告艾滋病病毒感染者18000例，而实际感染人数估计超过60万人，艾滋病加速流行形势十分严峻。
在一些地区和一些人群中，感染病毒的比例很高，而且感染的人数每年增加30％。当前我国艾滋病感染者主要分布在农村地区，其中，经吸毒途径感染艾滋病病毒者约占70％，18-39岁的感染者占60％。近年来，在各类高危人群的哨点监测中，发现艾滋病病毒感染者的人数明显增多，阳性率明显增高。这种严峻的国内外形势充分说明研制低毒有效的抗HIV药物的迫切性。
根据研究结果，在感染HIV-1病毒粒子吸附到宿主T淋巴细胞上以后，目前有四种阻断HIV-1生命周期的抑制剂：(1)逆转录酶抑制剂(2)整合酶抑制剂(3)蛋白酶抑制剂(4)锌指蛋白抑制剂。但是，至今只有逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂已被批准用于HIV感染的治疗，二者配伍使用效果更好，但由于HIV复制缺乏保真性，突变发生而致使抗病毒药物产生耐药性，近期有报道，即使采用上述二者抑制剂的联合治疗方案，艾滋病复发的趋势仍不能有效阻止。
为此，进一步研制开发有效的抗HIV药物不仅对于临床治疗艾滋病患者带来新的希望，而且为深入阐明其抗HIV的作用机理以及寻找更有效抑制剂提供新的有益启示。
发明内容：
本发明的目的是提供选择性良好且毒副作用低的芳杂环羧酸衍生物，为制备治疗艾滋病的新药提供基础。
本发明芳杂环羧酸衍生物具有下述式I结构：
Figure C20041009457200051
其中：
Y＝N，CH
R1为取代的含一个或两个杂原子的五元芳杂环，
R2为H，H2，羰基，
R4，R5为H，OCH3，卤素，烷基，
R6为H，OH，OCOR，OCOAr。
本发明芳杂环羧酸衍生物通过体外药效学研究，包括不同浓度的药物进行体外HIV-1病毒抑制试验、毒理学研究(LD50试验)和微生物的回复突变试验(Ames试验)，显示良好的抗HIV活性和较小的毒副作用，在体外对艾滋病病毒HIV株DP13、IIIB均具较好抑制作用，其作用强度相当于或略强于已知抗艾滋病药物AZT。
本发明的优选化合物具有下述化合物1的结构：
上述化合物通过体外药效学试验，在体外对艾滋病病毒HIV株DP13、IIIB均具较好抑制作用，其作用强度相当于或略强于已知抗艾滋病药物AZT。
本发明所要解决的另一技术问题，是公开上述芳杂环羧酸衍生物的制备方法。
本发明公开的式I芳杂环羧酸衍生物通过以下技术路线获得：
本发明以杂环二羧酸为原料，经脱水后和胺类反应生成吡嗪并杂环中间体，再经不同的官能团转化反应制得化合物芳杂环羧酸衍生物吡嗪并杂环醇酯。
本发明实施例1，详细描述了化合物1的制备方法，化合物1的制备过程如下式：
化合物1的制备工艺包括：1.化合物2在DioX/H2O中冷却下，分次加入KBH4，得深黄色悬浊反应液。快速搅拌下慢慢将上述反应液倾入放有蒸馏水和冰醋酸杯中，滤取析出的黄色固体，用蒸馏水洗，抽干得粗品。粗品加CHCl3搅拌0.5h，砂芯漏斗抽滤，洗涤，烘干得化合物 3。烧瓶内加入氯甲酸对甲苄酯和苯，用旋转蒸发仪共沸脱水干燥后，加入CH2Cl2，加热回流，从冷凝管底部慢慢加入Et3N后，再加热回流10分钟，向瓶内加入 3和CH2C12，加热搅拌回流20~30h。减压蒸去溶剂，抽干，向瓶内残留物加入蒸馏水，室温下搅拌，滤取固体，干燥后得化合物 1。
本发明所要解决的另一技术问题是公开化合物芳杂环羧酸衍生物在制备和作为抗HIV药物中的应用。
本发明化合物芳杂环羧酸衍生物经人淋巴细胞体外抗HIV试验，结果表明具有与阳性对照药AZT相当的抗HIV活性，尤其在药物先和细胞作用，再加入HIV病毒的试验中化合物1具明显抑制作用，略强于目前临床应用的AZT。毒理学研究，LD50试验结果显示毒性小，LD50＞2500mg/kg。微生物的回复突变试验，Ames试验显示其无致突变作用。本发明化合物芳杂环羧酸衍生物显示了很好的抗HIV活性和较小的毒副作用，可研制为治疗HIV的新药。
具体实施方式：
实施例1
6(5-氯吡啶-2-基)-7-(对甲基苯基羰氧基)-5，6-二氢吡咯[3，4-b]吡嗪-5-酮
1.在烧杯内加入化合物 219g和DioX/H2O(19/1)190ml，快速搅拌并冷水(10~12℃)冷却，分次小量加入KBH4(加前用刮刀碾碎)3.99g，维持反应液内温12~14℃，10~15分钟加完KBH4，悬浊液在反应中变厚，变深黄色。再在12~13℃搅拌10~15分钟，得深黄色悬浊反应液。
在另一冰水冷却的2000ml烧杯内放蒸馏水950ml和冰醋酸13ml，在快速搅拌下慢慢将上述反应液倾入到此杯中，15~25分钟加完。搅拌，气泡消失后复测反应液PH，加入冰HoAC，使PH为5~6，继续搅拌并用冰冷却(0~6℃)2~3h。滤取析出的黄色固体，用50ml蒸馏水洗滤饼，抽干，粗品于40℃左右红外干燥或置于真空干燥器内(KOH或K2CO3)，干重18.8g。将上述粗品加到250ml三角烧瓶内，加80mlCHCl3充，室温搅拌0.5h，用砂芯漏斗小心抽滤，再用30mlCHCl3充分洗涤滤饼，压干，烘干(40℃空气干燥)，称得11.4g产品 3，，收率59.5％。重量收率60％。
2.在250ml茄形烧瓶内加入氯甲酸对甲苄酯8.3g和50ml苯，用旋转蒸发仪加惹共沸脱水干燥后，加入CH2Cl2 50ml，加热回流，从冷凝管底部慢慢加入(在搅拌下)Et3N 22.5ml，加完后再加热回流10分钟左右，将反应瓶移出热源，稍冷后，移去冷凝管，向瓶内一次加入碾碎的 36.8g和CH2Cl2 50ml，再加热搅拌回流(冷凝管顶部装CaCl2管)20~30h[2-3]。减压蒸去所有溶剂，抽干，滤液不超过80℃。冷至RT，向瓶内残留物加入蒸馏水，室温下搅拌，滤取黄色松散状固体，干燥(600~700MHg)4~8h后，得 1粗品10~11g。粗品中加入50ml醋酸乙酯，回流溶解后再加入异丙醚(10~15ml)，冷至室温，析出粒状黄色结晶，滤取结晶，洗涤，得产品6.8g。真空加热干燥(60~80℃/＜10mmHg)至恒量。 1为近白色结晶，收率67％。1H NMR(CDCl3，ppm)：δ 8.96(d，1H)，8.83(d，1H)，8.23(s，1H)，7.79(s，1H)，7.75-7.72(d，1H)，7.49-7.47(d，1H)，7.35(m，2H)，7.16-7.11(m，2H)，2.24(s，3H)；EIMS：m/z 396(M+)。
实施例2  化合物的体外抗HIV活性测试
1.测试方法：对所测化合物进行实验室HIV-1病毒株和原发感染株药物体外抗HIV试验。抑制试验所用靶细胞为经植物血凝素刺激后的正常人外周血淋巴细胞；2-4病毒株(JRCSF，DPB，JRFL，III B)试验，病毒量为100TCID50，使用不同浓度的药物进行两种体外HIV-1病毒抑制试验方法：一为药物加病毒培养后再加细胞，二为病毒与细胞培养后加药物。病毒培养应用HIV-1P24抗原检测其病毒培养液HIV-1P24抗原的表达情况，并根据P24抗原检测结果，计算该药物抑制病毒率和EC50，并与阳性对照药AZT的结果进行比较。
2.试验结果：
对被测化合物进行人淋巴细胞体外抗HIV试验，结果表明本发明化合物有与阳性对照药AZT相当的抗HIV活性，尤其在药物先和细胞作用，再加入HIV病毒的试验中，本发明化合物具明显抑制作用，略强于目前临床应用的AZT。表1是人淋巴细胞体外抗HIV试验结果(EC50)。
表1
试验样品 给药方式 HIV病毒 HIV病毒 HIV病毒 HIV病毒
JRCSF DP13 JRFL III B
1 1 107.99 31.69 no effect 26.35
AZT 1 85.77 31.41 no effect 29.37
试验样品 给药方式 HIV病毒 HIV病毒 HIV病毒 HIV病毒
JRCSF DP13 JRFL III B
1 2 106 79.56 no effect 84.19
AZT 2 192.94 84.69 no effect no effect
实施例3：化合物的毒理学研究
LD50试验：受试动物：昆明种小鼠，腹腔注射受试药物的CMC溶液。然后观察动物反应及死亡情况(一周)，经统计，结果表明化合物毒性小，LD50＞2500mg/kg。表2是毒理学LD50试验结果(七天内小鼠死亡情况)。
表2
剂量 动  物♂  ♀     死亡的时间(天)
    1    2    3    4    5    6    7
  2500mg/kg2125 mg/kg1806 mg/kg1535 mg/kg 5    55    55    55    5 0    2    0    0    0    0    00    0    0    0    0    0    00    0    0    0    0    0    00    0    0    0    0    0    0
实施例6
化合物的微生物回复突变试验(Ames试验)
1.阴性对照用DMSO；阳性对照选用公认的有致突变作用时物质：非活化(不加S9)者TA102用MMS，TA100用SA，TA98用2，7-2AF，TA97用9A，；活化(加S9)者TA103，TA100TA98和TA97均用2-AF。
2.菌株采用鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA102，TA100、TA98、TA97，TA102和TA100用于检测置换型基因突变，TA98和TA97用于检测移码型基因突变，菌株由美围加州大学Ames试验室提供，保存于-80℃冰箱，均经四步法鉴定合格。
3.用二甲基亚砜按浓度递减原则将受试物配成100ug/ml，1mg/ml，5mg/ml，10mg/ml和50mg/ml五个浓度，实验时每皿加入0.1ml。
4.大鼠肝匀浆微粒体酶系(S9)由多氯联苯(Aroclor 1254)诱导，-80℃低温冰箱保存。使用时用BaP或2-AF测定其活力。
5.实验采用标准平皿渗入法，每个受试浓度作三个平行平皿，每一平皿加受试液0.1ml，37℃温箱培养48小时后以自动菌落计数仪计数菌落，每个试验重复一次。
6.结果：所有浓度的所试化合物均无致突变作用。
表3、4是本发明化合物的Ames试验结果。
表3
 SAM/CON  TA100+S9  TA100-S9  TA98+S9  TA98-S9
 DMSO
 0.00  136.0±7.0  16.0±6.2  373.3±2.5  26.7±1.5
 化合物3
 5000100050010010  104.7±7.51120.7±4.9131.0±2.6137.3±5.5131.3±3.5   86.3±3.5103.7±6.0120.0±6.2115.0±6.6110.7±3.1  29.7±3.534.3±3.837.7±6.143.0±3.651.3±3.2  20.3±3.130.0±2.637.3±1.539.0±3.651.0±2.0
 SA
 1.00  ---  769.3±22.2**  ---  ---
 2-AF
 10.0  912.3±26.9**  ---  723.0±57.7**  ---
 2.7-AF
 100  ---  ---  ---  817.7±30.0**
*：＞＝2*C **：＞＝3*C    (X±S)
表4
 SAM/CON  TA10+S9  TA102-S9  TA97+S9  TA97-S9
 DMSO
 0.00  264.3±20.1  207.7±11.0  133.3±5.5  122.7±9.7
 化合物3
 5000100050010010  264.7±7.4270.7±15.3275.7±15.8266.7±12.1273.0±11.5  216.0±13.7201.0±12.5187.7±6.1192.3±10.3186.0±7.0  120.3±8.3110.7±2.9115.0±6.0117.7±8.5103.0±5.6  106.3±7.6105.3±11.2109.7±7.6111.7±3.8101.7±11.9
 MMS
 4.00  ---  799.7±41.5**  ---  ---
 2-AF
 10.00  979.3±35.5**  ---  885.0±84.7**  ---
 PA
 50.00  ---  ---  ---  873.7±50.6**
*：＞＝2*C **：＞＝3*C    (X±S)

Claims (4)

1、芳杂环羧酸衍生物，具有下述式I的结构：
其中：Y＝N，CH
R1为氯取代的吡啶环，
R2为羰基，
R4，R5为H，
R6为OCOOAr，
虚线可以为双键。
2、根据权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物，其特征是所述衍生物是具有下述式结构的化合物
3、权利要求2所述的芳杂环羧酸衍生物的制备方法，其制备过程如下式：
4、权利要求1所述的芳杂环羧酸衍生物在制备治疗艾滋病毒感染药物中的用途。
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