CN1318103A - 肺炎链球菌的核酸和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了新的肺炎链球菌蛋白质以及编码它们的核酸序列。还描述了它们在疫苗和筛选方法中的用途。

Description

肺炎链球菌的核酸和蛋白质
本发明涉及源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的蛋白质,编码该蛋白质的核酸分子,该核酸和/或蛋白质作为抗原/免疫原的用途和在检测/诊断中的用途,以及筛选作为潜在抗-微生物靶的蛋白质/核酸序列的方法。
肺炎链球菌常被称为肺炎球菌,它是一种重要的致病微生物。在发展中国家和发达国家,肺炎链球菌感染在人类疾病中始终占有重要地位,有关专家已对此进行过评述(Fiber,G.R.,科学,265:1385-1387(1994))。据信在世界范围内,该微生物是急性呼吸道感染最常见的致病菌,估计每年可导致1百万名儿童死亡,其中的大多数为发展中国家的儿童(Stansfield,S.K.,儿科传染病,6:622(1987))。在美国,有人提出(Breiman等,Arch.Intern.Med.,150:1401(1990))肺炎球菌仍是细菌性肺炎最常见的致病菌,在儿童,老年人和患有易感染疾病,如无脾症,心脏病,肺病和肾病,糖尿病,酒精中毒的患者,或患有免疫抑制疾病(如AIDS)的患者中,细菌性肺炎的发病率特别高。这些人群患肺炎球菌败血症和(因此患)脑膜炎的风险较高,因此死于肺炎球菌感染的风险较大。肺炎球菌也是中耳炎和鼻窦炎的致病菌,在发达国家的儿童中这两种病一直是流行感染,并且带来很大的花费。
最近,青霉素-抗性肺炎球菌的出现使得对有效预防肺炎球菌感染之策略的需要日趋迫切。据报道,在美国12个州的13家医院中,6.6%的肺炎球菌分离株对青霉素具有抗性,一些分离株也对其它抗生素,包括第三代环孢菌素具有抗性(Schappert,S.M.,国家疾病防治中心/健康状况统计中心的人口和健康状况统计数据,214:1(1992))。在某些医院,青霉素抗性的比例更高(达20%)(Breiman等,美国医学会志,271:1831(1994))。由于肺炎球菌的青霉素抗性是在青霉素保持较好疗效几十年之后的近期突然出现的,因此这些发现令人恐慌。
鉴于上述理由,必须致力于改良预防,控制,诊断或治疗肺炎球菌疾病的方法。
已采用多种方法提供预防肺炎球菌感染所用的疫苗。根据微生物周围的多糖荚膜结构可将其分为不同的血清型(至少90种),由此产生多个难题。针对单个血清型的疫苗对其它血清型无效,这意味着疫苗必须包括所有血清型的多糖抗原才能在大多数情况下有效。有人发现当荚膜多糖(各自决定着血清型,并且是主要的保护性抗原)被纯化并用作疫苗时,不能在两岁以下的儿童体内可靠地诱导保护性抗体应答,而该年龄组恰恰是侵害性肺炎球菌感染和脑膜炎的发病率最高的人群。
使用荚膜抗原方法的改良依靠多糖与蛋白质的缀合,从而特别地通过赋予应答依赖于T-细胞的特征而获得增强的免疫应答。该方法已被用于开发例如抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的疫苗。然而,有关多重多糖疫苗和基于缀合物的疫苗的花费仍是争论的焦点。
第三种方法是寻找其它具有成为候选疫苗之潜力的抗原组分,这构成了本发明的基础。使用特别开发的细菌表达***,我们已经能鉴定出一组肺炎球菌蛋白质抗原,所述抗原与细菌外膜相结合或者能被分泌。
因此,第一方面,本发明提供了肺炎链球菌的蛋白质或多肽,其具有选自表1所示的序列。
第二方面,本发明提供了肺炎链球菌的蛋白质或多肽,其具有选自表2所示的序列。
所提供的本发明的蛋白质或多肽可以是基本上纯的形式。例如,可以是基本上不含其它蛋白质的形式。
如本文所述,本发明的蛋白质和多肽可用作抗原物质。所述物质可以是“抗原性的”和/或“免疫原性的”。通常,“抗原性的”是指蛋白质或多肽能被用于产生抗体,或者实际上能在受试者体内诱导抗体应答。“免疫原性的”是指蛋白质或多肽能在受试者体内引发保护性免疫应答。因此,在后一种情况下,蛋白质或多肽不仅能产生抗体应答,还能产生不基于抗体的免疫应答。
本领域技术人员应懂得本发明蛋白质或多肽的同系物或衍生物也可用于本发明的上下文,即用作抗原性的/免疫原性的物质。因此,本发明还包括例如具有一个或多个添加,缺失,取代等的蛋白质或多肽。另外,可以用一种氨基酸取代另一种相似“类型”的氨基酸。例如,用一种疏水氨基酸取代另一种疏水氨基酸。
可以使用程序(如CLUSTAL程序)比较氨基酸序列。该程序可比较氨基酸序列,并通过适当时在任一序列中***间隔找到最佳序列对比。可以计算最佳序列对比的氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)。诸如BLASTx的程序会对比最长的一段相似序列并指定符合值。因此,可以得到比较结果,在其中可以发现几个相似性区域,它们各自具有不同的评分值。本发明希望进行这两种类型的同一性分析。
对同系物和衍生物而言,与本文所述蛋白质或多肽的同一性程度较不重要,重要的是同系物或衍生物应该保持原始蛋白质或多肽的抗原性或免疫原性。然而,提供与本文所述蛋白质或多肽具有至少60%相似性的同系物或衍生物(如上文所讨论)较为合适,优选提供具有至少70%相似性的同系物或衍生物,更优选提供具有至少80%相似性的同系物或衍生物,最优选提供具有至少90%或甚至95%相似性的同系物或衍生物。
在另一种方法中,同系物或衍生物可以是融合蛋白,其中掺入的组成成分通过例如有效地标记所需蛋白质或多肽而使纯化变得更容易。必需除去“标记物”,或者,事实上融合蛋白自身应该保留足够的抗原性以使其有用。
在本发明的另一方面,提供了本发明蛋白质或多肽,或其同系物或衍生物的抗原性/免疫原性片段。
就本文所述蛋白质或多肽,或其同系物或衍生物的片段而言,情况略有不同。众所周知,可以筛选抗原蛋白质或多肽以鉴定表位区域,即负责蛋白质或多肽的抗原性或免疫原性的区域。进行这种筛选的方法是本领域众所周知的,因此,本发明的片段应该包括一个或多个所述表位区域,或者与所述区域足够相似以保留其抗原性/免疫原性。因此,对于本发明的片段而言,同一性程度可能是不相关的,因为它们可以与本文所述的蛋白质或多肽,同系物或衍生物的特定部分100%相同。同样,主要的问题是片段必须保留抗原性/免疫原性。
因此,对于由蛋白质或多肽衍生得到的同系物,衍生物和片段而言,重要的是它们应具有其所衍生自的所述蛋白质或多肽的至少部分抗原性/免疫原性。
可使用基因克隆技术提供基本上纯的本发明蛋白质。所述技术公开于例如Sambrook等,分子克隆,第2版,冷泉港实验室出版社(1989)。
因此,第三方面,本发明提供了核酸分子,其含有下列序列或由下列序列组成:
(ⅰ)表1所示的任何DNA序列或其RNA等同物;
(ⅱ)与(ⅰ)中的任一序列互补的序列;
(ⅲ)与(ⅰ)或(ⅱ)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列;
(ⅳ)与(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列;
(ⅴ)编码表1所限定蛋白质的同系物,衍生物或片段的序列。
第四方面,本发明提供了核酸分子,其含有下列序列或由下列序列组成:
(ⅰ)表2所示的任何DNA序列或其RNA等同物;
(ⅱ)与(ⅰ)中的任一序列互补的序列;
(ⅲ)与(ⅰ)或(ⅱ)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列;
(ⅳ)与(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列;
(ⅴ)编码表2所限定蛋白质的同系物,衍生物或片段的序列。
本发明的核酸分子包括多个这种序列和/或片段。本领域技术人员应懂得本发明包括本文所例举的新的特定核酸分子的新变体。本发明包括这种变体。所述变体可以是天然变体,例如由于菌株变异而产生的变体。例如,包括添加,取代和/或缺失。另外,特别是当使用微生物表达***时,人们希望通过利用表达所用特定生物体中已知的偏好使用的密码子来改造核酸序列。因此,本发明的范围内也包括合成的或非-天然的变体。
上文所用术语“RNA等同物”表示给定的RNA分子具有的序列与给定DNA分子的序列互补(允许在RNA遗传密码中用“U”替代“T”)。
当比较核酸序列以测定同源性或同一性程度时,可以使用例如BESTFIT和GAP(皆得自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)软件包)BESTFIT程序比较两个序列,产生最相似区段的最佳序列对比。GAP能使序列沿着其全长进行对比,并通过适当时在任一序列中***间隔找到最佳序列对比。在本发明的上下文中,当讨论核酸序列的同一性时,适于通过沿着全长序列进行序列对比来比较序列。
优选基本上相同的序列与所述序列具有至少50%的序列同一性,更优选具有至少75%的序列同一性,更优选具有至少90%或至少95%的序列同一性。在某些情况下,序列同一性可以是99%或以上。
优选地,术语“基本上相同”表示:相对于所述序列与现有技术的核酸序列的同一性程度而言,所述序列与本文所述任一序列的同一性程度更高。
然而,应该指出当本发明的核酸序列编码至少部分新基因产物时,本发明范围内包括编码基因产物或其新的部分的所有可能的序列。
核酸分子可以是分离的形式或重组的形式。可以将其掺入载体,载体可被掺入宿主。所述载体和适当的宿主构成本发明的另一方面。
因此,例如,通过使用基于本文所提供的核酸序列的探针,可以鉴定肺炎链球菌的基因。使用限制性酶可以切下这些基因,将其克隆至载体,再将载体导入适当宿主以进行表达。
通过使用与核酸分子的部分序列互补的适当探针,可以从肺炎链球菌中得到本发明的核酸分子。可使用限制性酶或超声处理技术得到适当大小的片段以用作探针。
或者,可使用PCR技术扩增所需的核酸序列。因此,可使用本文提供的序列资料设计两个引物用于PCR,从而使包括完整基因或其片段的所需序列被靶向,随即被高水平地扩增。
引物一般至少为15至25个核苷酸长。
另一种方法是使用化学合成,该方法可以实行自动化。可以化学合成相对较短的序列,再相互连接形成较长的序列。
使用本文所述的细菌表达***已鉴定出另一组得自肺炎链球菌的蛋白质。它们是肺炎链球菌的已知蛋白质,但以前无人将它们鉴定为抗原蛋白质。该组蛋白质的氨基酸序列以及编码它们的DNA序列示于表3。这些蛋白质或其同系物,衍生物和/或片段也可用作抗原/免疫原。因此,另一方面,本发明提供了具有选自表1-3所示序列之序列的蛋白质或多肽或其同系物,衍生物和/或片段作为免疫原/抗原的用途。
另一方面,本发明提供了免疫原性/抗原性的组合物,该组合物含有一种或多种具有选自表1-3所示序列之序列的蛋白质或多肽或其同系物或衍生物,和/或它们中的任一个的片段。在优选的实施方案中,免疫原性/抗原性的组合物是疫苗,或者可用于诊断试验。
就疫苗而言,它可包括适当添加的赋形剂,稀释剂,佐剂等。多个具体实例是本领域众所周知的。
也可以使用表1-3所示的核酸序列制备所谓的DNA疫苗。因此,本发明也提供了含有一种或多种本文所定义的核酸序列的疫苗组合物。本领域中已有人描述过DNA疫苗(例见Donnelly等,免疫学年评,15:617-648(1997)),熟练技术人员可使用本领域所述技术生产和使用本发明的DNA疫苗。
如上所述,在检测/诊断肺炎链球菌的方法中,可以使用本文所述的蛋白质或多肽,其同系物或衍生物,和/或它们中的任一个的片段。检测受试者体内存在的抗所述蛋白质的抗体,以此为基础建立上述方法。因此,本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法,所述方法包括使受试样品与至少一种本文所述的蛋白质或其同系物,衍生物或片段接触的步骤。优选样品为生物样品,如得自待测受试者的组织样品或血样或唾液。
在另一种方法中,可使用本文所述的蛋白质,或其同系物,衍生物和/或片段产生抗体,反过来,所述抗体可用于检测抗原,因而可检测肺炎链球菌。所述抗体构成本发明的另一方面。本发明范围内的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
当将本文所述的蛋白质,或其同系物,衍生物或片段注射至适当动物宿主(如小鼠,大鼠,豚鼠,兔,绵羊,山羊或猴)体内时,通过刺激抗体生成即可使动物产生多克隆抗体。必要时,可同时使用佐剂和蛋白质。众所周知的佐剂包括弗氏佐剂(完全和不完全佐剂)和氢氧化铝。然后,利用抗体与本文所述蛋白质的结合即可纯化抗体。
单克隆抗体可由杂交瘤产生。通过融合骨髓瘤细胞和产生所需抗体的脾细胞以形成无限增殖的细胞系即可形成杂交瘤。因此,可使用众所周知的Kohler&Milstein技术(自然,256(1975))或在此技术的基础上进行改动的技术。
目前,生产与特定多肽/蛋白质结合的单克隆和多克隆抗体的技术已是本领域的成熟技术。有关讨论可参见标准的免疫学课本,例如Roitt等,免疫学,第2版(1989),Churchill Livingstone,伦敦。
除了完整的抗体外,本发明还包括该抗体的衍生物,所述衍生物能与如本文所述的蛋白质等结合。因此,本发明包括抗体片段和合成构建体。抗体片段和合成构建体的例子可参见Dougall等,Tibtech 12372-379(1994年9月)。
抗体片段包括例如Fab,F(ab’)2和Fv片段。Fab片段(这些片段在Roitt等[文献同上]中讨论)。可修饰Fv片段以产生已知为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。该分子包括与Vh和Vl区共价连接的肽接头,它对分子的稳定性有所贡献。可以使用的其它合成构建体包括CDR肽,它们是含有抗原-结合决定簇的合成肽。也可使用模拟肽,这些分子通常是构象受限的有机环,它能模拟CDR环的结构,并包括能与抗原相互作用的侧链。
合成构建体包括嵌合分子。因此,例如,本发明范围内还包括人源化(或灵长动物化)抗体或其衍生物。人源化抗体的例子是具有人构架区和啮齿动物高变区的抗体。产生嵌合抗体的方法可参见例如Morrison等,PNAS,81,6851-6855(1984)和Takeda等,自然,314,452-454(1985)。
合成构建体还包括含有其它组成成分的分子,所述其它成分可为分子提供一些除抗原结合特性之外的所需特性。例如,所述组成成分可以是标记物(例如荧光或放射性标记)。或者,也可以是药物活性剂。
抗体或其衍生物可用于检测/诊断肺炎链球菌。因此,另一方面,本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法,所述方法包括使受试样品与抗体接触的步骤,所述抗体能结合一种或多种本文所述的蛋白质,或其同系物,衍生物和/或片段。
另外,可使用所谓的“亲和体”。这些亲和体是选自α-螺旋细菌受体结构域之组合文库的结合蛋白(Nord等)。因此,可使用组合文库法选择能与不同靶蛋白质特异性结合的小蛋白质结构域。
显然,可使用本文所述的核酸序列检测/诊断肺炎链球菌。因此,另一方面,本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法,所述方法包括使受试样品与至少一种本文所述的核酸序列接触。优选样品为生物样品,如得自待测受试者的组织样品或血样或唾液。在用于本发明的方法之前,可对样品进行预处理。因此,例如,可处理样品以提取DNA。然后可使用基于本文所述核酸序列(通常为该序列的片段)的DNA探针检测肺炎链球菌的核酸。
在其它方面,本发明提供了:
(a)免疫接种受试者以防肺炎链球菌的方法,所述方法包括给受试者施用本发明的蛋白质或多肽,或其衍生物,同系物或片段,或本发明的免疫原性组合物的步骤;
(b)免疫接种受试者以防肺炎链球菌的方法,所述方法包括给受试者施用本文所定义的核酸分子的步骤;
(c)预防或治疗肺炎链球菌感染的方法,所述方法包括给受试者施用本发明的蛋白质或多肽,或其衍生物,同系物或片段,或本发明的免疫原性组合物的步骤;
(d)预防或治疗肺炎链球菌感染的方法,所述方法包括给受试者施用本文所定义的核酸分子的步骤;
(e)用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒,其包括一种或多种本发明的蛋白质或多肽,或其同系物,衍生物或片段,或本发明的抗原性组合物;和
(f)用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒,其包括一种或多种本文所定义的核酸分子。
即使我们已鉴定出一组重要的蛋白质,所述蛋白质是抗微生物疗法的潜在靶标。然而仍必需测定每个蛋白质是否是微生物存活所必需的。因此,本发明也提供了测定本文所述蛋白质或多肽是否为潜在的抗微生物靶标的方法,所述方法包括拮抗,抑制或要不然干扰所述蛋白质的功能或表达,并测定肺炎链球菌是否仍旧存活。
灭活蛋白质的适当方法是实行选定的基因敲除,即阻止蛋白质的表达并测定是否会导致致死性改变。进行所述基敲除的适当方法描述于Li等,美国国家科学院院报(P.N.A.S.),94:13251-13256(1997)和Kolkman等,178:3736-3741(1996)。
最后一方面,本发明提供了能拮抗,抑制或要不然干扰本发明蛋白质或多肽的功能或表达的药剂用于制备药物的用途,所述药物可用于治疗或预防肺炎链球菌感染。
如上所述,我们已使用细菌表达***作为鉴定蛋白质的工具,所述蛋白质是与表面相结合的,被分泌或输出的蛋白质,因此可用作抗原。
已深入研究了细菌中分泌/输出蛋白质所必需的遗传信息。在大多数情况下,蛋白质输出需要前体蛋白的N-末端存在信号肽,以将其导向质膜上的转运机器。转运当中或转运之后,通过与膜结合的信号肽酶除去信号肽。最后,通过序列而不是前导肽本身来确定蛋白质的定位(即蛋白质是被分泌,还是膜内在蛋白质或是结合至细胞壁上)。
我们对位于表面或被输出的蛋白质特别感兴趣,因为它们可能是抗原,可以用于疫苗,用作诊断试剂或用新的化合物分子进行治疗的靶。因此,我们在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中研究出一种筛选载体-***,使用该***可鉴定和分离编码输出蛋白质的基因。下文将提供代表性的例子,显示如何鉴定和表征得自肺炎链球菌的给定的新的表面结合蛋白质。筛选载体掺入缺乏其自身输出信号的葡萄球菌核酶基因nuc作为分泌报道基因。葡萄球菌核酶是天然分泌的热-稳定性单体酶,它可以在***中被有效表达和分泌(Shortle,基因,22:181-189(1983);Kovacevic等,细菌学杂志,162:521-528(1985);Miller等,细菌学杂志,169:3508-3514(1987);Liebl等,细菌学杂志,174:1854-1861(1992);LeLoir等,细菌学杂志,176:5135-5139(1994);Poquet等,细菌学杂志,180:1904-1912(1998))。
最近,Poquet等((1998),文献同上)描述了一种筛选载体,其掺入缺乏其自身前导信号的nuc基因作为报道基因,以鉴定***中的输出蛋白质,该载体已应用于乳酸乳球菌。除了含有促进大肠杆菌和某些其它革兰氏阴性细菌中的复制的ColE1复制子外,该载体(pFUN)还含有在宽宿主范围的***中起作用的pAMβ1复制子。可使用载体中存在的唯一克隆位点产生转录和翻译融合物,所述融合物是在克隆的基因组DNA片段和不含其自身信号分泌前导序列的截短nuc基因的开放阅读框之间产生的。nuc基因是理想的报道基因,因为使用简单而敏感的平板试验即可容易地检测到核酶的分泌:分泌核酶的重组菌落产生粉色晕圈,而对照菌落仍为白色(Shortle,1983,文献同上;Le Loir等,1994,文献同上)。
因此,以下将参照代表性的实施例描述本发明,这些实施例将详细描述本文所述的蛋白质,多肽和核酸序列是如何被鉴定为抗原靶的。
在本文中,我们描述了3个报道载体的构建,以及它们在乳酸乳球菌中用于鉴定和分离编码分泌的或表面结合蛋白质的肺炎链球菌基因组DNA片段的用途。
以下将参照实施例描述本发明,不应将实施例看成是以任何方式限制本发明。实施例中参照的附图为:
图1:显示出大量DNA疫苗试验的结果;和
图2:显示出另一些DNA疫苗试验的结果。
实施例1(ⅰ)构建pTREP1-nuc系列报道基因载体(a)构建表达质粒pTREP1
pTREP1质粒是高-拷贝数(每个细胞40-80拷贝)的θ-复制革兰氏阳性质粒,它是pTREX质粒的衍生物,而pTREX质粒本身是以前公开的pIL253质粒的衍生物。pIL253掺入了宽革兰氏阳性宿主范围的pAMβ1复制子(Simon和Chopin,Biochimie,70:559-567(1988)),不能靠乳酸乳球菌的性因子进行转移。pIL253也缺乏tra功能,所述功能是通过接合亲代质粒(例如pIL501)进行转移或有效移动所必需的。肠球菌pAMβ1复制子以前曾被转移至多个种内,包括链球菌属(Streptococcus),乳杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)的种以及丙酮丁醇梭菌(Clostridium acteobutylicum)(Oultram和Klaenhammer,FEMS微生物学通讯,27:129-134(1985);Gibson等,(1979);LeBlanc等,美国国家科学院院报,75:3484-3487(1978)),显示出潜在宽宿主范围的实用性。pTREP1质粒为组成型转录载体。
按下述方法构建pTREX载体。通过退火2个互补的寡核苷酸并用Tfl DNA聚合酶延伸,可产生这样的人工DNA片段,所述片段含有推定的RNA稳定化序列,翻译起始区(TIR),用于***靶基因的多克隆位点和转录终止序列。有义和反义寡核苷酸在其5’末端分别含有NheⅠ和BamHⅠ的识别位点以便于克隆。将该片段克隆至pUC19NT7的XbaⅠ和BamHⅠ位点之间,pUC19NT7是pUC19的衍生物,它含有得自pLET1的T7表达盒(Wells等,应用细菌学杂志,74:629-636(1993)),该表达盒被克隆于EcoRⅠ和HindⅢ位点之间。所得构建体被称为pUCLEX。通过用HindⅢ切割,使其成为平端,再用EcoRⅠ切割以除去pUCLEX的整个表达盒,然后克隆至pIL253的EcoRⅠ和SacⅠ(平端)位点,产生载体pTREX(Wells和Schofield,代谢,遗传学和应用最新进展-NATO ASISeries,H 98:37-62(1996))。推定的RNA稳定化序列和TIR得自大肠杆菌T7噬菌体序列,并在一个核苷酸位置上被修饰以增强Shine Dalgarno(SD)基元与乳酸乳球菌核糖体16s RNA的互补性(Schofield等私人通信,剑桥大学病理学系)。
将表现出启动子活性(随后称之为P7)的乳酸乳球菌MG1363染色体DNA片段克隆至表达盒中存在的EcoRⅠ和BglⅡ位点之间,产生pTREX7。以前,曾使用启动子探测载体pSB292(Waterfield等,基因,165:9-15(1995))分离出该活性启动子区域。根据厂商的说明,使用VentDNA聚合酶,经PCR扩增启动子片段。
然后按下述构建pTREP1载体。通过退火2个重叠的部分互补的合成寡核苷酸,并根据厂商说明用测序酶进行延伸即可产生这样的人工DNA片段,该片段含有转录终止序列,正向pUC测序引物,启动子多克隆位点区域和通用的翻译终止序列。有义和反义(pTREPF和pTREPR)寡核苷酸在其5’末端分别含有EcoRV和BamHⅠ的识别位点以便于克隆至pTREX7。转录终止序列源自芽孢杆菌青霉素酶基因,已证实它在乳球菌属中同样有效(Jos等,应用和环境微生物学,50:540-542(1985))。据认为该序列是必需的,因为经观察靶基因在pTREX载体中的表达有缺陷,有人认为这是起始区隐蔽的启动子活性所致(Schofield等,私人通信,剑桥大学病理学系)。包括正向pUC引物测序可以直接测定克隆DNA片段的序列。包括编码3个不同构架中的终止密码子的翻译终止序列可以防止载体基因和克隆DNA片段之间产生翻译融合物。首先,用EcoRⅠ消化pTREX7载体,根据厂商说明,使用T4 DNA聚合酶(NEB)的5’-3’聚合酶活性使其成为平端。然后用BglⅡ消化经EcoRⅠ消化并平端化的pTREX7载体,以除去P7启动子。用EcoRV和BamHⅠ消化由退火的合成寡核苷酸衍生的人工DNA片段,克隆至经EcoRⅠ(平端)-BglⅡ消化的pTREX7载体,产生pTREP。然后将被称为P1的乳酸乳球菌MG1363染色体启动子克隆至pTREP表达盒中存在的EcoRⅠ和BglⅡ位点之间,形成pTREP1。使用启动子探测载体pSB292分离该启动子,并通过Waterfield等(1995),文献同上进行鉴定。起初,根据厂商说明,使用VentDNA聚合酶经PCR扩增P1启动子片段,并且作为EcoRⅠ-BglⅡ DNA片段被克隆至pTREX。通过限制性酶消化从pTREX1中除去含有EcoRⅠ-BglⅡ P1启动子的片段,并用于克隆至pTREP(Schofield等,私人通信,剑桥大学病理学系)。(b)PCR扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)nuc基因
使用金黄色葡萄球菌nuc基因的核苷酸序列(EMBL数据库登记号为V01281)设计PCR扩增所用的合成寡核苷酸引物。设计引物以扩增nuc基因的成熟形式(被称为nucA),通过用蛋白酶裂解分泌型前肽(被称为Snase B)N-末端的19至21个氨基酸即可产生nucA(Shortle,(1983),文献同上)。设计3个有义引物(nucS1,nucS2和nucS3,附录Ⅰ),每个引物在与nuc基因不同的读码框中具有平端限制性内切核酸酶裂解位点EcoRV或SmaⅠ。另外,分别在有义和反义引物的5’末端掺入BglⅡ和BamHⅠ以便克隆至经BamHⅠ和BglⅡ切割的pTREP1。所有引物的序列示于附录Ⅰ。联合使用各个有义引物和上述反义引物,经PCR扩增3个编码核酶基因成熟形式(NucA)的nuc基因DNA片段。使用金黄色葡萄球菌基因组DNA模板,Vent DNA聚合酶(NEB)和厂商推荐的条件,经PCR扩增nuc基因片段。起初于93℃变性2分钟,接着以93℃变性45秒,50℃退火45秒和73℃延伸1分钟循环30次,最后于73℃延伸5分钟。使用Wizard清洗柱(Promega)纯化PCR扩增产物以除去未掺入的核苷酸和引物。(c)构建pTREP1-nuc载体
使用标准条件,用BglⅡ和BamHⅠ消化b部分中所述的纯化的nuc基因片段,连接至经BamHⅠ和BglⅡ切割并去磷酸化的pTREP1,产生pTREP1-nuc1,pTREP1-nuc2和pTREP1-nuc3系列的报道基因载体。使用由厂商提供的试剂和缓冲液或使用标准条件进行普通的分子生物学技术(Sambrook和Maniatis,(1989),文献同上)。在各个pTREP1-nuc载体中,表达盒含有转录终止序列,乳球菌启动子P1,唯一的克隆位点(BglⅡ,EcoRV或SmaⅠ),接着是成熟形式的nuc基因和第二个转录终止序列。应注意:在此构建体中故意将nuc基因的翻译和分泌所需序列排除在外。这类元件只有通过经适当消化的外源DNA片段(相当于靶细菌)来提供,所述片段可被克隆至紧接nuc基因上游的唯一限制性位点。
在拥有启动子方面,pTREP1-nuc载体与Poquet等,(1998),文献同上所述的pFUN载体不同,pFUN载体可用于通过直接在乳酸乳球菌中直接筛选Nuc活性来鉴定乳酸乳球菌的输出蛋白质。由于pFUN载体在nuc开放阅读框的上游不含有启动子,因此,除了提供Nuc的翻译起始和分泌所需的那些元件外,克隆基因组DNA片段还必须提供转录信号。这一限制可防止分离与启动子远离的基因,例如多顺反子操纵子内的基因。此外,无法保证得自其它种细菌的启动子能被乳酸乳球菌识别并在其中起作用。某些启动子处于天然宿主而不是乳酸乳球菌的严格调控之下。相反,pTREP1-nuc系列载体中P1启动子的存在能确保无启动子的DNA片段(或含有在乳酸乳球菌中无活性的启动子序列的DNA片段)仍能被转录。(d)筛选肺炎链球苗中的分泌型蛋白质
用限制性酶Tru9Ⅰ消化分离自肺炎链球菌的基因组DNA。之所以使用识别序列5’-TTAA-3’的此酶是因为它能有效切割富含A/T的基因组,并能产生优选大小范围(通常平均为0.5-1.0kb)内的随机基因组DNA片段。之所以优选此大小范围是因为此时P1启动子用于转录新基因序列的可能性更大。然而,在所有的情况下P1启动子不都是必需的,因为很多链球菌的启动子可以在乳酸乳球菌中被识别。从肺炎链球菌基因组DNA的部分Tru9Ⅰ消化物中纯化不同大小范围的DNA片段。由于Tru9Ⅰ限制性酶产生了交错的末端,因此不得不先使DNA片段成为平端,然后再与经EcoRV或SmaⅠ切割的pTREP1-nuc载体连接。通过使用Klenow酶的5’-3’聚合酶活性进行部分补平酶反应即可实现此目的。简单地说,将经Tru9Ⅰ消化的DNA溶解于添加有T4 DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs;NEB)(1X)和33μM各种所需dNTP(此处为dATP和dTTP)的溶液中(总体积通常为10-20μl)。加入Klenow酶(每μg DNA加1个单位Klenow酶(NEB)),25℃保温反应15分钟。通过于75℃保温混合物20分钟以终止反应。然后加入经EcoRV或SmaⅠ消化的pTREP-nuc质粒DNA(通常为200-400ng)。再在混合物中添加400个单位的T4 DNA连接酶(NEB)和T4 DNA连接酶缓冲液(1X),于16℃保温过夜。直接在100%乙醇和1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)中沉淀连接混合物,并用于转化乳酸乳球菌MG1363(Gasson,1983)。或者,pTREP-nuc载体的基因克隆位点也含有BglⅡ位点,该位点可用于克隆例如经Sau3AⅠ消化的基因组DNA片段。
在脑心浸制琼脂上培养乳酸乳球菌的转化子菌落,基本上按Shortle,1983,文献同上和Le Loir等,1994,文献同上所述,通过甲苯胺蓝-DNA-琼脂覆层(0.05M Tris pH9.0,10g琼脂/l,10g NaCl/l,0.1mM CaCl2,0.03%wt/vol鲑精DNA和90mg甲苯胺蓝O染料)检测分泌核酶(Nuc+)的克隆。然后将平板置于37℃保温2小时,分泌核酶的克隆显示出容易鉴别的粉色晕圈。从Nuc+重组乳酸乳球菌克隆中分离质粒DNA,使用附录Ⅰ中所述的NucSeq测序引物测定DNA***片段一条链的序列,所述引物的序列直接穿过DNA***片段。从肺炎链球菌中分离编码输出蛋白质的基因
使用核酶筛选***已鉴定出大量据推测可编码肺炎链球菌的输出蛋白质的基因序列。以下将进一步对其进行分析以除去人为假象。使用大量参数分析用筛选***鉴定出的序列。
1.使用软件程序Sequencher(Gene Codes公司)和DNA Strider(Marck,核酸研究,16:1829-1836(1988))分析所有推定的表面蛋白质的前导/信号肽序列。细菌信号肽序列享有共同的设计,其特征在于短的带正电N-末端(N区域)后面紧接着一段疏水残基(中央部分-h区域),接着是含有裂解位点且更具极性的C-末端部分(c-区域)。可以使用能绘制出推定蛋白质的亲水性分布图,并能容易地鉴定前导肽序列代表性的非常与众不同的疏水部分(h-区域)的计算机软件。另外,需检查序列中是否存在潜在的核糖体结合位点(Shine-Dalgarno基元),该位点是推定的nuc报道基因融合蛋白的翻译起始所必需的。
2.使用公开的数据库[包括SwissProt和GenBank翻译的OWL-proteins]将所有推定的表面蛋白质序列与所有蛋白质/DNA序列相匹配。这样即可鉴定与已知基因或具有一些功能的基因同系物相似的序列。由此可推测使用LEEP***鉴定出的一些基因的功能,并且可以毫无疑义地确定该***可用于鉴定和分离表面结合蛋白质的基因序列。我们应该也能证实这些蛋白质实际上就是表面结合蛋白质而不是人为假象。LEEP***已被用于鉴定疫苗和治疗所用的新的基因靶。
3.一些基因已被鉴定的蛋白质不具有典型的前导肽序列,与数据库中的任何DNA/蛋白质序列也不具有同源性。实际上,这些蛋白质能显示出本发明筛选方法的主要优点,即分离不典型的表面相关蛋白质,而在所有前述筛选方法或基于序列同源性检索的方法中,却无法做到这一点。
在所有情况下,起初只得到部分基因序列。在所有情况下,参照TIGR肺炎链球菌数据库([email protected])可得到全长基因。因此,通过使起初得到的部分序列与数据库相匹配,即可鉴定出全长基因序列。如本文所述,通过这种方法清楚地鉴定出3组基因,即一组编码以前未曾鉴定的肺炎链球菌蛋白质的基因,另一组编码与得自多种来源的已知蛋白质表现出一些同源性的蛋白质的基因,第三组编码已知的但不是已知抗原的肺炎链球菌蛋白质的基因。
实施例2:疫苗试验pcDNA3.1+用作DNA疫苗载体pcDNA3.1+
被选择用作DNA疫苗载体的载体是pcDNA3.1(Invitrogen)(实际上是pcDNA3.1+,在所有情况下都使用正向载体,但本文都称之为pcDNA3.1)。在文献中,该载体已被广泛并成功地用作宿主载体以检测疫苗候选基因引发针对病原体保护作用的情况(Zhang等,Kurar和Splitter,Anderson等)。该载体被设计成能在哺乳动物细胞中进行高水平稳定和非-复制的瞬时表达。pcDNA3.1含有ColE1复制起点,以便在大肠杆菌中进行高拷贝数复制和生长。反过来也可以快速而有效地克隆和检测很多基因。pcDNA3.1载体具有大量克隆位点,也含有有助于克隆选择的氨苄青霉素抗性编码基因,和能有效地高水平表达重组蛋白质的人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子。在包括肌细胞和免疫(抗原呈递)细胞的多种细胞类型中,CMV启动子是强病毒启动子。这对于最佳免疫应答而言至关重要,因为目前仍不清楚何种细胞类型对于在体内产生保护性应答最重要。多克隆位点上游的T7启动子能使所需的经修饰***物有效表达,并能在体外在有义方向上转录克隆基因。
Zhang,D.,Yang,X.,Berry,J.Shen,C.,McClarty,G和Brunham,R.C.(1997),“用主要外膜蛋白基因进行DNA免疫能诱导针对沙眼衣原体(小鼠肺炎)感染的获得性免疫力”,感染和免疫,176,1035-40。
Kurar,E和Splitter,G.A(1997),“流产布鲁氏菌核糖体L7/L12基因的核酸免疫引发免疫应答”,疫苗,15,1851-57。
Ander,R.,Gao,X.M.,Papakonstantinopoulou,A.,Roberts,M和Dougan,G(1996),“用编码破伤风毒素C片段的DNA免疫小鼠之后的免疫应答”,感染和免疫,64,3168-3173。制备DNA疫苗
为使用LEEP***得到的各个所需基因设计寡核苷酸引物。彻底检查各个基因,如果可能的话,应设计引物使其靶向据认为仅编码基因蛋白质的成熟部分的基因部分。我们希望当在哺乳动物细胞中表达时,表达仅编码靶基因蛋白质的成熟部分的那些序列会有利于蛋白质的正确折叠。例如,在大多数情况下,设计引物以。使克隆至pcDNA3.1表达载体的最终扩增产物不含推定的N-末端信号肽序列。信号肽将多肽前体经由蛋白质输出途径导向细胞膜,在此一般通过信号肽酶Ⅰ(如果是脂蛋白,即为信号肽酶Ⅱ)切下信号肽。因此,无论是呈现在细菌表面还是被分泌,信号肽都不构成成熟蛋白质的任一部分。当N-末端前导肽序列不是立即显而易见时,应设计引物以靶向整个基因序列以在pcDNA3.1中克隆并最终进行表达。
然而,已经说过蛋白质的其它特征也能影响可溶性蛋白质的表达和呈递。在设计寡核苷酸的过程中,应在编码所需蛋白质的基因中排除编码这些特征的DNA序列。这些特征包括:
1.LPXTG细胞壁锚着基元。
2.LXXC脂蛋白结合位点。
3.疏水性的C-末端结构域。
4.当不存在N-末端信号肽或LXXC时,应除去终止密码子。
5.当不存在疏水性C-末端结构域或LPXTG基元时,应除去终止密码子。
为感兴趣的各个基因设计适当的PCR引物,当设计这些引物时,应从基因中除去编码上述特征的任何和所有区域。引物被设计成具有适当的限制性酶位点,其后紧接着保守的Kozak核苷酸序列(在大多数情况下(注意,除了在极少数情况下,例如ID59)使用的是GCCACC。Kozak序列有利于真核核糖体识别起始序列)和位于所需基因***物上游的ATG起始密码子。例如,使用BamHⅠ位点的正向引物以GCGGGATCCGCCACCATG起始,后面接着所需基因5’末端的一小段序列。设计反向引物以与正向引物相容,并在大多数情况下与5’末端的NotⅠ限制性位点(该位点是TTGCGGCCGC)相容(注意,除了在极少数情况下,例如ID59,用XhoⅠ位点替代NotⅠ)。PCR引物
下列PCR引物被设计用于扩增所需的截短基因。ID5
正向引物5′CGGATCCGCCACCATGGGTCTAATTGAAGACTTAAAAAATCAA 3′
反向引物5′TTGCGGCCGCCAATGCTAGACTAAACACAAGACTCA 3′ID59
正向引物5′CGCGGATCCATGAAAAAAATCTATTCATTTTTAGCA 3′
反向引物5′CCCTCGAGGGCTACTTCCGATACATTTTAAACTGTAGG3′
ID51
正向引物5′CGGATCCGCCACCATGAGTCATGTCGCTGCAAATG 3′
反向引物5′TTGCGGCCGCATACCAAACGCTGACATCTACG 3′
ID29
正向引物5′CGGATCCGCCACCATGCAAAAAGAGCGGTATGGTTATG3′
反向引物5′TTGCGGCCGCACCCCCATTCTTAATCCCTT 3′
ID50
正向引物5′
CGGATCCGCCACCATGGAGGTATGTGAAATGTCACGTAAA 3′
反向引物5′TTGCGGCCGCTTTTACAAAGTCAAGCAAAGCC 3′克隆
从得自国家典型培养物保藏中心的4型肺炎链球菌菌株11886中分离基因组DNA,以此为模板经PCR扩增***物以及具有上述特征的侧翼序列。用适当限制性酶切割PCR产物,使用常规分子生物学技术将其克隆至pcDNA3.1的多克隆位点。培养经适当作图的所需基因克隆,使用Plasmid Mega试剂盒(Qiagen)大规模分离质粒(>1.5mg)。通过对各个构建体的每个大规模制品的5’克隆接头的约700个碱基对进行限制性图谱分析和测序,进一步证实基因的成功克隆和维持。菌株证实
在克隆和攻击的方法中使用4型菌株,该菌株的肺炎链球菌基因组已被测序。4型肺炎链球菌菌株11886的均质实验室菌株冻干安瓿得自国家典型菌种保藏中心。打开安瓿,用0.5ml胰胨豆胨肉汤(0.5%葡萄糖,5%血液)重新悬浮培养物。在10ml胰胨豆胨肉汤(0.5%葡萄糖,5%血液)中传代培养悬浮液,于37℃静止保温过夜。在5%血液琼脂平板上划线此培养物以检查污染物并证实存活,在血液琼脂斜面上划线,使用其余培养物制备20%甘油原种。将斜面培养物送至公共卫生实验中心,经证实血清型为4型。
在5%血液琼脂平板上划线NCTC11886的甘油原种,于37℃在CO2气罐中保温过夜。制备新鲜的划线培养物并证实奥普托欣敏感性。肺炎球菌攻击
经小鼠传代肺炎球菌培养物1次,从感染动物的血液中收集肺炎球菌,在肉汤中培养至预定的活菌数约为109cfu/ml,然后冷冻,从而制备出4型肺炎链球菌的标准接种冷冻培养物。制备的流程图如下:
划线肺炎球菌培养物并证实其身份
                   ↓
在上述平板上培养4-5个菌落的过夜培养物
                   ↓
用动物传代肺炎球菌培养物(腹膜内注射心取血收集)
                     ↓
培养经动物传代的肺炎球菌的过夜培养物
                     ↓
由经动物传代的过夜培养物培养全天培养物(至预定的光
密度)并于-70℃冷冻-这是标准的极限
                     ↓
融化一等份标准的接种物以进行存活计数
                     ↓
使用标准接种物以测定有效剂量(称之为毒力检测试验)
                     ↓
使用有效剂量的标准接种物进行随后所有的攻击
用PBS将一等份标准的接种物稀释500倍,并用于接种小鼠。
使用卤代烷轻度麻醉小鼠,然后将剂量为1.4×105cfu的肺炎球菌施用于每个小鼠的鼻腔,小鼠的正常呼吸将有利于摄入肺炎球菌,让小鼠背朝下躺着等待恢复。肺炎链球菌疫苗试验
通过给6周龄的CBA/ca小鼠(Harlan,UK)施用DNA而在小鼠中进行疫苗试验。将待免疫接种的小鼠分成6组,每组用重组pcDNA3.1+质粒DNA进行免疫接种,所述质粒DNA中含有所需的特定靶基因序列。将总共100μg溶于Dulbecco PBS(Sigma)中的DNA肌内注射至两腿的前胫骨肌(每条腿50μl)。4周后使用相同的方法进行加强免疫。为了进行比较,在所有疫苗试验中都包括对照组。这些对照组或者是未经免疫的动物,或者是按与上述相同的时间进程仅施用了非重组pcDNA3.1+DNA(假免疫)的动物。第二次免疫接种3周后,用致死剂量的肺炎链球菌血清型4(菌株NCTC11886)鼻内攻击所有小鼠组。通过在5%血液琼脂平板上平铺接种经连续稀释的接种物来监测所施用细菌的数目。鼻内免疫接种的问题是:在一些小鼠中,接种物从鼻孔中象吹泡似地冒出来,在结果表中已注意到这个问题,并且在计算时已将此问题考虑在内。较不明显的问题是每只小鼠可能吞下了一部分接种物。假定对每只小鼠而言,被吞下去的量是相同的,在接种过程中将达到平均。然而,所使用的样品较少,这一问题将对一些实验产生显著影响。在注射后3或4天,杀死攻击后仍存活的所有小鼠。在感染过程中,监测被攻击的小鼠中与肺炎链球菌诱导-疾病的发作相关的症状发展情况。典型的症状依次包括立毛,逐渐增加的***体态,眼里流出***物,嗜睡和不愿动。后期的症状通常与濒死状态的产生一致,剔除濒死状态的小鼠以使它们不再遭受痛苦。据认为这些小鼠濒临死亡,使用剔除时间确定存活时间用以进行统计学分析。当发现小鼠死亡时,存活时间被当成是经监测认为小鼠仍旧活着的最后的时间点。结果的解释
如果被克隆并用于上述攻击实验的任何DNA序列能产生对抗攻击的保护作用,即为阳性结果。能产生统计学上显著的保护作用(置信水平为95%(p<0.05))的DNA序列,和使用Mann-Whitney发现的勉强或接近显著的保护作用,或显示出一些保护性特征,例如有一只或多只无关的小鼠或因为首次出现死亡的时间延长,被认为是保护作用。当我们认为一些结果被使用鼻内感染的相关问题再得模糊不清时,接近显著或非显著的结果被认为是潜在的阳性结果是可以接受的。结果试验1-6(见图1)
小鼠数目     平均存活时间(小时)
未免疫的对照(1)  pcDNA3.1+(1) ID5(1) 未免疫的对照(2) ID59(2) 未免疫的对照(5) ID59(5) 未免疫的对照(6) ID51(6)
1     47.5     61.0  61.0     49.0     55.0     58.0     55.3     71.6*  50.0
2     57.0     47.5  61.0     51.0     55.0     75.0     98.0     60.7  99.9T
3     47.5     50.5  57.0     49.0     55.0     48.0     58.5     98.5  53.6
4     47.5     50.5  72.0     55.0     69.5     46.7     55.3  (101.2)*T  99.9
5     77.0     72.0  47.5     49.0     74.0     58.0     53.5     60.7  59.4
6     57.0     50.5 小鼠死亡     49.0 小鼠死亡     75.0     98.0     50.8  50.0*
平均值     55.6     55.3  59.7     50.3     61.7     60.1     69.8     68.4  68.8
sd     11.5     9.4  8.8     2.4     9.3     12.5     21.9     18.3  24.4
p值1     -     -  0.1722     -    0.0064      -    0.2862      - <36.0
p值2     -     -  0.2565     -     -      -     -      -   -
*-当按此剂量免疫时,有一小部分象吹泡似地被冒出,因此可能未接受全部接种物。T-在实验结束时终止,没有感染症状。括号内的数字-不考虑所采用的不完全剂量的存活时间。P值1指的是与未经免疫的对照相比的显著性试验。P值2指的是与pcDNA3.1+免疫的对照相比的显著性试验。统计学分析
试验1-其它组无一比对照有显著更长的存活时间。未经免疫和pcDNA3.1对照组的存活时间没有显著的不同。ID5的一个小鼠是无关的结果,ID5的平均存活时间被延长,但不显著。
试验2-与未经免疫的对照组相比,ID59免疫组的存活时间显著更长。
试验5-与对照相比,ID59免疫组的存活时间平均约长10小时,但该结果在统计学上不是很显著。
试验6-与未经免疫的对照组相比,ID51免疫组不具有显著更长的存活时间(p=<36.0),然而,经免疫组中有2个无关的小鼠。疫苗试验7和8(见图2)
小鼠数目     平均存活时间(小时)
未免疫的对照(7) ID29(7) 未免疫的对照(8) ID50(8)
 1     59.6  73.1     45.1  60.6
 2     47.2  54.8     50.8  60.6
 3     59.6  59.3     60.4  51.1
 4     70.9  54.8*     55.2  60.6
 5     68.6*  59.3     45.1  60.6
 6     76.0  54.8     45.1  60.6
平均值     63.6  59.35     50.2  59.1
 sd     10.3  7.1     6.4  3.9
 p值1      - <39.0      -  0.0048
*-当按此剂量免疫时,有一小部分象吹泡似地被冒出,因此可能未接受全部接种物。T-在实验结束时终止,没有感染症状。括号内的数字-不考虑所采用的不完全剂量的存活时间。P值1指的是与未经免疫的对照相比的显著性试验。统计学分析
试验7-ID29免疫组首次出现死亡的时间延长。
试验8-与未经免疫的对照组相比,ID50免疫组具有显著更长的存活时间。
附录Ⅰ-寡核苷酸引物nucS1
BglⅡ Eco RV5′-cgagatctgatatctcacaaacagataacggcgtaaatag-3′nucS2
BglⅡ  SmaⅠ5′-gaagatcttccccgggatcacaaacagataacggcgtaaatag-3′nucS3
BglⅡ Eco RV5′-cgagatctgatatccatcacaaacagataacggcgtaaatag-3′nucR
BamHⅠ5′-cgggatccttatggacctgaatcagcgttgtc-3′NucSeq5′-ggatgctttgtttcaggtgtatc-3′pTREPF5′-catgatatcggtacctcaagctcatatcattgtccggcaatggtgtgggctttttttgttttagcggataagttatccgcta-3'pTREPR5′-gcggatcccccgggcttaattaatgtttaaacactagtcgaagatctcgcgaattctcctgtgtgaaattgttatccgcta-3'pUCF5′-cgccagggttttcccagtcacgac-3′VR5′-tcaggggggcggagcctatg-3′V15′-tcgtatgttgtgtggaattgtg-3′V25′-tccggctcgtatgttgtgtggaattg-3′
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Claims (20)

1.肺炎链球菌蛋白质或多肽,其具有选自表1所示序列的序列。
2.肺炎链球菌蛋白质或多肽,其具有选自表2所示序列的序列。
3.权利要求1或2的蛋白质或多肽,它以基本上纯的形式被提供。
4.与权利要求1至3中任一项所定义的基本上相同的蛋白质或多肽。
5.权利要求1至4中任一项所定义的蛋白质或多肽的同系物或衍生物。
6.表1-3中所定义的蛋白质或多肽的抗原性和/或免疫原性片段。
7.核酸分子,其含有下列序列或由下列序列组成:
(ⅰ)表1所示的任何DNA序列或其RNA等同物;
(ⅱ)与(ⅰ)中的任一序列互补的序列;
(ⅲ)与(ⅰ)或(ⅱ)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列;
(ⅳ)与(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列;
(ⅴ)编码表1所定义蛋白质的同系物,衍生物或片段的序列。
8.核酸分子,其含有下列序列或由下列序列组成:
(ⅰ)表2所示的任何DNA序列或其RNA等同物;
(ⅱ)与(ⅰ)中的任一序列互补的序列;
(ⅲ)与(ⅰ)或(ⅱ)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列;
(ⅳ)与(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列;
(ⅴ)编码表2所定义蛋白质的同系物,衍生物或片段的序列。
9.具有选自表1-3所示序列之序列的蛋白质或多肽、或其同系物、衍生物和/或片段用作免疫原和/或抗原的用途。
10.免疫原性和/或抗原性的组合物,该组合物含有一种或多种具有选自表1-3所示序列之序列的蛋白质或多肽或其同系物或衍生物、和/或它们中的任一个的片段。
11.权利要求10所述的免疫原性和/或抗原性组合物,该组合物是疫苗,或者可用于诊断试验。
12.权利要求11所述的疫苗,其含有一种或多种选自赋形剂、稀释剂、佐剂等的其它组分。
13.疫苗组合物,其含有一种或多种如表1-3所定义的核酸序列。
14.一种检测/诊断肺炎链球菌的方法,所述方法包括使受试样品与至少一种如表1-3所定义的蛋白质或多肽或其同系物、衍生物或片段接触的步骤。
15.一种抗体,所述抗体能与如表1-3所定义的蛋白质或多肽或其同系物、衍生物或片段结合。
16.权利要求15所定义的抗体,所述抗体是单克隆抗体。
17.一种检测/诊断肺炎链球菌的方法,所述方法包括使受试样品与至少一种如权利要求15或16所定义的抗体接触的步骤。
18.检测/诊断肺炎链球菌的方法,所述方法包括使受试样品与至少一种如权利要求7或8所定义的核酸序列接触的步骤。
19.一种测定如表1-3所定义的蛋白质或多肽是否是潜在的抗微生物靶的方法,所述方法包括灭活所述蛋白质或多肽并测定肺炎链球菌是否仍然存活。
20.能拮抗、抑制或要不然干扰如表1-3所定义的蛋白质或多肽的功能或表达的药剂用于制备药物的用途,所述药物可用于治疗或预防肺炎链球菌感染。
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