CN1317014A - 检测微生物的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测微生物的抗体，检测微生物的方法和检测微生物的试剂盒，它们对每种微生物而言为种特异性的，并且可以检测相同种内的所有血清型。本发明还制备了针对在每种类型的微生物中具有相同功能的细胞内分子的抗体，尤其是针对核糖体蛋白，即核糖体蛋白L7/L12的抗体，并选择出与问题微生物特异性反应的抗体。

Description

检测微生物的抗体
发明领域
本发明涉及用于检测多种微生物，尤其是细菌的抗体，使用所述抗体检测微生物的方法，使用所述抗体检测微生物的试剂盒，和制备检测微生物所用的特异性抗体的方法。
此外，本发明可用于药品工业，尤其可用于微生物(特别是细菌)感染的诊断。
现有技术药物
通过检测感染部位的致病病原体，或检测血清和体液中抗致病病原体的抗体，可以进一步证实微生物感染的诊断。从能够尽快治疗患者的意义上说，检测致病病原体尤其重要。
一般将检测感染的致病病原体的方法分为培养和鉴定法，即分离和培养致病病原体，然后根据其生化特性进行鉴定；基因诊断法，即根据致病病原体特定的基因进行PCR扩增等，从而检测出致病病原体；或免疫学方法，即使用抗体与致病病原体表面抗原标记的特异性反应检测致病病原体。然而，通过培养和鉴定法或基因诊断法得到结果的时间较长。因此，通常使用免疫学方法进行诊断，因为可以在短时间内以高敏感性检测出致病病原体，能尽快地和适当地治疗患者。
根据细菌的种，可通过常规的免疫学方法，单独或联合使用多种标记抗原和抗体检测感染的致病病原体。
例如，已知脂多糖(LPS)是衣原体的属-特异性抗原，它作为抗原决定簇存在(Stephens,R等：免疫学杂志，128:1083-89,1982,Caldwell,M.D.：感染和免疫，44:306-14,1984)，抗LPS的抗体在多种诊断试剂盒中被用作抗体试剂，特别地用于检测沙眼衣原体。
此外，Ellena M.Peterson等(感染和免疫，59(11),4147-4153,1991)和Byron E.Batteiger等(感染和免疫，53(3),530-533,1986)已分别报道了针对衣原体属主要外膜蛋白(MOMP)的单克隆抗体。
待审日本申请298/1988的公开文本中讨论了基于Western印迹法的免疫检测方法，所述印迹使用了针对肺炎枝原体约43千道尔顿膜蛋白抗原的单克隆抗体。
而且，待审日本申请148859/1987(日本专利64065/1994)的公开文本中描述了制备针对流感嗜血杆菌的单克隆抗体的方法，和使用所述抗体的诊断方法。
英国专利申请2,172,704中描述了约20千道尔顿的蛋白质，其分离自淋病奈瑟氏球菌菌株BS4(NCTC 11922)外膜小泡的胆酸钠提取物，该申请还公开了使用所述物质制备杂交瘤的方法。另外，欧洲专利文献EP419238A1描述了一种单克隆抗体制品，所述抗体能与使用淋病奈瑟氏球菌作为免疫原制备得到的约14千道尔顿的蛋白质结合，该申请还描述了所述单克隆抗体的制备方法。此外，加拿大专利申请1,220,147中提到了使用抗脂多糖(LPS)的单克隆抗体检测相同淋病奈瑟氏球菌的方法。
然而，所述抗体和基于该抗体的检测方法仍存在问题，因为它们对微生物的种特异性不足以进行准确的诊断。由于一个种内存在不同类型的表面抗原，抗体无法检测到所有的血清型。
上述现有技术中所用的标记抗原没有经过标准化以便能够使用相同功能的分子(例如，蛋白质LPS或具有相同功能的表面多糖组分)作为标记检测微生物，所说的分子一般存在于各种微生物的细胞中并且在微生物的***发育过程中有所变化，而基于使用一个分子作为标准检测菌种之间抗原性的不同这一概念的免疫诊断方法还不知道。
发明的公开
本发明力求向作为标准标记抗原的不同微生物的相同分子呈递抗体以使理想的微生物检测和免疫诊断成为可能，特别是针对在微生物的***发育过程中有所变化的所有待检测微生物的相同细胞内功能组分分子中的分子区段的抗体，本发明涉及检测微生物的方法，所述方法是种特异性的，并能覆盖几乎所有的血清型；使用所述抗体检测微生物的试剂盒；和制备检测微生物所用的特异性抗体的方法。
本发明人发现了具有相同功能的蛋白质，作为有用的抗原蛋白，它在所有微生物中都是保守的。通常，希望该蛋白质的结构改变极小。然而，令人惊奇地发现对某些微生物的种或属而言，该蛋白质的抗原表位具有特异性，该蛋白质的抗体不仅具有用于特异性鉴定微生物种或属的潜力，还能检测靶微生物的所有血清型。
本发明人致力于研究细胞内分子，特别是核糖体蛋白的成员核糖体蛋白L7/L12，所述分子存在于所有微生物细胞中，其氨基酸序列在不同微生物之间是不同的。核糖体蛋白L7/L12是分子量约为13千道尔顿的蛋白质，已知它作为蛋白质合成所必需的核糖体蛋白存在。在阐明来自几种微生物(特别包括大肠杆菌和枯草芽胞杆菌等)的蛋白质的全氨基酸序列方面已取得一定进展，发现微生物之间的氨基酸序列同源性为50％至65％。
本发明人注意到这样一个事实，即使不同微生物之间的所述分子具有相似性，该分子也具有每个微生物所特有的结构区段，本发明人还发现使用抗蛋白质的抗体可以检测多种具有种特异性的微生物，并可以检测相同种内的所有血清型。本发明人尝试开发使用特异性针对例如流感嗜血杆菌，肺炎链球菌和淋病奈瑟氏球菌的抗体免疫诊断微生物种的技术，结果发现能得到特异性针对每个微生物种的所述蛋白质的抗体，使用所述抗体可以对不同细菌进行种特异性检测，从而完成了本发明。
本发明涉及用于检测微生物的抗体，使用该抗体检测微生物的方法，使用该抗体检测微生物的试剂盒，以及制备检测微生物所用的特异性抗体的方法。
1)抗微生物核糖体蛋白的抗体，所述抗体能与所述微生物发生特异性反应。
2)上文1)所述的抗体，其中微生物核糖体蛋白是核糖体蛋白L7/L12。
3)上文1)或2)所述的抗体，其中所述微生物是导致性传播疾病(STD)的微生物。
4)上文1)或2)所述的抗体，其中所述微生物是导致呼吸道感染的微生物。
5)上文4)所述的抗体，其中呼吸道感染的致病微生物是流感嗜血杆菌微生物。
6)上文4)所述的抗体，其中呼吸道感染的致病微生物是肺炎链球菌微生物。
7)上文3)所述的抗体，其中性传播疾病(STD)的致病微生物是淋病奈瑟氏球菌微生物。
8)上文7)所述的抗体，该抗体是针对淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的抗体，并可识别序列表SEQ ID NO:22的氨基酸序列中5至30个氨基酸长的连续氨基酸序列组成成分，包括第115位的丙氨酸。
9)检测微生物的方法，其特征在于使用了抗细胞内分子的抗体，对多种微生物而言，所述分子具有相同的功能。
10)检测微生物的方法，其特征在于使用了上文1)至8)所述的任何抗体。
11)检测微生物的试剂盒，其特征在于使用了抗细胞内分子的抗体，对多种微生物而言，所述分子具有相同的功能。
12)检测微生物的试剂盒，其特征在于使用了上文1)至8)所述的任何抗体。
13)制备上文1)至8)所述的任何抗体的方法，其特征在于将通过基因操作法或通过分离自微生物而得到的微生物核糖体蛋白L7/L12，其肽组成成分，或对应于肽组成成分的合成肽用作免疫原。
以下将详细解释本发明。
序列表中的SEQ ID NO:1和NO:2是流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。SEQ ID NO:3和NO:4是幽门螺杆菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。SEQ ID NO:5和NO:6是肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。SEQ ID NO:7和NO:8是淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。SEQ ID NO:9和NO:10是脑膜炎奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO:11和SEQ NO:12是获得流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA。序列表中的SEQ ID NO:13和NO:14是获得肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA。序列表中的SEQ ID NO:15和NO:16是获得淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA。SEQ IDNO:17和NO:18显示了流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。SEQ ID NO:19和NO:20显示了肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。SEQ IDNO:21和NO:22显示了淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和相应的氨基酸序列。
此外，序列表中氨基酸序列的左和右末端分别是氨基末端(下文称之为N端)和羧基末端(下文称之为C端)，碱基序列的左末端和右末端分别是5’末端和3’末端。
另外，可通过标准实验手册中所述的方法进行本文所述基因制品的一系列生物分子实验。分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，Sambrook,J等(1989)是上述标准实验手册的一个例子。
本发明中的术语微生物指的是所有的微生物种，包括细菌，酵母，霉菌，放线菌，立克次氏体等，但从诊断微生物感染方面来说，细菌的问题尤其突出。
本发明所用术语“与微生物特异性反应的抗体”指的是与微生物的种或族特异性反应的抗体。与微生物的种特异性反应的抗体对诊断微生物感染疾病特别有用。
在本发明中，STD(性传播疾病)的致病微生物包括但不限于淋病奈瑟氏球菌，沙眼衣原体，白色念珠菌，梅毒密螺旋体和解脲尿枝原体。
在本发明中，呼吸道感染的致病微生物包括但不限于流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，肺炎衣原体，肺炎枝原体，肺炎克雷伯氏菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，A族链球菌，结核分枝杆菌，侵肺军团菌和曲霉。
本发明中的术语抗体指的是使用所述核糖体蛋白的全长或部分肽制备得到的多克隆抗体或单克隆抗体。尽管对制备抗体的肽长度没有特别的限制，但区段的长度应该能表征核糖体蛋白L7/L12，优选肽为5个氨基酸或更长，特别是8个氨基酸或更长。通过用佐剂以及与诸如KLH(匙孔嘁血蛋白)和BSA(牛血清白蛋白)的载体蛋白交联后的肽(或者必要时为全长蛋白质)接种实验室动物，并回收血清即可得到含有抗体(多克隆抗体)的抗血清，所述抗体能鉴定核糖体蛋白L7/L12。另外，从抗血清中纯化抗体之后，即可使用抗体。接种所用的实验室动物包括绵羊，马，山羊，兔，小鼠，大鼠等，特别优选使用绵羊，兔等制备多克隆抗体。此外，通过常规的制备杂交瘤细胞的方法也可得到单克隆抗体，但此时优选小鼠。与GST(谷胱甘肽S-转移酶)等融合的全长所述蛋白质或其部分肽经纯化后可用作抗原，也可以不经纯化即用作抗原，其中所述部分肽由5个或更多个氨基酸残基组成，优选由8个或更多个残基组成。抗体也可以是使用免疫球蛋白基因由细胞表达的基因重组抗体，所述基因可通过手册(“抗体：实验室手册”，E.Harlow等，冷泉港实验室)中的多种方法，克隆方法等分离得到。
通过下列3种方法以及其它类似的方法可得到核糖体蛋白L7/L12的抗体，所述核糖体蛋白可用作本发明的标记抗原；然而，可用的方法并不局限于这些。
a)通过合成具有已知核糖体蛋白L7/L12基因序列和氨基酸序列的微生物的由5至30个氨基酸组成的肽片段，并将该肽片段用作免疫原制备多克隆抗体或单克隆抗体，即可获得所需抗体，其中所述肽片段是使用与另一种微生物的所述蛋白质的氨基酸序列最不相似的区域合成的。
另外，通过使用常规的遗传学方法，例如用所述已知基因序列两端的DNA序列为引物经PCR进行基因扩增，或者使用同源区段的序列为模板探针进行杂交，可以获得所述基因的完整序列。
然后，构建与另一个蛋白质基因融合的融合基因，使用大肠杆菌等为宿主，通过常规的基因***法，将所述融合基因***宿主并大量表达。然后用针对融合蛋白质的抗体，经亲和柱法纯化表达的蛋白质而获得所需的蛋白质抗原。此时，即使获得了针对微生物内保留的氨基酸区段的抗体，也不符合本发明的目的，因为全长核糖体蛋白L7/L12成为了抗原。因此，按常规方法获得杂交瘤，该杂交瘤生产的单克隆抗体针对的是通过此方法得到的抗原，通过选择能生产出仅与所需微生物反应之抗体的克隆，即可得到所需抗体。
b)首先，由于细菌种之间的核糖体蛋白L7/L12氨基酸序列有50至60％同源性，故使用具有已知核糖体蛋白L7/L12氨基酸序列的细菌，通过常规的遗传学方法，如使用基于氨基酸序列之同源区段序列的PCR法进行特定序列区段的基因扩增，或者以同源区段为模板探针进行杂交，即可容易地获得具有未知L7/L12氨基酸序列的微生物的所述蛋白质基因。
然后，构建与另一个蛋白质基因融合的融合基因，使用大肠杆菌等为宿主，通过常规的基因***法，将所述融合基因***宿主并大量表达。然后用针对融合蛋白质的抗体，经亲和柱法纯化表达的蛋白质而获得所需的蛋白质抗原。此时，即使获得了针对微生物内保留的氨基酸区段的抗体，也不符合本发明的目的，因为全长核糖体蛋白L7/L12成为了抗原。因此，按常规方法获得杂交瘤，该杂交瘤生产的单克隆抗体针对的是通过此方法得到的抗原，通过选择能产生仅与所需微生物反应之抗体的克隆，即可得到所需抗体。
c)当核糖体蛋白L7/L12的氨基酸序列未知时，也可通过另一种方法得到被纯化至高纯度的核糖体蛋白L7/L12，即由已知的核糖体蛋白L7/L12氨基酸序列合成5至30个氨基酸长的肽，所述肽对应于微生物中保留的共有序列区段，并且通过常规方法制备抗此肽序列的多克隆抗体或单克隆抗体，再通过使用所述抗体的亲和柱层析从经破碎的微生物中得到高度纯化的核糖体蛋白L7/L12。
如果蛋白质的纯度不够，可通过常规方法，例如离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤等进行纯化，然后使用经制备用于得到纯组分的抗体，通过Western印迹等鉴定核糖体蛋白L7/L12的经洗脱组分。如b)所述，使用已得到的纯核糖体蛋白L7/L12抗原，通过常规方法获得杂交瘤或多克隆抗体，并选择与所需细菌特异性反应的杂交瘤或多克隆抗体，即可得到所需抗体。
通过a)至c)等方法得到的特异于多种微生物的本发明抗体可用于多种免疫分析法中以得到特异于多种微生物的诊断试剂盒。例如，此抗体可用于聚集反应，在该反应中，抗体被吸附至聚苯乙烯乳胶颗粒，ELISA(在微滴板上进行的常规技术)；常规的免疫层析法；夹心分析法，即使用被有色颗粒或具有显色能力的颗粒，或酶或黄磷标记的所述抗体，和被捕获抗体包被的磁性微粒等。
术语使用抗体检测微生物的方法指的是使用常规免疫分析的检测法，例如聚集反应，在该反应中，抗体被吸附至聚苯乙烯乳胶颗粒，ELISA(在微滴板上进行的常规技术)；常规的免疫层析法；夹心分析法，即使用被有色颗粒或具有显色能力的颗粒，或酶或黄磷标记的所述抗体，和被捕获抗体包被的磁性微粒等。
另外，国际专利申请日本特许公开509565/1995中描述了光学免疫分析(OIA)技术，该技术是使用抗体的有用的检测方法，其中通过由硅氧烷或氮化硅形成的光学薄膜上的抗体反应所诱导的光学干涉来检测微生物。
另外，在所述检测法中，可使用下列已知的方法从必需的微生物中提取细胞内的标记抗原，即使用多种表面活性剂(首选Triton X-100和吐温-20)进行提取试剂处理，用适当的酶，如蛋白酶等进行酶处理，以及破坏细胞结构(首先通过物理方法破碎微生物)。然而，优选使用表面活性剂等的组合来设计提取条件，从而使用试剂提取各微生物的条件最优化。
另外，术语使用抗体检测微生物的试剂盒指的是使用所述检测法的试剂盒。
例如，在得到抗流感嗜血杆菌(作为肺炎，气管炎，脑膜炎等的致病病原体而具有极高的诊断学意义)的特异性抗体时，将核糖体蛋白L7/L12的氨基酸序列和DNA序列录入数据库。
流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12的氨基酸和DNA序列示于“SEQ ID NO:1和NO:2”。
因此，对此细菌来说，可以类似地将其核糖体蛋白L7/L12的氨基酸序列与例如“SEQ ID NO:3和NO:4”所示幽门螺杆菌的相同蛋白质的氨基酸序列进行比较，并合成低同源性区段的5至30个氨基酸的肽，使用此肽制备特异于流感嗜血杆菌的多克隆抗体或单克隆抗体。
对特异性的多克隆抗体而言，优选通过用A蛋白柱等纯化经免疫实验室动物的抗血清，和用免疫实验室动物所用的合成肽进行的亲和纯化来得到IgG组分。
另外，由流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12的DNA序列设计基于N-末端和C-末端序列的PCR引物，例如序列表中的SEQ ID NO:11和NO:12所示的PCR引物。利用PCR引物的同源性，根据常规方法可获得使用提取自经培养的流感嗜血杆菌的基因组DNA，经PCR法等扩增的DNA片段。通过分析这些片段的DNA序列资料，可获得流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12的全长基因。
如此获得的流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12基因与例如GST等形成融合蛋白基因，使用适当表达质粒构建表达载体，转化大肠杆菌，表达大量所述蛋白质。培养适量经转化的大肠杆菌，通过使用GST的亲和柱纯化回收的被压碎的细菌流体，得到流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12-GST融合蛋白。通过使用所述融合蛋白质或用蛋白酶从所述融合蛋白质上切下GST组成成分得到的蛋白质作为抗原蛋白质建立多个杂交瘤，并选择对流感嗜血杆菌，或该细菌的破裂流体，或流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12表现出特异性反应的抗体，也可以获得靶特异性单克隆抗体。
另外，从数据库中的说明书已知肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12的氨基酸序列和DNA序列，与流感嗜血杆菌一样，肺炎链球菌对于呼吸道感染疾病的诊断也很有意义。肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12的氨基酸序列和DNA序列示于序列表中的SEQ ID NO:5和NO:6。
因此，通过按照与流感嗜血杆菌相同的方法，根据肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12 DNA序列的N-末端和C-末端序列设计PCR引物，如序列表中的SEQ ID NO:13或14所示的PCR引物，再按照与流感嗜血杆菌相同的方法进行处理，即可获得特异于肺炎链球菌的多克隆抗体或单克隆抗体。
已于1999年7月28日将产生特异于肺炎链球菌的单克隆抗体的杂交瘤AMSP-2保藏于日本通产省国立生物科学和人类-技术研究所，保藏号为FERM BP-6807。
另外，淋病奈瑟氏球菌是淋病的致病病原体，它作为STD典型的致病病原体而具有诊断学意义，尽管其核糖体蛋白L7/L12的DNA和氨基酸序列是未知的，但是，由美国Oklahoma大学淋病奈瑟氏球菌基因组计划测定的DNA序列和氨基酸序列的主要部分已在互联网上公开。
当使用核糖体蛋白L7/L12的已知DNA序列部分探测具有相似序列的DNA片段的存在时，发现存在相当于核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列，可以得到关于其完整DNA序列的数据。淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因的完整碱基序列和相应的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:7和NO:8。
因此，通过按照与流感嗜血杆菌和肺炎链球菌相同的方法，根据淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12 DNA序列的N-末端和C-末端序列设计PCR引物，如序列表中的SEQ ID NO:15或16所示的PCR引物，再按照与流感嗜血杆菌或肺炎链球菌完全相同的方法进行处理，即可获得特异于淋病奈瑟氏球菌的靶抗体，所述淋病奈瑟氏球菌具有淋病奈瑟氏球菌全部或部分的核糖体蛋白L7/L12作为抗原。
特别是，与淋病奈瑟氏球菌同属奈瑟氏球菌属的脑膜炎奈瑟氏球菌的核糖体蛋白L7/L12基因序列已经公开，在互联网上能容易地获得该序列。脑膜炎奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因的完整碱基序列和相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:9和NO:10。比较脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因的完整碱基序列，氨基酸序列仅有的差异是淋病奈瑟氏球菌自N-末端起第115位为丙氨酸，而脑膜炎奈瑟氏球菌的该位置为谷氨酸。因此，可以得出以下结论，能特异性检测淋病奈瑟氏球菌的淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的抗体是能鉴定自N-末端起第115位的丙氨酸和包括核糖体蛋白L7/L12的丙氨酸作为表位的氨基酸区域的抗体。
根据本发明制备的抗体可用于所有已知类型的免疫分析，例如聚集反应，在该反应中，抗体被吸附至聚苯乙烯乳胶颗粒，ELISA(在微滴板上进行的常规技术)；常规的免疫层析法；夹心分析法，即使用被有色颗粒或具有显色能力的颗粒，或酶或黄磷标记的所述抗体，和被捕获抗体包被的磁性微粒等。
另外，根据本发明制备的抗体可作为所谓的捕获抗体和所谓的酶-标抗体在上述任何免疫分析法中同时起作用，所述捕获抗体捕获固相或液相中的所述抗原蛋白质，所述酶-标抗体是通过使用常规方法，用诸如过氧化物酶和碱性磷酸酶等的酶修饰得到的。
下列实施例是为了具体解释本发明，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1克隆流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12基因
将适量流感嗜血杆菌菌株ATCC9334(IID984)(得自东京大学医学院实验室)接种于巧克力琼脂培养基之后，在37℃和0.5％CO2的条件下，在CO2温箱中将菌株培养24小时。将长出的菌落悬浮于TE缓冲液(由Wako Pure Chemical有限公司制备)至终浓度约为5×109CFU/ml。将约1.5ml该悬浮液转移至微量离心管，以10,000rpm离心2分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于567μl TE缓冲液。然后加入30μl 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和3μl 20mg/ml蛋白酶K溶液并彻底混合。于37℃将悬浮液再保温1小时，接着，加入80μl 10％鲸蜡基三乙基溴化铵/0.7M NaCl溶液并彻底混合产物，再于65℃保温10分钟。然后，按24∶1的体积比加入700μl氯仿-异戊醇溶液并充分搅拌。使用微量离心装置，以12,000rpm离心溶液5分钟(保持在4℃)，将水相转移至新的小管中。在水相中加入0.6倍体积的异丙醇，用力振荡小管，形成DNA沉淀物。用玻璃棒搅起白色DNA沉淀物，并转移至含有1ml 70％乙醇(冷却至-20℃)的不同微量离心管中。
接着，以10,000rpm离心产物5分钟，小心取出上清液。然后再加入1ml 70％乙醇，将产物离心5分钟。
一旦倒出上清液，将沉淀物溶解于100μl TE缓冲液以得到DNA溶液。根据分子克隆：实验室手册，E5DNA或RNA量的分光光度测定法(1989,Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T编，冷泉港实验室出版社)，定量检测基因组DNA溶液的浓度。
使用10ng基因组DNA进行PCR(聚合酶链反应)。Taq聚合酶(Takara有限公司，编号为R001A)被用于PCR。然后在酶中加入5μl缓冲液，4μl dNTP混合物和各为200pmol的合成寡核苷酸-A(示于序列表中的SEQ ID NO:11)和合成寡核苷酸-B(示于序列表中的SEQ IDNO:12)，使终体积为50μl。
用TaKaRa PCR热循环仪480将此混合物循环5次，即95℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，然后以95℃1分钟，60℃2分钟和72℃3分钟循环25次。使用一些PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。然后用溴化乙锭(Nihon Gene有限公司)染色此产物，并在紫外线下进行观察以证实约400bp cDNA的扩增。用限制性内切核酸酶BamHⅠ和XhoⅠ消化之后，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，并用溴化乙锭染色。从凝胶中切下约370bp的带，用Suprecol(Takara有限公司)纯化此带，然后***商购载体pGEX-4T-1(Pharmacia)。通过将所需基因片段***适当限制性内切核酸酶位点，相同载体可用作所需分子的表达载体，表达与GST蛋白的融合蛋白。
实际上，将载体pGEX-4T-1和上述DNA以1∶3的摩尔比相混合，并用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司)将DNA***载体。通过遗传学方法，将其中已***DNA的载体pGEX-4T-1导入大肠杆菌one-shot感受态细胞(Invitrogen有限公司)，然后接种于含有50μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的L-肉汤(Takara有限公司)半-固体培养基平板。然后于37℃将平板保温12小时，随机选择长出的菌落，接种于2ml含有相同浓度氨苄青霉素的L-肉汤液体培养基。于37℃振荡培养7小时，回收细菌，使用Wizard Miniprep(Promega)，根据所附文献分离质粒。用限制性内切核酸酶BamHⅠ/XhoⅠ裂解质粒，通过切下约370bp DNA进一步证实所述PCR产物的***。使用所述克隆测定所***DNA的碱基序列。
使用Applied Biosystems的荧光测序仪测定所***DNA片段的碱基序列。使用PRISM，即Ready Reaction Dye Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)制备序列样品。首先，在容量为0.5ml的小管中加入9.5μl反应贮存液，4.0μl 0.8pmol/μl的T7启动子引物(Gibco BRL)和6.5μl 0.16μg/μl测序用的模板DNA，混合，并在上面覆盖100μl矿物油。进行25轮PCR扩增循环，每轮循环为96℃30秒，55℃15秒和60℃4分钟。然后将产物置于4℃放5分钟，反应完成之后，加入80μl无菌纯水并搅拌。离心产物，用苯酚-氯仿将水层抽提3次。在100μl水层中加入10ml 3M醋酸钠(pH5.2)和300μl乙醇并搅拌。然后于室温下，以14,000rpm将产物离心15分钟，回收沉淀物。用75％乙醇洗涤沉淀物，真空干燥2分钟后得到测序样品。将测序样品溶解于4μl含有10mM EDTA的甲酰胺中，于90℃变性2分钟。然后在冰中冷却并上样于测序仪。
所得5个克隆中有1个与PCR所用探针具有序列同源性。另外，发现了与其它微生物，如淋病奈瑟氏球菌的核糖体蛋白L7/L12基因的基因序列十分相似的DNA序列。结构基因组成成分的完整碱基序列和相应的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO:17和NO:18。该基因片段显然编码流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12。
实施例2流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12在大肠杆菌中的大量表达及纯化
于37℃，在LB中将50ml其中已***表达载体的大肠杆菌培养过夜。然后于37℃将500ml浓度两倍于上述培养物的YT培养基加热1小时。将50ml经过夜培养的大肠杆菌溶液导入500ml上述培养基，1小时之后，加入550μl 100mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)培养4小时。然后回收产物，导入250ml至离心管，以7,000rpm离心10分钟。
弃去上清液，将沉淀物溶解于各为25ml的50mM Tris-HCl,pH7.4和含有25％蔗糖的裂解缓冲液。
另外，加入1.25ml 10％Nonidet P-40(NP-40)和125μl 1M MgCl2，并转移至塑料管。在冰冷的情况下进行超声处理5次，每次1分钟。以12,000rpm离心产物15分钟，回收上清液。
接着，将上述上清液吸附至用磷酸缓冲盐水(PBS)调节过的谷胱甘肽琼脂糖柱。
然后，使用两倍于床体积的洗涤溶液洗涤柱，所述溶液含有20mMTris缓冲液，pH7.4,4.2mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇(DTT)。用含有5mM谷胱甘肽的50mM Tris缓冲液，pH9.6进行洗脱。通过色素结合法(Bradford法；Biorad公司)测定级分中的蛋白质含量，获得主要级分。
通过电泳证实所得纯化的核糖体蛋白L7/L12/GST融合蛋白的纯度约为75％，表明能保证得到满意纯度的免疫原。
实施例3制备针对流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体
首先，将100μg流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12/GST融合蛋白抗原溶解于200μl PBS中，然后加入200μl弗氏完全佐剂，混合并进行乳化。将200μl抗原乳剂腹膜内注射至免疫小鼠。
2周，4周和6周后，用相同的抗原乳剂腹膜内注射免疫小鼠。10周和14周后，用2倍浓度的抗原乳剂腹膜内注射免疫小鼠。最后一次免疫后3天，切下脾脏进行细胞融合。
在玻璃管中按每108个无菌回收的小鼠脾细胞2×107个骨髓瘤细胞的比例彻底混合这两种细胞，以1,500rpm将混合物离心5分钟，弃去上清液。彻底混合细胞。
细胞融合所用的骨髓瘤细胞是通过下列方法得到的：即用含有10％FCS的RPMI 1640培养基培养细胞株NS-1，在细胞融合前2周，用含有0.13mM氮鸟嘌呤，0.5μg/ml MC-210和10％FCS的RPMI 1640培养基将此产物培养1周，然后再用含有10％FCS的RPMI 1640培养基将细胞株培养1周。
在混合的细胞样品中加入50ml保持在37℃中的RPMI 1640培养基并以1,500 rpm离心。取出上清液之后，加入1ml保持在37℃中的50％聚乙二醇，搅拌1分钟。加入10ml保持在37℃中的RPMI 1640培养基，用无菌移液管抽吸以充分混合溶液约5分钟。
以1,000rpm离心5分钟并取出上清液之后，加入30ml HAT培养基以使细胞浓度为5×106细胞/ml。搅拌此混合物直至均匀混合，然后倒至96孔培养板，每孔0.1ml，于37℃,7％CO2中培养。在第1天，第1周和第2周加入HAT培养基，每孔0.1ml。
然后通过ELISA筛选已生产出所需抗体的细胞。
将流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12和GST蛋白的GST融合蛋白溶解于含有0.05％叠氮钠的PBS中，稀释此溶液至10μg/ml，以每孔100μl的量将该稀释溶液倒入独立的96孔板，于4℃吸附过夜。
除去上清液之后，加入200μl 1％牛血清白蛋白溶液(溶于PBS中)，室温下反应并封闭1小时。除去上清液之后，用洗涤溶液(0.02％吐温20,PBS)洗涤产物。在其中加入100μl融合细胞的培养物溶液，室温下反应2小时。除去上清液，用洗涤缓冲液洗涤。接着，加入100μl浓度为50ng/ml的经过氧化物酶-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体溶液，室温下使溶液反应1小时。除去上清液，再次用洗涤溶液洗涤产物。然后加入TMB溶液(KPL有限公司)，每孔加100μl，室温下使混合物反应20分钟。生色之后，加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定450nm处的吸收值。
结果，检测到仅与GST-核糖体蛋白L7/L12融合蛋白反应，而不与GST蛋白反应的阳性孔，由此得出结论：存在针对核糖体蛋白L7/L12的抗体。
因此，回收阳性孔中的细胞，在24孔塑料板中用HAT培养基进行培养。用HT培养基将经培养的融合培养物稀释至细胞计数约为20个细胞/ml，然后与悬浮于96孔培养板中的HT培养基内的106个6周龄小鼠甲状腺细胞混合。于37℃，在7％CO2的条件下培养2周。
通过上述ELISA法类似地测定培养物上清液中的抗体活性，回收与核糖体蛋白L7/L12呈现阳性反应的细胞。
另外，重复相同的稀释试验和克隆方法以得到总共5个杂交瘤克隆HIRB-1至5。
实施例4与流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12蛋白反应的单克隆抗体与流感嗜血杆菌和其它细菌的反应
根据标准方法，使用按上述所得的阳性杂交瘤细胞生产和回收单克隆抗体。
简单地说，将使用RPMI 1640培养基(含有10％FCS)传代培养的5×106个细胞腹膜内注射至Balb/C小鼠，所述小鼠在2周前已经腹膜内注射了0.5ml降植醇。3周后回收腹水，得到离心上清液。
将所得的含抗体的溶液吸附至A蛋白柱(5ml床，Pharmacia)，用3倍床体积的PBS洗涤。然后用pH3的柠檬酸盐缓冲液进行洗脱。回收抗体级分，得到由每个杂交瘤生产的单克隆抗体。
在ELISA中使用这5株杂交瘤产生的单克隆抗体。
使用夹心分析法评估单克隆抗体。通过与过氧化物酶化学结合，将制备出的单克隆抗体用作酶-标抗体。
即根据“分析生物化学”132(1983),68-73中的方法，用结合试剂S-乙酰硫代乙酸N-羟基琥珀酰亚胺，和辣根过氧化物酶(SigmaGrade Ⅵ)进行酶标记。利用ELISA反应，将商购的溶解于含有0.05％叠氮钠的PBS中的抗-流感嗜血杆菌多克隆抗体溶液(Biodesign，兔)稀释至浓度为10μg/ml，以每孔100μl的量将该稀释溶液移入独立的96孔板，于4℃吸附过夜。
除去上清液之后，加入200μl 1％FCS溶液(溶于PBS中)，室温下反应并封闭1小时。除去上清液，用洗涤溶液(0.02％吐温20,PBS)洗涤产物。在其中加入100μl抗原溶液，室温下反应2小时，所述抗原溶液是通过在每种微生物的培养物溶液中加入Triton X-100至浓度为0.3％，然后在室温下提取溶液5分钟而得到的。除去上清液，用洗涤溶液进一步洗涤产物。接着，加入100μl浓度为5μg/ml的经过氧化物酶-标记的抗-核糖体蛋白L7/L12抗体溶液，室温下反应1小时。除去上清液，用洗涤溶液洗涤产物。加入TMB溶液(KPL公司)，每孔加100μl，室温下反应20分钟。生色之后，加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定450nm处的吸收值。
结果，如表1所示，当得自杂交瘤HIRB-2的单克隆抗体被用作酶-标抗体时，所有受试的流感嗜血杆菌菌株以106个细菌/ml的敏感度被测出，而属于奈瑟氏球菌属的其它细菌和其它微生物的反应性不能被测出，甚至在108个细菌/ml的高浓度下也是如此，因此，使用抗核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体可得到对流感嗜血杆菌具有特异反应性的抗体。
表1
    检测结果(106个细菌/ml)
流感嗜血杆菌    ATCC9327    +流感嗜血杆菌    ATCC9334    +流感嗜血杆菌    ATCC9007    +流感嗜血杆菌    ATCC9332    +流感嗜血杆菌    ATCC8142    +流感嗜血杆菌    ATCC9833    +
    检测结果(108个细菌/ml)
脑膜炎奈瑟氏球菌  ATCC13090    -乳糖奈瑟氏球菌    ATCC30011    -粘液奈瑟氏球菌    ATCC35611    -干燥奈瑟氏球菌    ATCC9913     -粘膜炎奈瑟氏球菌  ATCC25240    -淋病奈瑟氏球菌    ATCC9793     -大肠杆菌          ATCC25922    -肺炎克雷伯氏菌    ATCC13883    -
(+：阳性；-：阴性)
实施例5克隆肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12基因，在大肠杆菌中大量表达和纯化所述蛋白质并制备抗此蛋白质的单克隆抗体
将适量肺炎链球菌菌株IID555(得自东京大学医学院实验室)接种于血液琼脂培养基中，在37℃温箱中培养菌株48小时。将长出的菌落悬浮于TE缓冲液至终浓度约为5×109CFU/ml。将约1.5ml该悬浮液转移至微量离心管，以10,000rpm离心2分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于567μl TE缓冲液。然后加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K溶液并彻底混合。于37℃将悬浮液再保温1小时，接着，加入80μl 10％鲸蜡基三乙基溴化铵/0.7M NaCl溶液并彻底混合产物，再于65℃保温10分钟。然后，按24∶1的体积比加入700μl氯仿-异戊醇溶液并充分搅拌。使用微量离心装置，以12,000rpm离心溶液5分钟(保持在4℃)，将水相转移至新的小管中。在水相中加入0.6倍体积的异丙醇，用力振荡小管，形成DNA沉淀物。用玻璃棒搅起白色DNA沉淀物，并转移至含有1ml 70％乙醇(冷却至-20℃)的不同微量离心管中。
接着，以10,000rpm离心产物5分钟，小心取出上清液。然后再加入1ml 70％乙醇，将产物离心5分钟。一旦倒出上清液，将沉淀物溶解于100μl TE缓冲液以得到DNA溶液。根据分子克隆：实验室手册，E5:DNA或RNA量的分光光度测定法(1989,Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T编，冷泉港实验室出版社)，定量检测基因组DNA溶液的浓度。
使用10ng基因组DNA进行PCR。Taq聚合酶(Takara有限公司，编号为R001A)被用于PCR。然后在酶中加入5μl随酶出售的缓冲液，4μl随酶出售的dNTP混合物和各为200pmol的合成寡核苷酸-C(示于序列表中的SEQ ID NO:13)和合成寡核苷酸-D(示于序列表中的SEQ IDNO:14)，使终体积为50μl。
用TaKaRa PCR热循环仪480将此混合物循环5次，即95℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，然后以95℃1分钟，60℃2分钟和72℃3分钟循环25次。使用一些PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。然后用溴化乙锭(Nihon Gene有限公司)染色此产物，并在紫外线下进行观察以证实约400bp cDNA的扩增。用限制性内切核酸酶BamHⅠ和XhoⅠ消化之后，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，并用溴化乙锭染色。从凝胶中切下约370bp的带，用Suprecol(Takara有限公司)纯化此带，然后***商购载体pGEX-4T-1(Pharmacia)。
通过将所需基因片段***适当限制性内切核酸酶位点，相同载体可用作所需分子的表达载体，表达与GST蛋白的融合蛋白。实际上，将载体pGEX-6P-1和上述DNA以1∶5的摩尔比相混合，并用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司)将DNA***载体。通过遗传学方法，将其中已***DNA的载体pGEX-4T-1导入大肠杆菌one-shot感受态细胞(Invitrogen有限公司)，然后接种于含有50μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的LB-琼脂(Takara有限公司)半-固体培养基平板。然后于37℃将平板保温12小时，随机选择长出的菌落，接种于2ml含有相同浓度氨苄青霉素的LB-液体培养基。于37℃振荡培养8小时，回收细菌，使用Wizard Miniprep(Promega有限公司)，根据所附文献分离质粒。用限制性内切核酸酶BamHⅠ/XhoⅠ裂解质粒，通过切下约370bp DNA进一步证实所述PCR产物的***。使用所述克隆测定所***DNA的碱基序列。
使用Applied Biosystems的荧光测序仪测定所***DNA片段的碱基序列。使用PRISM，即Ready Reaction Dye Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)制备序列样品。首先，在容量为0.5ml的小管中加入9.5μl反应贮存液，4.0μl 0.8pmol/μl的T7启动子引物(Gibco BRL)和6.5μl 0.16μg/μl测序用的模板DNA，混合，并在上面覆盖100μl矿物油。进行25轮PCR扩增循环，每轮循环为96℃30秒，55℃15秒和60℃4分钟。然后将产物置于4℃放5分钟，反应完成之后，加入80μl无菌纯水并搅拌。离心产物，用苯酚-氯仿将水层抽提3次。在100μl水层中加入10μl 3M醋酸钠(pH5.2)和300μl乙醇并搅拌。然后于室温下，以14,000rpm将产物离心15分钟，回收沉淀物。用75％乙醇洗涤沉淀物，真空干燥2分钟后得到测序样品。将测序样品溶解于4μl含有10mM EDTA的甲酰胺中，于90℃变性2分钟。然后在冰中冷却并上样于测序仪。
所得7个克隆中有1个与PCR所用探针具有序列同源性。另外，发现了与其它微生物，如淋病奈瑟氏球菌的核糖体蛋白L7/L12基因的基因序列十分相似的DNA序列。结构基因组成成分的完整碱基序列和相应的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO:19和NO:20。该基因片段显然编码肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12。
于37℃，在两倍浓度的YT培养基中将50ml其中已***表达载体的大肠杆菌培养过夜。然后于37℃将450ml两倍浓度的YT培养基加热1小时。将50ml经过夜培养的大肠杆菌溶液导入450ml上述培养基，37℃培养1小时之后，加入100μl 500mM IPTG,25℃培养4小时。然后回收产物，以各250ml导入至离心管，以5,000rpm离心20分钟。弃去上清液，将沉淀物溶解于各为25ml的50mM Tris-HCl,pH7.4和含有25％蔗糖的裂解缓冲液。
另外，加入1.25ml 10％ P-40和125μl 1M MgCl2，并转移至塑料管。在冰冷的情况下进行超声处理5次，每次1分钟。以12,000rpm离心产物15分钟，回收上清液。
接着，将上述上清液吸附至用PBS调节过的谷胱甘肽sepharose柱(由Pharmacia制备)。然后，使用三倍于床体积的PBS洗涤柱，用含有10mM谷胱甘肽的50mM Tris-HCl,pH8.0进行洗脱。通过色素结合法(Bradford法；Biorad公司)测定级分中的蛋白质含量，获得主要级分。对着3L PBS透析主要级分3次。
在10ml 1mg/ml所得GST-核糖体蛋白L7/L12融合蛋白溶液中加入1ml裂解缓冲液，该缓冲液含有500mM Tris-HCl(pH7.0),1.5MNaCl,10mM EDTA和10mM DTT。再加入100μl 2u/μl PreScission蛋白酶(由Pharmacia公司制备)，4℃下进行反应以从核糖体蛋白L7/L12上分离GST组成成分。
使反应溶液流经用PBS调节过的谷胱甘肽Sepharose柱。回收从柱中流出的溶液。使1倍床体积的PBS也流经该柱，并回收流出的PBS。通过电泳证实所得纯化核糖体蛋白L7/L12的纯度约为90％，这表明免疫原所满意的纯度是有保证的。
首先，将100μg肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12的蛋白抗原溶解于200μl PBS中，然后加入200μl弗氏完全佐剂，混合并进行乳化。将200μl抗原乳剂腹膜内注射至免疫小鼠。2周，4周和6周后，用相同的抗原乳剂腹膜内注射免疫小鼠。10周和14周后，用2倍浓度的抗原乳剂腹膜内注射免疫小鼠。最后一次免疫后3天，切下脾脏进行细胞融合。
在玻璃管中按每108个无菌回收的小鼠脾细胞2×107个骨髓瘤细胞的比例彻底混合这两种细胞，以1,500rpm将混合物离心5分钟，弃去上清液。彻底混合细胞。
细胞融合所用的骨髓瘤细胞是通过下列方法得到的：即用含有10％FCS的RPMI 1640培养基培养细胞株NS-1，在细胞融合前2周，用含有0.13mM氮鸟嘌呤，0.5μg/ml MC-210和10％FCS的RPMI 1640培养基将此产物培养1周，然后再用含有10％FCS的RPMI 1640培养基将细胞株培养1周。在混合的细胞样品中加入30ml保持在37℃中的RPMI 1640培养基并以1,500rpm离心。取出上清液之后，加入1ml保持在37℃中的50％聚乙二醇，搅拌2分钟。加入10ml保持在37℃中的RPMI 1640培养基，用无菌移液管抽吸以充分混合溶液约5分钟。
以1,000rpm离心5分钟并取出上清液之后，加入30ml HAT培养基以使细胞浓度为5×106/ml。搅拌此混合物直至均匀混合，然后倒至96孔培养板，每孔0.1ml，于37℃,7％CO2中培养。在第1天，第1周和第2周加入HAT培养基，每孔0.1ml。
然后通过ELISA筛选已生产出所需抗体的细胞。将肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12溶解于含有0.05％叠氮钠的PBS中，稀释此溶液至10μg/ml，以每孔100μl的量将该稀释溶液倒入独立的96孔板，于4℃吸附过夜。除去上清液之后，加入200μl 1％牛血清白蛋白溶液(溶于PBS中)，室温下反应并封闭1小时。除去上清液之后，用洗涤溶液(0.02％吐温20,PBS)洗涤产物。在其中加入100μl融合细胞的培养物溶液，室温下反应2小时。除去上清液，用洗涤溶液进一步洗涤产物。接着，加入100μl浓度为50ng/ml的经过氧化物酶-标记的山羊抗-小鼠抗体溶液，室温下反应1小时。除去上清液，再次用洗涤溶液洗涤产物。然后加入TMB溶液(KPL)，每孔加100μl，室温下反应20分钟。生色之后，加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定450nm处的吸收值。
结果，检测到与核糖体蛋白L7/L12反应的阳性孔，由此证实存在针对核糖体蛋白L7/L12的抗体。
因此，回收阳性孔中的细胞，在24孔塑料板中用HAT培养基进行培养。用HT培养基将经培养的融合培养物稀释至细胞计数约为20个细胞/ml，然后与悬浮于96孔培养板中的HT培养基内的106个6周龄小鼠甲状腺细胞混合。于37℃，在7％CO2的条件下培养2周。通过上述ELISA法类似地测定培养物上清液中的抗体活性，回收与核糖体蛋白L7/L12呈现阳性反应的细胞。
另外，重复相同的稀释和克隆方法以得到总共4个杂交瘤克隆AMSP-1至4。
实施例6与肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12反应的单克隆抗体与肺炎链球菌和其它微生物的反应
根据标准方法，使用按上述所得的阳性杂交瘤细胞生产和回收单克隆抗体。
具体地说，在25cm2培养瓶中用无血清培养基将在RPMI 1640培养基(含有10％FCS)中传代培养的细胞稀释至约2×105个细胞/ml，3.3×105个细胞/ml和5×105个细胞/ml，总体积为5ml。于37℃，在7％CO2中培养细胞3至5天之后，在生长出细胞的培养瓶中选择含有最少数目的原始细胞的培养瓶。重复相同方案，直至3至4天内将稀释至2×105个细胞/ml的细胞培养至2×106个细胞/ml，从而使细胞适应无血清培养基。接着，在用于细菌培养的96孔板中进行克隆以选择表现出最快生长和最高抗体滴度的细胞。在24孔板中培养选定的细胞，在25cm2培养瓶中用无血清培养基稀释至浓度约为2×105个细胞/ml，总体积为10ml。于37℃，在7％CO2中保温3至4天至浓度为1×106个细胞/ml之后，将100ml培养肉汤，按照相同的方法在75cm2培养瓶中培养的1×106个细胞/ml转移至大量培养所用的瓶中。在混合物中加入100ml无血清培养基，于37℃搅拌保温2天。再加入200ml无血清培养基，将混合物再保温2天。将培养肉汤分成4份，在每份中加入无血清培养基，接着保温2天。再加入400ml无血清培养基，将培养肉汤保温6天。收集培养肉汤，以10,000rpm离心15分钟以得到含有靶抗体的培养物上清液。加入叠氮化钠至终浓度0.1％，然后将培养物上清液储存于4℃。用PBS将100ml所得的含抗体的溶液稀释5倍，并吸附至G蛋白柱(5ml床，Pharmacia)，用3倍床体积的PBS洗涤。然后用pH3的柠檬酸盐缓冲液进行洗脱。回收抗体级分，得到由每个杂交瘤产生的单克隆抗体。根据国际专利申请日本特许公开(Toku-Hyou)509565/1995的翻译文本中所述的OIA法，评价源自4株杂交瘤克隆的单克隆抗体。
具体地说，OIA法包括通过反应具有氮化硅薄膜层的硅片上的捕获抗体以制备反应性底物，在规定的一段时间内，使该底物与身为微生物提取物的抗原反应，导致被捕获的抗原与身为酶-标抗体的抗体(倍增试剂)反应，最终加入底物溶液以产生薄膜沉淀物。通过沉淀物所产生的光干涉颜色的水平能肉眼判断抗原-抗体反应。
在OIA法中，单克隆抗体制品作为捕获抗体被使用和评价，所述捕获抗体被固定于具有氮化硅薄膜层的硅片上。另外，参考实施例中所述的经过氧化物酶-标记的AMGC-1单克隆抗体被用作检测抗体，所述抗体能与多种微生物核糖体蛋白L7/L12蛋白发生非特异性反应。即根据“分析生物化学”132(1983),68-73中的方法，用结合试剂S-乙酰硫代乙酸N-羟基琥珀酰亚胺，和辣根过氧化物酶(Sigma Grade Ⅵ)进行酶标记。
在OIA反应中，用0.1M HEPES(pH8.0)稀释溶于含0.05％叠氮钠的PBS中的单克隆抗体，使其浓度为10μg/ml，然后加到具有氮化硅薄膜层的硅片上(每次50μl)，室温下反应30分钟，接着用蒸馏水洗涤并使用。
通过在多种微生物的培养物溶液中加入0.5％Triton X-100，然后于室温下提取溶液5分钟即可得到抗原溶液，将15μl抗原溶液加到按上述方法得到的样品中，室温下反应10分钟。然后，加入15μl20μg/ml经过氧化物酶标记的AMGC1抗体并反应10分钟。用蒸馏水洗涤之后，加入底物溶液(KPL)，每次加15μl，室温下反应5分钟。用蒸馏水洗涤产物，用裸眼通过光干涉的强度判断检测信号的浓度。
结果，如表2所示，当得自杂交瘤AMSP-2的单克隆抗体被用作捕获抗体时，所有受试的肺炎链球菌菌株以106个细菌/ml的敏感度被测出，而浓度高达108个细菌/ml的其它细菌的反应性不能被测出，由此证明，使用抗核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体可得到对肺炎链球菌具有特异反应性的抗体。
已于1999年7月28日将产生特异于肺炎链球菌的单克隆抗体的杂交瘤AMSP-2保藏于日本通产省国立生物科学和人类-技术研究所，保藏号为FERM BP-6807。
表2
    检测结果(106个细菌/ml)
肺炎链球菌    ATCC27336 +肺炎链球菌    IID554    +肺炎链球菌    IID555    +肺炎链球菌    IID556    +肺炎链球菌    IID557    +肺炎链球菌    IID558    +肺炎链球菌    IID559    +肺炎链球菌    IID1603   +
    检测结果(108个细菌/ml)
大肠杆菌          ATCC25922    -粪肠球菌          ATCC19433    -流感嗜血杆菌      ATCC10211    -肺炎克雷伯氏菌    ATCC13883    -淋病奈瑟氏球菌    IID821       -乳糖奈瑟氏球菌    ATCC23970    -脑膜炎奈瑟氏球菌  ATCC13090    -铜绿假单胞菌      ATCC27853    -B族链球菌         ATCC12386    -金黄色葡萄球菌    ATCC25923    -酿脓链球菌        ATCC19615    -
(+：阳性；-：阴性)实施例7克隆淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因，在大肠杆菌中大量表达和纯化所述蛋白质并制备抗此蛋白质的单克隆抗体
将适量淋病奈瑟氏球菌菌株IID821(得自东京大学医学院实验室)接种于巧克力琼脂培养基中，在37℃和0.5％CO2的条件下，在CO2温箱中培养菌株24小时。将长出的菌落悬浮于TE缓冲液至终浓度约为5×109CFU/ml。将约1.5ml该悬浮液转移至微量离心管，以10,000rpm离心2分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于567μl TE缓冲液。然后加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K溶液并彻底混合。于37℃将悬浮液再保温1小时。
接着，加入80μl 10％鲸蜡基三乙基溴化铵/0.7M NaCl溶液并彻底混合产物，再于65℃保温10分钟。然后，按24∶1的体积比加入700μl氯仿-异戊醇溶液并充分搅拌。使用微量离心装置，以12,000rpm离心溶液5分钟(保持在4℃)，将水相转移至新的小管中。在水相中加入0.6倍体积的异丙醇，用力振荡小管，形成DNA沉淀物。用玻璃棒搅起白色DNA沉淀物，并转移至含有1ml 70％乙醇(冷却至-20℃)的不同微量离心管中。
接着，以10,000rpm离心产物5分钟，小心取出上清液。然后再加入1ml 70％乙醇，将产物离心5分钟。
一旦倒出上清液，将沉淀物溶解于100μl TE缓冲液以得到DNA溶液。根据分子克隆：实验室手册，E5:DNA或RNA量的分光光度测定法(1989,Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T编，冷泉港实验室出版社)，定量检测基因组DNA溶液的浓度。
使用10ng基因组DNA进行PCR。Taq聚合酶(Takara有限公司，编号为R001A)被用于PCR。然后在酶中加入5μl随酶出售的缓冲液，4μl随酶出售的dNTP混合物和各为200pmol的合成寡核苷酸-E(示于序列表中的SEQ ID NO:15)和合成寡核苷酸-F(示于序列表中的SEQ IDNO:16)，使终体积为50μl，所述合成的寡核苷酸是根据从互联网资料(Oklahoma大学，淋病奈瑟氏球菌基因组计划，公开的基因组DNA数据)中获得的淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12 DNA序列设计的，因为它与其它细菌的核糖体蛋白L7/L12 DNA序列具有相似性。
用TaKaRa PCR热循环仪480将此混合物循环5次，即95℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，然后以95℃1分钟，60℃2分钟和72℃3分钟循环25次。使用一些PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。然后用溴化乙锭(Nihon Gene有限公司)染色此产物，并在紫外线下进行观察以证实约400bp cDNA的扩增。用限制性内切核酸酶BamHⅠ和XhoⅠ消化之后，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，并用溴化乙锭染色。从凝胶中切下约370bp的带，用Suprecol(Takara有限公司)纯化此带，然后***商购载体pGEX-4T-1(Pharmacia)。实际上，将载体pGEX-4T-1和上述DNA以1∶3的摩尔比相混合，并用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司)将DNA***载体。通过遗传学方法，将其中已***DNA的载体pGEX-4T-1导入大肠杆菌one-shot感受态细胞(Invitrogen有限公司)，然后接种于含有50μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的LB(Takara有限公司)半-固体培养基平板。然后于37℃将平板保温12小时，随机选择长出的菌落，接种于2ml含有相同浓度氨苄青霉素的LB-液体培养基。于37℃振荡培养8小时，回收细菌，使用WizardMiniprep，根据所附文献分离质粒。用限制性内切核酸酶BamHⅠ/XhoⅠ裂解质粒，通过切下约370bp DNA进一步证实所述PCR产物的***。使用所述克隆测定所***DNA的碱基序列。
使用Applied Biosystems的荧光测序仪测定所***DNA片段的碱基序列。使用PRISM，即Ready Reaction Dye Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)制备序列样品。首先，在容量为0.5ml的小管中加入9.5μl反应贮存液，4.0μl 0.8pmol/μl的T7启动子引物(Gibco BRL)和6.5μl 0.16μg/μl测序用的模板DNA，混合，并在上面覆盖100μl矿物油。进行25轮PCR扩增循环，每轮循环为96℃30秒，55℃15秒和60℃4分钟。然后将产物置于4℃放5分钟，反应完成之后，加入80μl无菌纯水并搅拌。离心产物，用苯酚-氯仿将水层抽提3次。在100μl水层中加入10μl 3M醋酸钠(pH5.2)和300μl乙醇并搅拌。然后于室温下，以14,000rpm将产物离心15分钟，回收沉淀物。用75％乙醇洗涤沉淀物，真空干燥2分钟后得到测序样品。将测序样品溶解于4μl含有10mM EDTA的甲酰胺中，于90℃变性2分钟。然后在冰中冷却并上样于测序仪。所得5个克隆中有1个与PCR所用探针具有序列同源性。另外，发现了与其它微生物，如流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12基因的基因序列十分相似的DNA序列。结构基因组成成分的完整碱基序列和相应的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO:21和NO:22。该基因片段显然编码淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12。
使用按此方法构建的淋病奈瑟氏球菌GST-核糖体蛋白L7/L12融合蛋白表达载体得到通过按照与实施例2相同的方法制备的淋病奈瑟氏球菌GST-核糖体蛋白L7/L12融合蛋白。
此外，根据实施例3的方法得到杂交瘤株GCRB-3，它能生产针对淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体。
实施例8与淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12反应的单克隆抗体与淋病奈瑟氏球菌和其它微生物的反应
根据标准方法，使用按上述所得的阳性杂交瘤细胞GCRB-3生产和回收单克隆抗体。
简单地说，将使用RPMI 1640培养基(含有10％FCS)传代培养的5×106个细胞(于PBS中)腹膜内注射至Balb/C小鼠，所述小鼠在2周前已经腹膜内注射了0.5ml降植醇。3周后回收腹水，得到离心上清液。
将所得的含抗体的溶液吸附至A蛋白柱(5ml床，Pharmacia)，用3倍床体积的PBS洗涤。然后用pH3的柠檬酸盐缓冲液进行洗脱。回收抗体级分，得到由每个杂交瘤生产的单克隆抗体。在ELISA中使用GCRB-3杂交瘤产生的单克隆抗体。
使用夹心分析法评估单克隆抗体。通过与过氧化物酶化学结合，将制备出的单克隆抗体用作酶-标抗体。即根据“分析生物化学”132(1983),68-73中的方法，用结合试剂S-乙酰硫代乙酸N-羟基琥珀酰亚胺，和辣根过氧化物酶(Sigma Grade Ⅵ)进行酶标记。利用ELISA反应，将商购的溶解于含有0.05％叠氮钠的PBS中的抗-淋病奈瑟氏球菌多克隆抗体溶液(Virostat，兔)稀释至浓度为10μg/ml，以每孔100μl的量将该稀释溶液移入独立的96孔板，于4℃吸附过夜。
除去上清液之后，加入200μl 1％牛血清白蛋白溶液(溶于PBS中)，室温下反应并封闭1小时。除去上清液，用洗涤溶液(0.02％吐温20,PBS)洗涤产物。在其中加入100μl抗原溶液，室温下反应2小时，所述抗原溶液是通过在每种微生物的培养物溶液中加入TritonX-100至浓度为0.3％，然后在室温下提取溶液5分钟而得到的。除去上清液，用洗涤溶液进一步洗涤产物。接着，加入100μl浓度为5μg/ml的经过氧化物酶-标记的抗-核糖体蛋白L7/L12抗体溶液，室温下反应1小时。除去上清液，用洗涤溶液洗涤产物。加入TMB溶液(KPL公司)，每孔加100μl，室温下反应20分钟。生色之后，加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定450nm处的吸收值。
结果，如表3所示，当得自杂交瘤GCRB-3的单克隆抗体被用作酶-标抗体时，所有受试的淋病奈瑟氏球菌菌株以106个细菌/ml的敏感度被测出，而属于奈瑟氏球菌属的其它细菌和其它微生物的反应性不能被测出，甚至在108个细菌/ml的高浓度下也是如此，因此，使用抗核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体可得到对淋病奈瑟氏球菌具有特异反应性的抗体。
表3
    检测结果(106个细菌/ml)
淋病奈瑟氏球菌    ATCC9793     +淋病奈瑟氏球菌    ATCC19424    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC27628    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC27629    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC27630    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC27631    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC27632    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC27633    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC35541    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC35542    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC43069    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC43070    +淋病奈瑟氏球菌    ATCC49226    +
    检测结果(108个细菌/ml)
脑膜炎奈瑟氏球菌  ATCC13090    -乳糖奈瑟氏球菌    ATCC30011    -粘液奈瑟氏球菌    ATCC35611    -干燥奈瑟氏球菌    ATCC9913     -粘膜炎奈瑟氏球菌  ATCC25240    -流感嗜血杆菌      ATCC10211    -大肠杆菌          ATCC25922    -肺炎克雷伯氏菌    ATCC13883    -
(+：阳性；-：阴性)
实施例9获得对奈瑟氏球菌属特异的抗核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体
将适量淋病奈瑟氏球菌菌株IID821(得自东京大学医学院实验室)接种于巧克力琼脂培养基中，在37℃和0.5％CO2的条件下，在CO2温箱中培养菌株24小时。将长出的菌落悬浮于TE缓冲液至终浓度约为5×109CFU/ml。将约1.5ml该悬浮液转移至微量离心管，以10,000rpm离心2分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于567μl TE缓冲液。然后加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K溶液并彻底混合。于37℃将悬浮液再保温1小时。接着，加入80μl 10％鲸蜡基三乙基溴化铵/0.7M NaCl溶液并彻底混合产物，再于65℃保温10分钟。然后，按24∶1的体积比加入700μl氯仿-异戊醇溶液并充分搅拌。使用微量离心装置，以12,000rpm离心溶液5分钟(保持在4℃)，将水相转移至新的小管中。在水相中加入0.6倍体积的异丙醇，用力振荡小管，形成DNA沉淀物。用玻璃棒搅起白色DNA沉淀物，并转移至含有1ml 70％乙醇(冷却至-20℃)的不同微量离心管中。
接着，以10,000 rpm离心产物5分钟，小心取出上清液。然后再加入1ml 70％乙醇，将产物离心5分钟。
一旦倒出上清液，将沉淀物溶解于100μl TE缓冲液以得到DNA溶液。根据分子克隆：实验室手册，E5:DNA或RNA量的分光光度测定法(1989,Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T编，冷泉港实验室出版社)，定量检测基因组DNA溶液的浓度。
使用10ng基因组DNA进行PCR。Taq聚合酶(Takara有限公司，编号为R001A)被用于PCR。然后在酶中加入5μl随酶出售的缓冲液，4μl随酶出售的dNTP混合物和各为200pmol的合成寡核苷酸-E(示于序列表中的SEQ ID NO:15)和合成寡核苷酸-F(示于序列表中的SEQ IDNO:16)，使终体积为50μl，所述合成的寡核苷酸是根据从互联网资料(Oklahoma大学，淋病奈瑟氏球菌基因组计划，公开的基因组DNA数据)中获得的淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12 DNA序列设计的，因为它与其它细菌的核糖体蛋白L7/L12 DNA序列具有相似性。
用TaKaRa PCR热循环仪480将此混合物循环5次，即95℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，然后以95℃1分钟，60℃2分钟和72℃3分钟循环25次。使用一些PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。然后用溴化乙锭(Nihon Gene有限公司)染色此产物，并在紫外线下进行观察以证实约400bp cDNA的扩增。用限制性内切核酸酶BamHⅠ和XhoⅠ消化之后，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，并用溴化乙锭染色。从凝胶中切下约370bp的带，用Suprecol(Takara有限公司)纯化此带，然后***商购载体pGEX-6P-1(Pharmacia)。通过将所需基因片段***适当限制性内切核酸酶位点，相同载体可用作所需分子的表达载体，表达与GST蛋白的融合蛋白。实际上，将载体pGEX-6P-1和上述DNA以1∶5的摩尔比相混合，并用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司)将DNA***载体。通过遗传学方法，将其中已***DNA的载体pGEX-6P-1导入大肠杆菌one-shot感受态细胞(Invitrogen有限公司)，然后接种于含有50μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的L-肉汤(Takara有限公司)半-固体培养基平板。然后于37℃将平板保温12小时，随机选择长出的菌落，接种于2ml含有相同浓度氨苄青霉素的L-肉汤液体培养基。于37℃振荡培养8小时，回收细菌，使用Wizard Miniprep，根据所附文献分离质粒。用限制性内切核酸酶BamHⅠ/XhoⅠ裂解质粒，通过切下约370bp DNA进一步证实所述PCR产物的***。使用所述克隆测定所***DNA的碱基序列。
使用Applied Biosystems的荧光测序仪测定所***DNA片段的碱基序列。使用PRISM，即Ready Reaction Dye Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)制备序列样品。首先，在容量为0.5ml的小管中加入9.5μl反应贮存液，4.0μl 0.8pmol/μl的T7启动子引物(Gibco BRL)和6.5μl 0.16μg/μl测序用的模板DNA，混合，并在上面覆盖100μl矿物油。进行25轮PCR扩增循环，每轮循环为96℃30秒，55℃15秒和60℃4分钟。然后将产物置于4℃放5分钟，反应完成之后，加入80μl无菌纯水并搅拌。离心产物，用苯酚-氯仿将水层抽提3次。在100μl水层中加入10μl 3M醋酸钠(pH5.2)和300μl乙醇并搅拌。然后于室温下，以14,000rpm将产物离心15分钟，回收沉淀物。用75％乙醇洗涤沉淀物，真空干燥2分钟后得到测序样品。将测序样品溶解于4μl含有10mM EDTA的甲酰胺中，于90℃变性2分钟。然后在冰中冷却并进行测序。
所得4个克隆中有1个与PCR所用探针具有序列同源性。另外，发现了与其它微生物，如流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12基因的基因序列十分相似的DNA序列。结构基因组成成分的完整碱基序列和相应的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO:21和NO:22。该基因片段显然编码淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12。
于37℃，在两倍浓度的YT培养基中将50ml其中已***表达载体的大肠杆菌培养过夜。然后于37℃将450ml两倍浓度的YT培养基加热1小时。将50ml经过夜培养的大肠杆菌溶液导入450ml上述培养基，37℃培养1小时之后，加入100μl 500mM IPTG,25℃培养4小时。然后回收产物，导入250ml至离心管，以5,000rpm离心20分钟。弃去上清液，将沉淀物溶解于各为25ml的50mM Tris-HCl,pH7.4和含有25％蔗糖的裂解缓冲液。
另外，加入1.25ml 10％NP-40和125μl 1M MgCl2，并转移至塑料管。在冰冷的情况下进行超声处理5次，每次1分钟。以12,000rpm离心产物15分钟，回收上清液。
接着，将上述上清液吸附至用PBS调节过的谷胱甘肽sepharose柱(由Pharmacia制备)。然后，使用三倍于床体积的PBS洗涤柱，用含有10mM谷胱甘肽的50mM Tris-HCl,pH8.0进行洗脱。通过色素结合法(Bradford法；Biorad公司)测定级分中的蛋白质含量，获得主要级分。对着3L PBS透析主要级分3次。
在10ml 1mg/ml所得GST-核糖体蛋白L7/L12融合蛋白溶液中加入1ml裂解缓冲液，该缓冲液含有500mM Tris-HCl(pH7.0),1.5MNaCl,10mM EDTA和10mM DTT。再加入100μl 2μg/μl PreScission蛋白酶(由Pharmacia公司制备)，4℃下进行反应以从核糖体蛋白L7/L12上分离GST组成成分。
使反应溶液流经用PBS调节过的谷胱甘肽sepharose柱。回收从柱中流出的溶液。使1倍床体积的PBS也流经该柱，并回收流出的PBS。通过电泳证实所得纯化核糖体蛋白L7/L12的纯度约为90％，这表明免疫原所满意的纯度是有保证的。
首先，将100μg淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的蛋白抗原溶解于200μl PBS中，然后加入200μl弗氏完全佐剂，混合并进行乳化。将200μl抗原乳剂腹膜内注射至免疫小鼠。2周，4周和6周后，用相同的抗原乳剂腹膜内注射免疫小鼠。10周和14周后，用2倍浓度的抗原乳剂腹膜内注射免疫小鼠。最后一次免疫后3天，切下脾脏进行细胞融合。
在玻璃管中按每108个无菌回收的小鼠脾细胞2×107个骨髓瘤细胞的比例彻底混合这两种细胞，以1,500rpm将混合物离心5分钟，弃去上清液。彻底混合细胞。
细胞融合所用的骨髓瘤细胞是通过下列方法得到的：即用含有10％FCS的RPMI 1640培养基培养细胞株NS-1，在细胞融合前2周，用含有0.13mM氮鸟嘌呤，0.5μg/ml MC-210和10％FCS的RPMI 1640培养基将此产物培养1周，然后再用含有10％FCS的RPMI 1640培养基将细胞株培养1周。在混合的细胞样品中加入30ml保持在37℃中的RPMI 1640培养基并以1,500rpm离心。取出上清液之后，加入1ml保持在37℃中的50％聚乙二醇，搅拌2分钟。加入10ml保持在37℃中的RPMI 1640培养基，用无菌移液管抽吸以充分混合溶液约5分钟。
以1,000rpm离心5分钟并取出上清液之后，加入30ml HAT培养基以使细胞浓度为5×106/ml。搅拌此混合物直至均匀混合，然后倒至96孔培养板，每孔0.1ml，于37℃,7％CO2中培养。在第1天，第1周和第2周加入HAT培养基，每孔0.1ml。
然后通过ELISA评估已生产出所需抗体的细胞。将淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12溶解于含有0.05％叠氮钠的PBS中，稀释此溶液至10μg/ml，以每孔100μl的量将该稀释溶液倒入独立的96孔板，于4℃吸附过夜。除去上清液之后，加入200μl 1％牛血清白蛋白溶液(溶于PBS中)，室温下反应并封闭1小时。除去上清液之后，用洗涤溶液(0.02％吐温20,PBS)洗涤产物。在其中加入100μl融合细胞的培养物溶液，室温下反应2小时。除去上清液，用洗涤溶液进一步洗涤产物。接着，加入100μl浓度为50ng/ml的经过氧化物酶-标记的山羊抗-小鼠抗体溶液，室温下反应1小时。除去上清液，再次用洗涤溶液洗涤产物。然后加入TMB溶液(KPL)，每孔加100μl，室温下反应20分钟。生色之后，加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定450nm处的吸收值。
结果，检测到与核糖体蛋白L7/L12反应的阳性孔，由此证实存在针对核糖体蛋白L7/L12的抗体。
因此，回收阳性孔中的细胞，在24孔塑料板中用HAT培养基进行培养。用HT培养基将经培养的融合培养物稀释至细胞计数约为20个细胞/ml，然后与悬浮于96孔培养板中的HT培养基内的106个6周龄小鼠甲状腺细胞混合。于37℃，在7％CO2的条件下将细胞培养2周。通过上述ELISA法类似地测定培养物上清液中的抗体滴度，回收与核糖体蛋白L7/L12呈现阳性反应的细胞。
另外，重复相同的稀释和克隆方法以得到总共4个杂交瘤克隆AMGC-5至AMGC-8。
根据标准方法，使用按上述所得的阳性杂交瘤细胞生产和回收单克隆抗体。
具体地说，在25cm2培养瓶中用无血清培养基将在RPMI 1640培养基(含有10％FCS)中传代培养的细胞稀释至约2×105个细胞/ml，3.3×105个细胞/ml和5×105个细胞/ml，总体积为5ml。于37℃，在7％CO2中培养细胞3至5天之后，在生长出细胞的培养瓶中选择含有最少数目的原始细胞的培养瓶。重复相同方案，直至3至4天内将稀释至2×105个细胞/ml的细胞培养至2×106个细胞/ml，从而使细胞适应无血清培养基。接着，在用于细菌培养的96孔板中进行克隆以选择表现出最快生长和最高抗体滴度的细胞。在24孔板中培养选定的细胞，在25cm2培养瓶中用无血清培养基稀释至浓度约为2×105个细胞/ml，总体积为10ml。于37℃，在7％CO2中保温3至4天至浓度为1×106个细胞/ml之后，将100ml培养肉汤，按照相同的方法在75cm2培养瓶中培养的1×106个细胞/ml转移至大量培养所用的瓶中。在混合物中加入100ml无血清培养基，于37℃搅拌保温2天。再加入200ml无血清培养基，将混合物再保温2天。将培养肉汤分成4份，在每份中加入一体积无血清培养基，接着保温2天。再加入400ml无血清培养基，将培养肉汤保温6天。收集培养肉汤，以10,000rpm离心15分钟以得到含有靶抗体的培养物上清液。加入叠氮化钠至终浓度0.1％，然后将培养物上清液储存于4℃。用PBS将100ml所得的含抗体的溶液稀释5倍，并吸附至G蛋白柱(5ml床，Pharmacia)，用3倍床体积的PBS洗涤。然后用pH3的柠檬酸盐缓冲液进行洗脱。回收抗体级分，得到由每个杂交瘤产生的单克隆抗体。
根据国际专利申请日本特许公开509565/1995中所述的OIA法，评价源自4株杂交瘤克隆的单克隆抗体。
具体地说，OIA法包括通过反应具有氮化硅薄膜层的硅片上的捕获抗体以制备反应性底物，在规定的一段时间内，使该底物与身为微生物提取物的抗原反应，导致被捕获的抗原与身为酶-标抗体的抗体(倍增试剂)反应，最终加入底物溶液以产生薄膜沉淀物。通过沉淀物所产生的光干涉颜色的水平能肉眼判断抗原-抗体反应。
在OIA法中，单克隆抗体制品作为捕获抗体被使用和评价，所述捕获抗体被固定于具有氮化硅薄膜层的硅片上。另外，参考实施例中所述的经过氧化物酶-标记的AMGC-1单克隆抗体被用作检测试剂抗体，所述抗体能与多种微生物核糖体蛋白L7/L12蛋白发生非特异性反应。即根据“分析生物化学”132(1983),68-73中的方法，用结合试剂S-乙酰硫代乙酸N-羟基琥珀酰亚胺，和辣根过氧化物酶(SigmaGrade Ⅵ)进行酶标记。
在OIA反应中，用0.1M HEPES(pH8.0)稀释溶于含0.05％叠氮钠的PBS中的单克隆抗体，使其浓度为10μg/ml，然后加到具有氮化硅薄膜层的硅片上(每次50μl)，室温下反应30分钟，接着用蒸馏水洗涤并使用。
通过在多种微生物的培养物溶液中加入0.5％Triton X-100，然后于室温下提取溶液5分钟即可得到抗原溶液，将15μl抗原溶液加到按上述方法得到的样品中，室温下反应10分钟。然后，加入15μl20μg/ml经过氧化物酶标记的AMGC1抗体并反应10分钟。用蒸馏水洗涤之后，加入底物溶液(KPL)，每次加15μl，室温下反应5分钟。用蒸馏水洗涤产物，用裸眼通过光干涉的强度判断检测信号的浓度。
结果，如表4所示，当得自杂交瘤AMGC-8的单克隆抗体被用作捕获抗体时，所有受试的奈瑟氏球菌属菌株以108个细菌/ml的敏感度被测出，而其它微生物的反应性不能被测出，由此证明，使用抗核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体可得到对奈瑟氏球菌属具有特异反应性的抗体。
表4
    检测结果(108个细菌/ml)
淋病奈瑟氏球菌    IID821       +乳糖奈瑟氏球菌    ATCC23970    +脑膜炎奈瑟氏球菌  ATCC13090    +大肠杆菌          ATCC25922    -粪肠球菌          ATCC19433    -流感嗜血杆菌      ATCC10211    -肺炎克雷伯氏菌    ATCC13883    -铜绿假单胞菌      ATCC27853    -B族链球菌         ATCC12386    -金黄色葡萄球菌    ATCC25923    -肺炎链球菌        ATCC27336酿脓链球菌        ATCC19615    -
(+：阳性；-：阴性)实施例10使用核糖体蛋白L7/L12蛋白-固定化亲和柱获得与流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12特异性反应的多克隆抗体
将已用0.5％Triton X-100处理的流感嗜血杆菌细胞提取物的离心上清液用作抗原。加入1.5ml弗氏佐剂以乳化1.2ml含有100μg抗原的生理盐水溶液。将乳剂皮下注射至4只SPF日本白兔以免疫动物。白兔被免疫5至6次，每2周1次，测定抗体滴度。
通过ELISA法证实抗体滴度。将流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12溶解于含有0.05％叠氮钠的PBS中，稀释此溶液至10μg/ml，以每孔100μl的量将该稀释溶液倒入96孔板，于4℃吸附过夜。除去上清液之后，加入200μl 1％牛血清白蛋白溶液(溶于PBS中)，室温下反应并封闭1小时。除去上清液之后，用洗涤溶液(0.02％吐温20,PBS)洗涤产物。在其中加入100μl通过稀释正常的兔血清和经免疫的兔抗血清而得到的溶液，室温下反应2小时。除去上清液，用洗涤溶液进一步进行洗涤。接着，加入100μl浓度为50ng/ml的经过氧化物酶-标记的山羊抗-兔IgG抗体溶液，室温下使溶液反应1小时。除去上清液，再次用洗涤溶液洗涤产物。然后加入OPD溶液(Sigma公司)，每孔加100μl，室温下反应20分钟。生色之后，加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定492nm处的吸收值。
证实抗体滴度增加之后，收集大量血液。用玻璃制成的离心管收集耳动脉血，37℃放置1小时，然后于4℃放置过夜。以3000rpm离心混合物5分钟，回收上清液。将所得4批抗血清储存于4℃。
接着，制备具有固定化流感嗜血杆菌和淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的亲和柱。使用HiTrap NHS-激活柱(1ml，由Pharmacia制备)。用6ml 1mM HCl替换柱之后，立即充满1ml核糖体蛋白L7/L12(被调节至1mg/ml)的PBS溶液。将柱置于25℃放15分钟，重复该方法5次，从而添加总共5ml核糖体蛋白L7/L12的PBS溶液。然后添加6ml缓冲液A(0.5M乙醇胺，0.5M NaCl,pH8.3),6ml缓冲液B(0.1M醋酸，0.5M NaCl,pH4)和6ml缓冲液A作为封闭试剂。将柱置于25℃放15分钟，再加入6ml缓冲液B,6ml缓冲液A和6ml缓冲液B。然后用6ml PBS平衡混合物。
使用具有固定化流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12的亲和柱，使用经Triton X-100处理的流感嗜血杆菌上清液为抗原纯化所得抗血清中的多克隆抗体。首先用PBS稀释该抗血清至5倍体积，流经0.45μm滤器，然后以0.5ml/min的流速吸附至固定有流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12的柱上。用0.1M甘氨酸(pH2.1)从柱上洗脱之后，立即用1M Tris-HCl(pH9.0)中和，通过与抗体-滴度测定法相同的ELISA法回收靶抗体的洗脱级分。使所述级分流经用PBS平衡过的，固定有淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的亲和柱，使得与淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12反应的抗体被吸附，回收未被吸附的流出级分。
通过如实施例6所述的OIA法评价通过此方法纯化的多克隆抗体。
在OIA法中，纯化的抗体被用作捕获抗体。另外，参考实施例中所述的经过氧化物酶-标记的AMGC-1单克隆抗体被用作检测抗体。即根据“分析生物化学”132(1983),68-73中的方法，用结合试剂S-乙酰硫代乙酸N-羟基琥珀酰亚胺，和辣根过氧化物酶(Sigma Grade Ⅵ)进行酶标记。
在OIA反应中，用0.1M HEPES(pH8.0)稀释溶于含0.05％叠氮钠的PBS中的纯化的多克隆抗体，使其浓度为10μg/ml，然后加到硅片上(每次50μl)，室温下反应30分钟，接着用蒸馏水洗涤并使用。
通过在多种微生物的培养物悬浮液中加入0.5％Triton X-100，然后于室温下提取悬浮液5分钟即可得到抗原溶液，将15μl抗原溶液加到按上述方法得到的样品中，室温下反应10分钟。然后，加入15μl20μg/ml经过氧化物酶标记的AMGC1抗体并反应10分钟。用蒸馏水洗涤之后，加入底物溶液(KPL)，每次加15μl，室温下反应5分钟。用蒸馏水洗涤产物，用裸眼观察蓝色浓度。
结果，如表5所示，当APHI2-2纯化的多克隆抗体被用作捕获抗体时，受试的流感嗜血杆菌以108个细菌/ml的敏感度被测出，而其它微生物的反应性不能被测出，由此证明，使用经固定有流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12的亲和柱纯化的多克隆抗体已得到对流感嗜血杆菌具有特异反应性的抗体。
表5
    检测结果(108个细菌/ml)
流感嗜血杆菌      ATCC10211    +大肠杆菌          ATCC25922    -粪肠球菌          ATCC19433    -肺炎克雷伯氏菌    ATCC13883    -淋病奈瑟氏球菌    IID821       -乳糖奈瑟氏球菌    ATCC23970    -脑膜炎奈瑟氏球菌  ATCC13090    -铜绿假单胞菌      ATCC27853    -B族链球菌         ATCC12386    -金黄色葡萄球菌    ATCC25923    -肺炎链球菌        ATCC27336    -酿脓链球菌        ATCC19615    -
(+：阳性；-：阴性)参考实施例1获得与多种细菌的核糖体蛋白L7/L12非特异性反应的单克隆抗体
在所谓的夹心试验中，抗原被夹在捕获抗体和需检测的标记抗体之间，因其检测敏感度高，可用于通过光学免疫分析法和ELISA法检测微生物。此时，不仅需要与源自目的微生物的抗原特异性反应的抗体，也需要识别与特异性抗体的抗原表位不同的抗原表位的另一种抗体。
与源自多种微生物的核糖体蛋白L7/L12非特异性反应的抗体十分有用，因为与核糖体蛋白L7/L12特异性反应的抗体能与其构成夹心试验。
幸运的是，多种微生物的核糖体蛋白L7/L12蛋白具有氨基酸序列同源区域。本发明人成功地获得了能与得自淋病奈瑟氏球菌的多种微生物的核糖体蛋白L7/L12蛋白交叉反应的单克隆抗体。已发现由一种微生物得到的，不具有特异性的抗核糖体蛋白L7/L12的抗体可用于所有微生物的夹心试验。
从淋病奈瑟氏球菌中克隆核糖体蛋白L7/L12基因，在大肠杆菌中大量表达并纯化此蛋白质，制备抗此蛋白质的单克隆抗体。
将适量淋病奈瑟氏球菌菌株IID821(得自东京大学医学院实验室)接种于巧克力琼脂培养基中，在37℃和0.5％CO2的条件下，在CO2温箱中培养菌株24小时。将长出的菌落悬浮于TE缓冲液至终浓度约为5×109CFU/ml。将约1.5ml该悬浮液转移至微量离心管，以10,000rpm离心2分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于567μl TE缓冲液。然后加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K溶液并彻底混合。于37℃将悬浮液再保温1小时。接着，加入80μl 10％鲸蜡基三乙基溴化铵/0.7M NaCl溶液并彻底混合产物，再于65℃保温10分钟。然后，按24∶1的体积比加入700μl氯仿-异戊醇溶液并充分搅拌。使用微量离心装置，以12,000rpm离心溶液5分钟(保持在4℃)，将水相转移至新的小管中。在水相中加入0.6倍体积的异丙醇，用力振荡小管，形成DNA沉淀物。用玻璃棒搅起白色DNA沉淀物，并转移至含有1ml 70％乙醇(冷却至-20℃)的不同微量离心管中。
接着，以10,000rpm离心产物5分钟，小心取出上清液。然后再加入1ml 70％乙醇，将产物离心5分钟。
一旦倒出上清液，将沉淀物溶解于100μl TE缓冲液以得到DNA溶液。根据分子克隆：实验室手册，E5:DNA或RNA量的分光光度测定法(1989,Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T编，冷泉港实验室出版社)，定量检测基因组DNA溶液的浓度。
使用10ng基因组DNA进行PCR。Taq聚合酶(Takara有限公司，编号为R001A)被用于PCR。然后在酶中加入5μl随酶出售的缓冲液，4μl随酶出售的dNTP混合物和各为200pmol的合成寡核苷酸-E(示于序列表中的SEQ ID NO:15)和合成寡核苷酸-F(示于序列表中的SEQ IDNO:16)，使终体积为50μl，所述合成的寡核苷酸是根据从互联网资料(Oklahoma大学，淋病奈瑟氏球菌基因组计划，公开的基因组DNA数据)中获得的淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12 DNA序列设计的，因为它与其它细菌的核糖体蛋白L7/L12 DNA序列具有相似性。
用TaKaRa PCR热循环仪480将此混合物循环5次，即95℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，然后以95℃1分钟，60℃2分钟和72℃3分钟循环25次。使用一些PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。然后用溴化乙锭(Nihon Gene有限公司)染色此产物，并在紫外线下进行观察以证实约400bp cDNA的扩增。用限制性内切核酸酶BamHⅠ和XhoⅠ消化之后，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，并用溴化乙锭染色。从凝胶中切下约370bp的带，用Suprecol(Takara有限公司)纯化此带，然后***商购载体pGEX-4T-1(Pharmacia)。实际上，将载体pGEX-4T-1和上述DNA以1∶3的摩尔比相混合，并用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司)将DNA***载体。通过遗传学方法，将其中已***DNA的载体pGEX-4T-1导入大肠杆菌one-shot感受态细胞(Invitrogen有限公司)，然后接种于含有50μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的LB(Takara有限公司)半-固体培养基平板。然后于37℃将平板保温12小时，随机选择长出的菌落，接种于2ml含有相同浓度氨苄青霉素的LB-液体培养基。于37℃振荡培养8小时，回收细菌，使用WizardMiniprep，根据所附文献分离质粒。用限制性内切核酸酶BamHⅠ/XhoⅠ裂解质粒，通过切下约370bp DNA进一步证实所述PCR产物的***。使用所述克隆测定所***DNA的碱基序列。
使用Applied Biosystems的荧光测序仪测定所***DNA片段的碱基序列。使用PRISM，即Ready Reaction Dye Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)制备序列样品。首先，在容量为0.5ml的小管中加入9.5μl反应贮存液，4.0μl 0.8pmol/μl的T7启动子引物(Gibco BRL)和6.5μl 0.16μg/μl测序用的模板DNA，混合，并在上面覆盖100μl矿物油。进行25轮PCR扩增循环，每轮循环为96℃30秒，55℃15秒和60℃5分钟。然后将产物置于4℃放4分钟，反应完成之后，加入80μl无菌纯水并搅拌。离心产物，用苯酚-氯仿将水层抽提3次。在100μl水层中加入10μl 3M醋酸钠(pH5.2)和300μl乙醇并搅拌。然后于室温下，以14,000rpm将产物离心15分钟，回收沉淀物。用75％乙醇洗涤沉淀物，真空干燥2分钟后得到测序样品。将测序样品溶解于4μl含有10mM EDTA的甲酰胺中，于90℃变性2分钟。然后在冰中冷却并进行测序。
所得5个克隆中有1个与PCR所用探针具有序列同源性。另外，发现了与其它微生物，如流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12基因的基因序列十分相似的DNA序列。结构基因组成成分的完整碱基序列和相应的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO:21和NO:22。该基因片段显然编码淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12。
使用按此方法构建的淋病奈瑟氏球菌GST-核糖体蛋白L7/L12融合蛋白表达载体得到通过按照与实施例2相同的方法制备的淋病奈瑟氏球菌GST-核糖体蛋白L7/L12融合蛋白。
此外，根据实施例3的方法得到杂交瘤株AMGC1，它能生产针对淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体。
根据标准方法，使用按上述所得的阳性杂交瘤细胞AMGC1生产和回收单克隆抗体。
具体地说，在25cm2培养瓶中用无血清培养基将在RPMI 1640培养基(含有10％FCS)中传代培养的细胞稀释至约2×105个细胞/ml，3.3×105个细胞/ml和5×105个细胞/ml，总体积为5ml。于37℃，在7％CO2中培养细胞3至5天之后，在生长出细胞的培养瓶中选择含有最少数目的原始细胞的培养瓶。重复相同方案，直至3至4天内将稀释至2×105个细胞/ml的细胞培养至2×106个细胞/ml，从而使细胞适应无血清培养基。接着，在用于细菌培养的96孔板中进行克隆以选择表现出最快生长和最高抗体滴度的细胞。在24孔板中培养选定的细胞，在25cm2培养瓶中用无血清培养基稀释至浓度约为2×105个细胞/ml，总体积为10ml。于37℃，在7％CO2中保温3至4天至浓度为1×106个细胞/ml之后，将100ml培养肉汤，按照相同的方法在75cm2培养瓶中培养的1×106个细胞/ml转移至大量培养所用的瓶中。在混合物中加入100ml无血清培养基，于37℃搅拌保温2天。再加入200ml无血清培养基，将混合物再保温2天。将培养肉汤分成4份，在每份中加入无血清培养基，接着保温2天。再加入400ml无血清培养基，将培养肉汤保温6天。收集培养肉汤，以10,000rpm离心15分钟以得到包括靶抗体的培养物上清液。加入叠氮化钠至终浓度0.1％，然后将培养物上清液储存于4℃。用PBS将100ml所得的含抗体的溶液稀释5倍，并吸附至A蛋白柱(5ml床，Pharmacia)，用3倍床体积的PBS洗涤。然后用pH3的柠檬酸盐缓冲液进行洗脱。回收抗体级分，得到由每个杂交瘤产生的单克隆抗体。在ELISA中使用得自杂交瘤的单克隆抗体。
为了评价抗体，将用多种微生物的核糖体蛋白L7/L12致敏的96孔板用作抗原，与所制备的单克隆抗体反应，接着，所述单克隆抗体与用作第二抗原的经辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(由MBL制备，编码为330)发生反应，最终，使用酶反应生色试剂检测抗体。在ELISA反应中，将溶解于含有0.05％叠氮钠的PBS中的淋病奈瑟氏球菌，流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的重组核糖体蛋白L7/L12溶液(被稀释至1μg/ml)以每孔100μl的量倒入独立的96孔板，于4℃吸附过夜。
除去上清液之后，加入200μl 1％牛血清白蛋白溶液(溶于PBS中)，室温下反应并封闭1小时。除去上清液，用洗涤溶液(0.02％吐温20,PBS)洗涤产物。在其中各加入100μl浓度为0.1-1μg/ml的AMGC1抗体溶液，室温下反应2小时。除去上清液，用洗涤溶液进一步洗涤产物。接着，加入100μl浓度为5μg/ml的经辣根过氧化物酶-标记的抗-小鼠IgG(由MBL制备，编码为330)，室温下反应1小时。除去上清液，用洗涤溶液洗涤产物。加入TMB溶液(KPL公司)，每孔加100μl，室温下反应20分钟。生色之后，加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定450nm处的吸收值。
结果，如表6所示，当得自杂交瘤AMGC1的单克隆抗体被使用时，该抗体能与所有细菌，如淋病奈瑟氏球菌，流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的核糖体蛋白L7/L12反应。
表6
AMGC1抗体和微生物核糖体蛋白L7/L12的检测结果
淋病奈瑟氏球菌流感嗜血杆菌肺炎链球菌 +++
(+：阳性)
本发明所得的AMGC1抗体是十分有用的抗体，在所谓的夹心试验中，它可通过光学免疫分析和ELISA法，与特异于每种微生物的抗-核糖体蛋白L7/L12抗体相联合以用于检测微生物。
工业实用性
根据本发明，通过使用针对功能相同的细胞内分子的抗体，不仅可以根据种特异性检测微生物，也可以高精确度检测相同种中所有血清型的微生物。
通过使用针对多种微生物的核糖体蛋白L7/L12的抗体作为此抗体，可以准确地检测流感嗜血杆菌和淋病奈瑟氏球菌。
另外，通过使用在多种微生物中表现出相同功能的细胞内分子为抗原，可以制备出检测多种类型微生物所用的特异性抗体。
  序列表<110>ASAHIKASEI KOGYO KABUSIKI KAISHA<120>检测微生物的抗体<130>ASAHI-2<150>JP 10/230204<151>1998-7-31<160>22<210>1<211>369<212>DNA<213>流感嗜血杆菌<400>1atg tca tta act aac gaa caa atc att gaa gcg att gct tca aaa act           48Met Ser Leu Thr Asn Glu Gln Ile Ile Glu Ala Ile Ala Ser Lys Thr1               5                 10                  15gta act gaa atc gtt gaa tta atc gca gcg atg gaa gaa aaa ttc ggt           96Val Thr Glu Ile Val Glu Leu Ile Ala Ala Met Glu Glu Lys Phe Gly
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   35                  40                  45gcg gca gca gaa gaa aaa act gaa ttc gac gtt gta ctt aaa tct gca          192Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Lys Ser Ala
50                  55                  60ggt gcg aac aaa gta gca gta att aaa gca gta cgt ggt gca act ggt          240Gly Ala Asn Lys Val Ala Val Ile Lys Ala Val Arg Gly Ala Thr Gly65                  70                  75                  80tta ggc tta aaa gaa gct aaa gat tta gtt gaa tct gct cca gct aac          288Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Ser Ala Pro Ala Asn
            85                  90                  95tta aaa gaa ggc gtt tct aaa gaa gaa gct gaa gca ctt aag aaa gaa          336Leu Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu
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    115                 120<210>2<211>123<212>PRT<213>流感嗜血杆菌<400> 2Met Ser Leu Thr Asn Glu Gln Ile Ile Glu Ala Ile Ala Ser Lys Thr1               5                 10                  15Val Thr Glu Ile Val Glu Leu Ile Ala Ala Met Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30Val Ser Ala Ala Ala Als Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala
    35                  40                  45Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Lys Ser Ala
50                  55                  60Gly Ala Asn Lys Val Ala Val Ile Lys Ala Val Arg Gly Ala Thr Gly65                  70                  75                  80Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Ser Ala Pro Ala Asn
            85                  90                  95Leu Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu
        100                 105                 110Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Val Glu Val Lys
    115                 120<210>3<211>375<212>DNA<213>幽门螺杆菌<400>3atg gca att tca aaa gaa gaa gtg tta gag tat att ggt tca ttg agc           48Met Ala Ile Ser Lys Glu Glu Val Leu Glu Tyr Ile Gly Ser Leu Ser1               5                 10                  15gtt tta gag ctt tct gaa ttg gtt aaa atg ttt gag gaa aaa ttt ggc           96Val Leu Glu Leu Ser Glu Leu Val Lys Met Phe Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30gtg agc gcg act cca acg gtc gta gcg ggt gcg gct gta gct ggc ggt          144Val Ser Ala Thr Pro Thr Val Val Ala Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly
    35                  40                  45gca gcg gct gag agc gaa gaa aaa acc gaa ttt aat gtg att ttg gcc          192Ala Ala Ala Glu Ser Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asn Val Ile Leu Ala
50                  55                  60gat agc ggt gct gaa aaa att aag gtg att aaa gtg gtt cgt gaa atc          240Asp Ser Gly Ala Glu Lys Ile Lys Val Ile Lys Val Val Arg Glu Ile65                  70                  75                  80act gga ctt ggc ctg aaa gaa gct aaa gac gct acc gaa aaa acc cct          288Thr Gly Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ala Thr Glu Lys Thr Pro
           85                  90                  95cat gtg ctt aaa gag ggc gtg aat aaa gaa gaa gct gaa acc atc aag          336His Val Leu Lys Glu Gly Val Asn Lys Glu Glu Ala Glu Thr Ile Lys
       100                 105                 110aag aaa ctt gaa gaa gta ggc gct aag gtt gaa gtc aag                      375Lys Lys Leu Glu Glu Val Gly Ala Lys Val Glu Val Lys
    115                 120                 125<210>4<211>125<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>4Met Ala Ile Ser Lys Glu Glu Val Leu Glu Tyr Ile Gly Ser Leu Ser1               5                 10                  15Val Leu Glu Leu Ser Glu Leu Val Lys Met Phe Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30Val Ser Ala Thr Pro Thr Val Val Ala Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly
    35                  40                  45Ala Ala Ala Glu Ser Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asn Val Ile Leu Ala
50                  55                  60Asp Ser Gly Ala Glu Lys Ile Lys Val Ile Lys Val Val Arg Glu Ile65                  70                  75                  80Thr Gly Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ala Thr Glu Lys Thr Pro
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        100                 105                 110Lys Lys Leu Glu Glu Val Gly Ala Lys Val Glu Val Lys
    115                 120                 125<210>5<211>366<212>DNA<213>肺炎链球菌<400> 5atg gca ttg aac att gaa aac att att gct gaa att aaa gaa gct tca       48Met Ala Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Glu Ala Ser1               5                 10                  15atc ctt gaa ttg aac gac ctt gta aaa gct atc gaa gaa gaa ttt ggt       96Ile Leu Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Ile Glu Glu Glu Phe Gly
        20                  25                  30gta act gca gct gct cct gta gct gtt gct gca gct gat gca gct gat      144Val Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp
    35                  40                  45gct ggt gct gct aaa gat tca ttc gac gtt gaa ttg aca tct gca ggc      192Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala Gly
50                  55                  60gac aaa aaa gtt ggc gtt atc aaa gtt gta cgt gaa atc act ggt ctt      240Asp Lys Lys Val Gly Val Ile Lys Val Val Arg Glu Ile Thr Gly Leu65                  70                  75                  80ggt ctt aaa gaa gct aaa gaa ctt gtt gac ggt gca cca gca ctt gtt      288Gly Leu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Val Asp Gly Ala Pro Ala Leu Val
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        100                 105                 110gaa gaa gct gga gct tca gtt act ctt aaa                                  366Glu Glu Ala Gly Ala Ser Val Thr Leu Lys
    115                 120<210>6<211>122<212>PRT<213>肺炎链球菌<400>6Met Ala Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Glu Ala Ser1               5                 10                  15Ile Leu Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Ile Glu Glu Glu Phe Gly
        20                  25                  30Val Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp
    35                  40                  45Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala Gly
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            85                  90                  95Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ile Lys Ala Lys Leu
        100                 105                 110Glu Glu Ala Gly Ala Ser Val Thr Leu Lys
    115                120<210>7<211>369<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>7atg gct att act aaa gaa gac att ttg gaa gca gtt ggt tct ttg acc           48Met Ala Ile Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr1               5                 10                  15gta atg gaa ttg aat gac ctg gtt aaa gct ttt gaa gaa aaa ttc ggt           96Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly
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            85                  90                  95att aaa gag ggt gtt tct aaa gct gaa gcc gaa gac atc caa aaa caa          336Ile Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp Ile Gln Lys Gln
        100                 105                 110ctg gaa gca gca ggc gct aaa gtc gaa atc aaa                              369Leu Glu Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys
    115                 120<210>8<211>123<212>PRT<213>淋病奈瑟氏球菌<400>8Met Ala Ile Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr1               5                 10                  15Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala
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    115                 120<210>9<211>369<212>DNA<213>脑膜炎奈瑟氏球菌<400>9atg gct att act aaa gaa gac att ttg gaa gca gtt ggt tct ttg acc           48Met Ala Ile Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr1               5                 10                  15gta atg gaa ttg aac gac ttg gtt aaa gct ttt gaa gaa aaa ttc ggt           96Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30gtt tct gct gct gct gtt gca gtt gca ggt cct gct ggt gcc ggt gct          144Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala
    35                  40                  45gcc gat gct gaa gaa aaa acc gaa ttt gat gtc gtt ttg gct tct gcc          192Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala
50                  55                  60ggt gat caa aaa gtc ggc gtg att aaa gtt gtc cgt gca att acc ggt          240Gly Asp Gln Lys Val Gly Val Ile Lys Val Val Arg Ala Ile Thr Gly65                  70                  75                  80ttg ggt ctg aaa gaa gct aaa gac atc gtt gac ggt gca cct aaa acc          288Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ile Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr
            85                  90                  95att aaa gag ggt gtt tct aaa gct gaa gcc gaa gac atc caa aaa caa          336Ile Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp Ile Gln Lys Gln
        100                 105                 110ctg gaa gaa gcc ggc gct aaa gtc gaa atc aaa                              369Leu Glu Glu Ala Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys
    115                 120<210>10<211>123<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟氏球菌<400>10Met Ala Ile Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr1               5                 10                  15Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala
    35                  40                  45Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala
50                  55                  60Gly Asp Gln Lys Val Gly Val Ile Lys Val Val Arg Ala Ile Thr Gly65                  70                  75                  80Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ile Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr
            85                  90                  95Ile Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp Ile Gln Lys Gln
        100                 105                 110Leu Glu Glu Ala Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys
    115                 120<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>获得流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的
12引物DNA<400>11gtaaggatcc atgtcattaa ctaacgaaca a    31<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>获得流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA<400>12agcatctcga gatttaactt ctacttctgc accc    34<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>获得肺炎链球菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA<400>13ggaaggatcc atggcattga acattgaaaa cat    33<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>获得流感嗜血杆菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA<400>14tactctcgag tttaagagta actgaagctc cag    33<210>15<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>获得淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA<400>15gtaaggatcc atggctatta ctaaagaaga c    31<210>16<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>获得淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12基因所用PCR的引物DNA<400>16agcatctcga gatttgattt cgactttagc gcct        34<210>17<211>369<212>DNA<213>流感嗜血杆菌<400>17atg tca tta act aac gaa caa atc att gaa gcg att gct tca aaa act           48Met Ser Leu Thr Asn Glu Gln Ile Ile Glu Ala Ile Ala Ser Lys Thr1               5                 10                  15gta act gaa atc gtt gaa tta atc gca gcg atg gaa gaa aaa ttc ggt           96Val Thr Glu Ile Val Glu Leu Ile Ala Ala Met Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30gtt tca gca gcg gca gca gta gca gca gct cca gca gca ggc ggt gca          144Val Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala
    35                  40                  45gcg gca gca gaa gaa aaa act gaa ttc gac gtt gta ctt aaa tct gca          192Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Lys Ser Ala
50                  55                  60ggt gcg aac aaa gta gca gta att aaa gca gta cgt ggt gca act ggt          240Gly Ala Asn Lys Val Ala Val Ile Lys Ala Val Arg Gly Ala Thr Gly65                  70                  75                  80tta ggc tta aaa gaa gct aaa gat tta gtt gaa tct gct cca gct aac          288Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Ser Ala Pro Ala Asn
            85                  90                  95tta aaa gaa ggc gtt tct aaa gaa gaa gct gaa gca ctt aag aaa gaa          336Leu Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu
        100                 105                 110tta gaa gaa gcg ggt gca gaa gta gaa gtt aaa                              369Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Val Glu Val Lys
    115                 120<210>18<211>123<212>PRT<213>流感嗜血杆菌<400>18Met Ser Leu Thr Asn Glu Gln Ile Ile Glu Ala Ile Ala Ser Lys Thr1               5                 10                  15Val Thr Glu Ile Val Glu Leu Ile Ala Ala Met Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30Val Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala
    35                  40                  45Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Lys Ser Ala
50                  55                  60Gly Ala Asn Lys Val Ala Val Ile Lys Ala Val Arg Gly Ala Thr Gly65                  70                  75                  80Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Ser Ala Pro Ala Asn
            85                  90                  95Leu Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu
        100                 105                 110Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Val Glu Val Lys
    115                 120<210>19<211>366<212>DNA<213>肺炎链球菌<400>19atg gca ttg aac att gaa aac att att gct gaa att aaa gaa gct tca           48Met Ala Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Glu Ala Ser1               5                 10                  15atc ctt gaa ttg aac gac ctt gta aaa gct atc gaa gaa gaa ttt ggt           96Ile Leu Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Ile Glu Glu Glu Phe Gly
        20                  25                  30gta act gca gct gct cct gta gct gtt gct gca gct gat gca gct gat          144Val Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp
    35                  40                  45gct ggt gct gct aaa gat tca ttc gac gtt gaa ttg aca tct gca ggc          192Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala Gly
50                  55                  60gac aaa aaa gtt ggc gtt atc aaa gtt gta cgt gaa atc act ggt ctt          240Asp Lys Lys Val Gly Val Ile Lys Val Val Arg Glu Ile Thr Gly Leu65                  70                  75                  80ggt ctt aaa gaa gct aaa gaa ctt gtt gac ggt gca cca gca ctt gtt            288Gly Leu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Val Asp Gly Ala Pro Ala Leu Val
            85                  90                  95aaa gaa ggc gtt gca act gca gaa gct gaa gaa atc aaa gct aaa ttg            336Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ile Lys Ala Lys Leu
        100                 105                 110gaa gaa gct gga gct tca gtt act ctt aaa                                    366Glu Glu Ala Gly Ala Ser Val Thr Leu Lys
    115                 120<210>20<211>122<212>PRT<213>肺炎链球菌<400>20Met Ala Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Glu Ala Ser1               5                 10                  15Ile Leu Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Ile Glu Glu Glu Phe Gly
        20                  25                  30Val Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp
    35                  40                  45Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala Gly
50                  55                  60Asp Lys Lys Val Gly Val Ile Lys Val Val Arg Glu Ile Thr Gly Leu65                  70                  75                  80Gly Leu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Val Asp Gly Ala Pro Ala Leu Val
            85                  90                  95Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ile Lys Ala Lys Leu
        100                 105                 110Glu Glu Ala Gly Ala Ser Val Thr Leu Lys
    115                 120<210>21<211>369<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>21atg gct att act aaa gaa gac att ttg gaa gca gtt ggt tct ttg acc           48Met Ala Ile Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr1               5                 10                  15gta atg gaa ttg aat gac ctg gtt aaa gct ttt gaa gaa aaa ttc ggt           96Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30gtt tct gct gct gct gtt gca gtt gca ggt cct gct ggt gcc ggt gct          144Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala
    35                  40                  45gcc gat gct gaa gaa aaa acc gaa ttt gat gtc gtt ttg gct tct gcc          192Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala
50                  55                  60ggc gat caa aaa gtc ggc gtg att aaa gtt gtc cgt gca att act ggt          240Gly Asp Gln Lys Val Gly Val Ile Lys Val Val Arg Ala Ile Thr Gly65                  70                  75                  80ttg ggt ctg aaa gaa gct aaa gac atc gtt gac ggc gca cct aaa acc          288Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ile Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr
            85                  90                  95att aaa gag ggt gtt tct aaa gct gaa gcc gaa gac atc caa aaa caa          336Ile Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp Ile Gln Lys Gln
        100                 105                 110ctg gaa gca gca ggc gct aaa gtc gaa atc aaa                              369Leu Glu Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys
    115                 120<210>22<211>123<212>PRT<213>淋病奈瑟氏球菌<400>22Met Ala Ile Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr1               5                 10                  15Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly
        20                  25                  30Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala
    35                  40                  45Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala
50                  55                  60Gly Asp Gln Lys Val Gly Val Ile Lys Val Val Arg Ala Ile Thr Gly65                  70                  75                  80Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ile Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr
            85                  90                  95Ile Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp Ile Gln Lys Gln
        100                 105                 110Leu Glu Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys
    115                 120

Claims (13)

1．抗微生物核糖体蛋白的抗体，所述抗体能与所述微生物发生特异性反应。
2．根据权利要求1的抗体，其中微生物核糖体蛋白是核糖体蛋白L7/L12。
3．根据权利要求1或2的抗体，其中所述微生物是导致性传播疾病(STD)的微生物。
4．根据权利要求1或2的抗体，其中所述微生物是导致呼吸道感染的微生物。
5．根据权利要求4的抗体，其中呼吸道感染的致病微生物是流感嗜血杆菌微生物。
6．根据权利要求4的抗体，其中呼吸道感染的致病微生物是肺炎链球菌微生物。
7．根据权利要求3的抗体，其中性传播疾病(STD)的致病微生物是淋病奈瑟氏球菌微生物。
8．根据权利要求7的抗体，该抗体是针对淋病奈瑟氏球菌核糖体蛋白L7/L12的抗体，并可识别序列表SEQ ID NO:22的氨基酸序列中5至30个氨基酸长的连续氨基酸序列组成成分，包括第115位的丙氨酸。
9．检测微生物的方法，其特征在于使用了抗细胞内分子的抗体，多种微生物中的所述分子具有相同的功能。
10．检测微生物的方法，其特征在于使用了根据权利要求1至8的任何抗体。
11．检测微生物的试剂盒，其特征在于使用了抗细胞内分子的抗体，多种微生物中的所述分子具有相同的功能。
12．检测微生物的试剂盒，其特征在于使用了根据权利要求1至8的任何抗体。
13．制备权利要求1至8中的任一项所述的任何抗体的方法，其特征在于将通过基因操作法或通过分离自微生物而得到的微生物核糖体蛋白L7/L12，其肽组成成分，或对应于肽组成成分的合成肽用作免疫原。
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