CN1309389C - 具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物及其制备方法和应用，通过人工合成或从植物中分离纯化得到的去氢吴茱萸碱(或其盐)与小檗碱(或其盐)进行组方，形成组合物，经生物活性测发现此组合物具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，因此，可将此组合物应用在制备预防和治疗老年痴呆症、血管性痴呆、中风、学习记忆功能障碍等疾病的药物中。

Description

具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物及其制备方法和应用

技术领域：本发明是一种具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物及其制备方法和应用，属于药物的技术领域。

背景技术：具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质，即乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEI)能减少神经递质乙酰胆碱的降解，是目前公认的最强的胆碱能增强剂；乙酰胆碱酯酶抑制剂是通过抑制突触间隙内乙酰胆碱的降解，增加毒蕈碱受体和烟碱受体处乙酰胆碱的浓度，从而提高认知能力，另外，乙酰胆碱对毒蕈碱受体和烟碱受体的激动具有神经保护作用，大多数的乙酰胆碱酯酶抑制剂均可以改善认知功能。

在老年痴呆症(Alzheimer’sDisease，AD)病人中，学习和记忆能力的丧失，与乙酰胆碱能神经功能的下降，也就是说，与乙酰胆碱含量的高低直接关联。因此提高AD患者脑中的乙酰胆碱含量，促进胆碱能功能的药物，为治疗老年痴呆症可供选择的药物，如他克林(Tacrine)、多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galanthanmine)、卡巴拉汀等，占以上市用于治疗老年痴呆症药物的70％。血管性痴呆、中风等，均为脑功能障碍性疾病，伴有认知功能障碍，学习与记忆能力下降。通过寻找新型乙酰胆碱酯酶抑制剂，增加患者脑中乙酰胆碱的含量，改善胆碱能神经功能，改善脑功能障碍，提高学习记忆能力，是预防和治疗老年痴呆症、中风等疾病的一条有效途径。

国外研究发现：吴茱萸中化学成分之一的去氢吴茱萸碱(胺)(dehydroevodiamine，DHED)体外具有强的抗乙酰胆碱酯酶作用(Park CH；Kim SH；Choi W；Lee YJ；Kim JS；Kang SS；Suh YH，Novel anticholinesterase and antiamnesic activities ofdehydroevodiamine，a constituent of Evodia rutaecarpa.，Planta Med.，1996，62：405-409)，可增强脑血流(Akira Haji，Yasumori Momose，Ryuji Takeda，SuehiroNakanishi，Increase Feline Cerebral Blood Flow Induced by DehydroecodiamineHydrochlorideFromEvodia Rutaecarp)，去氢吴茱萸碱能显著地恢复东莨菪碱引起的记忆障碍，可以保护脑缺血对神经细胞造成的损伤、促进神经生长因子的作用，以及改善β-淀粉样蛋白诱导的健忘症(Wang，H.H.，Chou，C.J.，Liao，J.F.，and Chen，C.F.Dehydroevodiamine attenuates beta-amyloid peptide-induced amnesia in mice，European JournalofPharmacology，2001，413(2-3)：221-225)。在抗老年性痴呆症方面，其在体效果比Tacrine还佳。另外去氢吴茱萸碱可修复脑细胞达到治疗中风的效果，因此，去氢吴茱萸碱可望发展成为一类新型抗老年痴呆症和中风的药物。

小檗碱(Berberine)存在于多种植物中，如小檗科植物日本小檗、九连小檗、日本十大功劳，罂粟科植物白屈菜，防己科植物头花千金藤，毛茛科植物黄连，芸香科植物黄柏等，具有抗微生物及原虫，降压，利胆，镇静，解热，增白等作用，临床上主要用于治疗细菌性痢疾、伤寒、肺结核、例行性脑脊髓膜炎、肺脓肿、高血压、急性扁桃体炎等，服用治疗量相当安全，长期服用未见任何毒副作用。有研究报道：小檗碱在低剂量有增强乙酰胆碱的作用(张冒绍，生理学报，1963，19(1)：12)，高剂量则有抑制作用；小檗碱能增强神经生长因子NGF诱导的PC12细胞轴突生长和增强NGF诱导神经细胞的分化作用(ShigetaK.，Otaki K.，Tatemoto H.，et al.，Potential of nerve growth factor-inducedneurite outgrowth in PC12 cells by a Coptidis Rhizoma extract and protoberberinealkaloids[J].Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(11)：2491-2494)；最近研究发现，盐酸小檗碱为M受体的特异性激动剂，可引起血管内皮扩张，可改善AD症状等(王文雅，陈克敏，关永源，盐酸小檗碱对毒蕈碱性受体的作用[J].药学学报，1999，34(4)260-263)。另外，小檗碱可改善东莨菪碱致小鼠记忆获得障碍及促进正常小鼠的记忆保持(郭树仁，罗卫芳，刘天培，小檗碱对小鼠学习记忆及开场行为的影响，中药药理与临床[J].1997，13(2)：17-20)。因此，小檗碱通过增强乙酰胆碱，达到改善对脑功能的改善作用。

发明内容：我们在开展民族药中具有抗老年痴呆症物质基础研究时对多种药材进行了研究、实验、筛选，在筛选的100余种黔产道地苗药材中吴茱萸和黄连的乙醇总提取物具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，经分段处理，结合活性跟踪，提取出了活性成分分别为去氢吴茱萸碱和小檗碱的物质，本结果与上述文献报道一致；进一步研究发现，去氢吴茱萸碱和小檗碱具有协同的抗乙酰胆碱酯酶作用。

为此，本发明是为了达到以下目的：

1、提供一种具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组合物，即去氢吴茱萸碱与小檗碱组方，以及它们的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等组方，形成的组合物。

2、提供组合物中采用的原料制备方法，即人工合成或从植物(如中药吴茱萸)中分离纯化得到的去氢吴茱萸碱(及其盐)；从中药如黄连等植物中获得小檗碱及其盐并按一定比例进行组合成组合物。

3、提供组合物的组合方法，即通过机械搅拌均匀，也可以是水、乙醇、乙酸乙酯等溶剂溶解后，去除溶剂得到的均匀混合物。

4、提供具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组合物的应用，即应用在制备预防和治疗老年性痴呆症、血管性痴呆、学习记忆功能障碍、中风等疾病的药物中。

本发明是这样构成的：具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组合物，去氢吴茱萸碱(dehydroevodiamine)与小檗碱(berberine)组方，以及它们的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等组方，形成的组合物。按照重量比：去氢吴茱萸碱或其盐0.5～99.5与小檗碱或其盐99.5～0.5进行混合制备而成。它的制备方法：人工合成或从植物，如从中药吴茱萸、黄连等中分离纯化、制备得到的去氢吴茱萸碱及其盐和小檗碱及其盐，将得到的去氢吴茱萸碱及其盐和小檗碱及其盐采取机械搅拌的方法或者是用水、乙醇、乙酸乙酯等溶剂溶解后，去除溶剂得到的均匀混合物的方法制备具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物。从中药材中制备该组合物原料的具体方法：中药吴茱萸干燥近成熟果实经乙醇回流提取，除去溶剂，得到粗提物，粗提物再经硅胶柱层析，以以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，得到富含去氢吴茱萸碱的部位，该部位再经中压柱层析(硅胶)后，得到高含去氢吴茱萸碱的粗品，经重结晶后，即可的纯品去氢吴茱萸碱；将黄连的块根粉粹后，用酒精热提取，得到的提取物用稀盐酸溶解，除杂后的母液：酸水层经碱化后，析出沉淀，过滤沉淀，水洗后，再重结晶，可得纯品小檗碱，经相应的酸中和成盐可制得小檗碱的盐；将原料氢吴茱萸碱或其盐和小檗碱或其盐分别粉粹，过80～120目筛网，按需要比例进行机械搅拌均匀混合后，必要时添加辅料，制备成适宜的给药剂型：胶囊、片剂、针剂、注射剂等；也可以用溶剂水、乙醇或乙酸乙酯等溶解后，去除溶剂得到的均匀混合物原料，必要时添加辅料，制备成适宜的给药剂型。具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物的应用：这种组合物对乙酰胆碱酯酶有显著的抑制活性。具体的说：应用在制备预防和治疗老年性痴呆症、血管性痴呆、中风、学习记忆功能障碍等疾病的药物中。

在本发明中：还可以采用人工合成的方法制备去氢吴茱萸碱及其盐

人工合成方法：参照文献i)Jan Bergman，Solveig Bergman，Studies ofRutaecarpine and Related Quinazolinocarboline Alkaloids，J.Org.Chem.，1985，50：1246～1255；ii)Tatsuo Nakasato，Shozo Asada and Keiko Marui，Dehydroevodiamine，Main Alkaloid from the Leaves of Evodia rutaecarpa Hookerfil.Et Thomson，Yakugaku Zasshi，1962，82：619~626，得到如下技术方案：

合成路线为：

Isotoic anhydride(1)溶于吡啶中，加入三氟乙酸酐，回流后冷至室温，加入色胺，在回流反应结束后，加入乙酸和盐酸混合溶液处理可得中间体(2)。中间体(2)在强碱的作用下，得到吴茱萸次碱(3)。吴茱萸次碱(3)经氮甲基化可得去氢吴茱萸碱(4)，其盐(4’)是与相应的反应后得到。

组合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性测试

对通过本发明的技术方法获得的组合物进行生物活性测试。

(1)方法：

a.药品与试剂：乙酰胆碱系Fluka公司产品，乙酰胆碱酯酶和他克林系SIGMA公司产品，5，5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)系ACROS公司产品，其他试剂均为分析纯。

b.实验仪器：Bio-RAD 550酶标仪为美国伯乐公司产品

c.将样品加入含有酶和DTNB的体系中，37℃孵育一段时间。加入乙酰胆碱，37℃再孵育一段时间。加入十二烷基磺酸钠(SDS)终止反应。在450nm处测定光密度值。试验同时设有空白对照、标准对照、阳性对照、样品颜色对照。按如下公式计算抑制率：

抑制率＝(标准对照光密度值-样品光密度值)/标准对照光密度值×100

(2)样品编号及比例

a：去氢吴茱萸碱；b：小檗碱；c：盐酸小檗碱

ab11：a/b＝1∶1(重量比)；ab12：1a/b＝1∶2(重量比)；

ab15：a/b＝1∶5(重量比)；ab110：a/b＝1∶10(重量比)；

ab21：a/b＝2∶1(重量比)；ab51：a/b＝5∶1(重量比)；

ac11：a/c＝1∶1(重量比)；ac31：a/b＝3∶1(重量比)；

(3)结果：通过对乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究发现，依据本发明提供的技术获得的组合物具有显著的活性(结果见表1)，表现在：i)与组合物的组成原料去氢吴茱萸碱(a)相比，所有组合物的活性均比其高(IC₅₀值为2～5倍)。ii)组合物ab11、ab12、ab15、ab110、ab21和ac11的IC50值与小檗碱(b)的IC₅₀值相当，组合物ab51和ac31的抑制活性较小檗碱差(2倍左右)；iii)所有组合物及其组合物的组成原料的体外乙酰胆碱酯酶抑制活性均较阳性对照物Tacrine低。

表1不同比例组合物对乙酰胆碱酯酶的抑制效果(3次平均值)

样品编号	IC50(mg/ml)	样品编号	IC50(mg/ml)
				ab11	0.0043	ab21	0.0043
ab12	0.0045	ab51	0.0069
				ab15	0.0030	ac11	0.0044
ab110	0.0031	ac31	0.0070
				a	0.0157	b	0.0034
Tacrine	0.0009

通过实验证明：本发明提供的组合物具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，所有组合物的活性比组成组合物的原料去氢吴茱萸碱(a)的活性高，大部分组合物的活性与小檗碱的活性相当，特别是ab11组合物中，剂量减少了一半，其活性是组成原料去氢吴茱萸碱(a)的4倍。虽然本发明提供的组合物、组成原料去氢吴茱萸碱(a)和小檗碱(b)的体外乙酰胆碱酯酶抑制活性没有阳性对照物Tacrine强，但在体动物实验已经证明去氢吴茱萸碱(a)的抗老年痴呆症效果比Tacrine好，所以，本发明提供的组合物可应用在制备预防和治疗老年痴呆症、血管性痴呆、学习记忆障碍、儿童智力低下、中风等疾病的药物中。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)本发明提供了一种新的组合物。

2)本发明提供的组合物的组成原料来源丰富，制备工艺合理、可行，适于扩大规模，易于实现产业化的目的。

3)本发明提供的组合物具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其组份之间有协同作用，此研究结果在此前尚未见报道；本组合物可以用在制备预防和治疗老年性痴呆症、血管性痴呆、中风、学习记忆功能障碍等疾病的药物中。

具体实施方式：

本发明通过以下实施例进行进一步阐明，但并不限于本发明的内容。

本发明的实施例1：

去氢吴茱萸碱及其盐的制备

1、人工合成：

Isotoic anhydride(1)(580mg，3.56mmol)溶于15mL吡啶中，搅拌下滴加三氟乙酸酐1.5g(7.12mmol)，回流15min后，冷却至室温，加入色胺570mg(3.56mmol)，在回流30min，反应结束后(TLC跟踪反应进程)，减压除去溶剂，得残留物，在残留物中加入乙酸(12mL)和浓盐酸(2mL)混合溶液，回流30min，减压除去酸液，加入适量水分配，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经无水硫酸镁干燥后，减压除去溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂为氯仿甲醇40∶1)纯化得到中间体(2)1.2g(94％)。

取中间体(2)500mg溶于KOH(0.8g)，水(3mL)和乙醇(10mL)组成的溶液中，回流30min后，加压出去溶剂，加水分配后，经乙酸乙酯萃取得到粗品，粗品经硅胶柱层析(洗脱剂为氯仿∶二乙胺100∶1)的所需物吴茱萸次碱(3)332mg(79.3％)。

将30mg吴茱萸次碱(3)置于25ml反应瓶中，加入15ml苯溶解，在加入0.3ml硫酸二甲酯回流6h后，再添加0.2ml硫酸二甲酯，在回流12h(TLC跟踪反应进程)，减压除去溶剂，得到的粗品，经PTLC纯化，得产物去氢吴茱萸碱(4)20mg(63％)。

在甲醇或乙醇中溶解去氢吴茱萸碱(4)，通入盐酸蒸汽，可制得去氢吴茱萸碱(4)的盐酸盐(4’)；其他盐可参照此法制备。

2、从吴茱萸中分离纯化：

中药吴茱萸干燥近成熟果实(5kg)经85％乙醇回流提取(3次)，减压除去溶剂，得到粗提物(300g)，粗提物再经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇20∶1、10∶1、5∶1为洗脱剂进行梯度洗脱，得到富含去氢吴茱萸碱的部位，该部位再经中压柱层析(硅胶)(洗脱剂为为石油醚∶丙酮∶二乙胺＝5∶1∶0.1)后，得到高含去氢吴茱萸碱的粗品，经甲醇重结晶后，即可的纯品去氢吴茱萸碱(4g)。

本发明实施例2：

小檗碱及其盐原料的制备

将5kg黄连(块根)粉粹后，用75％酒精热提取，得到的提取物用稀盐酸溶解，除杂后的母液(酸水层)经碱化后，析出沉淀，过滤沉淀，水洗后，再经乙醇重结晶，可得纯品小檗碱。小檗碱经相应的酸中和成盐可制得小檗碱的盐(重结晶用70％为溶剂)。

本发明实施例3：将原料去氢吴茱萸碱和小檗碱分别粉粹，过80目筛网，按去氢吴茱萸碱0.5公斤与小檗碱99.5公斤的比例进行机械搅拌均匀混合后，即得组合物，制备成常规片剂。口服，一日三次，每次2片。

本发明实施例4：将原料去氢吴茱萸碱的盐和小檗碱的盐分别粉粹，过120目筛网，按去氢吴茱萸碱的盐99.5公斤与小檗碱的盐0.5公斤的比例进行机械搅拌均匀混合后，即得组合物；添加常用的辅料，制备成注射剂。

本发明实施例5：将原料去氢吴茱萸碱和小檗碱分别粉粹，过100目筛网，按去氢吴茱萸碱50公斤与小檗碱50公斤的比例用乙醇(也可以用乙酸乙酯等溶剂)溶解后，去除溶剂得到的均匀混合物原料，即组合物，直接灌装、制备成胶囊剂。

本发明实施例6：将原料去氢吴茱萸碱的盐和小檗碱的盐分别粉粹，过90目筛网，按去氢吴茱萸碱的盐70公斤与小檗碱的盐30公斤的比例用水(或酒精)溶解后，去除溶剂得到的均匀混合物原料，即组合物，添加常规的辅料，制备成冻干粉针剂。

Claims (7)

1.一种具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组合物，其特征在于：由去氢吴茱萸碱或其盐与小檗碱或其盐组方，其中，所述的盐是盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐。

2.按照权利要求1所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组合物，其特征在于：按照重量比，去氢吴茱萸碱或其盐0.5～99.5与小檗碱或其盐99.5～0.5进行混合制备而成。

3.如权利要求1或2中所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物的制备方法，其特征在于：人工合成或从植物中分离纯化、制备得到去氢吴茱萸碱及其盐和小檗碱及其盐，将得到的去氢吴茱萸碱及其盐和小檗碱及其盐采取机械搅拌的方法或者是用水、乙醇、乙酸乙酯溶解后，去除溶剂得到的均匀混合物的方法制备具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物。

4.按照权利要求3中所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物的制备方法，其特征在于：所述植物是中药吴茱萸或黄连。

5.按照权利要求4中所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物的制备方法，其特征在于：中药吴茱萸干燥近成熟果实经乙醇回流提取，除去溶剂，得到粗提物，粗提物再经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，得到富含去氢吴茱萸碱的部位，该部位再经中压硅胶柱层析后，得到高含去氢吴茱萸碱的粗品，经重结晶后，即可得纯品去氢吴茱萸碱，经相应的酸中和成盐可制得去氢吴茱萸碱的盐；将黄连的块根粉粹后，用酒精热提取，得到的提取物用稀盐酸溶解，除杂，除杂后的母液：酸水层经碱化后，析出沉淀，过滤沉淀，水洗后，再重结晶，可得纯品小檗碱，经相应的酸中和成盐可制得小檗碱的盐；将原料去氢吴茱萸碱或其盐和小檗碱或其盐分别粉粹，过80～120目筛网，按需要比例进行机械搅拌均匀混合后，添加辅料，制备成适宜的给药剂型：胶囊、片剂、针剂或注射剂；或用溶剂水、乙醇或乙酸乙酯溶解后，去除溶剂得到的均匀混合物原料，添加辅料，制备成胶囊、片剂、针剂或注射剂。

6.如权利要求1或2中所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物的应用，其特征在于：该组合物用于制备抑制乙酰胆碱酯酶活性方面的药物。

7.按照权利要求6所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性组合物的应用，其特征在于：应用在制备预防和治疗老年性痴呆症、血管性痴呆、中风疾病的药物中。