CN1301357A - 共焦显微镜成像*** - Google Patents

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Abstract

一个使用细长束斑的共焦成像***。特别的实施例用于说明有电荷耦合器件(CCD)的仪器和用于观察物品的荧光的仪器。

Description

共焦显微镜成像***
这是申请日为1998年3月16目的美国专利申请号09/042,527的继续部分，这里通过参考合并为一个整体。
本发明涉及一种包括利用线扫描共焦成像***和相关数据处理程序的各种实施例，通过执行对细胞提取物、细胞或组织的生物学活性测定的多种分析，识别用于诊断和治疗疾病的药剂的方法和设备。
准确执行细胞水平的分析的方法和设备是当前在药物发现和发展以及生物学研究方面所需要的。细胞水平的分析有利于用在评估化合物的生物学活性和新的生物物品的作用机制。在细胞水平的分析中，研究物的活性用竞争和补偿方法来测定。因为关于化合物的筛选、信息对于化合物的特定活性很有用。例如，不仅可以评估化合物是否结合到被分析的靶物质，而且可评估它究竟是该靶物质的正常活性的***还是拮抗剂。常见的情况是，该靶物质是一个细胞表面受体。在一些信号通道，具有治疗功能的最大电位通道的元素不是受体而是与该受体相关的细胞内信号蛋白。因此，有必要发展一种分析整个通道，尤其是在细胞环境下的活性的方法。
另外，需要快速且价廉的筛选大量的化合物。这种需要已经出现在制药工业，这里常常需要测试化合物对各种生物化学靶物质，例如受体、酶和核酸的活性。这些化合物从很广的组中选择，大约超过一百万种分立的化合物。这里使用术语化合物的目的是为了说明包括很广的，简单的有机和无机分子、蛋白质、肽、核酸和寡核苷酸、碳水化合物、脂类、或任何生物学研究的化学结构，但并不仅限于此。
在化合物筛选领域，细胞水平的分析涉及的是一堆细胞。测定的反应通常是整个细胞群的平均水平。例如，一个常见的用于离子通道分析的仪器在美国专利申请号5,355,215中公开。典型的分析包括测定离子敏感染料的时间依赖的荧光性，这种荧光是作为测定在加入某种化合物后继发的研究离子在细胞内浓度的变化的指标。准备加入细胞群中的染料在测定前被置于多孔板的孔底部。一般来说，细胞的反应无论在幅度上还是时间上都是不同的。这种变异性可能是阻碍或者妨碍了对化合物筛选来说很重要的生物活性的观察。这种不均一性可能由于实验的原材料引起，但更重要的是，不均一性是任何细胞群所固有的。其中，变异性的起源可能是继发于细胞群中生命周期的差异，或者是许多活的靶物质分子进化差异的结果。一种可减缓、补偿、甚至利用这种变异的方法，将增强在化合物药物活性的特征的细胞水平分析的值。
量化单个细胞的反应防止了在细胞群反应中出现的非均一性问题。假设一下在细胞群中很小一部分对刺激起反应的情况。测定平均反应的装置将比判断单个细胞反应的装置的敏感性低。后一种方法产生了一个反应全貌的统计学特征，允许人们从该活细胞亚群中去挑选。细胞群的另外的特征将增强对反应全貌的说明。
现有技术已经使用的各种测定装置试图满足这种需求。流式细胞仪分析被广泛应用，通过一次一个使细胞穿过聚焦的激光束测定细胞的特性。但这种方法有几个缺点。对制药工业最重要的是不能很方便地对放置于微量滴定板中的化合物进行分析。另外，处理量很低，典型地每个样本需要10-100秒时间，每个细胞的观察时间少于1ms，不允许动力学分析，还有，只能确定细胞平均信号。
另外，很多分析需要判断荧光信号的相对位置。如美国专利申请号5,107,422和美国专利申请号5,547,849公开的被称作扫描细胞仪的装置，被广泛用于成像单个细胞。为了获得可接受的速度，这些装置在很低的分辨率(5～10μm)下操作。因此，这些装置在分析需要荧光信号分布的空间信息方面比流式细胞仪强不了多少。
另一个可选的技术是快像、全场显微镜。这些装置对于某些样本具有能在可以与本发明相媲美的分辨率和速度下获得图像的能力，然而，它们不是共焦，因此容易受背景荧光的影响，而且不能用于光截面样本。另外，不能方便地同步获得多参数数据。
与现有技术相比，本发明可以以足够快且多用途的方式对单个细胞或细胞群执行多参数荧光成像，用于化合物筛选。提供不仅用于获得并分析单个细胞的初始反应而且还另外测定样本群的变异性的方法和设备。另外，用亚细胞分辨率还可判断多重荧光的定位。最后，本发明可用于以视频速率快速成像变化的事件。综合这些能力，能够使研究进入到备选药物的作用机制的新领域。
本发明还可被用在基于荧光的生物化学分析的发明上，有些类似于那些被广泛应用于筛选化合物的方法中的表面闪烁分析。(“SSA”)。
图1(a)-1(f)描述了受体结合SSA的步骤。在图1(a)，具有挑选的受体12的可溶性膜10被加入到包含液体30的孔20中。这些膜从表达受体的细胞中分离出来。在图(b)中，放射性标记的配体14被加入到孔中。已知该配体对于膜受体具有高亲和力。最普通的放射性标记是3H,35S,125I,33P和32P。在图1(c)中，硅珠16被加入到孔中。这些硅珠表面包被有对膜有强烈粘着作用的小麦胚凝集素。硅珠具有3-8μm直径，由掺杂有闪烁剂的塑料材料制成。另外，图1(b)和1(c)描述的操作的顺序可以互换。
放射性标记通过发射高能电子或贝塔粒子衰减，该粒子根据放射性同位素的不同，传播约1-100μm才停止。如果该放射性标记结合到附着在硅珠表面的膜上，该贝塔粒子可穿入轨珠引起发光。如果该放射性标记分散在液体中，发射的贝塔粒子一般将不激发硅珠发光。在图1(d)中，检测由放射性标记衰减引起的硅珠的发光。在图1(e)中，待测化合物18被加入孔中。该分析的目的是判断这种化合物置换放射性标记配体的程度。如果放射性标记被置换并弥散到液体中，硅珠的发光将减弱。在图1(f)中，再次检测硅珠的发光。通过测定发光的减少，可以判断待测化合物的活性。
图2(a)-2(f)描述了另一个实施例的受体结合SSA的步骤。这个实施例除了在图2(a)-2(f)中描述的实施例使用在由掺杂了闪烁剂的塑料制成的孔底部22上涂布能够粘着膜的材料来代替硅珠外，基本上与图1(a)-1(f)描述的相同。结果，在图2(a)-2(f)描述的实施例检测孔底部的发光而不是硅珠的发光。
图3(a)-3(d)描述了一个酶SSA的实施例。在图3(a)中，掺杂闪烁剂的硅珠40与其上附着的放射性标记的肽42被加入到包含液体60的孔50中。在图3(b)中，待测化合物44被加入孔中。在图3(c)中，酶46被加入孔中。如果没有被抑制，酶46将从硅珠40上分离放射性标记肽42。结果，该放射性标记将弥散入液体中，放射性标记的衰减在硅珠40上将不产生发光。另一方面，如果该待测化合物44抑制酶46，典型的是通过封闭酶的活性区域，酶46将不能分离该放射性标记，则放射性标记的衰减将在硅珠上产生发光。在图3(d)中，测定该硅珠的发光，由此可以确定待测化合物的活性。
图4(a)-4(d)描述了另一个酶SSA的实施例。在图4(a)中，放射性标记肽42附着在掺杂了闪烁剂的孔底部52上。在图4(b)中，待测化合物44被加入孔中。在图4(c)中，酶46被加入孔中。在图4(d)中，测定孔底部的发光，由此可以确定待测化合物的活性。
上面的示例描述了SSA的一般原则，即被研究物的活性通过在闪烁剂的放射性衰减长度内的放射性标记数目的变化来分析。SSA的吸引力之一是没有附着在闪烁剂上的放射性标记在冲洗步骤中不需要从孔中移除。这就是SSA是相似的分析的原因。
放射性免疫测定(RIA)是受体结合分析的特异形式，这里受体是一种抗体，配体最常见的是天然或合成肽、蛋白质、糖酶或小有机分子。RIA是一种间接的方法，用于测定在任何待测样本，最常见是诸如血浆、脑脊液、尿、或细胞提取液等生物样本中的配体浓度。在标准RIA，抗体对于配体具有特异的亲和力，该分析包括抗体、固定浓度的放射性标记和未知浓度的未标记配体。未标记配体的浓度通过它结合抗体，从而阻挡了标记配体的结合的程度来判断。RIA最常用于执行类似于需要用冲洗步骤将未结合配体与结合的配体分离的分析。RIA已经被发展成使用SSA的结构，其中抗体受体被附着在掺杂于硅珠中的闪烁剂上，冲洗步骤被省略。
然而，SSA和RIA也有许多不足。首先，这些分析需要处理放射性材料，这既费钱又费时。第二，这些分析仅仅在较大的孔中才能有效。从硅珠或孔底部发射的发光率与贝塔粒子的发射率成正比。一个典型的3H分析产生少于每3H衰减检测的光子。为增加分析的速度，必须增加放射性标记配体的量，相应的膜、硅珠和待测化合物的量也要增加。为了在10-60秒时间执行氚SSA，需要使用107个硅珠。这种硅珠的量需要大约150μL的孔。SSA在用于筛选大量化合物所需的μL-体积的孔中无效。
本发明用荧光标记配体代替SSA和RIA中使用的放射性标记配体，如下面将要描述。这样的方法，它引用了类似RIA的形式并保留了SSA的形式。这对于μL-体积的孔特别重要，因为表面张力使得不可能进行冲洗。然而，以相似的形式，荧光可能出现如受体结合分析描述的一样的问题。当加入待测化合物时，一些荧光标记配体被置换出来，弥散游离于孔的容量中，而其它仍附着在膜上。这是用来判断待测化合物活性的荧光标记配体的荧光附着在膜上。但是，如果从整个孔中检测荧光，游离于孔中的荧光标记配体的发射将会干扰附着在膜上的荧光标记配体的发射。
这里提到的问题在Schroeder等的美国专利申请号5,355,215中的图5(a)和5(b)中示出。根据Schroeder等的方法，样本被直接用以斜角放置在孔底部的光束134照射，如图5所示，所以它不能照射整个孔。另外，当光束照射区域114｀，荧光只有从位于孔容积下方接受最小量照射的区域114a才能检测到。
然而，Schroeder等的方法仍有很多不足。首先，因为它检测的仅仅是孔底的一小部分，只有用足够的准确度在足够大的孔上才能执行Schroeder等的方法。它不适于成像放置在1536孔板的直径约1mm的孔中的样本。第二，它的几何结构限制了照明角度，排除了使用高数值孔径的光学组件的可能，而这是成像微米尺寸物品，如位于孔底部的单个细胞以达到足够的光敏度和分辨率所需要的。
解决这个问题使用的另一个方法是点扫描显微镜。例如，Baer等人的美国专利申请号5,547,849中，阐述了点扫描共焦***的使用。Baer等人的方法是通过牺牲空间分辨率来增加点扫描共焦技术固有的成像获取时间的缓慢速度。例如，人们在一定条件下将样本上的照明光束直径扩大10倍，则照明区域增加100倍，容许人们以100倍的更快速度扫描。但该速度的获得是以损失分辨率为代价。此外，像公开在｀849专利里的、适合所述的扫描方法的这些检测装置，将它们用于本发明则灵敏度太低。最后，背景反射程度和分辨率一起变低。因此，公开在｀849专利里的装置与本发明相比，具有更低的灵敏度、更高的背景和更低的分辨率，而所有这些在现今的应用中都很重要。
本发明包括新颖的线扫描共焦显微镜。线扫描共焦显微镜是现有技术所熟知的。两个具有代表性的实施例是在White等的美国专利申请号5,452,125和由Brakenhoff和Visscher出版的J.Microscopy 17117-26(1993)图7所示。两者都使用了一个扫描镜去扫描通过样本的照明。相同的扫描镜用来去扫描(de-scan)荧光辐射。经过一个狭缝进行空间滤光后，荧光集团被再次扫描以利于裸眼观察。振荡镜的使用使得这些显微镜能够快速扫描视野。线照明主要用在需要快速成像的应用中。线照明的平行性所固有的潜在速度与点照明相比的增加，只有在成像***能够同时沿照明线检测到从样本的每个点发射的光时才能实现。该公开的仪器的一个基本特征是具有在与物面共轭的平面上的多种的、独立的检测元件。
根据本发明，样本必须位于成像***的景深决定精确的“平面性”的“平面”中。在一个优选实施例中，成像区域是1mm2而景深是10μm。因此，如果整个视野都要被同步聚焦，样本必须是1％的平坦。这对于位于局部区域(如孔底部的中心区域)的许多样本衬底(例如微量滴定板)是正确的。然而，要求样本衬底在整个表面都平坦是不实际的。因为微量滴定板具有约～100mm范围，需要10,000分之一的平面性。
本发明提供的光学自动聚焦***能够维持将要成像的样本衬底的部分“聚焦”。光学自动聚焦机构具有快速，且能够在非导体基质例如塑料微量滴定板和显微镜载玻片上操作的优点。再有，这种聚焦机构具有可忽略的操作延迟，即，聚焦机构的反应时间相对短于图像获取时间，最好是几分之一秒。适合于现今应用的基于光学的自动聚焦机构是大家都知道的。例如，用于产生适用于伺服控制的定位误差信号的基于像散透镜的***在Applied Optics 23 565-570(1984)中公开，和使用“偏斜光束”的聚焦误差检测***在SPIA200 73-78(1979)公开。在本发明的一个优选实施例中，样本衬底是一个微量滴定板。在这种情况下，完成聚焦的较好的方法更依赖于该板的特性。如果该板的底部厚度是均一的，是焦深的一小部分，则维持板底部在与物面有一个恒定偏差的聚焦机构就已足够。但现在普通使用的微量滴定板底部是不够均一的。因此，聚焦机构必须跟踪样本驻留的表面，这通常是在微量滴定板的孔中。本发明的一个特征是使用一个新颖的自动聚焦机构，用于快速聚焦不连续表面，如微量滴定板的孔底部。
因此，需要一种方法和设备用于准确、快速并价廉地、以相似的形式筛选大量的化合物。另外，还需要一种方法和设备能够以足够成像单个细胞和亚细胞事件的分辨率执行多参数荧光成像。还需要一种能够以视频速率附加监测统计学上显著的细胞群的成像***。
本发明涉及线扫描共焦显微镜，以及线扫描共焦成像***(LCI)进行生物活性分析的用法。
在一个优选实施例中，该线扫描共焦成像***采用用于照明样本和激发荧光基团发出电磁能的多波长激光光源。这些波长包括紫外光谱以及可见光。
本发明能够使用自动聚焦性能在微孔板上进行一连串快速分析，这种自动聚焦性能容许该LCI***能够迅速地从一个孔移动到另一个孔，而不会丢失共焦显微镜分辨薄的光截面这个固有能力的优点。
在本发明的各个实施例中，移动样本来影响在该样本上的照明线的扫描。在另外的实施例中，振动反射镜用于产生迅速移动的照明线，该线影响留存在固定位置的样本的扫描。举个例子，图像能够以每秒高达50帧的速度获取。
本发明最好提供整合的分配，以容许附加的物质迅速启动生物事件的变化，如神经或肌肉细胞的动作电位的传播。
本发明最好使用多元件固态检测装置如电荷耦合器件(CCD)。这种装置最好能够连续的读取。在一个优选实施例，本发明使用了一个矩形CCD，它避免了对全二维检波器的需要，允许高的读取速度。另外，在一个多级扫描实施例可达到大的有效视野。
本发明还在一个优选实施例中提供了在采集数据的同时进行特定的数据分析，从而允许以一个高事项处理吞吐量筛选模式操作的性能。
本发明提供了利用荧光进行多种生物分析的方法。在一个实施例中，被研究的靶物质可以在一个固定的细胞或活细胞内，或在亚细胞器内或细胞膜上。这些分析包括对一个或多个参数的判断，该判断需要激发一个或多个荧光标记，其中的荧光标记一般来说对入射光的不同波长敏感。此外，这些分析需要以一个或多个波长发射的光的同步和精确的成像，并从该成像判断荧光标记的标本在两维或三维中的位置和强度以及它们的相关性。
此外，本发明提供一种方法来执行这样的分析，该分析需要或者依赖荧光发射的反应而单独成像，或者是同样区域或细胞的快速重复成像。在各个实施例中，成像以每秒50帧的速度执行。在多波长情况下、以高空间分辨率快速地成像的这种能力允许本发明执行不能够被提前执行的分析，或者以一种高级方式执行这些分析。
本发明涉及用于筛选化合物，以及用于各种牵涉使用荧光基团或荧光探针的多种类型分析的几种方法。一般来说，这些分析和筛选程序包括待测化合物和试剂的使用，它们中的一些或全部是固有荧光，用荧光标记或代谢成为荧光产品。待测化合物和试剂可以各种方式结合。
在一个实施例中，试剂被加入到包含液体的孔中。这可以是一个单孔或者多孔板上许多孔中的其中一个孔。被研究物质的生物学活性通过由线扫描共焦显微镜测定的在位于孔底部或在孔底部的硅珠表面存在或不存在荧光集团来确定。该实施例和SSA形式一样，即从检测的标本的局域化来判断活性。在SSA情况下，局域化接近于闪烁剂的中心。在本方法中，定位是一个孔的区域，最好在底部。在SSA中，邻近的标本的敏感性由贝塔粒子的衰减长度来确定。在本方法中，对于局域化的荧光的敏感性通过共焦显微镜的光截面深度来确定。
另外，本发明可以快速、自动的方式执行需要筛选多个样本的高事项吞吐量分析。这些样本可以是单独的微孔，或可以是包含有液体、活细胞、固定细胞或细胞成分的孔。本发明还提供在分析期间需要保留液体样本或维持活细胞活性的环境对照。
本发明的其它目的、特征和优势从下面的详细描写中将变得很明显。
图1(a)-1(f)示出了第一受体结合的SSA。
图2(a)-2(f)示出了第二受体结合的SSA。
图3(a)-3(f)示出了第一酶的SSA。
图4(a)-4(f)示出了第二酶的SSA。
图5(a)和5(b)是用于成像放置于孔底的样本的现有技术的设备的概略图。
图6是根据本发明的用于成像样本的线扫描共焦显微镜的第一实施例的概略图。
图7是现有技术显微镜的概略图。
图8(a)和8(b)分别是本发明的没有扫描镜的彩色实施例的射线路径的顶视图和侧视图。图8(c)是单束自动聚焦的射线路径的顶视图。
图9(a)和9(b)分别是本发明的具有扫描镜的彩色实施例的射线路径的顶视图和侧视图。图9(c)是单束自动聚焦的射线路径的顶视图。
图10是两束自动聚焦***的侧视图。
图11(a)-11(c)示出了矩形CCD照相机和读出寄存器。
图12(a)和12(b)是本发明的线扫描共焦显微镜使用传统的暗视野成像形成的射线路径的截面图。
图13(a)和13(b)是本发明的线扫描共焦显微镜使用倒置暗视野成像形成的射线路径的截面图。
图14是本发明的线扫描共焦显微镜使用倒置暗视野成像形成的射线路径的截面图，这里的区域大于被照明的样本平面的衍射极限区域。
图15(a)-15(f)示出了根据本发明的受体结合分析的第一实施例。
图16(a)-16(f)示出了根据本发明的受体结合分析的第二实施例。
图17(a)-17(f)示出了根据本发明的酶分析的第一实施例。
图18(a)-18(f)示出了根据本发明的酶分析的第二实施例。
图19(a)-19(p)示出了成神经细胞瘤细胞钙离子对氨甲酰胆碱的反应。示出了分别在预注射时间，0,1.2,2.4,3.6,4.8,6.0,7.2,8.4,9.6,10.8,12.0,13.2,14.4,15.6秒的反应(即，图19(a)-(o))
图20(a)-20(h)示出了成神经细胞瘤细胞钙离子对50mM的KCl的反应。示出了分别在0,0.6,3.0,5.4,7.8,10.2,12.6和15.0秒的反应(即，图20(a)-(h))
图21(a)-21(c)示出了同种活细胞受体结合分析。图21(a)示出了荧光素标记的肽配体染色的细胞。图21(b)示出了细胞质用LDS751染色产生的掩膜。图21(c)是图21(a)和21(b)的重叠，它显示了可变的受体活性。
图22(a)-22(d)示出了同种活细胞受体结合分析。图22(a)是标记的和未标记的配体竞争性结合细胞表面受体的图示。图22(b)-22(d)显示在表中指定位点的免疫荧光反应的图像。
图23(a)-23(d)示出了有Cy3标记配体的同种活细胞受体结合分析。
图24(a)-24(d)示出了具有不同数目Cy5标记的4μm直径硅珠。图24(a)显示了没有标记的硅珠的图像。图24(b)-(d)分别显示了每珠平均17,170或1700Cy5标记分子的硅珠的图像。图24(d)显示的图像比图24(a)-24(c)的图像尺寸缩小了10倍。
图25(a)-25(c)示出了如表中的离子通道分析的数据。图25(a)涉及成神经细胞瘤细胞与附加的氨甲酰胆碱的反应。图25(b)-(c)显示成神经细胞瘤与附加的50mM KCl的钙离子的反应。
列在这里的所有专利申请、出版物和别的参考材料的整体被引用作为参考。
本发明用于鉴别疾病治疗所用的药剂。这里提供一种使用一种或多种荧光试剂测定生物反应的、可进行多种生物分析的高吞吐量处理事项的方法。这种分析可在化学混合物或任何被研究的生物制剂分子，包括但不仅仅限于例如那些在组合库中发现的药物试验品。另外，本发明提供一种用于从细胞和组织样本中诊断病理状态的方法。本发明还提供一种用于使用荧光试剂显示药物试验品对整个细胞的多种生物反应的方法。
本发明的技术可以用在分析以足够快的速度从单个细胞、细胞的或亚细胞水平的数据，从而容许在足够量的构成有统计学意义的细胞群样本中获得这种数据。本发明可进行多参数同步测定，以及从单个细胞使多个信号相关。因此它可被用在分析多相细胞反应，以及分析限定的小细胞亚集的反应。
另外，本发明可以成像多重信号通路的同步激活，并使这些多重信号同时相关或随时间相关。当一个特定的分析需要单个细胞的瞬时反应或对照的单个细胞的瞬时反应时这种性能显得很重要。
另外，本发明可以在存在未结合的荧光集团或在化合物，包括潜在的药物试验品中存在固有荧光时从细胞的共焦平面成像荧光信号。
这些分析可以使用任何已知的荧光团或荧光标记，包括荧光素、若丹明、Texas Red、Amersham Corp.的染料Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7、Hoechst的核染料核Coumarin染料。(见Haugland,R.P.荧光探针和研究化学手册,第六版,1996,分子探针,Inc.,Eugene,Oregon.)。
这些分析包括但不仅限于此：受体结合分析、细胞内电位或pH分析、离子浓度分析、酶活性分析、交通分析、动态成像分析和珍贵细胞事件分析。
受体结合和酶活性分析可以是基于硅珠的或基于细胞的分析。基于硅珠的一些例子在WO98/55866中被描述。然而，那里描述的方法使用的是点扫描共焦技术，而本发明使用的线扫描共焦成像***在数据采集率方面具有显著优势。
光学结构
图6显示本发明的第一实施例。该显微镜包括例如在光射距350-750nm内的电磁辐射源400或410，柱面透镜420，第一裂孔膜430，第一中继透镜440，分色镜450，物镜470，包含二维阵列的样本孔482的微量滴定板480，管透镜490，滤镜500，第二裂孔膜510和检测器520。这些元件沿光轴OA排列，裂孔膜430、510上的裂隙孔径432、512与图6的平面垂直伸展。透镜440、470和490的焦距和这些透镜之间的距离与裂孔膜430和透镜440之间的距离，物镜470和微量滴定板480以及透镜490和裂孔膜510之间的距离相等，如此提供一个共焦显微镜。在这一实施例中，使用柱面透镜420聚焦从灯400或激光器410发出的电磁辐射成一条直线。该线的形状经第一裂孔膜430优化。裂孔膜430在光学***的图像平面上被描述，该平面与物面共轭。由裂孔膜430上的孔径432形成的照明条带通过透镜440、分色镜450和物镜470中继到包含二维阵列样本孔482的微量滴定板480。为方便说明，图6的光学元件以截面形式，孔板以可透视形式来描述。照明光线在孔板480上的投影由线484形成，可以理解它同样垂直于图6的平面。如箭头A和B所指，孔板480可以在平行于阵列(未显示)的方向在二维(X,Y)方向移动。
在另一个实施例，裂孔膜430位于光学***的傅里叶(Fourier)平面，即与物镜的后焦平面(BFP)460共轭的平面。在这种情况下，孔径432位于图中的平面上，透镜440转播由孔径432形成的照明条带在物镜470的后焦平面460上，它转换光线成为垂直于图6的平面的物面上的线484。
在另一个实施例中，该裂孔膜430被完全移动。根据该实施例，照明光源是激光器410，从激光器发出的光线被聚焦到物镜470的后焦平面460。这可以通过如图6所示的柱面透镜420和球面透镜440的组合，或可以用柱面透镜直接聚焦光线到平面460来完成。
通过投影照明光线到样本平面，反射那里的荧光发射到检测器520，在垂直于光线的方向移动板480，可以与检测器520的读取同步获得样本区域，例如在样本孔482内的样本的图像。在图6描述的实施例中，荧光发射被物镜470收集，经双色分光镜450投射，穿过滤镜500和第二裂孔膜510由物镜490反射到检测器520上，这样适合于具有无穷远校正物镜470的共焦成像***。双色分光镜450和滤镜500优先阻挡在照明波长内的光线。检测器520实际上是一个照相机，可以是一维或两维的。如果使用的是一维检测器，则不需要裂孔膜510。在指定区域被成像前，照明、检波和转换连续进行。如果样本以连续的速率转换则机械运动可以简化。如果照相机读取时间小于曝光时间，则连续运动是最有用的。在一个优选实施例中，照相机被连续读取。在合并的曝光时间和读取时间内，样本的位移d可以大于或小于照明线宽度W，例如0.5W≤d≤5W。多孔板上所有的孔都可以同样的方式成像。
另外，显微镜可以被构造成聚焦照明光线穿过许多相邻的、主要由光学***的视野所限制的孔，结果，可以同时使用一个以上的显微镜。
照明条带484的大小和形状由物镜后焦平面460的富里叶变换条带的宽度和长度确定。例如，线484的长度由460上线的宽度确定，相反，484的宽度由460的长度确定。对于衍射极限性能，挑选在460处的照明条带的长度以充满物镜后部孔径。本领域的熟练技术人员很容易理解，照明条带484的大小和形状可以被柱面透镜420的焦距和420处束斑大小的组合控制，即由每个尺寸上的有效数值孔径、物镜的像差和物镜视野的限制所控制。
选择照明线484的尺寸以优化信噪比。结果，它们是样本依赖的。根据该分析，分辨率在衍射极限之间变动，即，少于0.5μm，大约为5μm。束斑的长度最好由物镜的视野确定，例如在0.5和1.5mm之间。例如，尼康ELWD,0.6NA,40X物镜有大约0.75mm的视野。这种物镜的633nm辐射的衍射极限分辨率大约是0.6或大约为1100分辨单元。
有效深度分辨率主要由裂孔膜510上的孔径宽度512或一维检测器宽度和由物镜470及透镜490联合产生的图像放大倍数确定。共焦显微镜的最高深度分辨率接近1μm。在本申请中，5-10μm高的深度分辨率已经足够或者说非常好了。
例如，当被研究的样本，如活细胞，在衍射极限体积中包含的荧光基团不足以允许在足够短的图像获得时间内得到满意的信噪比图像，照射和收集从比衍射极限体积大的体积中的发射是有利的。在以视频速率动态研究瞬态事件，例如离子通道开放的一个类似的情况下更适合用这种方法。实际上，这可以通过充满物镜的后部孔径，等同于增加照明孔径的直径的方法来完成。照明的有效数值孔径(“NA)小于物镜的NA。然而，荧光发射以物镜的全NA被收集。孔径512的宽度必须增加，以检测较大的照明体积的发射。在孔径宽度大于衍射极限几倍时，几何光学给检测体积单元的尺寸提供一个足够的近似值。
横向深度： a d = d d / M
轴向深度： z d = 2 a d / tan α
这里，M是放大倍数，dd是孔径512的宽度，α是物镜470所对着的半角。本发明的重要部分之一就是实施例中照明孔径432或它的等价物在没有孔径及检测孔径512时可被单独控制。多波长结构
启用多波长荧光成像的实施例对某些分析类型是较合适的。由于在生物反应领域时间是一个重要因素，所以两种或者多种测量方法同时进行，一般来说是有利的，而且也是必要的。
独立波长或色彩的数量与执行的具体分析有关。在一个实施例中，使用了三个照明波长。图8(a)和8(b)分别从顶视图和侧示图，图示了三色(three-color)线扫描共焦成像***中的射线路径。总之，该***包括几个电磁辐射源Sn、校准透镜Ln和镜子Mn，该镜子用于产生由柱面透镜CL聚焦成为第一空间滤波器SF1上的细长束斑的校准束斑，位于第一空间滤波器SF1和第二空间滤波器SF2和成像透镜IL、射束分离器DM1和DM2以及检测器D之间的共焦显微镜，用于从样本中分离和检出荧光辐射的不同波长成分。空间滤波器SF、SF1和SF2最好是裂孔膜。
特别是，图8(a)描述了关于颜色λ1、λ2和λ3的光源S1、S2和S3，以及校准来自各自光源的光线的透镜L1、L2和L3。透镜L1、L2和L3最好调整成能够补偿该***中的别的透镜的任何染色。镜子M1、M2和M3用于组合来自光源Sn的照明色彩。镜子M2和M1部分透射、部分反射并且最好是双色的。
在共焦模式下操作显微镜需要把来自光源Sn的经组合的激发光源聚焦成在物面OP上的“线”，或者高偏心椭圆。象以上结合图6所作的讨论那样，可以使用多种的配置实现这种功能。在图8所描述的实施例中，经组合的照明光源由柱形透镜CL聚焦到被拉长的椭圆，该椭圆与空间滤波器SF1中的缝隙一致。象图8a和8b中所画的那样，裂孔膜SF1放在该***的图像平面内，摆放成垂直于照明光线的传播方向，并且其长轴处于图8a的页面内。透镜CL和OL中继从包含SF1到物面OP的照明光线。旋转镜TM的作用是方便使用。在另一个实施例中，DM3位于TL和OL之间，CL把照明光线直接聚焦到BFP。对于本领域的熟练技术人员来说，别的实施例是显然的。
参考图8(b)，由样本发出和由物镜OL聚集的光线被管状透镜TL成像到空间滤波器SF2上。SF2最好是被摆放成垂直于页平面延伸的缝。因此，通过滤光器SF2的光基本上是一条照明线。SF2可以被放置在初始成像平面或任何那里的共轭平面。DM3是部分反射，部分透射，最好是彩色。可得到最好能够反射一定波段内的波长而透射其余波长的多波长“双色”镜，或“彩色”镜。
δλ1定义为由λ1激发的荧光辐射。一般来说，这是比λ1稍长的波长分布。δλ2和δλ3的定义相似。DM3优先反射λn，优先透射δλn,n=1,2,3。由SF2透射的光被成像在检测装置上，该检测装置位于与初始成像平面共轭的平面上。在图8(a)中，空间滤波器SF2的图像是由透镜IL产生于所有三个检测器，Dn上。这个实施例是在需要几乎完全的记录在由各自检测器产生图像之间的应用中优选出来的。在另一个实施例中，各个透镜ILn与检测装置相连，一对透镜IL和ILn用作中继空间滤光器SF2的图像到各个检测器Dn。光线在检测器中被镜DM1和DM2分离。镜是部分透射、部分反射、最好是双色。DM2优先反射δλ2并且优先透射δλ3。阻挡滤光片BF2和BF3分别优先透射δλ2和δλ3，有效阻挡所有出现的其它波长。
扫描镜结构
在本发明的一些实施例中，高速数据采集需要在视频速率取景图像。视频速率成像一般每秒30到60帧。在目前的应用中，意图暗示具有30Hz数量级的帧速。在一个优选实施例中，通过沿样本平面的一维照明，以及通过扫描在垂直于它的方向上的照明束斑，以使得引起照明和样本的相对位移，来实现视频速率成像。该扫描级一般来说量很大。因此，它不能迅速充分地移动。
图9描述了使用扫描镜SM的本发明的一个实施例。该镜子较适合放在与物镜后焦平面(objective back focal plane,BFP)共轭的一个平面上：在该BFP(或与其共轭的平面)里的旋转引起该物面(OP)和它的共轭平面里的位移。对于透镜RL1和RL2的聚焦长度的典型值来说，SM的整个扫描范围仅仅需要几度。如图9所示，这一对透镜把BFP以放大率为1成像到SM上，但可以很方便地使用各种放大率。图象获得速度的限制因素是照相机的读取速度和信号强度。在以上所描述的成像模式中，数据能够以照相机的读取速度，例如1MHz，连续地获得。最好用扫描镜单向地获得数据。允许人们连续地获得数据的理想扫描移动是锯齿移动。在实践中，折返和返回的扫描时间的组合将构成～1/3-2/3个扫描周期。假设空载时间为50％，则50Hz的镜子振动频率和1MHz～10,000像素的像素获得率，将以每秒50帧获得每一帧，这足够用来一帧一帧地分辨和跟踪诸如细胞之类的单独物品。但每个图像104个像素，比以上考虑的一般情况少102倍。根据该应用，其优势是在高分辨率下获得相对小的图像，而在较低的分辨率下获得相对较大的图像，例如在像素为0.5μm×0.5μm时图像为50μm×50μm，而在像素为2μm时图像为200μm×200μm。
自动聚焦
根据本发明，样本必须位于成像***的物面内。因此，本发明提供一种自动聚焦机构，它把该成像***的视野中的样本部分维持在那个***的物面之内。平面化的精确度由该***的景深确定。在一个优选实施例中，景深约等于10μm，而视野约等于1mm2。
公开的自动聚焦***以可以忽略的延迟运行，即其响应时间相对于该图像的获得时间来说较短，比如0.01-0.1s。此外，该自动聚焦光源独立于照明光源和样本特性。尤其是该配置允许该样本容器的位置顺着成像***将被独立于物面的位置确定的光轴放置。
图8和9提供了单束自动聚焦的一个实施例，其中示出了波长为λ4的单独光源S4和检测器D4。波长为λ4需要区别于样本荧光，特别是一个不能激发样本中的明显的荧光的波长。因此，λ4最好为近红外光，例如为800-1000nm。部分透射、部分反射镜DM4最好是二色性的，反射λ4和透射δλn,n=1,2,3。适用于本发明的基于光学的自动聚焦机构是公知的。例如用于产生适合于伺服控制的位置误差信号的、基于散光透镜的***公开在Applied Optics 23 565-570(1984)。使用“非对称束”的聚焦误差检测***公开在SPIE 200 73-78(1979)。后者的方法容易根据图8和9实现，其中的D4为分开的检测器。
为了使用具有在孔底放有样本的微量滴定板，伺服回路必须中断，以便在孔之间移动。这会引起相当大的时间延迟，原因是每一次照明被移动到另一个孔时都需要重新聚焦。
在本发明的图10所示的优选实施例中，提供了样本平面和物面的相对位置的连续闭环控制。该***使用两个独立的电磁辐射束。来自S5的那一个聚焦在连续平面，例如微量滴定板的底上。来自S4的那一个聚焦在非连续平面，例如微量滴定板的孔底上。在一个实施例中，来自S4和S5的束斑分别具有波长λ4和λ5。λ4由L4校准，由光圈I4形成孔，由物镜OL聚焦到不连续的表面。λ5由L5校准，由光圈I5形成孔，由物镜CFL和物镜OL共同聚焦到连续的表面。反射的光分别由透镜IL4和IL5聚焦到检测器D4和D5。部分透射，部分反射镜DM4最好二色性的反射λ4和λ5，透射λn和δλn,n=1,2,3。镜M4,M5和M6是部分透射，部分反射。在λ4和λ5不同时，M6最好是二色性的。
根据该实施例，其中样本留存于微量滴定板中，λ4被聚焦到孔的底部。物面可以在可变距离内偏移孔底部。这可以通过调整L4或通过伺服控制回路内的偏移调整来完成。为描述方便起见，可以假定λ4聚焦到物面。
自动聚焦***的操作描述如下。如果样本孔的底部不在物镜OL的焦平面，检测器D4产生一个通过开关SW提供给Z控制的误差信号。Z控制用于移动微量滴定板朝向或离开物镜的马达(未显示)。另外，Z控制可以移动物镜。如果微量滴定板的底部PB不在透镜CFL和物镜OL组合的焦平面，检测器D5产生一个通过开关SW提供给Z控制的误差信号。一个XY控制控制用于移动微量滴定板到物镜OL的物面OP的马达(未显示)。
如指示的，整个扫描在计算机控制下进行。下面举一个扫描的例子：在一个特定的孔的成像完成后，计算机运行SW以将伺服机构的控制从由D4产生的误差信号切换到D5产生的误差信号。然后计算机指令XY控制去移动板到下一个孔，之后伺服又切换回D4。
利用板底部的信号的“粗”聚焦机构被用来维持样本平面的位置在板底部的厚度中的孔到孔距离内，从而需要“细”聚焦机构搜索的范围被减小。例如，光圈I5的直径是2mm,IL5是100mm，则在检测器上的图像尺寸将是～100μm。同样，如果光圈I4直径是0.5mm,IL4是100mm，则在检测器上的图像尺寸将是～400m。后者被选成低灵敏度以使得它起“粗”聚焦作用。
象以上描述的含单-束斑的实施例那样，波长λ4和λ5需要区别于样本荧光，特别是不能激发样本中的明显荧光的波长。因此，λ4和λ5最好接近红外线，例如为800-1000nm。此外，这两个波长最好是有区别的，例如λ4=830nm、λ5=980nm。
在二-束斑自动聚焦的另一实施例中，λ4=λ5并且这二束斑可以来自同一源。最好这二束斑被偏振成相互垂直，和M6是偏振分束器(beamsplitter)。
在按以下方式操作的单束自动聚焦的优选实施例中，提供伪闭环路控制。在所述板移动到SW在其后被切换回D4的下一个孔的同时，计算机在一次扫描的末尾操作SW把控制切换样本固定装置，该装置维持Z控制输出在一个恒定水平，此时板被移动到下一个孔，之后SW被切换回D4。
检测装置
这里公开的设备的基本特征是在与物面共轭的平面内，使用了具有多种独立的检测元件的检测装置。如以上所述，线照明的优势主要在于需要迅速成像的应用中。与点照明情况相比较，潜在的速度增加是线照明的平行性固有特点，然而只有该成像***有能力同时检测沿照明线发射自样本的每一点的光线，才能实现。
在以上描述的现有技术的成像***(White等,US5,452,125和Brakenhoff and Visscher,J.Microscopy 171 17-26(1993))的输出处安装一个电荷耦合装置(CCD)或别的照相机也是可以的。但这样构成的设备与本发明相比有三个显著的缺点。一个是需要把图像重新扫描到二维检测器上，这增加了对设备来说是不必要的复杂度。另一个是需要有超过一般体系结构照相机的1000像素×1000像素的足够高质量的全二维检测器。第三个缺点是需要额外的时间从二维装置中读取整个图像。
本发明被设计用来避免这些缺点，并且不但在高灵敏度和低噪声检测的限制条件下优化成像速度，而且优化吞吐量。一个实施例使用连续读取的线照相机，而在一个优选实施例中把一个矩形CCD用作线照相机。这两个实施例在一个图像内的线之间、或者图像之间都没有空载时间。本发明的一个附带优点是：在阶段扫描实施例中可获得更大的有效视野，这将在以下讨论。
该检测装置的必要特性通过考虑下列优选实施例，能够进一步得到阐述。物镜的分辨率极限是＜1μm，一般为～0.5μm，检测器包括由～1000个独立元件组成的阵列。分辨率、视野(FOV)和图像获取速度都不是独立变量，需要在这些性能参数中协调。总的来说，该光学***的放大率设置成在不牺牲分辨率的情况下，使得图像尽可能和FOV一样大。例如，～1mm的视野能够以1μm的像素点成像在1000个元件阵列上。如果检测元件是20μm平方，则***的放大率将设置成20X。注意这不会产生1μm分辨率。像素点不等于分辨率。例如，如果物镜的固有分辨率极限为0.5μm，并且物面中的每一个0.5μm×0.5μm区域映射到一个像素，则产生的数字图像的真实分辨率不是0.5μm。为了获得真实0.5μm分辨率，该像素点必须与物面中的一个0.2μm×0.2μm区域相对应。在一个实施例中，成像***的放大率设置成能获得真实的光学分辨率。
目前，具有适合于本申请的足够读取速度的最高检测效率、最低噪声的检测装置是CCD照相机。在图11中示出了一个具有mxn个检测器元件阵列的矩形CCD照相机，其中m严格小于n。荧光发出的图像覆盖了最好地接近到读取寄存器的一行。这使得传输时间最小，并且避免了把被照明的行和读取寄存器之间的行中的假数累加到信号中。
理论上，人们能够把光学***的放大率设置成使得CCD照相机上的缝隙SF2的图像的高度为一个像素，如图11所示。但在实践中，难于在照明线和照相机的行轴之间保持完全对准，更难于如在图8和9示范的多波长实施例中的三个照相机和照明之间保持完全对准。通过在照相机的每一行中把多个检测器元件，例如二到五个，缠绕在一起，在读取噪声或读取时间受到最小损失的同时，对准条件可以放宽。
具有一个或多个矩形CCD照相机作为检测装置联合可变宽度检测的空间滤波器，如图8和9中的SF2以及图6中的510，每个都安装在与物面共轭的平面，该优选实施例的另一个优势将在下面阐述。如上面所讨论的，在本发明的一个实施例中，检测空间滤波器被省去，线照相机(line camera)被用作检测空间滤波器和检测装置的组合。但是如上面讨论的，可变宽度检测空间滤波器允许优化检测体积从而优化样本依赖的信噪比。下面的优选实施例保留了线照相机的优点，即速度和可变检测体积的弹性。设定放大倍数从而在照相机的一行上成像一个衍射极限的高度h的线。检测空间滤波器的宽度最好在h≤d≤10h之间可变。在照相机的照射柱上的检测器是双向的(binned)，在读之前，与曝光和读出时间相比，它需要一个可忽略时间的操作。
在一个优选实施例中，照相机是Princeton InstrumentsNTE/CCD-1340/100-EMD。在一个优选实施例中在少量读噪声电子的情况下读出率是1MHz。图象格式是1340×100，照相机可以连接电线以将大部分行(80％)从研究区域移开，使照相机在1340×20处更有效。
除了上面提到的连续读照相机的优点外，即在连续获得之间无空载时间，另一个优点是它允许获得其长度仅仅由样本的范围限制的矩形图像。该长度由更小的照相机宽度和照明线的范围确定。在一个优选实施例中，样本被放置在96孔微量滴定板的孔底部，直径是7mm。被照射的带是1μm×1mm，从照射区域发出的辐射被成像到检测装置上。光学系列被设计成视野是1mm2。根据本发明，孔底部的图像可在1×7mm视野的1μm像素上产生。环境控制
在本发明的一个优选实施例中对活细胞进行检测。活细胞检测常常需要接近生理状态以使它正常存活。重要的参数之一是温度。理想的是加入一个装置能够升高和降低温度，特别是，维持样本的温度在37℃。在另一个实施例中，还需要控制相对湿度，和/或CO2和O2以维持活细胞的生存力。另外，控制湿度以减少蒸发对于小体积样本来说很重要。
下面描述配置有可升高温度，最好是37℃，与LCI***兼容的微量滴定板的三个实施例。
成像***最好安置在避光的罩内。在第一个实施例中，通过维持整个密封罩内的温度来维持样本板到所需温度。然而，在37℃，除非升高的湿度被有意维持，蒸发冷却将减少样本体积从而限制检测时间。
第二实施例在微孔板上配备了加热罩，它允许微孔板在静止的罩下移动。罩在孔上方有单独一个开孔对准显微镜的光轴。这个开孔允许发散进入活动孔中，同时维持加热并限制板中留存物的循环。在加热的罩盘和微孔板之间约0.5mm的空间允许自由移动微孔板及减少蒸发。因为被观察孔的内容物通过发散孔被暴露于环境状态最多不过几秒钟，所说的内容物在检测期间不会遭受明显的温度变化。
在第三个实施例中，一个很薄的、加热的蓝宝石窗被用作盘底部的壳。一个电阻发热丝贴在孔的隔板上，维持窗的温度到所需的标准。
在另一实施例，三种公开的方法可以不同地组合。
综合分配器
在一个实施例中成像***的视频速率结构进一步配置成用定时试剂发送进行促发动力学分析，特别是离子通道分析，通道开放的启动通过发送溶液进入微孔来完成。例如，电压门控通道可通过加入KCl溶液使胞膜去极化来打开。通道开放和随后关闭的时间的依赖性和细胞内浓度的相应变化常要求以足够快的视频速率成像。然而成像***的固有速度是不相关的，除非通道反应可以被迅速地促发。
本发明的一个实施例提供了一种综合分配器。对于在96或384孔板上分析的运行，需要范围20-100μL的附加体积。例如单头分配器，是IVEK分配器2000，因为比较适合离子通道活性促效药的添加。可比单元可从CAVRO取用。一般地说，能够分配一种特定的化合物给每个孔就比较理想。一个实施例提供单头分配器在机器人运动装置上，该装置在分析站点、包含特定化合物的源板和顶端清洁站点之间往复移动分配器头。后者是对于固定的顶端分配器的清洁站和对于一次性顶端分配器的清洁站。这个***相对便宜地提供了所要的功能，但它效率低，每一种化合物的吸入-配制-清洁周期需要约30秒。替换用的实施例是通过提供诸如Hamilton Microlab MPH-96这样的多头分配器集成到公开的LCI***来。MPH-96由96个安装在能够执行上述的吸入-配制-洗涤周期的机器人运动装置上的、独立的固定的顶端分配器组成。
在本发明的另外一个优选实施例中，被用在自动筛选分析中的成像***集成有诸如Zymark Twister那样的操纵板机器人(plate-handling robots)。
暗视野共焦结构
在横向分辨率小于衍射极限的情况下，由悬浮液引起的背景荧光通过本申请的暗视野成像技术能够降低。图12(a)和12(b)示出了传统暗视野中的射线路径。在图12(a)，样本600由来自物镜620的光线610的空心锥照明。例如，这个光线的空心锥通过在图10(a)中的透镜440处放一根不透明的杆630来产生。在图12(b)中，从样本600散发出来的荧光穿过物镜620的中心后，被收集起来。由于照明和收集的角度不同，所以只有既被照明又被检测的平面才是包含样本600的平面。
图13(a)和13(b)示出了倒置的暗视野中的射线路径。在图13(a)，样本700用穿过物镜720中心的光线710的光束照明。在图13(b)中，仅仅从物镜720外边周围散发出来的荧光被收集到起来。从物镜720外边周围收集可以通过在图10(a)中透镜490处，例如放一根不透明的杆730来实现。象传统暗视野中一样，倒置的暗视野包括在一个角度的照射和在另一个不同的角度收集，从而仅仅样本平面既被照射也能被检测到。
图14描述在上述情况下的焦平面，其中照明一个比样本平面的衍射极限区域更大的区域是有好处的。照明和收集的射线与图3的倒置暗视野几何形状中那些相同。如果在与具有匹配于照明光束的宽度的透镜后焦平面共轭的平面上放一个光阑，则可得到该暗视野体系结构。从图14可以了解到，这种体系结构降低了不共面的荧光撞击检测器。来自上面的阴影区和下面的物面的荧光不穿过光阑。在点扫描共焦情况下，来自这些平面外区域的荧光被检测孔径有效地反射。在线扫描共焦情况下，来自沿该线的一侧位置的不共面荧光被提供给沿该线的另一点的背景信号：这是在相对于点扫描共焦的线扫描中信号-背景方面退化的起因。线扫描共焦的倒置暗视野体系结构恢复了点扫描共焦的背景反射属性的重要部分，同时保持了线扫描体系结构的速度优势。
实时数据分析
本发明可以连续产生每秒兆字节数据。在一个实施例中，***集成有快速高强度，大容量存储装置，实时数据可以被假脱机以在之后分析。在一个优选实施例，数据分析的运行基本上与数据采集同步进行。因此，数据在存储之前被处理。一般来说，只有分析的结果被存档，但它的优点是还同时存储了选择的原始数据。
实时分析程序的示例结合每一分析组被提供如下。在所有情况下，程序被用来优化操作研究物的硬件平台的软件密码。在当前的优选实施例中，计算机是32位处理器，如PentiumⅡ。在这种情况下，所有数据以32位数据包被存取。
一般情况下，数据的采集和分析包括许多不连续的步骤。首先，荧光被转换成一个或多个数字图像，其数值与入射到检测装置的每个像素上的荧光辐射强度成正比。在这一步，因为穿过视野的成像***的非均匀响应而进行了一个校正，其中被剔除数据的背景被称作平面场的文件分割。第二，一个二进制位图从这些数字图像之一产生，其中所有满足某一标准的值用1代替，所有不满足某一标准的值用0代替。在一个实施例，该标准包括由图像自身确定的阈值。第三，搜索该位图以查找相邻的1值像素组。在一个实施例中，该组还被相对于最小和/或最大尺寸标准进行测试。第四，对于合格的组，总和并记录在相同图像或另一图像中对应像素的值，确定和记录该总和的平均值和其它统计特性。下面将描述适合各种分析的、在这种基本程序上的添加和变异。
分析
下面描述的该分析方法的许多变异可根据本发明进行实践。一般来讲，用一个或多个荧光标记种类的特征空间和/或瞬间分布来量化该分析。优点是，荧光是使用线扫描共焦显微镜从基本上是平面的表面被观察的。这个截面通过一般根据相关数据分析程序的复杂性增加程度的分析类型而被组织。然而，这种组织并不严格，因为该分析算法常常可以用在不止一个分析类型中。结合分析
根据本发明的方法可以很容易地操作的第一型分析是结合分析。一般来说，用公开的线扫描共焦显微镜图像***获得的、包含至少靶物质和标记配体的样本的一个或多个荧光图像，量化荧光素标记配体与被研究的靶物质的结合度。使用的配体包括：荧光基团结合的天然或合成肽和蛋白质、糖、脂类、核酸序列、病毒质粒、抗菌素质粒、天然和合成毒素、已知药剂、有机小分子或神经递质的合成类似物、或自发荧光小分子、肽或蛋白质、从组合库中合成的化合物、cDNA文库的随机肽、蛋白质，和肽(peptidomimetics)(见Haugland R.P.荧光探针和研究化合物6th Ed.Chap.18)，但不仅仅限于此。靶物质包括：细胞提取物或受体纯化试剂、配体门控或离子门控通道蛋白质、酶、转录因子、细胞骨架蛋白、抗体和从病毒、细菌、抗菌素、无脊椎和脊椎动物细胞衍生的物质，但不仅仅限于此。示例性的受体包括：如乙酰胆碱、肾上腺素(α和β)、蕈毒碱、多巴胺、甘氨酸、谷氨酸盐、复合氨、天冬氨酸盐、γ-氨基酪氨酸(GABA)、嘌呤(purinergic)、组氨酸、去加肾上腺素、P物质、神经肽Y、脑啡肽、神经加压素、缩胆囊素(CCK)、内啡肽(阿片样肽)、黑色素(melanocriotin)/ACTH促肾上腺皮质激素、生长激素抑制素、甲状旁腺激素、生长激素、促甲状腺素、甲状腺素、细胞***素、(chemokine)、胰岛素、***(IGF)、干细胞因子、***释放激素、***、血管紧张素、内皮素、神经加压素、干扰素、缓激肽、抗利尿激素、催产素、血管活性肠肽(VIP)、促肾上腺皮质激素释放激素、神经营养素、红细胞生成素、***素、白三烯、凝血恶烷A2、降钙素、T细胞、LDL/HDL、表皮生长因子(EGF)、***和半乳糖酸(galainan)，但不仅仅限于这些。
基于硅珠的结合(bingding)
图15(a)-15(f)描述了可以根据本发明操作的受体结合分析的实施例的步骤。在图15(a)中，由细胞或组织制备的、包含靶受体212的膜210被加入到包含液体230的孔220中。在图15(b)中，荧光素标记配体214被加入到孔220中；这些配体结合膜受体212。在图15(c)中，硅珠224被加入到孔220中。另外，15(b)到15(c)的顺序可以颠倒，在一个优选实施例中，膜包被的硅珠是在加入孔里之前已经被分开制备好。硅珠224的直径范围大约是1-20μm，被敷有一层物质例如小麦胚凝集素，使膜220能粘附其上，或有一个表面允许膜直接共价或非共价结合。
前述步骤除了用荧光素标记代替放射性标记以外，均与图1(a)-1(f)描述的现有技术SSA的相应步骤一样。但是，在本发明中，硅珠224是不发光的，它们有一定密度因此它们会沉降到孔的底部，或被磁化从而在使用外部磁铁时可以使它们在孔底移动。在图15(d)中，荧光素标记被使用例如描述为元件240的线扫描共焦显微镜成像。在图15(e)中，一个待测化合物218被加入孔中。如现有技术的分析一样，本分析的目的是判断待测化合物从膜受体212置换荧光素标记214的程度。在图15(f)中，仍然结合在膜210上的荧光素标记被成像。通过比较两个荧光图像，可以确定待测化合物的活性。
在图15(a)-(f)描述的分析的另一个实施例中，在图15(d)描述的成像步骤可以省略，待测化合物的活性可通过将图15(f)获得的图像与对照孔图像，或与已知加入孔中的荧光素标记配体量和已知它们与受体的亲和力而获得的预期图像相比来确定。
在图15(a)-(f)描述的分析的一个特别实施例中，受体是可识别配体的抗体，荧光素标记与包含不定量未标记配体的样本一同加入进行反应。如现有的放射免疫测定技术一样，本分析的目的是通过测定从抗体受体中被置换的荧光素标记配体214的程度来确定样本中未标记配体的浓度。
表面结合
图16(a)-16(f)描述了根据本发明的受体结合试验的第二实施例的步骤。在图16(a)中，由细胞或组织制备的，包含靶受体252的膜250被加入到包含液体270的孔260中。孔底部262涂有一层物质例如可使膜粘附其上的小麦胚凝集素。在图16(b)中，显示了膜250结合在这层物质上。在图16(c)中，荧光素标记配体254被加入到孔260中并结合该膜受体252。另外，16(b)和16(c)的顺序可以颠倒。
在图16(d)中，荧光素标记的荧光被使用例如描述为元件280的线扫描共焦显微镜成像。在图16(e)中，一个待测化合物258被加入孔260中。在图16(f)中，仍然结合在膜250上的荧光素标记被成像，并与第一个图像比较，确定待测化合物258的活性。
在图16(a)-(f)描述的分析的另一个实施例中，在图16(d)的成像步骤可以省略，待测化合物的活性可通过将图16(f)步获得的图像与对照孔图像，或与已知加入孔中的荧光素标记配体量和已知它们与受体的亲和力而获得的预期图像相比来确定。
基于细胞的结合
在另一个实施例中，通过收集表达靶物质的细胞能够很容易地分析配体-靶物质结合。一般来说，用扫描化合物进行基于细胞的结合有很多优点。特别是在竞争和代偿这两种影响化合物生物活性的细胞程序都存在时，测量研究物的活性。在细胞分析中，从细胞系或组织制备的细胞被放在组织培养孔中或显微镜的载玻片上，细胞可以存活和不受损害，或者可被诸如地高辛一类的试剂渗透，或可用甲醛固定。一个或多个荧光素标记的配体和任何分析所需的无荧光素的试剂一起被加入细胞；荧光素标记配体结合一个或多个细胞内化合物。然后把待测化合物加入细胞。另外，荧光素配体和化合物的加入顺序可以颠倒。使用例如元件240描述的线扫描共焦显微镜成像荧光素标记。本分析的目的是测定待测化合物从受体中置换的荧光素标记配体的浓度。成像在有或没有待测化合物存在的情况下仍然结合在细胞上的荧光素标记，通过比较这两个荧光图像，可以确定待测化合物的活性。
在基于细胞的受体结合试验的另一个实施例中，可以省略没有化合物情况下的成像步骤，待测化合物的活性可通过将存在化合物时获得的图像与对照孔图像，或与已知加入孔中的荧光素标记配体量和已知它们与受体的亲和力而获得的预期图像相比来确定。
线扫描共焦显微镜在结合分析中的优势
在第一实施例，用一个激发波长和一个发射波长执行配体-靶物质结合。图24提供的数据示例了本发明的速度和敏感性。下面将描述涉及现有技术的它的性能的详细分析，其中配体用放射性标记以便于检测。现有技术的受体-配体分析包括SSA形式，以及用物理方法将结合和未结合配体分开，并用加入液体闪烁剂测定结合到受体上的配体量的形式。
首先，本发明可用于小容量孔，例如1μL。在使用放射性标记配体的受体-配体结合分析，每个放射性标记，例如3H，仅一次就会衰减，每次衰减产生最多90个光子，每秒衰减率小于10-8。一个单一荧光素分子总共可产生104～107个光子，它每秒将发射103到106之间的光子。因此，相对于3H的荧光素标记的计数率大约是1011。因此，在本发明，每孔只需要很少的标记、膜和硅珠。例如，当氚SSA需要每孔107个硅珠时，本发明每孔仅需要不到103个硅珠。结果，本发明仅在μL-容量孔和非常短的时间就可执行。另外，在SSA很难改变成像时间，因为放射性标记以固定速率衰减。相反，可增加荧光素标记的激发速率以增加光子的发射率，从而减少了所需的成像时间。然而，激发速率不可能无限制地增加。实际上，在本申请中，存在所谓荧光激发率的饱和极限，这就是线扫描优于点扫描之处。第二，本发明勿需时间和花费来处理放射性物质。第三，因为本发明可在小容量孔中操作，化合物和试剂的耗费比SSA大大减少，进一步降低了费用。最后，本发明不需要涂布有发光剂的硅珠或底部，费用进一步降低。
本发明使用线扫描共焦显微镜来成像孔内样本的荧光。显微镜的共焦特征允许光学分割，即从样本所处的平面检测荧光，减少从大批溶液中检测荧光。这省去了要除去未结合荧光标记配体的冲洗步骤。这一步除了在SSA中不需要外，在其它任何受体-配体结合分析中仍需要，包括不用闪烁珠的RIA。该显微镜的共焦特征还排除了可能出现的待测化合物自发荧光的干扰问题。线扫描特性允许样本在没有丢失值得注意的背景反射时能以比传统点扫描快的速度成像。速度的增加依赖于荧光基团强度、横向分辨率、视野、硬件参数包括物镜NA、检测灵敏度和照相机读出率。理论上讲，速度的增加可达到每行像素的数目，这在本发明的优选实施例是1000。实际上这个增加大约是100X。
为了量化这些优点，下面将描述一个样本示例。分析是基于细胞的，其中荧光的定位可精确到1μm。因此1mm直径样本区的成像将由～103像素的～103线构成。被研究物体的荧光信号可能发自细胞表面的配体或细胞内固定的源，例如核受体。在另一种情况下，荧光基团的局部浓度是一个重要的参数。对于一个基因工程(engineered)细胞系每细胞表达～105个受体，细胞平均浓度(cell-averaged)是-1μM。定位于核内的几千个受体导致可观的局部浓度。符合所需的1μm横向分辨率，每像素大约有～2×103的荧光基团。假定细胞背景自身的荧光基团少于标记荧光，但在一个数量级，所需的信噪比最小是10。考虑进信号的闪粒噪声和背景及高频固态检波器的读噪声，检测到的光子的数目几乎需要高达103。本发明使用约0.7NA的物镜、阻挡滤光器和固态照相机的收集和检测率是～1％。需要每像素约105光子，或每分子～102光子被发射。可在不到一秒，更好的是几分之一秒的时间内获得成像。如果以系列方式获得像素，则像素滞留时间必须小于1μs，需要每秒每分子大于108的光子发射率。这超过了荧光基团典型的106的最大饱和值。重要的是，需要达到饱和的流量105～106W/cm2，同样也足够驱动非线性光子诱导的荧光基团去色。结果，在系列扫描中需要的数据速率下不能使用最高效的检测装置。相反，如果103像素被同步照射，则每个荧光基团的发射率仅需要105。点扫描共焦的背景荧光干扰(rejection)的增加不能克服扫描速度剧降的缺点。
图24例举的数据展示了所阐述的***有足够的灵敏度，以量化每珠数万个荧光基团，同时在不到一秒的时间内清楚地分析数百个单独的硅珠。在cell-bassed结合试验可获得同等的数据，下面将举例说明。
数据分析
数据分析程序与基于细胞的还是基于硅珠的或者是两者同时都有密切相关，下面将描述。数据可用下面的程序分析，最简单的是阈值分析算法。该程序的目的是判断以连续的或点状的方式定位的荧光标记种类的量，以超过最小荧光强度，但不要超过最大荧光强度。在一个实施例中，该分析被用来分析化合物的活性。
该算法步骤如下：
1．获得该标记种类的数字化图像。
2．逐行打开文档和
ⅰ．从图像中减去照相机偏移值。
ⅱ．图像中的每一行乘以平面场图像文档中对应行的倒数。
3．任选地，将该图像做成直方图以确定背景标准。
4．建立包括最小值和任选地最大值的选择标准。通过统计分析背景直方图峰值宽度或使用预定值来确定该值，例如是平均背景标准的固定倍数，或是平均背景标准之上的计数的固定数目。
5．将图像中的每个像素与选择标准比较。如果图像中的每个像素都符合标准，则添加该值到运行总数。报告符合标准的像素总数和平均强度。
这个程序被很方便地用在处理与图24中相似的数据，其中单个硅珠被很清楚地从背景或人为假象中分辨出来，因为成堆的硅珠或细胞较小。这样的程序同样适合膜结合到孔底部的分析类型。
第二个可应用于分析结合数据的程序是局域分析算法，它需要另外的分析程序。与阈值程序一样，该程序的目的是判断以连续的或点状的方式定位的荧光标记种类的量，在一个实施例中，该分析被用来分析化合物的活性。
该算法步骤如下：
1．获得该标记种类的数字化图像。
2．逐行打开文档和
ⅰ．从图像中减去照相机偏移值。
ⅱ．图像中的每一行乘以平面场图像文档中对应行的倒数。
3．任选地，将该图像做成直方图和总和像素值。
4．建立包括最小值和任选地最大值的选择标准。通过统计分析背景直方图峰值宽度或使用预定值来确定该值，例如为平均背景标准的固定倍数，或为平均背景标准之上的计数的固定数目。
5．将图像中的每个像素与选择标准比较。所有符合标准的像素都被赋值为1，其它被赋值为0，因此实现16到1位的压缩。
6．通过将在具有接触边缘元素的二进制掩码中的全部值为1的邻接像素设置成0，来“清除”图像边缘。
7．搜索物品位图，定义连续的组为值1的像素，通过：
1．以逐行的方式搜索图像以发现值1的像素。
2．判断所有值1的像素与在ⅰ中识别的像素连续。
3．任选地在物品上使用最小和最大尺寸滤光器，该尺寸已经被预定。
4．如果物品合格，进行第8步，否则转换所有物品中的1值像素为0并继续搜索下一个物品。
5．如果到达最后一个位图，则运行步骤9。
8．对每个通过滤光器标准的物品：
1．任选地创建一个含有扩展边界的新矩形位图，该位图的扩展边界包括从物品边缘的每一个方向加上n个额外0像素的目标。n是下面将运行的、并已经预定好的扩张步骤的数目。
2．如果步骤8.ⅰ被执行，通过应用扩张步骤n次来扩张物品，其中接触1值像素的0值像素被设定为1。
3．如果8.ⅰ步骤没有执行，则对于在扩张位图或在初始位图的1值像素的每次集合，总和与平均来自该图像的相应像素，以便在掩膜下计算平均像素强度。
4．转换在初始位图图像中的所有像素成0，并返回到步骤7，以便搜索更多的物品。
9．在所有物品都被计数后，对图像中所有物品，计算每个物品的荧光标记种类的平均强度，和定位的种类的总强度的任意一部分，并把它与诸如标准差之类的统计信息一同报告。
在这个程序中所有下列算法共用的操作之间的区别是步骤4-6的二进制掩膜的创建。对于该掩膜的物品选择标准可包括最小和最大值、尺寸和形状。例如，在一个实施例，用于基于珠程(基于硅珠的)分析的分析程序包括步骤7ⅲ中的圆滤光器。
在第二实施例，同步检测由一个或多个照明波长激发的两个或多个荧光标记种类的发射。如在结合分析中应用的一样，第一荧光标记种类被用来识别第二荧光标记种类结合的物品。在图21和23提供了两个二色基于细胞的结合分析。一个可用来分析这种图像的程序示例是共-局域分析程序(Co-localization Analysis)，它设计用来判断相对于第二荧光标记种类定位的第一荧光标记种类。在一个实施例，该分析被用来分析化合物的活性，例如在活性依赖于亚细胞定位的被研究化合物。
该算法步骤如下：
1．分别获得第一和第二种标记的数字图像。
2．逐行打开文档和
ⅰ．从每个图像中减去照相机偏移值。
ⅱ．每个图像中的每一行乘以平面场图像文档中对应行的倒数。
3．任选地将第一图像做成直方图以判断背景标准并总和第二种类的图像强度。
4．建立包括最小值和任选地最大值的选择标准。通过统计分析背景直方图峰值宽度或使用预定值来确定该值，例如为平均背景标准的固定倍数，为平均背景标准之上的计数的固定数目。
5．将第一种类图像中的每个像素与选择标准比较。所有符合标准的像素都被赋值为1，其它被赋值为0，因此实现16到1位的压缩。
6．通过将在具有接触边缘元素的二进制掩码中的全部值为1的邻接像素设置成0，来“清除”图像边缘。
7．搜索物品位图，定义为连续的值1的像素组，通过：
1．逐行的方式搜索图像以发现值1的像素。
2．判断所有值1的像素与在ⅰ中识别的像素连续。
3．任选的在物品上使用最小和最大尺寸滤光器，该尺寸已经被预定。
4．如果物品合格，进行第8步，否则转换所有物品中的1值像素为0并继续搜索下一个物品。
5．如果到达最后一个位图，则运行步骤9。
8．对每个通过滤光器标准的物品：
1．任选地创建一个含有扩展边界的新矩形位图，该位图的扩展边界包括从物品边缘的每一个方向加上n个额外0像素的物品。n是下面将运行的、并已经预定好的扩张步骤的数目。
2．如果步骤8.ⅰ被执行，通过应用扩张步骤n次来扩张物品，其中接触1值像素的0值像素被设定为1。
3．如果8.ⅰ步骤没有执行，则对于在扩张位图或在初始位图的1值像素的每次集合，总和与平均来自第二种类的图像的相应像素，以便在掩膜下计算平均像素强度。
4．转换在初始位图图像中的所有像素成0，并返回到步骤7、以便搜索更多的物品。
9．在所有物品都被计数后，对图像中所有物品，计算每个物品的第二荧光标记的种类的平均强度和与第一种类共同定位的第二种类的总强度的任意一部分，并把它与诸如标准差之类的统计信息一同报告。
这个更详细程序的优点是，该物品不论它是细胞还是硅珠都能被独立地识别出来。如图21的示例：不是所有的细胞都有反应。例如，细胞的单独识别将使反应与不反应细胞的比率与那些反应者中反应的程度一同制成表格。这个算法，不管它的别的复杂性，可以在PentiumЦ平台上执行以在一秒时间内分析1兆像素。
易位分析
根据第二实施例可容易执行另外的分析类型，即由一个或多个照明波长激发的两个或多个荧光标记种类的发射被同步检测的易位分析。在这些分析中，被研究物质的易位是一个或多个种类，它可以是蛋白质、脂类、或其它分子复合物或亚细胞结构如囊泡，从一个细胞的轮廓分明的区域到另一个。这包括但并不仅限于：突触(synaptin)(囊泡膜蛋白)、转录因子(NK-kB,NFAT,AP-1)，激素受体，LDL/HDL受体，T细胞受体，和PTH受体。
原型的易位分析是共-局域化测定的一个特殊情况。例如，第一和第二种类的共-局域化被相对于第一种类的第二种类共-局域化的那一部分量化，或者第二种类与第一种类和存在于细胞别处的共-局域化的比率量化。下面提供比较适合用于处理易位图像数据的扩展分析程序。
该标记定位于细胞核，该标记是对DNA特异的荧光，例如Hoechst33342。其它对核酸特异的染料是本领域共知的(如Haugland,R.P.荧光探针和研究化学，第六版，第8章)。第二种是转录因子，它从细胞质向细胞核的迁移是分析的对象。这种蛋白可用多种方法标记，包括与GFP融合的表达，接触对转录因子蛋白特异的荧光标记抗体的样本。
下面易位数据分析程序(translocation Data Analysis)可被用来判断以与第二种荧光标记相关或不相关的方式分布的第一种荧光标记的量。在一个实施例，该分析被用来分析化合物的活性。
1 分别获得第一和第二种标记的数字图像。
2 逐行打开文档和
ⅰ．从每个图像中减去照相机偏移值。
ⅱ．每个图像中的每一行乘以平面场图像文档中对应行的倒数。
3 任选地将第一种类图像做成直方图以判断背景标准并总和第二种类的图像强度。
4 建立包括最小值和任意最大值的选择标准。通过统计分析背景直方图峰值宽度或使用预定值来确定该值，例如为平均背景标准的固定倍数，为平均背景标准之上的计数的固定数目。
5 将第一种类图像中的每个像素与选择标准比较。所有符合标准的像素都被赋值为1，其它被赋值为0，因此实现16到1位的压缩。
6．通过将在具有接触边缘元素的二进制掩码中的全部值为1的邻接像素设置成0，来清除图像边缘。
7 搜索物品位图，定义为连续的值1的像素组，通过：
1 逐行的方式搜索图像以发现值1的像素。
2 判断所有值1的像素与在ⅰ中识别的像素连续。
3 任选的在物品上使用最小和最大尺寸滤光器，该尺寸已经被预定。
4 如果物品合格，进行第8步，否则转换所有物品中的1值像素为0并继续搜索下一个物品。
5 如果到达最后一个位图，则运行步骤9。
8．对每个通过滤光器标准的物品：
1 创建一个含有扩展边界的新矩形位图，该位图的扩展边界包括从物品边缘的每一个方向加上n个额外0像素的物品。n是下面将运行的、并已经预定好的扩张步骤的数目。
2 通过应用扩张步骤n次来扩张物品，其中接触1值像素的0值像素被设定为1。
3 比较扩展位图与初始实际大小位图。设置在扩展为途中的所有像素即在初始位图中对应区域的1值为0。这样产生一个环形掩膜，保证在扩展期间位图边缘增加时只有一个物品被捕获。
4 从原始物品创建另一个位图，通过设置接触0值像素的1值像素为0侵蚀它m次。M等同于n，已在前面确定。
5 对于在环形或在侵蚀的位图的1值像素的每次集合，总和与平均来自第二种类的图像的相应像素，以在侵蚀的或环形掩膜下计算平均像素强度。
6 计算每个物品侵蚀的对环形位图的比率并存储在表中。
7 转换在初始位图图像中的所有物品像素成0，并返回到步骤7、以便搜索更多的物品。
9 在所有物品都被计数后，计算图像中所有物品的平均强度比率，并把它与诸如标准差之类的统计信息一同报告。
这个程序区别于上述程序的新特征是在第8步两个子掩膜的创建，一个是原始掩膜的环形扩展，一个是原始掩膜的侵蚀的样式。在这个例子中，后一种被用来量化种类2和种类1，转录因子和细胞核(实际上是DNA)的共-局域化。前一个掩膜被用来量化没有共-局域化的种类2。在当前例子中，这两种量化的比率是在逐个细胞基础上形成，将结果制成一个表。
根据本发明的方法，数据的采集和分析几乎可以在1秒钟时间内完成。为了比较，这里引用两个现有技术的例子。在Ding等(J.Biol.Chem,273,28897-28905(1998))中，执行了一个二色易位分析。本发明的优点包括：1)每图像通道几乎50X的快速图像获取，2)同步二色图像获取，3)大约10X的高敏性，允许低染色标准。4)共焦检测，允许省却冲洗步骤，5)对比大约30秒的聚焦时间，本发明仅需0.1秒聚焦时间。6)对比3-6s/帧的数据分析时间，它仅需0.2s/帧，7)连续图像获取。现有技术的第二个例子是Deptala等(Cytometry,33,376-382,(1998))。本发明提供：1)高空间分辨率，约为4X，2)大约为16X的高像素获取率，3)快速数据分析，4)微量滴定板上可操作的自动聚焦***，和5)对比3-6s/帧的数据分析时间，它仅需0.2s/帧。
胞吞、胞吐和受体螯合
一般来讲，胞吞、胞吐、受体螯合和再循环是可以根据第一或第二实施例以及上述的相关图像分析方案分析的特殊的附加程序。荧光标记可以根据各种已知的方法来完成。例如，由Tarasova等公开的包括受体和配体标记的一流试验。本图像分析***每图像通道可快50X，可同步获得两个图像。另外，本分析方案，例如共-局域化算法可被用来实时处理螯合图像数据。现有技术中没有这样的例子。
现有技术中已知许多其它分析需要类似的图像和分析能力。例如，吞噬作用和相关的细胞活动，(例如J.Immunology,(1983)130,1910；J,Leukocyte Biol.(1988)43,304)；另外包括受体介导的和非受体介导的胞吞和胞吐分析(例如Neuron 14,983(1995)；J.Physiol.460,287(1993)和Science 255,200(1992)),包括低密度脂蛋白复合物(Low-Density Lipoprotein Complexes)(见J.Cell Biol.121,1257(1993)和脊椎动物细胞的转染传递(见Cell 49,423(1994))；荧光标记的表皮生长因子的内吞和横向运动性的成像(见Proc.Natl.Acad.Sci.USA75,2135(1975)；J Cell Biol.109,2105(1989))；有荧光葡聚糖胞吞作用监测胞吐物质的摄取和内部处理(见J.Biol.Chem.269,12918(1994)),用亲水性染料在激活神经元过程中的胞吞介导的突触小泡再循环的成像(见Nature 314,357(1985))。另外,细胞系表达绿色荧光蛋白(GFP)与位于胞吐和分泌小泡中的蛋白(见J.Cell Sci.110,1453(1997))融合的遗传工程或定位于分化的神经细胞生长锥的tPA(见Mol.Biol.Cell 9:2463(1998))允许监测胞吐作用。众多的荧光标记可以用于这样的分析(见Haugland,R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第17章)。
离子通道
本发明的第三个实施例，在图9描述的样式之一可被用来成像在每秒约30帧的速率下一个或多个荧光标记种类的时间依赖的反应。这允许捕获诸如开启或关闭离子通道的瞬态现象。示例的离子通道包括：K+-门控电压、Na+-门控电压、Ca++-门控电压、Cl-、Na+/K+ ATP酶和P糖蛋白。
下面的动态成像数据分析(Kinetic Imaging Data Analysis)算法定义和跟踪一帧一帧的单个细胞，能够同步动力学分析足够数目的细胞以获得满意的有统计学意义的数据。该算法步骤如下：
1 获得一个(仅仅指示剂)、二个(标记物和指示剂或两个指示剂)或多个数字图像作为时间的函数。
2 逐行打开文档和
ⅰ．从每个图像中减去各个照相机偏移值。
ⅱ．每个图像中的每一行乘以各个平面场图像文档中对应行的倒数。从每个图像中减去各个照相机偏移值。
3 任选地将第一种类图像做成直方图以判断背景标准。
4 建立包括最小值和任意最大值的选择标准。通过统计分析背景直方图峰值宽度或使用预定值来确定该值，例如为平均背景标准的固定倍数，为平均背景标准之上的计数的固定数目。
5 将第一种类图像中的每个像素与选择标准比较。所有符合标准的像素都被赋值为1，其它被赋值为0，因此实现16到1位的压缩。
6 通过将在具有接触边缘元素的二进制掩码中的全部值为1的邻接像素设置成0，来“清除”图像边缘。
7 搜索物品位图，定义为连续的组值1像素，通过：
ⅰ．逐行的方式搜索图像以发现值1的像素。
ⅱ．判断所有值1的像素与在ⅰ中识别的像素连续。
ⅲ．任选的在物品上使用最小和最大尺寸滤光器，该尺寸已经被预定。
ⅳ．如果物品合格，进行第8步，否则转换所有物品中的1值像素为0并继续搜索下一个物品。
ⅴ．如果到达最后一个位图，则运行步骤9。
8．对每个通过滤光器标准的物品：将时间序列中的每个图像的对应像素平均。如果使用单一指示剂，记录这个强度。如果使用辐射测量的指示剂，将时间序列中的每个图像用另一个图像的值来划分一个图像的值，并记录结果。
9  在所有物品都被分析后，报告步骤8的每个物品的分析结果。报告每个物品的包括冲洗时间、衰减时间和振幅的动态参数，作为从一批动力学分析和从固定时间的一套所有物品衍生的统计信息。
图19和20提供了使用本发明以成像和分析与离子通道相关的瞬态动作的两个例子。这些分析使用Ca++敏染料、Fluo-3来指示细胞内Ca++浓度变化。在第一个试验中，变化是由于乙酰胆碱受体的激活促发的Ca++第二信号引起。在第二个试验，该变化是由电压门控Ca++通道的激活引起的。
离子通道是近些年研究的热点领域。本发明相对于现有技术的优点在下面的比较后会变得很明显。
在化合物筛选应用中，引用背景技术部分的现有技术标准，是在美国专利号5,335,215中公开的。这个装置最初用来检测细胞内Ca++的感应变化，包括一个用于促发瞬态动作的分配器。本发明优于现有技术的主要点如下：1)成像和分析容许通过与该孔的平均反应水平比较来判断单个细胞的反应。2)敏感性的增加，只需要添加少量的试剂和低的光照强度，所需样本量也减少。3)以视频速率获得图像，可与每秒1点的最大率相比。
在研究应用中，在生物共焦显微镜手册(Handbook of BiologicalConfocal Microscopy)J.B.Pawley,ed.,Plenum出版社，纽约，1995,pp.459-478中公开的Tsien***和合作者做为标准。它已显示具有以超过本发明的速率成像的能力。然而，这个不能用在现在研究的样本。现有技术需要在一个可比的信噪比，每像素102-103较大的荧光基团以达到本发明的速率。另外，本发明可在12-或16-位分辩率，给出4-16X较大的动态范围情况下获得图像。
研究***的第二个例子在Sun等,J.Physiology,509,67-80,1998.中被公开。根据Sun，使用传统的点扫描共焦显微镜，可在速率高达650Hz/600像素线，以5微秒/像素积分时间产生数据。只能产生一维图像。可以监测位于扫描线上的物品的瞬时现象。另外，这个速率只有在1μs像素积分时间才可以达到，需要102-103大的荧光浓度以达到可与本发明相比的图像质量。
本发明成像和分析细胞内离子浓度应答外部刺激变化的能力在化合物筛选和一般生物研究应用中有多重应用(例如见J.Cell Biol.137(3),633-648(1997)；J.Biol.Chem.271(9),4999-5006(1996)；Science280,69-76(1998)；Biochem,J.324,645-651(1997))。许多荧光指示剂被用在对特定离子敏感的试验中(见Haugland,R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第18、22和24章)。这些指示剂容许Mg2+、Zn2+、Ca2+、Na+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Ni2+、Co2+、Al3+、Ga2+、Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+的浓度测定。另外，即使在有其它生理浓度的单价阳离子存在的情况下也可以分析Na+和K+(见J.Biol.Chem.264,19449(1989))，包括分析各种细胞例如血细胞、脑细胞和肌肉细胞中Na+水平或Na+的流动(见J.Biol.Chem.268,18640(1993)；J.Neurosi.14,2464(1994)；Am J.Physiol.267,H568(1994))，和***细胞、神经末梢突触体及淋巴细胞中K+的变化。另外，本发明可被用在分析在囊泡、脂质体和活细胞中Cl-的浓度(见Am.J.Physio.259,c375(1990))。
另外，本发明还可用来分析细胞和细胞器上膜电位的变化。迅速地成像膜电位的变化是分析细胞和细胞器的生存力、神经冲动的产生、肌肉收缩、细胞信号和离子门孔通道的关结合(见Biophys J.67,208(1994)；Neuron 13,1187(1994)；J Membrane Biol.130,1(1992))。荧光标记可用来对可兴奋细胞如神经元、心肌细胞和无损伤的脑细胞产生快速(微秒)膜电位变化应答(见Haugland,R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第25章)。应答快速跨膜电位变化的荧光探针仅仅显示一般为每100mV约2-10％的荧光基团变化。细胞等离子膜有大约-70mv的跨膜电位，一些细胞器例如线粒体的跨膜电位可保持-150mV。因此，包括这种快速变化的分析需要高灵敏度，快速的数据采集能力，这对于本发明的各种实施例来说很平常。
基于荧光共振能传递的测定
本发明可很容易地用来执行包括荧光共振能传递(FRET)的分析。当一个荧光基团，供体，吸收一个光子并将该吸收的能量非放射性地转移给另一个荧光基团，受体，则发生FRET。然后，该受体以它的特征波长发射该能量。供体和受体分子必须非常接近，小于10nm，以利于有效能量转移的发生。(见Methods Enzymol.211,353-388(1992)；Methods Enzymol.246,300-334(1995))。这种所需的邻近可被用来创立对于供体-受体对之间的小间隙敏感的分析。FRET典型的需要单一激发波长和两个发射波长，一个分析包括供体和受体发射强度的比率。FRET供体-受体对可被用来创立不但基于硅珠的而且基于细胞的分析。几种显示增强的荧光和改变的发射波长的绿色荧光蛋白(GFP)突变体可通过将GFP FRET供体与一个蛋白融合，GFP FRET受体与相同的蛋白融合或同在同一个细胞内表达的另一个蛋白融合，而与FRET基于细胞的分析配对。这样的FRET对可用来分析分子内变化，如Ca2+的Ca2+-调钙素结合或分子间相互作用，如受体二聚化作用。上面公开的动态成像算法可以优先使用。
瞬时转染
基于图像的测定中，最显著的优势是不但有机会观察到一般情况下会丢失的珍贵的事件，而且可以规格化在逐个物品的基础上的一级反应成为二级反应。这两个特征在使用具有瞬时转染的靶物质的细胞系的分析中都很重要。转染之后的基因表达和继发的蛋白质的产生常常是无效且瞬时的(见Bio Techniques 24；478-482(1998))。根据本发明可以很容易地使用的监测转染效率的方法是本领域所熟知的。例如，被研究基因可与绿色荧光蛋白(GFP)基因一起转染，这样这两个蛋白将会作为融合蛋白表达或分开的实体表达。本发明可用来检测存在于一个波长处的指示剂的量以及在另一处与靶物质相关的反应。前面的信号可被用来规格化后面的对所存在的靶物质量的反应。这容许本发明执行对靶物质的分析，这种靶物质因为它不稳定以至于不能用当前使用的筛选方法和不能检测仅仅百分之几的转染率。上面公开的动态成像算法可被用来分析这样的数据，这里只需要一个图像帧。可以监测细胞的病毒感染，要么直接通过病毒蛋白的表达，要么间接通过获得新的表型，即使仅仅只有很少的细胞被感染。最后，本发明提供用于检测珍贵事件，例如获得新表型，这种新表型是由于整个细胞群被不同cDNAs文库转染结果导致单个细胞或一群细胞转染特异的cDNA而获得。
酶分析
本发明可被用于进行一般酶活性的分析。示例性的细胞内酶包括：碳酸酐酶、鸟嘌呤核苷结合蛋白(G蛋白)、腺苷酸环化酶、调钙素、PI、PIP和PIP2激酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白磷酸酶、β-内酰胺酶、β-牛乳糖、二氢叶酸还原酶、磷酸二脂酶、钙长石(caspase)、蛋白体蛋白酶、氮氧化物合酶、胸腺嘧啶脱氧核苷激酶、核苷脱氨酶、谷胱苷肽转移酶、脂氧合酶和磷脂酶，但不仅限于此。
图17(a)-17(b)描述了根据本发明的酶分析的第一实施例的步骤。在图17(a)中，包被有已知数量的荧光标记肽312的硅珠310被加入到含有液体330的孔320中。硅珠310具有的密度使它们沉积到孔的底部。在图17(b)中，待测化合物314被加入到孔中。在图17(c)中，酶316被加入到孔中。除了在没有待测化合物之前孔里不能加入肽或酶之外，图17(a)、17(b)和图17(c)描述的步骤的顺序可以互换。如果没有限制，则酶316将***肽312，并且将荧光标记混匀到液体中。另一方面，如果待测化合物314限制酶316，典型的是封闭了酶的活性位点，酶316将不能***荧光标记。在图17(d)中，仍然包被在硅珠上的荧光标记，例如，使用如图中描述的340元件即线扫描共焦显微镜成像。从这个图像中，可以判断待测化合物的活性。
在图17(a)-17(d)描述的酶分析的另一实施例中，待测化合物的活性可以通过将在图17(d)中获得的图像与在图17(a)或17(b)中成像荧光标记的荧光获得的图像或对照组图像比较而确定。
图18(a)-18(d)描述了根据本发明的酶分析的第二实施例的步骤。在图18(a)中，包被有已知数量的荧光标记肽352涂布在孔360中。在图18(b)中，待测化合物354被加入到孔中。在图18(c)中，酶356被加入到孔中。在图18(d)中，仍然涂布在孔底部的荧光标记，例如，使用如图中描述的380元件即线扫描共焦显微镜成像，以判断待测化合物354的活性。
在图18(a)-18(d)描述的酶分析的另一实施例中，待测化合物的活性可以通过将在图18(d)中获得的图像与在图18(a)或18(b)中成像荧光标记的荧光获得的图像或对照组图像比较而确定。
可以根据本发明实行的另一个分析的示例是酪氨酸激酶分析。酪氨酸激酶磷酸化底物肽中的酪氨酸残基。底物肽中既有酪氨酸残基又有荧光标记。在这个分析中，一侧末端被选择为磷酸化残基的抗体，以另一末端结合到诸如硅珠或孔底部表面。酪氨酸激酶和有酪氨酸残基的荧光标记肽被加入孔中。如果酪氨酸激酶磷酸化该肽，该磷酸化的酪氨酸将结合到抗体上。从而将荧光标记定位于抗体附着物的表面。如果酪氨酸激酶没有磷酸化该肽，在肽上的荧光标记将分散于孔中。通过测定粘结在表面的荧光基团可以判断该肽磷酸化的程度。这种分析还可被用作对由酶作用于荧光底物产生的荧光产品特异的抗体上。
另外，根据本发明还可以进行活细胞酶分析。现有技术已知有许多可以分析活细胞的酶活性的技术(见Biolchem.Histochem。70,243(1995)，J.Fluorescence 3,119(1993))，用酶作用于可以产生荧光的底物上(见Haugland，R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第10章)。一般来讲，这些分析使用被动地进入细胞继而被细胞内酶作用产生留存在细胞内的产品的探针。其它底物产生不溶性荧光产品沉积在酶活性位点。本发明可分析酶活性度和使用这样的探针判断酶活性的准确空间位点。使用本发明进行多种酶分析所用的探针包括磷酸酶、ATP酶、5｀核苷酸酶、DNA和RNA多聚酶、肽酶、蛋白酶、酯酶和过氧化物酶，但不仅限于此。
酶活性分析可以根据上面公开的第一或第二示例性实施例和相关的图像分析方案。
形态学
本发明的方法还可以被用来进行那些需要判断细胞的或亚细胞的形态，包括轴突和细胞器的分析，但不仅限于此。为进行这样的分析，通过直接显微注射或使用可以被代谢或被改变从而能够滞留在研究物结构内的细胞渗透剂接触细胞，将荧光探针导入研究物例如细胞或细胞器的结构内。如果被用于活细胞，该荧光标记必须是无毒的和无生物学活性的。有很多商业化的可以用于该分析的合适的染料(见Haugland,R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第15章)，例如，包括毛细血管连续流、神经元细胞连接性，通过缝隙连接、细胞***和细胞溶解以及脂质体融合的染料易位。另外，这些跟踪剂可用于跟踪在培养、组织或无损伤有机物中的标记细胞的运动。现有技术中有很多已知的用荧光示踪剂分析细胞或亚细胞形态或运动的技术，包括使用生物素右旋糖苷共轭体、荧光素微滴、或蛋白和蛋白共轭体(见Meth.Cell.Biol.29,153(1989)；Cytometry 21,230(1995)；Cell 84,381(1996)；Biolchem.Biophys.Acta 998,319(1989)；Cytometry 14,747(1993))。当使用于这些类型的分析时本发明的各种实施例具有明显的优势。本发明容许具有极好的空间分辨率的多种参数快速成像。
核酸
本发明还可用于进行核酸的分析。受益于本发明的空间分辨力和多波长成像能力的特定DNA分析是荧光原位杂交(FISH)。FISH是用于定位和判断在细胞、组织、间期细胞核和中期染色体中特定核酸序列的相对含量，用于临床诊断和基因定位的重要的技术(见Histo-chem J.27,4(1995)；Science 247,64(1990)；Trends Genet.9,71(1993)和Science 250,559(1990))。多种荧光杂交探针被用于彩色荧光DNA和RNA杂交技术(见Haugland,R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第8.4章)。另一种技术通过使用AT或GC选择性DNA染料并核酸复染来判断染色体分带。这种技术被广泛用于核型分析和染色体结构研究(见Human Genet.57,1(1981))。
活性氧类
本发明还可被用于分析各种活性氧种类如单肽氧、过氧化物和氮氧化物的水平。这些活性氧种类的重要性才刚刚被发现(见BiplchemPharmcol 47,373(1994),J.Cell Biol.126,901(1994))。已知由活性氧引起的生理损伤的一大部分是由单态氧引起(见J.Photochem.Photobiol.11,241(1991)).Nitric Oxide(NO))，特别是，现在知道它在包括神经传递和血压调节的很多生理过程中起到关结合的分子介导的作用(见Current Biology 2,437(1995),J.Med.Chem.38,4343(1995),Cell 78,919(1994))。现有技术已知的是使用间接的方法分析NO。例如，在生理条件下，NO被氧化成亚硝酸盐，这可以通过监测它在548nm处的吸光率或使用一个与亚硝酸盐反应的探针以形成可确认的荧光基团产品而检测(见Haugland，R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第21章)。
 pH
本发明还可被用于执行包括测定细胞内或无细胞介质中pH变化的分析。细胞内pH所起作用的重要性在包括细胞增生、凋亡、受精、坏死、多重抗药性、离子转运、溶酶体沉积病和早老年性痴呆等很多种不同的生理和病理过程中早已被认识到(见Cell Physiol.Biochem.2,159(1992)；J.Biol.Chem.270,6235(1995)；Biophys.J.68,739(1995)；J.Biol.Chem.270,19599(1995)；Cancer Res.54,5670(1994))。用于分析在生理范围内的pH变化的荧光探针可以购买到(见Haugland,R.P.荧光探针和研究化学手册，第六版，第23章)。
示例
这里描述和申明的发明通过参考以下的示例能够更容易地被本领域的普通熟练技术人员所理解。这些示例仅仅是为了说明本发明的几个方面，而不能解释为对本发明的任何限制。
转录因子易位
细胞在96孔板中生长、固定、用Texas Red标记的抗体孵育成转录因子蛋白、冲洗、然后用5μM Hoechst 33342缓冲液染色。
图像按0.5×0.5mm2的矩形进行观察，该矩形中的像素点大小为1.08×1.08μm2。Texas Red辐射在568nm处被激发，由600-nm长的过滤器检测。Hoechst辐射在364nm处被激发，由420-480-nm的带通滤波器检测。图像获取时间为0.9秒。每幅图像有～150个细胞。
不活动的一个视野中的细胞的图像在固定以前获得。在细胞核中的Texas Red的强度比细胞质中的要低。产生用Texas Red标记的抗体和Hoechst 33342染色的细胞图像的一幅合成图。
不活动的一个视野中的细胞的图像在固定以前获得。由于色标的原因，如果细胞核不饱和，则难于看到细胞质。产生用Texas Red标记的抗体和Hoechst 33342染色的细胞图像的一幅合成图。
该数据分析按照以下方法执行。该Hoechst图像的一种二进制表示通过施加适当的阈值产生。大于阈值的那些值设置成1，而小于阈值的那些值设置成0。这用作原始掩模。然后产生两个下一代掩模，一个是通过腐蚀原始掩模产生，另一个是通过膨胀原始掩模和减掉原来的掩模以形成环状掩模来产生。Texas Red辐射图乘以被腐蚀的二值掩模，和这些像素总和起来作为该细胞核中被标记的转录因子的量度。类似地，Texas Red辐射图乘以环状掩模，和这些像素总和起来作为在该细胞质中被标记的转录因子的量度。活化程度使用细胞核与细胞质的强度比来评估。
蕈毒碱受体和电压门控通道刺激的瞬时钙成象
图19和20的细胞是来源于成神经细胞瘤系。它们在标准介质内生长并成像。这些细胞表达可以被碳酰胆碱刺激，产生作为第二信使的大的细胞内钙离子释放的蕈毒碱乙酰胆碱受体。另外，这些细胞表达电压门控的“L”钙通道，它被细胞外K+浓度较大变化导致的细胞膜去极化刺激，受异搏定抑制。
一般来说，通过快速加入100μL生长液试剂到96孔板中100μL生长液中的细胞可促发图像序列。由加入该体积液体导致的搅动引起细胞形状小的变形。这个变形作为一个分布在每个细胞上的钙荧光瞬时变化在加入后的第一图像帧是可见的。
在图19显示了在帧之间1.2秒的电影。图像序列由快速加入100μM碳酰胆碱促发。最后一幅图像是二元掩模，用来识别和列举图像中的荧光物品，它是从注射前帧中产生的。尽管注射前图像显得很模糊，但它却很明亮。该掩模被用在序列中的每一幅图像、每一个物品，整合的强度被标准化成注射前图像，被绘制成相对于时间的表，如图25a所示。掩膜并不被处理成覆盖整个细胞。例如，物品1可能多于一个细胞，但显示无反应。物品7可能是2个覆盖的细胞，显示一次延迟反应。
图20a-h是从一个电影中挑选出来的帧，显示通过加入50mM KCl引起电压门控“L”通道开放促发去极化事件的成神经细胞瘤细胞的反应。分析程序如联系图25a已在上面描述。结果显示在图25b。注意灵敏度的增加的获得是使用“细胞平均”而不是“图像平均”。
活细胞G蛋白偶联受体的结合
图21a-c到22a-c显示的图像是从96孔板中的活细胞获得的。这些细胞已经用G蛋白偶联受体转染，它的天然肽配体是已知的。成像之前，这些细胞用包含10％血清的标准生长液中天然未标记配体孵育37℃，20分钟，之后是20nM荧光标记配体和100nM LDS751反应20分钟，也是37℃。样本不用冲洗。
图像是0.5×0.5mm2,1.08×1.08μm2g个像素。荧光辐射在488nm处被激发，由45nm的带通滤波器，中心点在535nm处检测。LDS751辐射也在488nm处被激发，由40nm的带通滤波器，中心点在690nm处检测。图像获取时间为0.9秒。这些细胞大约有～100,000个受体/细胞，或25个受体/m2膜表面。
图21a是细胞在用标记配体孵育后的图像。在成像之前不执行冲洗步骤。受体活性的实际变化是明显的。一些细胞结合非常少的配体，它们的显像在背景中被淹没。如图21b所示，通过从LDS751辐射的成像制成掩模、非特异核酸染色，则逐个细胞的结合活性的分析变得很容易。该染色并非完全均一，但是细胞体积的大部分都被显现出来。从图21b的数据阈值和受体结合图像产生的图21c的二元掩模的覆盖产生一个受体活性的伪色图。高活性显示为黄色，低活性显示为橙红色。
图22显示了三个图像对应的20nM标记配体与未标记配体的滴定曲线上的点。该曲线显示在图22。未标记配体用AKi=3±1×1010M公式计算。
图23a-d显示了受体结合到不同哺乳类动物细胞系上的图像。图23a是用256nM Cy3标记配体孵育的细胞的图像。结合活性的范围是可见的。图23b显示Cy3数据与同步获得的1μM Hoechat 33342染色细胞核的图像的叠加。后者可作为单个细胞的可靠的标示。图23c是用存在10μM未标记配体的256nM Cy3标记配体孵育的细胞的图像，图23d是显示这个数据与1μM Hoechat 33342染色细胞核的图像的叠加。在图23c中用未标记细胞置换的液体的效果是很明显的。在图23c和d之间的高相关性显示了用它们的排除的体积识别细胞的有效性。
模拟基于硅珠的受体结合
图24a-d呈现了Cy5标记的硅珠的图像。该试验是模拟受体结合分析，其中的荧光标记配体结合到由微滴支撑的膜限定受体上。
硅微滴，直径4μm，包被有聚氮丙烷和生物素NHS酯的生物素。硅珠的活性用荧光计通过量化从液体中除去的通过吸收已知量的硅珠的Cy5标记的抗生蛋白链菌素来分析。每个硅珠被发现包含有1.3×106的抗生蛋白链菌素分子。通过将适当比例的Cy5标记和未标记的抗生蛋白链菌素预先混匀并和硅珠一起孵育，使硅珠包被上已知量的Cy5分子。硅珠的荷载等于0.16,1.6和16 fmole/200μg聚氮丙烷硅珠。每个硅珠分别有平均17、170和1700个标记。样本被放入Costar 96孔板中成像。Cy5用647nm激光激发，发射的荧光用中心在690nm的40nm带宽过滤器检测。扫描图像在1μm像素，大约0.7秒时间获得。
荷载有170和1700分子的硅珠很容易被检测到，17-fluro硅珠在构成图24的图像中是可以辨认的。那些仅仅荷载有未标记的抗生蛋白链菌素的硅珠不能产生可见的强度。
权利要求书
按照条约第19条的修改
1．一种共焦成像***，包括：
a)用于形成电磁辐射的细长束斑的部件，该光束沿辐射传播的光轴横向延伸；
b)用于将该细长束斑导引到和聚焦到物品所在的第一平面的第一细长区上，和用于将该物品发射的电磁辐射导引到一个或多个位于与第一平面共轭的不同的第二平面上的第二细长区上的部件；
c)在至少一个第二共轭平面，或者共轭于至少一个第二共轭平面的第三平面中的检测装置，该检测装置包括在其上从物品发射出的电磁辐射是一致的检测元件组成的矩形阵列；和
d)用于通过相对于物品移动该细长束斑，或通过相对于该细长束斑移动物品来扫描物品，使得该发射的电磁辐射被送到检测元件组成的矩形阵列，并且用该检测装置将所述电磁辐射同步于所述的扫描转换成代表电磁辐射的电信号。
2．根据权利要求1的共焦成像***，还包括：
a)细长空间过滤器，具有一条与第二细长区一致的长轴；和
b)用于在检测装置上形成第二共轭平面的图像的部件。
3．根据权利要求1的共焦成像***，其中导引到物品的电磁辐射的该细长束斑包括两个或更多个波长。
4．根据权利要求2的共焦成像***，其中细长空间过滤器具有可变的宽度。
5．根据权利要求1的共焦成像***，其中检测装置包括多个检测器元件组成的m×n阵列，其中m是该阵列中的第一维中的检测器元件数目，n是该阵列中的第二维中的检测器元件数目，并且n大于m。
6．根据权利要求5的共焦成像***，其中发射的电磁辐射所导引到的细长区具有一条与检测装置的阵列一致的长轴，使得该长轴在与第二维同样的方向上延伸。
7．根据权利要求5的共焦成像***，其中形成在该阵列的第一维中延伸的列的至少两个检测元件被集合在一起。
8．根据权利要求5的共焦成像***，其中该阵列的多个检测元件被集合在一起。
9．根据权利要求5的共焦成像***，其中检测装置是CCD阵列。
10．根据权利要求1的共焦成像***，其中检测装置是矩形排列的CCD阵列。
11．根据权利要求1的共焦成像***，其中从物品发射的辐射是荧光辐射。
12．根据权利要求1的共焦成像***，其中物品位于衬底不连续表面上，这种衬底具有与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，所述***还包括一种聚焦***，该聚焦***包括：
a)具有第一波长的电磁辐射的第一聚焦束斑，所述第一束斑经由物镜导引到不连续表面，并且从所述不连续表面经由物镜反射回来；
b)具有第二波长的电磁辐射的第二聚焦束斑，所述第二束斑经由物镜导引到连续表面，并且由所述连续表面经由物镜反射回来；
c)用于将第一波长的辐射与经由物镜反射回来的第二波长的辐射隔离的部件；
d)第一检测器，用于检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的第一聚焦束斑；
e)第二检测器，用于检测由所述连续表面经由物镜反射回来的第二聚焦束斑；
f)移动部件，用于相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底；和
g)与第一和第二检测器以及移动部件相连接的控制器，其中控制器根据第一聚焦束斑或第二聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自第一检测器或第二检测器的信号来操作移动部件。
13．根据权利要求1的共焦成像***，其中扫描部件包括用于移动细长束斑扫过物品的旋转光学元件。
14．根据权利要求1的共焦成像***，其中扫描部件包括放置物品的可移动载物台。
15．根据权利要求1的共焦成像***，还包括用于将试剂分配到放置物品的第一平面的部件。
16．根据权利要求1的共焦成像***，还包括用于控制物品温度的部件。
17．根据权利要求2的共焦成像***，其中被导引到物品的电磁辐射的细长束斑包括一个或多个波长，并且其中第二平面是单个的。
18．根据权利要求1、3或17的任何一条的共焦成像***，其中电磁辐射的两个或多个波长从第一平面中的第一细长区域里的物品发射，所述***还包括用于隔离被发射的各个波长的部件，以便通过一个或多个检测装置检测这些被隔离的波长的至少一个。
19．根据权利要求1的共焦成像***，其中物品位于衬底不连续表面上，这种衬底包括以与该不连续表面相同方向延伸的连续表面，所述***还包括一种聚焦***，该聚焦***包括：
a)经由物镜导引到不连续表面，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来的电磁辐射的聚焦束斑；
b)聚焦检测器，用于检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的聚焦束斑；
c)移动部件，用于相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底；和
d)与聚焦检测器以及移动部件相连接的控制器，其中控制器根据聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自聚焦检测器的信号调整移动部件。
20．根据权利要求12的共焦成像***，其中第一和第二波长相同。
21．根据权利要求12或19的共焦成像***，其中控制器包括一台计算机。
22．根据权利要求12或19的共焦成像***，其中衬底是微量滴定板，不连续表面是微量滴定板中的一个孔的底。
23．根据权利要求18的共焦成像***，其中物品位于衬底部不连续表面上，这种衬底具有朝向与该不连续表面同方向延伸的连续表面，并且其中电磁辐射的两个或多个波长从物品发射，所述***还包括一种聚焦***，该聚焦***包括：
a)具有第一波长的电磁辐射的第一聚焦束斑，所述第一束斑经由物镜导引到不连续表面，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来；
b)具有第二波长的电磁辐射的第二聚焦束斑，所述第二束斑经由物镜导引到不连续表面，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来；
c)用于将第一波长的辐射与经由物镜反射回来的第二波长的辐射隔离的部件；
d)第一检测器，用于检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的第一聚焦束斑；
e)第二检测器，用于检测由所述连续表面经由物镜反射回来的第二聚焦束斑；
f)移动部件，用于相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底；和
g)与第一和第二检测器以及移动部件相连接的控制器，其中控制器根据第一聚焦束斑或第二聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自第一检测器或第二检测器的信号操作移动部件。
24．根据权利要求18的共焦成像***，其中物品位于衬底不连续表面上，这种衬底具有与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，并且其中电磁辐射的两个或多个波长从物品发射，所述***还包括一种聚焦***，该聚焦***包括：
a)经由物镜导引到不连续表面，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来的电磁辐射的聚焦束斑；
b)聚焦检测器，用于检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的聚焦束斑；
c)移动部件，用于相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底；和
d)与聚焦检测器以及移动部件相连接的控制器，其中控制器根据聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自聚焦检测器的信号调整移动部件。
25．使用衬底的共焦成像***，其中衬底包括不连续表面和与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，所述***包括：
a)一个物镜，经由它，要被聚焦在不连续表面或在位于该不连续表面中的一个物品上的电磁辐射的第一束斑将被导引；
b)具有第一波长的电磁辐射的第二聚焦束斑，所述第二束斑经由所述物镜导引到不连续表面上的一个焦点，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来；
c)具有第二波长的电磁辐射的第三聚焦束斑，所述第三束斑经由所述物镜导引到不连续表面上的一个焦点，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来；
d)用于将第一波长的辐射与经由物镜反射回来的第二波长的辐射隔离的部件；
e)第一检测器，用于检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的第二聚焦束斑；
f)第二检测器，用于检测由所述连续表面经由物镜反射回来的第三聚焦束斑；
g)移动部件，用于相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底，以便控制经由物镜反射回来束斑的焦点；和
h)与第一和第二检测器以及移动部件相连接的控制器，其中控制器根据第一聚焦束斑或第二聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自第一检测器或第二检测器的信号操作移动部件。
26．使用衬底的共焦成像***，其中衬底包括不连续表面和与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，所述***包括：
a)一个物镜，经由它，要被聚焦在不连续表面或在位于该不连续表面中的一个物品上的电磁辐射的第一束斑将被导引；
b)经由所述物镜导引到不连续表面，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来的聚焦束斑；
c)聚焦检测器，用于检测由不连续表面经由物镜反射回来的聚焦束斑；
d)移动部件，用于相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底，以便控制经由物镜反射回来的聚焦束斑的焦点；和
e)与聚焦检测器以及移动部件相连接的控制器，其中控制器根据聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自聚焦检测器的信号操作移动部件。
27．根据权利要求25的共焦成像***，其中第一和第二波长相同。
28．根据权利要求25或26的共焦成像***，其中控制器包括一台计算机。
29．根据权利要求25或26的共焦成像***，其中衬底是微量滴定板，不连续表面是微量滴定板中的一个孔的底。
30．用于监测生物分析的方法，包括使用根据权利要求1的共焦成像***测量从生物分析中的物品发射的电磁辐射的步骤。
31．用于监测生物分析的方法，包括使用含有根据权利要求25或26的聚焦***的显微镜测量从生物分析中的物品发射的电磁辐射的步骤。
32．用于监测生物分析的方法，包括使用根据权利要求12或19的共焦成像***测量从生物分析中的物品发射的电磁辐射的步骤。
33．根据权利要求30的方法，其中该生物分析为转染效果分析、感染分析、FRET分析、蛋白质易位分析、蛋白质定位分析、离子定位分析、pH差异分析、细胞移动分析、细胞器移动分析、形态学分析、化合物筛选分析、配体-蛋白质结合分析、蛋白质-蛋白质结合分析、核酸分析、关于活性氧标本的分析、酶活性分析或者动力学分析。
34．根据权利要求31的方法，其中该生物分析为转染效果分析、感染分析、FRET分析、蛋白质易位分析、蛋白质定位分析、离子定位分析、pH差异分析、细胞移动分析、细胞器移动分析、形态学分析、化合物筛选分析、配体-蛋白质结合分析、蛋白质-蛋白质结合分析、核酸分析、关于活性氧标本的分析、酶活性分析或者动力学分析。
35．根据权利要求32的方法，其中该生物分析为转染效果分析、感染分析、FRET分析、蛋白质易位分析、蛋白质定位分析、离子定位分析、pH差异分析、细胞移动分析、细胞器移动分析、形态学分析、化合物筛选分析、配体-蛋白质结合分析、蛋白质-蛋白质结合分析、核酸分析、关于活性氧标本的分析、酶活性分析或者动力学分析。
36．用于检验物品的方法，包括：
a)使用根据权利要求1的共焦成像***测量从生物分析中的物品发射的电磁辐射；
b)使用如下过程将多个由检测装置产生的电信号分组：
接受多个信号；
将多个信号与阈值比较；
根据多个信号与阈值的比较，建立一个对应于该多个信号的简化数据值的集合；以及
根据相应于简化数据值的集合的多个区域的一部分的空间关系，将该简化数据值的集合分组成至少两个组。
37．用于检验物品的方法，包括：
a)使用含有根据权利要求25或26的聚焦成像***测量从生物分析中的物品发射的电磁辐射，其中从物品发射的电磁辐射被传递到检测装置并被转换成多个电信号；
b)使用如下过程将多个由检测装置产生的电信号分组：
接受多个信号；
将多个信号与阈值比较；
根据多个信号与阈值的比较，建立一个对应于该多个信号的简化数据值的集一个合；以及
根据对应于简化数据值的集合的多个区域的一部分的空间关系，将该简化数据值的集合分组成至少两个组。
38．用于检验物品的方法，包括：
a)形成电磁辐射的一条细长束斑，它横切于辐射传播的光轴延伸；
b)导引和聚焦该细长束斑到放置该物品的第一平面里的第一细长区域，并导引从物品发射的电磁辐射到一个或多个第二细长区域，其中每个第二细长区域位于与第一平面共轭的不同的第二平面上；
c)将检测装置放到在至少一个第二共轭平面里、或者放到在与至少一个第二共轭平面共轭的第三平面里，该检测装置包括由检测元件组成的矩形阵列，在该阵列上从物品发射的电磁辐射是均匀的；以及
d)通过将该细长束斑相对于物品移动或者将物品相对于该细长束斑移动来扫描该物品，使得发射的电磁辐射被传递到由检测元件组成的矩形阵列，并且用检测装置将所述电磁辐射同步于所述的扫描转换成代表电磁辐射的电信号。
39．根据权利要求38的检验物品的方法，还包括以下步骤：
a)利用具有一条定位于第二细长的区的长轴的细长空间过滤器，在空间上过滤被发射的电磁辐射；和
b)在检测装置上形成第二共轭平面的图像。
40．根据权利要求38的检验物品的方法，其中两个或更多个波长的电磁辐射被导引到该物品上。
41．根据权利要求39的检验物品的方法，其中空间滤波器具有可变的宽度。
42．根据权利要求38的检验物品的方法，其中检测装置包括一个由多个检测器元件组成的m×n阵列，其中m是该阵列中的第一维中的检测器元件数目，n是该阵列中的第二维中的检测器元件数目，并且n大于m。
43．根据权利要求42的检验物品的方法，其中发射的电磁辐射所导引到的细长区具有一条位于检测装置的阵列中的长轴，使得该长轴在与第二维同样的方向上延伸。
44．根据权利要求42的检验物品的方法，其中形成在该阵列的第一维上延伸的列的至少两个检测元件被集合在一起。
45．根据权利要求42的检验物品的方法，其中该阵列的多个检测元件被集合在一起。
46．根据权利要求42的检验物品的方法，其中检测装置是CCD阵列。
47．根据权利要求38的检验物品的方法，其中检测装置是矩形排列的CCD阵列。
48．根据权利要求38的检验物品的方法，其中从物品发射的辐射是荧光辐射。
49．根据权利要求38的检验物品的方法，其中物品位于衬底不连续表面上，这种衬底具有与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，所述方法还包括一种聚焦方法，该聚焦方法包括：
a)经由物镜将具有第一波长的电磁辐射的第一聚焦束斑导引到不连续表面，使得该第一聚焦束斑由所述不连续表面经由物镜反射回来；
b)经由物镜将具有第二波长的电磁辐射的第二聚焦束斑导引到连续表面，使得该第二聚焦束斑由所述连续表面经由物镜反射回来；
c)将第一波长的辐射与经由物镜反射回来的第二波长的辐射隔离；
d)用第一聚焦检测器检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的第一聚焦束斑；
e)用第二聚焦检测器检测由所述连续表面经由物镜反射回来的第二聚焦束斑；和
f)根据第一聚焦束斑或第二聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自第一检测器或第二检测器的信号，相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底。
50．根据权利要求38的检验物品的方法，还包括将试剂分配到放置物品的第一平面的步骤。
51．根据权利要求38的检验物品的方法，还包括用于控制物品温度的步骤。
52．根据权利要求39的检验物品的方法，其中电磁辐射的一个或多个波长被导引到该物品，并且其中第二平面是单一的。
53．根据权利要求38、40或52的检验物品的方法，其中电磁辐射的两个或多个波长从第一平面中的第一细长区域里的物品发射，所述方法还包括以下步骤：
隔离被发射的各个波长；以及
通过一个或多个检测装置检测这些被隔离的波长的至少一个。
54．根据权利要求38的检验物品的方法，其中物品位于衬底不连续表面上，这种衬底包括与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，所述方法还包括一种聚焦方法，该聚焦方法包括：
a)经由物镜将电磁辐射的聚焦束斑导引到不连续表面，使得它由所述不连续表面经由物镜反射回来；
b)用聚焦检测器检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的聚焦束斑；以及
c)根据聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自聚焦检测器的信号，相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底。
55．根据权利要求49的检验物品的方法，其中第一和第二波长相同。
56．根据权利要求53的检验物品的方法，其中物品位于衬底不连续表面上，这种衬底具有与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，并且其中电磁辐射的两个或多个波长从物品发射，所述方法还包括一种聚焦方法，该聚焦方法包括：
a)经由物镜将具有第一波长的电磁辐射的第一聚焦束斑导引到不连续表面，使得它由所述不连续表面经由物镜反射回来；
b)经由物镜将具有第二波长的电磁辐射的第二聚焦束斑导引到不连续表面，使得它由所述不连续表面经由物镜反射回来；
c)将第一波长的辐射与经由物镜反射回来的第二波长的辐射隔离；
d)用第一检测器检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的第一聚焦束斑；
e)用第二检测器检测由所述连续表面经由物镜反射回来的第二聚焦束斑；以及
f)根据第一聚焦束斑或第二聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自第一检测器或第二检测器的信号，相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底。
57．根据权利要求53的检验物品的方法，其中物品位于衬底不连续表面上，这种衬底具有与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，并且其中电磁辐射的两个或多个波长从物品发射，所述方法还包括一种聚焦方法，该聚焦方法包括：
a)经由物镜将电磁辐射的聚焦束斑导引到不连续表面，使得它由所述不连续表面经由物镜反射回来；
b)用聚焦检测器检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的聚焦束斑；
c)根据聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自聚焦检测器的信号，相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底。
58．使用衬底的聚焦方法，其中衬底包括不连续表面和与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，所述方法包括：
a)经由物镜导引电磁辐射的第一束斑，以便聚焦到不连续表面或在位于该不连续表面中的一个物品上；
b)经由物镜导引具有第一波长的电磁辐射的第二聚焦束斑，以便聚焦到不连续表面上的一个焦点，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来；
c)经由物镜导引具有第二波长的电磁辐射的第三聚焦束斑，以便聚焦到不连续表面上的一个焦点，并且由所述不连续表面经由物镜反射回来；
d)将第一波长的辐射与经由物镜反射回来的第二波长的辐射隔离；
e)用第一检测器检测由所述不连续表面经由物镜反射回来的第二聚焦束斑；
f)用第二检测器检测由所述连续表面经由物镜反射回来的第三聚焦束斑；
g)根据第一聚焦束斑或第二聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自第一检测器或第二检测器的信号，相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底，以便控制经由物镜反射回来束斑的焦点。
59．使用衬底的聚焦方法，其中衬底包括不连续表面和与该不连续表面以相同方向延伸的连续表面，所述方法包括：
a)经由物镜导引电磁辐射的第一束斑，以便聚焦到不连续表面或在位于该不连续表面中的一个物品上；
b)经由物镜导引电磁辐射的聚焦束斑不连续表面，使得由所述不连续表面经由物镜反射回来；
c)用聚焦检测器检测由不连续表面经由物镜反射回来的聚焦束斑；以及
f)根据聚焦束斑在衬底上的位置，响应于来自聚焦检测器的信号，相对于衬底移动物镜，或者相对于物镜移动衬底，以便控制经由物镜反射回来的聚焦束斑的焦点。
60．根据权利要求58的聚焦方法，其中第一和第二波长相同。
61．根据权利要求38的聚焦方法，还包括使用以下各项的过程，将多个由检测装置产生的电信号分组的步骤：
a)接受多个信号；
b)将多个信号与阈值比较；
c)根据多个信号与阈值的比较，建立一个对应于该多个信号的简化数据值的集合；以及
d)根据相应于简化数据值的集合的多个区域的一部分的空间关系，将该简化数据值的集合分组成至少两个组。
62．用于检验物品的方法，包括下列步骤：
a)使用根据权利要求58或59的聚焦方法；
b)通过传递发射的电磁辐射到检测装置来测量从物品中发射的电磁辐射，在该检测装置中从物品发射的电磁辐射被转换成多个电信号；
c)使用如下过程将多个由检测装置产生的电信号分组：
接受多个信号；
将多个信号与阈值比较；
根据多个信号与阈值的比较，建立一个对应于该多个信号的简化数据值的集合；以及
根据对应于简化数据值的集合的多个区域的一部分的空间关系，将该简化数据值的集合分组成至少两个组。
63．根据权利要求38、49或54的检验物品的方法，其中物品是生物分析中的对象。
64．用于监测生物分析方法，包括使用根据权利要求58或59的聚焦方法的步骤。
65．根据权利要求63的方法，其中该生物分析是转染效果分析、感染分析、FRET分析、蛋白质易位分析、蛋白质定位分析、离子定位分析、pH差异分析、细胞移动分析、细胞器移动分析、形态学分析、化合物筛选分析、配体-蛋白质结合分析、蛋白质-蛋白质结合分析、核酸分析、关于活性氧标本的分析、酶活性分析或者动力学分析。
66．根据权利要求64的方法，其中该生物分析是转染效果分析、感染分析、FRET分析、蛋白质易位分析、蛋白质定位分析、离子定位分析、pH差异分析、细胞移动分析、细胞器移动分析、形态学分析、化合物筛选分析、配体-蛋白质结合分析、蛋白质-蛋白质结合分析、核酸分析、关于活性氧标本的分析、酶活性分析或者动力学分析。

Claims (10)

1．一个共焦成像***，包括：
a)一个用于形成电磁辐射的细长束斑的部件，该光束沿辐射传播的光轴横向延伸；
b)一个共焦成像***，用于导引到该细长束斑到物品所在的第一平面的第一细长区上，并用于将该物品发射的电磁辐射导引到第二平面的第二细长区上；
c)在该第二平面内，或在与该第二平面共轭的第三平面内的一个检测装置，它具有一个由检测器元件组成的矩形阵列，在该阵列上电磁辐射是一致的；以及
d)相对于该物品扫描细长束斑，使得在这些检测器元件上，从被扫描的物品中产生电磁辐射，用检测装置将所述电磁辐射同步于所述的扫描转换成代表电磁辐射的电信号。
2．根据权利要求1的共焦成像***，还包括：
在第二平面内的一个细长空间过滤器，它具有一个与其中第二细长的区是一致的长轴。
3．根据权利要求2的共焦成像***，其中所述空间过滤器具有可变的宽度。
4．根据权利要求1的共焦成像***，其中检测装置包括由紧密摆放的多个检测器元件组成的mxn阵列，其中m是该阵列中的第一维中的检测器元件数目，n是该阵列中的第二维中的检测器元件数目，并且n远大于m。
5．根据权利要求4的共焦成像***，其中第二细长区具有一条长轴，检测装置放置在第二细长区，使得该长轴在与第二维同样的方向上延伸。
6．根据权利要求4的共焦成像***，其中在该阵列的第一维中延伸的各个列内的至少某些检测元件被集合在一起。
7．根据权利要求4的共焦成像***，其中在该阵列的多个检测元件被集合在一起。
8．根据权利要求4的共焦成像***，其中检测装置是CCD阵列。
9．根据权利要求1的共焦成像***，其中检测装置是矩形排列的CCD阵列。
10．根据权利要求1的共焦成像***，其中从物品发射的辐射是荧光射线。
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Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1310023C (zh) * 2004-11-10 2007-04-11 哈尔滨工业大学 三差动共焦显微三维超分辨成像方法
US7468837B2 (en) 2004-05-19 2008-12-23 Celloptic, Inc. Wide-field multi-photon microscope having simultaneous confocal imaging over at least two pixels
CN1934481B (zh) * 2004-03-19 2010-06-23 塞隆纳牙科***有限责任公司 根据共焦显微术的基本原理的高速测量设备和方法
CN102236051A (zh) * 2010-03-30 2011-11-09 索尼公司 辐射测量成像设备及相应的方法
CN102782480A (zh) * 2010-03-01 2012-11-14 奥林巴斯株式会社 光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序
CN101361015B (zh) * 2005-11-23 2012-11-21 伊鲁米那股份有限公司 共焦成像的方法和装置
CN102841083A (zh) * 2012-06-11 2012-12-26 北京大学 一种激光扫描位相显微成像方法及***
CN103135220A (zh) * 2011-11-28 2013-06-05 徕卡显微***复合显微镜有限公司 显微镜照明***及方法
CN103308497A (zh) * 2012-03-14 2013-09-18 泰肯贸易股份公司 用于研究生物细胞或细胞培养物的方法和酶标仪
CN103477209A (zh) * 2011-03-01 2013-12-25 应用精密公司 用于荧光显微镜中照明相位控制的***和方法
CN103575218A (zh) * 2012-08-08 2014-02-12 先进科技新加坡有限公司 彩色共焦扫描装置
CN103782155A (zh) * 2011-09-06 2014-05-07 皇家飞利浦有限公司 具有多个传感器区域的光学生物传感器
CN104155279A (zh) * 2013-05-13 2014-11-19 中国科学院大连化学物理研究所 一种线形共聚焦紫外拉曼光谱仪
CN104296684A (zh) * 2014-11-05 2015-01-21 哈尔滨工业大学 基于表面镀膜共焦显微形貌测量装置的膜厚误差校正方法
CN104677884A (zh) * 2015-03-17 2015-06-03 北京理工大学 高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置
CN104697452A (zh) * 2015-03-24 2015-06-10 宁波高新区零零七工业设计有限公司 激光成像***
CN106662530A (zh) * 2014-09-05 2017-05-10 特莫费希尔科学公司 用于液体样品的光学测量的方法和装置
CN107533218A (zh) * 2015-01-22 2018-01-02 Idea生物医学有限公司 自动聚焦的方法和装置
CN107735681A (zh) * 2015-06-30 2018-02-23 通用电气公司 用于检测透镜浸没的方法和光学显微镜
CN108061964A (zh) * 2017-10-25 2018-05-22 中国科学技术大学 一种可用于大样品的高速三维显微成像装置和方法
CN108319008A (zh) * 2018-02-02 2018-07-24 华中科技大学 一种光学显微成像方法及装置
CN108445619A (zh) * 2018-05-11 2018-08-24 中国工程物理研究院流体物理研究所 光学扫描***及方法
CN108680542A (zh) * 2018-03-26 2018-10-19 华中科技大学 一种阵列式线扫描荧光显微成像装置
CN108885336A (zh) * 2016-04-08 2018-11-23 徕卡显微***复合显微镜有限公司 用于研究样品的方法和显微镜
WO2021180013A1 (zh) * 2020-03-09 2021-09-16 深圳中科飞测科技股份有限公司 一种光学设备及实现自动聚焦的方法
CN114813706A (zh) * 2022-06-29 2022-07-29 国科大杭州高等研究院 一种血细胞高光谱光镊捕获能量共振转移分析仪

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876946A (en) * 1997-06-03 1999-03-02 Pharmacopeia, Inc. High-throughput assay
US20030036855A1 (en) 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
GB2338568B (en) * 1998-06-19 2000-12-20 Optiscan Pty Ltd Two photon endoscope or microscope method and apparatus
US6690463B2 (en) * 2000-02-10 2004-02-10 Evotec Biosystems Ag Fluorescence intensity and lifetime distribution analysis
DE60014188T2 (de) * 2000-10-27 2005-11-17 Amersham Biosciences Corp. Verfahren zum screening von chemischen verbindungen
FR2820828B1 (fr) * 2001-02-09 2003-05-02 Commissariat Energie Atomique Dispositif d'observation d'echantillons par fluorescence, notamment de facon sequentielle
DE10117723A1 (de) * 2001-04-09 2002-10-17 Evotec Ag Probenträger, insbesondere für biochemische Reaktionen
US7219016B2 (en) 2001-04-20 2007-05-15 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
DE10122607B4 (de) * 2001-05-10 2006-11-30 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Anordnung zur direkten Fourierabbildung von Proben
DE10157511A1 (de) * 2001-11-23 2003-06-12 Evotec Ag Verfahren und Vorrichtung zur Korrektur der Größe und/oder Form eines Messvolumens in einer chemischen und/oder biologischen Probe
JP2003177131A (ja) * 2001-12-11 2003-06-27 Olympus Optical Co Ltd 生物学的な結合親和性を検出する方法
GB0211068D0 (en) * 2002-05-14 2002-06-26 Amersham Biosciences Uk Ltd Method for assessing biofilms
GB0211072D0 (en) * 2002-05-15 2002-06-26 Amersham Biosciences Uk Ltd Reagent and method for the determination of changes in a cellular morphological parameter
US6982166B2 (en) 2002-05-16 2006-01-03 Applera Corporation Lens assembly for biological testing
US9157860B2 (en) 2002-05-16 2015-10-13 Applied Biosystems, Llc Achromatic lens array
DE102004034970A1 (de) * 2004-07-16 2006-02-02 Carl Zeiss Jena Gmbh Lichtrastermikroskop und Verwendung
US7335898B2 (en) * 2004-07-23 2008-02-26 Ge Healthcare Niagara Inc. Method and apparatus for fluorescent confocal microscopy
GB0427050D0 (en) * 2004-12-10 2005-01-12 Amersham Biosciences Uk Ltd Method of,and apparatus and computer software for,imaging biological objects
DE202005010588U1 (de) * 2005-07-04 2005-10-13 Weiss Umwelttechnik Gmbh Simulationsanlagen-Messtechnik Anordnung zum Prüfen von pharmazeutischen Substanzen
KR100737170B1 (ko) * 2006-01-20 2007-07-10 경북대학교 산학협력단 양자점 형광체를 이용한 이동식 형광 측정장치
US7567346B2 (en) * 2006-03-01 2009-07-28 General Electric Company System and method for multimode imaging
CA2650776A1 (en) 2006-05-05 2007-11-15 Yale University Immunohistochemical methods for determining signal transduction activity in tumors
JP2009544007A (ja) 2006-07-13 2009-12-10 イェール・ユニバーシティー バイオマーカーの細胞内局在性に基づいて癌予後を行う方法
US7838302B2 (en) 2006-08-07 2010-11-23 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution and other imaging techniques
GB0625775D0 (en) 2006-12-22 2007-02-07 Isis Innovation Focusing apparatus and method
JP4957458B2 (ja) * 2007-08-27 2012-06-20 株式会社Ｊｖｃケンウッド ボイスコイル及びスピーカ
WO2009048142A1 (ja) * 2007-10-11 2009-04-16 Nikon Corporation 観察装置
EP2232244A1 (en) * 2007-12-21 2010-09-29 President and Fellows of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution in three dimensions
WO2009115108A1 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg A method and an apparatus for localization of single dye molecules in the fluorescent microscopy
KR101532611B1 (ko) * 2009-04-28 2015-07-01 삼성전자주식회사 주밍샷 효과를 나타내는 디지털 영상 처리 장치 및 방법
US8767069B2 (en) * 2010-06-30 2014-07-01 Luminex Corporation Apparatus, system, and method for increasing measurement accuracy in a particle imaging device using light distribution
WO2012014778A1 (ja) 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法
EP2602613B1 (en) 2010-09-10 2017-02-22 Olympus Corporation Optical analysis method using optical intensity of single light-emitting particle
WO2012032955A1 (ja) 2010-09-10 2012-03-15 オリンパス株式会社 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法
CN103119421B (zh) * 2010-09-21 2015-04-08 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测的光分析方法
JP5737704B2 (ja) * 2010-09-27 2015-06-17 株式会社ライフテック 蛍光一粒子検出方法および検出システム
WO2012050011A1 (ja) * 2010-10-13 2012-04-19 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた粒子の拡散特性値の測定方法
WO2012053355A1 (ja) * 2010-10-19 2012-04-26 オリンパス株式会社 単一発光粒子の偏光特性を観測する光分析装置、光分析方法及びそのための光分析用コンピュータプログラム
JP5945506B2 (ja) 2010-11-25 2016-07-05 オリンパス株式会社 単一発光粒子の光の波長特性を用いた光分析装置及び光分析方法
EP2667183A4 (en) 2011-01-20 2017-05-10 Olympus Corporation Photoanalysis method and photoanalysis device using detection of light from single light-emitting particle
CN103328956B (zh) 2011-01-26 2015-08-12 奥林巴斯株式会社 鉴别核酸分子多态性的方法
JP6009944B2 (ja) 2011-01-26 2016-10-19 オリンパス株式会社 核酸分子の多型識別方法
EP2693201A4 (en) 2011-03-29 2014-10-29 Olympus Corp PHOTOMETRIC ANALYSIS DEVICE, PHOTOMETRIC ANALYSIS METHOD, AND COMPUTER PROGRAM FOR PHOTOMETRIC ANALYSIS, DETECTING SINGLE LIGHT EMITTING PARTICLE
JP5885738B2 (ja) 2011-04-13 2016-03-15 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2012144528A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 オリンパス株式会社 標的粒子の定量方法、光分析装置及び光分析用コンピュータプログラム
EP2743682B1 (en) 2011-08-11 2017-05-31 Olympus Corporation Method for detecting target particles
JP6013337B2 (ja) 2011-08-15 2016-10-25 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
EP2749868B1 (en) 2011-08-26 2019-02-27 Olympus Corporation Single-particle detector using optical analysis, single-particle detection method using same, and computer program for single-particle detection
CN103765196B (zh) 2011-08-26 2016-03-02 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测的光分析装置及光分析方法
WO2013031365A1 (ja) 2011-08-30 2013-03-07 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
WO2013031377A1 (ja) 2011-08-30 2013-03-07 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
CN103930768B (zh) 2011-11-10 2016-05-18 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
WO2013121905A1 (ja) 2012-02-17 2013-08-22 オリンパス株式会社 単一粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP5940644B2 (ja) 2012-02-22 2016-06-29 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
WO2013140890A1 (ja) 2012-03-21 2013-09-26 オリンパス株式会社 標的核酸分子の検出方法
WO2013157319A1 (ja) 2012-04-18 2013-10-24 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
WO2013157283A1 (ja) 2012-04-18 2013-10-24 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
JP6360481B2 (ja) 2013-07-31 2018-07-18 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム
WO2015052965A1 (ja) 2013-10-07 2015-04-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2017098597A1 (ja) 2015-12-09 2017-06-15 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析方法及び光分析装置
US20230081546A1 (en) * 2020-01-31 2023-03-16 Stellenbosch University Method for determining mitochondrial events
JP2023541449A (ja) 2020-09-14 2023-10-02 シンギュラー・ゲノミクス・システムズ・インコーポレイテッド 多次元撮像のための方法およびシステム
KR102447224B1 (ko) * 2020-10-26 2022-09-27 한국생산기술연구원 미세 입자의 정성 및 정량 분석 장치

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63306413A (ja) * 1987-06-09 1988-12-14 Olympus Optical Co Ltd 走査型光学顕微鏡
US4844617A (en) * 1988-01-20 1989-07-04 Tencor Instruments Confocal measuring microscope with automatic focusing
US5020891A (en) * 1988-09-14 1991-06-04 Washington University Single aperture confocal scanning biomicroscope and kit for converting single lamp biomicroscope thereto
US5034613A (en) * 1989-11-14 1991-07-23 Cornell Research Foundation, Inc. Two-photon laser microscopy
US5274240A (en) * 1990-01-12 1993-12-28 The Regents Of The University Of California Capillary array confocal fluorescence scanner and method
GB9015793D0 (en) * 1990-07-18 1990-09-05 Medical Res Council Confocal scanning optical microscope
JPH04221917A (ja) * 1990-12-25 1992-08-12 Tamron Co Ltd 顕微鏡の自動焦点調節方法およびその装置
US5162641A (en) * 1991-02-19 1992-11-10 Phoenix Laser Systems, Inc. System and method for detecting, correcting and measuring depth movement of target tissue in a laser surgical system
US5784162A (en) * 1993-08-18 1998-07-21 Applied Spectral Imaging Ltd. Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy
US5465147A (en) * 1991-04-29 1995-11-07 Massachusetts Institute Of Technology Method and apparatus for acquiring images using a ccd detector array and no transverse scanner
JPH05188301A (ja) * 1991-09-09 1993-07-30 Sumitomo Electric Ind Ltd レーザ顕微鏡
JPH05332733A (ja) * 1992-05-27 1993-12-14 Hitachi Ltd 検出光学系並びに立体形状検出方法
JPH07128596A (ja) * 1993-09-08 1995-05-19 Nikon Corp コンフォーカル顕微鏡
US5587832A (en) * 1993-10-20 1996-12-24 Biophysica Technologies, Inc. Spatially light modulated confocal microscope and method
JP3450406B2 (ja) * 1994-03-10 2003-09-22 オリンパス光学工業株式会社 観察画像の位置調整装置及び走査型光学顕微鏡
JPH07281100A (ja) * 1994-04-05 1995-10-27 Nikon Corp オートフォーカス顕微鏡用の挟持標本体
US5515864A (en) * 1994-04-21 1996-05-14 Zuckerman; Ralph Method and apparatus for the in vivo measurement of oxygen concentration levels by the indirect determination of fluoescence lifetime
US5981956A (en) * 1996-05-16 1999-11-09 Affymetrix, Inc. Systems and methods for detection of labeled materials
US5900949A (en) * 1996-05-23 1999-05-04 Hewlett-Packard Company CCD imager for confocal scanning microscopy
US5880465A (en) * 1996-05-31 1999-03-09 Kovex Corporation Scanning confocal microscope with oscillating objective lens
US5915048A (en) * 1996-06-05 1999-06-22 Zetetic Institute Method and apparatus for discriminating in-focus images from out-of-focus light signals from background and foreground light sources
JPH09329749A (ja) * 1996-06-11 1997-12-22 Nikon Corp 光走査型顕微鏡
DE19627568A1 (de) * 1996-07-09 1998-01-15 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung und Verfahren zur konfokalen Mikroskopie
DE19632594A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Johannes Prof Dr Schwider Konfokales Mikroskop unter Anwendung von refraktiven Mikrolinsen-Feldern
US5760901A (en) * 1997-01-28 1998-06-02 Zetetic Institute Method and apparatus for confocal interference microscopy with background amplitude reduction and compensation
JP3816632B2 (ja) * 1997-05-14 2006-08-30 オリンパス株式会社 走査型顕微鏡

Cited By (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1934481B (zh) * 2004-03-19 2010-06-23 塞隆纳牙科***有限责任公司 根据共焦显微术的基本原理的高速测量设备和方法
US7468837B2 (en) 2004-05-19 2008-12-23 Celloptic, Inc. Wide-field multi-photon microscope having simultaneous confocal imaging over at least two pixels
CN1310023C (zh) * 2004-11-10 2007-04-11 哈尔滨工业大学 三差动共焦显微三维超分辨成像方法
CN101361015B (zh) * 2005-11-23 2012-11-21 伊鲁米那股份有限公司 共焦成像的方法和装置
CN102782480B (zh) * 2010-03-01 2013-09-11 奥林巴斯株式会社 光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序
CN102782480A (zh) * 2010-03-01 2012-11-14 奥林巴斯株式会社 光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序
CN102236051A (zh) * 2010-03-30 2011-11-09 索尼公司 辐射测量成像设备及相应的方法
CN103477209B (zh) * 2011-03-01 2016-03-30 通用电气医疗集团生物科学公司 用于荧光显微镜中照明相位控制的***和方法
CN103477209A (zh) * 2011-03-01 2013-12-25 应用精密公司 用于荧光显微镜中照明相位控制的***和方法
CN103782155B (zh) * 2011-09-06 2016-11-16 皇家飞利浦有限公司 具有多个传感器区域的光学生物传感器
CN103782155A (zh) * 2011-09-06 2014-05-07 皇家飞利浦有限公司 具有多个传感器区域的光学生物传感器
CN103135220A (zh) * 2011-11-28 2013-06-05 徕卡显微***复合显微镜有限公司 显微镜照明***及方法
CN103135220B (zh) * 2011-11-28 2016-12-21 徕卡显微***复合显微镜有限公司 显微镜照明***及方法
CN103308497A (zh) * 2012-03-14 2013-09-18 泰肯贸易股份公司 用于研究生物细胞或细胞培养物的方法和酶标仪
CN103308497B (zh) * 2012-03-14 2017-11-17 泰肯贸易股份公司 用于研究生物细胞或细胞培养物的方法和酶标仪
CN102841083B (zh) * 2012-06-11 2014-08-20 北京大学 一种激光扫描位相显微成像方法及***
CN102841083A (zh) * 2012-06-11 2012-12-26 北京大学 一种激光扫描位相显微成像方法及***
CN103575218A (zh) * 2012-08-08 2014-02-12 先进科技新加坡有限公司 彩色共焦扫描装置
CN104155279A (zh) * 2013-05-13 2014-11-19 中国科学院大连化学物理研究所 一种线形共聚焦紫外拉曼光谱仪
CN106662530A (zh) * 2014-09-05 2017-05-10 特莫费希尔科学公司 用于液体样品的光学测量的方法和装置
US10677734B2 (en) 2014-09-05 2020-06-09 Thermo Fisher Scientific Oy Method and apparatus for optical measurement of liquid sample
CN104296684A (zh) * 2014-11-05 2015-01-21 哈尔滨工业大学 基于表面镀膜共焦显微形貌测量装置的膜厚误差校正方法
CN104296684B (zh) * 2014-11-05 2016-11-30 哈尔滨工业大学 基于表面镀膜共焦显微形貌测量装置的膜厚误差校正方法
CN107533218A (zh) * 2015-01-22 2018-01-02 Idea生物医学有限公司 自动聚焦的方法和装置
CN107533218B (zh) * 2015-01-22 2020-06-12 Idea生物医学有限公司 自动聚焦的方法和装置
CN104677884B (zh) * 2015-03-17 2017-07-11 北京理工大学 高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置
CN104677884A (zh) * 2015-03-17 2015-06-03 北京理工大学 高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置
CN104697452A (zh) * 2015-03-24 2015-06-10 宁波高新区零零七工业设计有限公司 激光成像***
CN107735681A (zh) * 2015-06-30 2018-02-23 通用电气公司 用于检测透镜浸没的方法和光学显微镜
CN108885336A (zh) * 2016-04-08 2018-11-23 徕卡显微***复合显微镜有限公司 用于研究样品的方法和显微镜
CN108885336B (zh) * 2016-04-08 2021-12-14 徕卡显微***复合显微镜有限公司 用于研究样品的方法和显微镜
CN108061964A (zh) * 2017-10-25 2018-05-22 中国科学技术大学 一种可用于大样品的高速三维显微成像装置和方法
CN108319008A (zh) * 2018-02-02 2018-07-24 华中科技大学 一种光学显微成像方法及装置
CN108680542A (zh) * 2018-03-26 2018-10-19 华中科技大学 一种阵列式线扫描荧光显微成像装置
CN108680542B (zh) * 2018-03-26 2020-01-10 华中科技大学 一种阵列式线扫描荧光显微成像装置
CN108445619A (zh) * 2018-05-11 2018-08-24 中国工程物理研究院流体物理研究所 光学扫描***及方法
WO2021180013A1 (zh) * 2020-03-09 2021-09-16 深圳中科飞测科技股份有限公司 一种光学设备及实现自动聚焦的方法
CN114813706A (zh) * 2022-06-29 2022-07-29 国科大杭州高等研究院 一种血细胞高光谱光镊捕获能量共振转移分析仪

Also Published As

Publication number Publication date
EP1064579A1 (en) 2001-01-03
IL138496A0 (en) 2001-10-31
KR100560588B1 (ko) 2006-03-16
WO1999047963A9 (en) 1999-12-23
KR100618502B1 (ko) 2006-09-01
CN100380160C (zh) 2008-04-09
WO1999047963A1 (en) 1999-09-23
JP4812937B2 (ja) 2011-11-09
EP1064579A4 (en) 2007-11-07
KR20050088500A (ko) 2005-09-06
WO1999047963A8 (en) 1999-11-18
KR20010041945A (ko) 2001-05-25
IL164319A0 (en) 2005-12-18
NO20004601L (no) 2000-11-10
JP2002507762A (ja) 2002-03-12
BR9908767B1 (pt) 2011-09-06
CA2324262C (en) 2010-05-25
NO20004601D0 (no) 2000-09-15
BR9908767A (pt) 2001-10-16
AU3354799A (en) 1999-10-11
CA2324262A1 (en) 1999-09-23
AU758571B2 (en) 2003-03-27

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