CN1300317C

CN1300317C - 抗李斯特菌细菌素

Info

Publication number: CN1300317C
Application number: CNB018112579A
Authority: CN
Inventors: J－M·博杰奥德; C·弗利茅克斯; Y·塞纳蒂姆伯; L·希曼
Original assignee: Rhone Poulenc Chimie SA
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2000-05-29
Filing date: 2001-05-28
Publication date: 2007-02-14
Anticipated expiration: 2021-05-28
Also published as: CA2409940C; AU2001264038B2; DK1285069T3; JP2004504815A; RU2250267C2; AU2001264038C1; DK1927661T3; FR2809404B1; BR0111265A; EP1285069B1; CA2409940A1; CN1436238A; US20050232910A1; US7238515B2; EP1927661A2; DE60142653D1; DE60135325D1; EP1927661A3; JP4302976B2; AU6403801A

Abstract

本发明涉及由清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)2512衍生的分离多肽，即称为Sakacine G的细菌素。本发明还涉及编码所述细菌素的核酸，以及所述多肽在食品制作中作为抗致病和非期望菌群的活性剂的用途。

Description

抗李斯特菌细菌素

本发明涉及清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)(更具体的说是清酒乳杆菌2512)的细菌素、编码该细菌素的核苷酸序列、和该细菌素在食品制作中作为针对致病或非期望菌群的活性剂的工业用途。

乳酸菌被广泛用于食品发酵，不仅用于改进食品的味道和质地，而且尤其用于延长它们的保存期。事实上，许多乳酸菌能够抑制某些***(包括致病菌株，诸如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))的生长，这要归功于拮抗分子(包括肽化合物)的分泌。这些肽化合物(称为细菌素)因而具有潜在价值，可用于保持发酵食品的品质和卫生。

作为这种细菌素的范例，特别要提到那些构成称为抗李斯特菌细菌素的多肽亚型的细菌素、IIa型细菌素(S.Ennahar等人，2000，FEMSMicrobiol.Rev.，24：85-106)和cystibiotic细菌素(R.Jack等人，1995，Microbiol.Rev.，59(2)：171-200)。最近人们已经注意到了这些IIa型细菌素之一即divercin V41用于在熏鱼中防止单核细胞增生李斯特菌生长的潜在用途(F.Duffes等人，1999，J.FoodProt.，62(12)：1394-1403)。

这些多肽的序列在N端部分显示强相似性，特别是存在二硫键。疏水C端部分的差异要大得多，但是这些细菌素中的某些即所谓的片球菌素型细菌素(片球菌素PA-1、肠菌素A和divercin V41)特征为残基数目超过40且C端存在第二个二硫键。

本发明的作者发现了由清酒李斯特菌特定菌株生成的新的IIa型细菌素，经证明对抑制李斯特菌(尤其是单核细胞增生李斯特菌)的生长特别有效。

与J.R.Tagg等人，1976，Bacteriol.Rev.，40：722-756一致，术语“细菌素”在本发明的范围内指由能够特异抑制其它细菌生长的微生物通过核糖体合成而生成的多肽。

本发明因而首先涉及由清酒乳杆菌2512菌株衍生的、具有细菌素活性的多肽。

清酒乳杆菌2512菌株已于2000年5月25日保藏于国家微生物培养物收藏中心(Collection Nationale des Cultures deMicroorganismes)，保藏物编号I-2479。

已将本发明所涉及的细菌素命名为sakacin G。该多肽的分子量是3700-3900，优选大约3834Da(通过质谱测定)。它的细菌抑制谱与IIa型细菌素非常相似。因此，经证明它对除清酒乳杆菌2512以外的其它清酒乳杆菌、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、全体李斯特菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和耐久肠球菌(Enterococcus durans)特别有效。相反，经证明它对乳杆菌的其它种诸如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的一种菌株无活性。

与片球菌素型抗李斯特菌细菌素一样，sakacin G在其肽结构中有利的具有两个二硫键。

关于几种IIa型细菌素的遗传决定因子的分析显示，参与其生成、转运和免疫的基因被组织成一个或多个操纵子型结构。这些操纵子通常位于质粒中，而且通常具有至少两种编码与ABC转运蛋白和辅助蛋白同源的蛋白质的基因，所述蛋白质可能参与细菌素转运。

包含sakacin G基因的核苷酸片段的克隆揭示了存在三个完整的开放读码框即skgA1(SEQ ID NO：1)、skgA2(SEQ ID NO：3)和skgDc(SEQ ID NO：13)(包括截短的读码框skgD(SEQ ID NO：7))及一个截短的读码框即skgI(SEQ ID NO：5)，图1显示了它们的示意图。核苷酸片段是双链的，SEQ ID NO：15显示了它的5’-3’单链。

基因skgA1和skgA2的产物(称为前细菌素)可经历成熟，在此过程中，在第18与19位残基之间切除各自的前导肽，从而释放有活性的sakacin G(第19-55位残基)。

SEQ ID NO：9显示了包含skgA1、skgA2、skgD和skgI的5’-3’单链核苷酸片段。

本发明因而还涉及对应于细菌素的分离多肽，特征为它包含SEQID NO：2和/或SEQ ID NO：4。成熟细菌素的序列对应于SEQ ID NO：12，且包含于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4之中。

读码框skgI编码52个残基的蛋白质。该序列与数据库序列的比较显示SkgI与所谓的免疫蛋白之间存在强相似性。它可能编码可保护sakacin G生产细菌的免疫蛋白。

本发明还延伸至包含对应于读码框skgI的SEQ ID NO：6的分离多肽。

关于最后一个基因skgDc，它编码与ABC转运蛋白家族的蛋白质(更具体的说是片球菌素PA-1的转运蛋白)同源的蛋白质。基因skgDc可能编码对sakacin G特异的ABC转运蛋白。

本发明还延伸至包含对应于所谓skgD基因的SEQ ID NO：8的分离多肽，以及包含对应于所谓skgDc基因的SEQ I D NO：14的分离多肽。

应当理解，本发明还包括同源序列，定义如下：

1)与序列SEQ ID NO：2、4、6、8、12或14至少70％相似的序列；或

2)由下文定义的同源核酸序列编码的序列，即在严谨杂交条件下与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15或其互补序列发生杂交的核酸序列。

同样，术语“相似”指进行比较的同源序列氨基酸之间的完全类似性或同一性，还包括不完全类似性，称为相似性。多肽序列中的这种相似性搜索考虑到了保守替代，即相同类型氨基酸的替代，诸如侧链不带电荷的氨基酸(诸如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)、侧链碱性的氨基酸(诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、侧链酸性的氨基酸(诸如天冬氨酸和谷氨酸)、侧链非极性的氨基酸(诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸)之中的替代。

因此，更一般的说，“同源氨基酸序列”应理解为因一个氨基酸或少数氨基酸的替代、删除和/或***(尤其是在这些修饰不会显著影响分离多肽(优选sakacinG)的生物学活性的位置中用非天然氨基酸或假氨基酸替代天然氨基酸)而与SEQ ID NO：2、4、6、8、12或14不同的任何氨基酸序列。

这种同源氨基酸序列优选与序列SEQ ID NO：2、4、6、8、12或14的至少85％相似，优选至少95％。

通常使用序列分析软件(例如威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机小组的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊市大学路1710号，53705)来测定同源性。比对相似的氨基酸序列，以获得最大同源程度(即同一性或相似性，见上文定义)。为此目的，可能必需在序列中人工导入缺口。一旦完成最佳比对，如下计算同源程度：记录比较的两种序列中氨基酸相同的所有位置，并除以位置总数。

分离多肽(更具体的说是sakacin G)的生物学活性指其抑制致病和/或非期望细菌菌株(优选李斯特菌，更具体的说是单核细胞增生李斯特菌)生长的能力。

本发明还涉及编码上述多肽的分离核酸。

更准确的说，本发明涉及包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3的分离核酸。

已经测定了参与sakacin G表达的区域的完整核苷酸序列(3055bp)。它是双链DNA，SEQ ID NO：15显示了它的5’-3’链。图2显示了它的3’-5’链。本发明还涉及包含这种序列的核酸。

如上所述，该序列具有三个完整的开放读码框即skgA1、skgA2和skgDc及一个截短的读码框即skgI。假设基因skgA1(SEQ ID NO：1)、skgA2(SEQ ID NO：3)和skgI(SEQ ID NO：5)在其中的取向与skgDc(SEQ ID NO：13)相反。

本发明的范围还要求包含SEQ ID NO：5的核酸、包含SEQ ID NO：13的核酸和包含SEQ ID NO：17的核酸。

应当理解，本发明还包括同源序列，定义如下：

1)与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15至少70％相似的序列；

2)在严谨杂交条件下与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15或其互补序列发生杂交的序列；或

3)编码上述称为sakacin G的多肽的序列。

依照本发明的同源核苷酸序列优选与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13、或15至少75％相似，优选至少85％或至少90％相似。

这种同源核苷酸序列优选能够在严谨条件下与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15的互补序列发生特异杂交。定义严谨条件的参数取决于50％的配对链分开的温度(Tm)。

对于包含超过30个碱基的序列，Tm由如下方程定义(Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室)：

Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6Log(阳离子浓度)

-0.63(％甲酰胺)-(600/碱基数目)

对于长度小于30个碱基的序列，Tm由如下方程定义：

Tm＝4(G+C)+2(A+T)

在适当的严谨条件(在此条件下非特异序列不发生杂交)下，杂交温度可优选比Tm低5-10℃，而且所用杂交缓冲液优选高离子强度溶液，诸如6xSSC溶液。

上文所用表述“相似序列”指进行比较的核苷酸之间的完全类似性或同一性，还包括不完全类似性，称为相似性。核酸序列中的这种相似性搜索将区分例如嘌呤和嘧啶。

具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15中所示开放读码框的同源核苷酸序列包括因一个或多个碱基的突变、***、删除或替代或者遗传密码的简并性而与序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13或15不同、但编码下文定义的具有sakacin G生物学活性的多肽的任何核苷酸序列。

这种同源序列包括编码sakacin G的、除乳杆菌以外的其它细菌的基因序列。

可以通过本领域技术人员知道的任何方法来合成本发明的多肽。可以通过例如化学合成技术(诸如Merrifield型合成)来合成本发明的多肽，就纯度、抗原特异性、不含非期望次级产物且易于生产而言，这种方法是有利的。

本发明还涉及用于生产重组多肽的方法，其中将包含依照本发明的核酸的载体转移至宿主细胞中，并将其在容许表达依照本发明的多肽或由依照本发明的核酸序列编码的多肽的条件下进行培养。

还可以通过如下方法来生产重组细菌素，其中：将载体转移至宿主细胞中，并将其在容许表达相应多肽的条件下进行培养，所述载体包含依照本发明的核苷酸序列(优选序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3或其同源序列)的核酸。然后可以回收并纯化生成的蛋白质。本领域技术人员知道所用的纯化方法。可以单独或联合使用诸如分级分离、层析法、使用特异单克隆或多克隆抗体的免疫亲和技术等方法，由裂解物和细胞提取物、培养物上清液开始，纯化生成的重组多肽。

可以将编码sakacin G的目的核酸序列***表达载体，在其中以可操作方式连接容许调控其表达的元件，诸如(尤其是)启动子、激活子和/或转录终止子。根据所用宿主细胞来选择控制核苷酸序列表达的信号(启动子、激活子、这种序列、等)。为此目的，可以将依照本发明的核苷酸序列***能够在所选宿主中自主复制的载体或可整合到所选宿主中的载体内。本领域技术人员可以通过常规使用的方法来制备这种载体，并通过标准方法(诸如电穿孔或磷酸钙沉淀)将由此生成的克隆导入合适的宿主。

包含依照本发明的核苷酸序列的上述克隆和/或表达载体也构成本发明的一部分。

本发明还涉及经那些表达载体暂时或永久转化的宿主细胞。可以如下获得这些细胞：将***上述载体的核苷酸序列导入宿主细胞(优选原核宿主细胞)，然后在容许转移的核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养所述细胞。

宿主细胞的范例具体包括诸如乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)的细菌和酵母。

本发明的核苷酸序列可以是合成或天然来源的。它们可以是使用基于序列SEQ ID NO：1、3、5、7、9、13和/或15而生成的探针筛选序列文库而得到的DNA或RNA序列。可以通过本领域技术人员知道的常规分子生物学技术来制备这种文库。

还可以通过化学合成法或者通过混合法来制备依照本发明的核苷酸序列，所述混合法包括对通过筛选文库而得到的序列进行化学或酶促修饰。

本发明还涉及在可能是或不是食品环境且易于受到单核细胞增生李斯特菌污染的环境中抑制李斯特菌(尤其是单核细胞增生李斯特菌)生长的方法。

单核细胞增生李斯特菌是致病微生物，是人类和动物严重疾病的根源，尤其易于通过污染食品进行传播，更具体的说是通过肉类、肉制品、海产品、奶类及由其衍生的产品。本发明因而提出了在有可能包含单核细胞增生李斯特菌作为污染物的食品中抑制单核细胞增生李斯特菌生长的方法，所述方法包括以足以抑制单核细胞增生李斯特菌生长的数量在所述食品中添加依照本发明的多肽。

优选以每克食品1-100,000任意单位(AU)细菌素的数量将依照本发明的细菌素用于任何食品***。

一个AU的细菌素定义为在琼脂培养基上，相对于***的对照菌株，5μl最高稀释度的培养物上清液导致确定的生长抑制圈。

虽然食品最受单核细胞增生李斯特菌污染的影响，但是兽医和医学产品也可能受到这类细菌的污染，化妆品或相似产品也一样。

依照本发明的细菌素(更具体的说是sakacin G)因而可用于在这些产品中抑制这类病原体的生长。

因此，本发明涉及依照本发明的细菌素在食品制作中作为针对致病或非期望菌群的活性剂的用途，更准确的说是在食品中抑制李斯特菌(更具体的说是单核细胞增生李斯特菌)的生长和繁殖。

可以如此将多肽掺入讨论的食品，或者可以在其中由清酒乳杆菌2512生成该多肽。

因此，本发明还涉及清酒乳杆菌2512菌株在食品中生成依照本发明的细菌素多肽的用途。

本发明还涉及细菌素组合物，特征为它包含至少一种依照本发明(即由清酒乳杆菌2512菌株衍生或包含序列SEQ ID NO：2、4、12或14)的多肽或清酒乳杆菌2512菌株。

本发明还延伸至清酒乳杆菌2512菌株意欲在食品中生成上文定义的多肽以用于抑制李斯特菌(更具体的说是单核细胞增生李斯特菌)的生长和繁殖的用途，及包含该菌株的组合物。

给出下文实施例和图作为范例，而非限制本发明的主题。

图

图1：参与sakacin G生成的基因座的示意图。

图2：对应于参与sakacin G表达的区域的完整核苷酸序列的3’-5’互补链，它的5’-3’链显示于SEQ ID NO：15。

材料和方法

细菌菌株和培养基

在MRS培养基(DIFCO Laboratories)(于110℃灭菌12分钟)中于30℃培养清酒乳杆菌2512。在BHI培养基(脑心浸液；DIFCOLaboratories)中于37℃培养指示菌株。

活性测试

在将添加10g/L琼脂的BHI培养基倒入培养皿之前，以1％接种量接种处于静止期的指示菌株预培养物。用打孔器在冷却后的琼脂中打孔，并加入50μl sakacin G。于37℃保温过夜后，细菌素通过孔周围出现的抑菌圈而显现其活性。

蛋白质分析

使用配备了离子喷射电离源的Perkin-Elmer Sciex API 165设备通过质谱分析sakacin G。冻干后，用含0.1％甲酸的乙腈/水溶液(1∶1)溶解有活性的HPLC级分，然后以5μl/min的流速注入。

使用BCA试剂盒(Sigma)，依照制造商的指示，通过二金鸡宁酸法测定蛋白质浓度。

使用可以由瑞士生物信息研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)的ExPASy服务器获得的BLAST(1)程序进行蛋白质序列比较。

分子克隆和转化

分别依照先前由Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室及Muriana和Klaenhammer，1987，Appl.Environ.Microbiol.，53：553-560描述的方法，由大肠杆菌和清酒乳杆菌2512提取和纯化质粒。

依照供应商(Gibco-BRL)的指示使用DNA限制酶和修饰酶。依照由Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室描述的方法，在Tris/硼酸/EDTA缓冲液(pH8.3)中进行分析性和制备性琼脂糖凝胶电泳。使用“制备基因”试剂盒(Bio-Rad)由琼脂糖凝胶纯化消化得到的DNA片段。依照供应商的建议在质粒pGEM-T(Promega)和pZERO2(Invitrogen)中进行克隆。依照Sambrook等人，1989，纽约，冷泉港实验室的方法，在尼龙膜(Hybond-N+，Amersham)上进行Southern型转移。转移后，使用借助“随机引物DNA标记***”试剂盒(Gibco-BRL)通过32P标记得到的放射性探针进行杂交。依照Hanahan，1983，J.Mol.Biol.，166：557-580的方法，使大肠杆菌处于感受态和进行转化。

依照供应商的建议使用Taq聚合酶(Gibco-BRL)。使用“基因扩增9700”装置(Perkin-Elmer)进行编码sakacin G的DNA片段的扩增，条件如下：35个循环，变性94℃ 30sec、杂交45℃ 30sec、延伸72℃ 60sec；1个额外的延伸，72℃ 5min。

使用ABI Prism 310自动测序仪(Perkin-Elmer)和“大染料终止剂”测序试剂盒(Perkin-Elmer)及适当的核苷酸引物对携带sakacin G基因座的DNA片段进行测序。

实施例

实施例1：sakacin G的分离和纯化

将100ml清酒乳杆菌2512的16小时培养物以6000g离心15分钟。然后将培养物上清液于70℃加热20分钟。用1倍体积的水稀释冷却后的上清液(稀释后溶液的pH必须低于6，如果需要就加入1M HCl)，然后流过装有阳离子交换树脂(羧甲基纤维素；Cellufine C-200，Amicon)并经水平衡的层析柱(2.5×18cm)。先用100ml水、后用150ml 0.1M NaCl连续清洗后，用200ml 0.5M NaCl洗脱sakacin G。所有溶液的pH必须低于6。然后将活性级分在固相提取柱(Sep-pak+C18，Waters)(用水平衡)上沉积。用5ml含0、10、20和30％乙腈的20mM醋酸铵连续清洗后，用10ml含80％乙腈的20mM醋酸铵洗脱sakacin G。冻干后，将提取物溶于1ml 40％乙腈水溶液，然后注射到C8反相分析HPLC柱(Kromasil，5μm，100，4.6×250mm，A.I.T.)上。在包括Perkin-Elmer系列200LC泵且连接Perkin-Elmer 785A检测器的装置上进行HPLC。记录220nm的吸收色谱。以0.8ml/min流速进行分离，梯度如下：溶剂A＝水/0.1％三氟乙酸；溶剂B＝乙腈/水/0.07％三氟乙酸。用20％的溶剂B清洗5分钟后，以如下梯度进行洗脱：20-40％溶剂B 10min；40-55％溶剂B 20min。

对应于第23分钟峰的级分经证明对伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)BUG 496有活性，并通过“离子喷射”电离质谱进行分析。该分子表现为至少95％纯，且具有分子量3834.32±0.31Da。由此纯化的sakacin G的质量估计是100ml培养物得到120μg。纯化产量估计是所发现活性的55％。

通过微量测序测定了sakacin G的部分一级序列，并由该序列确定了两种简并寡核苷酸。

实施例2：参与sakacin G生成的基因座的克隆

通过反求遗传学，选择两种简并寡核苷酸即SakG01(5’-AARTATTATGGNAAYGGNGT-3’)(SEQ ID NO：10)和SakG02S(5’-ACATGATGNCCNCCRTTNGC-3’)(SEQ ID NO：11)，用于通过聚合酶链式反应(PCR)扩增对应于成熟sakacin G结构基因(SEQ ID NO：15)的DNA片段。将由此获得的、近似大小100bp的扩增产物克隆到质粒pGEM-T中，形成质粒pJMBYC01。在为了将结构基因在清酒乳杆菌2512基因组上定位而进行的Southern型转移过程中，将由pJMBYC01衍生的、包含***片段的560bp PvuII限制性片段用作杂交探针。由经限制酶HindIII和EcoRI消化的清酒乳杆菌2512质粒提取物开始，探针分别揭示了近似大小2.1和9kb的片段。纯化2.1kb的HindIII片段，然后***载体pZERO2，生成质粒pJMBYC02。通过使用引物SakG01和SakG02的PCR扩增及***pJMBYC02中的片段的核苷酸测序，证明了pJMBYC02中存在sakacin G的结构基因。将相似策略用于测定基因skgD的完整序列。用XbaI消化清酒乳杆菌2512的质粒提取物。将消化产物***质粒pBluescript SK+。使用寡核苷酸SakG03(5’-CCTTGGTCAGGCTATCG-3’)(SEQ ID NO：16)和SakG04(5’-ATCACCTTTTTGAATTACCC-3’)(SEQID NO：17)在质粒pJMBYC02上通过PCR制备放射性探针，并将其用于揭示携带目的序列的克隆。

对该区域完整核苷酸序列(3051bp)的分析揭示了存在三个完整的开放读码框即skgA1、skgA2和skgDc及一个截短的读码框即skgI。假设基因skgA1、skgA2和skgI的取向与skgDc相反。

每个开放读码框的前面都有一个潜在的核糖体结合位点。基因skgA1和skgA2都编码具有55个氨基酸残基的蛋白质，它们的第19-55位序列完全相同。第19-52位序列对应于通过微量测序得到的sakacinG序列。值得注意的是第9、14和24位和C末端存在4个半胱氨酸。此外，该肽的计算分子量是3838.2Da，与测量分子量(3834.32Da)相差4Da，显示在sakacin G中存在两个二硫键，正如其它抗李斯特菌细菌素早就证明的。

蛋白质SkgA1和SkgA2的第1-18位序列只差3个残基，而且与II型细菌素的“前导”肽具有强同源性，所述前导肽参与那些肽通过特异ABC转运蛋白的转运。具体而言，末端GG单位是这些前导序列的特征，并构成这些细菌素的成熟位点。基因skgA1和skgA2的核苷酸序列比较还显示基因中编码成熟细菌素的部分的序列同一性超过95％。

称为skgI的不完整开放读码框编码52个残基的蛋白质。该序列与数据库序列的比较显示SkgI与所谓免疫蛋白LccI和MesI之间存在强同源性。已经证明了MesI参与针对肠膜菌素Y105的保护。可以假设skgI编码sakacin G免疫蛋白。

最后一种基因skgDc编码727个氨基酸的蛋白质。依照数据库，SkgDc与ABC转运蛋白家族的蛋白质高度同源，尤其是与片球菌素PA-1：PedD或PapD(Marugg等人，1992，Appl.Environ.Microbiol.，58：2360-2367；Motlagh等人，1994，Lett.Appl.Microbiol.，18：305-312)、sakacin P：SppT(Huhne等人，1996，Microbiology，142：1437-1448)、sakacin A：SapT(Axelsson和Holck，1995，J.Bacteriol.，177：2125-2137)和肠膜菌素Y105：MesD(Fremaux等人，1995，Microbiology，141：1637-1645)的转运蛋白高度同源。

实施例3：抑制谱

通过孔试法(见材料和方法)测试了17种细菌菌株对sakacin G的敏感性。下文表1显示了结果。

表1
表1		菌株	抑菌圈半径(mm)
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ATCC 11454	0	菌株	抑菌圈半径(mm)
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ATCC 11454	0	类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)DSM 20288	0
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)DSM20484	0	类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)DSM 20288	0
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)DSM20484	0	肠膜明串珠菌DSM 20240	0
德氏乳杆菌DSM 20081	0	肠膜明串珠菌DSM 20240	0
德氏乳杆菌DSM 20081	0	植物乳杆菌DSM 20174	0
短乳杆菌DSM 20054	0	植物乳杆菌DSM 20174	0
短乳杆菌DSM 20054	0	干酪乳杆菌DSM 20011	0
清酒乳杆菌2515	1	干酪乳杆菌DSM 20011	0
清酒乳杆菌2515	1	乳酸片球菌(Pediococcus acidilactic)ENSAIA 583	0
啤酒片球菌IP 5492	1	乳酸片球菌(Pediococcus acidilactic)ENSAIA 583	0
啤酒片球菌IP 5492	1	屎肠球菌ENSAIA 631	0
粪肠球菌IP 5430	2	屎肠球菌ENSAIA 631	0
粪肠球菌IP 5430	2	粪肠球菌ENSAIA 636	1
耐久肠球菌ENSAIA 630	2	粪肠球菌ENSAIA 636	1
耐久肠球菌ENSAIA 630	2	无害李斯特菌(Listeria innocua)8811	3
伊氏李斯特菌BUG 496	6	无害李斯特菌(Listeria innocua)8811	3

这种细菌素的抑制谱显得相当窄，而且对于乳酸菌仅限于菌株清酒乳杆菌和啤酒片球菌。与其它IIa型细菌素一样，这种肽显得对测试的所有李斯特菌菌株以及粪肠球菌和耐久肠球菌有活性，而对屎肠球菌无活性。

序列表

<110>RHODIA CHIMIE

<120>抗李斯特菌细菌素

<130>

<140>

<141>

<160>17

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>196

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(187)

<400>1

ttaacaggag gtattcaaa atg aag aat aca cgt agc tta acg atc caa gaa 52

Met Lys Asn Thr Arg Ser Leu Thr Ile Gln Glu

1 5 10

ata aaa tcc atc aca ggt ggt aaa tac tat ggt aat ggt gtt agc tgt 100

Ile Lys Ser Ile Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys

15 20 25

aac tct cat ggt tgt tca gta aat tgg ggg caa gca tgg act tgt ggg 148

Asn Ser His Gly Cys Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly

30 35 40

gta aat cat cta gct aat ggc ggt cat ggg gtt tgt taa ttatttaaa 196

Val Asn His Leu Ala Asn Gly Gly His Gly Val Cys

45 50 55

<210>2

<211>55

<212>PRT

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>2

Met Lys Asn Thr Arg Ser Leu Thr Ile Gln Glu Ile Lys Ser Ile Thr

1 5 10 15

Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys

20 25 30

Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala

35 40 45

Asn Gly Gly His Gly Val Cys

50 55

<210>3

<211>196

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(187)

<400>3

taatttggag atgttcttt atg aaa aac gca aaa agc cta aca att caa gaa 52

Met Lys Asn Ala Lys Ser Leu Thr Ile Gln Glu

1 5 10

atg aaa tct att aca ggt ggt aaa tac tat ggt aat ggc gtt agc tgt 100

Met Lys Ser Ile Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys

15 20 25

aac tct cac ggc tgt tca gta aat tgg ggg caa gca tgg act tgt gga 148

Asn Ser His Gly Cys Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly

30 35 40

gta aac cat cta gct aat ggc ggt cat gga gtt tgt taa ttaccagat 196

Val Asn His Leu Ala Asn Gly Gly His Gly Val Cys

45 50 55

<210>4

<211>55

<212>PRT

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>4

Met Lys Asn Ala Lys Ser Leu Thr Ile Gln Glu Met Lys Ser Ile Thr

1 5 10 15

Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys

20 25 30

Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala

35 40 45

Asn Gly Gly His Gly Val Cys

50 55

<210>5

<211>181

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<220>

<221>CDS

<222>(24)..(179)

<400>5

ttaaaaaagg agacgtgatt aaa atg gca aac aaa gac aat att aaa act gaa 53

Met Ala Asn Lys Asp Asn Ile Lys Thr Glu

1 5 10

tct aaa aac aac atc gaa gct ctc ttg cac tta cta gaa aag cgt cct 101

Ser Lys Asn Asn Ile Glu Ala Leu Leu His Leu Leu Glu Lys Arg Pro

15 20 25

gta aaa tcc agt gaa tta ctc gat att att gac gtt ctt tcc caa gtt 149

Val Lys Ser Ser Glu Leu Leu Asp Ile Ile Asp Val Leu Ser Gln Val

30 35 40

tat agc aaa att gat ata gct aag aat ccc ga 181

Tyr Ser Lys Ile Asp Ile Ala Lys Asn Pro

45 50

<210>6

<211>52

<212>PRT

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>6

Met Ala Asn Lys Asp Asn Ile Lys Thr Glu Ser Lys Asn Asn Ile Glu

1 5 10 15

Ala Leu Leu His Leu Leu Glu Lys Arg Pro Val Lys Ser Ser Glu Leu

20 25 30

Leu Asp Ile Ile Asp Val Leu Ser Gln Val Tyr Ser Lys Ile Asp Ile

35 40 45

Ala Lys Asn Pro

50

<210>7

<211>1203

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(1201)

<400>7

aaattaggag acttatata ttg ttt aat ctg ttg aga tac aaa aaa tta tat 52

Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr

1 5 10

tgt tca caa gtg gat gaa gat gat tgt gga atc gca gct ttg aat atg 100

Cys Ser Gln Val Asp Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met

15 20 25

att ttt aaa aat ttt ggt tcc gaa tat tca cta tca aaa ttg cga ttc 148

Ile Phe Lys Asn Phe Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe

30 35 40

tta gca aaa acc agt caa caa ggg act act att ttt gga ctg ata aag 196

Leu Ala Lys Thr Ser Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys

45 50 55

gct gca gag gaa cta aat tta gaa gcg aat gca tta caa gct gat atg 244

Ala Ala Glu Glu Leu Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met

60 65 70 75

ggc atc ttt aaa gat gaa aat tta atg cta cca atc att gca cat gtt 292

Gly Ile Phe Lys Asp Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val

80 85 90

tta aag caa gga aaa gtt ctg cat tac tac gtt gta ttt gat gtt tcg 340

Leu Lys Gln Gly Lys Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser

95 100 105

aaa gac ttt tta att att ggt gac cca gac cca aca ata gga att acg 388

Lys Asp Phe Leu Ile Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr

110 115 120

gaa atc tcc aaa aag gat ttt gaa aat gaa tgg acg ggt aat ttc ata 436

Glu Ile Ser Lys Lys Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile

125 130 135

aca ttt tca aaa gga aag aac ttt gtt tca gag aag cag aga aat aac 484

Thr Phe Ser Lys Gly Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn

140 145 150 155

agt tta ctc aag ttt att cct att ttg aga cag caa aaa tcc cta ata 532

Ser Leu Leu Lys Phe Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile

160 165 170

ttc tgg ata gct ttc gcc gca ata cta ttg atg ata att agt att gca 580

Phe Trp Ile Ala Phe Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala

175 180 185

gga tca ctt ttt tta gaa caa ctt gta gat ata tat ata cca cac aaa 628

Gly Ser Leu Phe Leu Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys

190 195 200

aat atg gat aca ttg ggg att atc tcg att tgc tta att gga gcc tat 676

Asn Met Asp Thr Leu Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr

205 210 215

ctt tta cag gcc gta atg acg tat ttt cag aat ttt tta cta act ata 724

Leu Leu Gln Ala Val Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile

220 225 230 235

ttt gga caa aat ctt tct aga aaa att att tta aat tat att aat cac 772

Phe Gly Gln Asn Leu Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His

240 245 250

ctt ttt gaa tta ccc atg tct ttc ttc tca aca cgt aga gtt ggc gaa 820

Leu Phe Glu Leu Pro Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu

255 260 265

ata gtc tct cgg ttt aca gat gca agc aag att ata gat gct ttg gca 868

Ile Val Ser Arg Phe Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala

270 275 280

agt acg att ttg act ctc ttt tta gat gtt tgg atg ttg gtt aca atc 916

Ser Thr Ile Leu Thr Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile

285 290 295

tca atc gtt ctc gta ttt tta aat aca aag tta ttt atg att tct ctg 964

Ser Ile Val Leu Val Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu

300 305 310 315

gta tct ata ccg gtg tac tca gtt ata att tat gcg ttt aaa aat aca 1012

Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr

320 325 330

ttt aat ggc ctg aac cat aaa tca atg gaa aat gca gca tta ttg aat 1060

Phe Asn Gly Leu Asn His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn

335 340 345

tct gca ata atc gaa aac gta act ggc ata gaa act gta aaa tca tta 1108

Ser Ala Ile Ile Glu Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu

350 355 360

act tca gaa gaa ttt tcc tac aat caa atc act gat aga ttc gaa aat 1156

Thr Ser Glu Glu Phe Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn

365 370 375

ttt ctt aac agt tcc tta cgg tat acg ata gct gac caa gga cag ca 1203

Phe Leu Asn Ser Ser Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln

380 385 390

<210>8

<211>394

<212>PRT

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>8

Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr Cys Ser Gln Val Asp

1 5 10 15

Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met Ile Phe Lys Asn Phe

20 25 30

Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Ala Lys Thr Ser

35 40 45

Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys Ala Ala Glu Glu Leu

50 55 60

Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met Gly Ile Phe Lys Asp

65 70 75 80

Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val Leu Lys Gln Gly Lys

85 90 95

Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser Lys Asp Phe Leu Ile

100 105 110

Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr Glu Ile Ser Lys Lys

115 120 125

Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile Thr Phe Ser Lys Gly

130 135 140

Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn Ser Leu Leu Lys Phe

145 150 155 160

Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile Phe Trp Ile Ala Phe

165 170 175

Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Sar Ile Ala Gly Ser Leu Phe Leu

180 185 190

Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys Asn Met Asp Thr Leu

195 200 205

Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Val

210 215 220

Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile Phe Gly Gln Asn Leu

225 230 235 240

Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His Leu Phe Glu Leu Pro

245 250 255

Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu Ile Val Ser Arg Phe

260 265 270

Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Thr

275 280 285

Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile Ser Ile Val Leu Val

290 295 300

Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu Val Ser Ile Pro Val

305 310 315 320

Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr Phe Asn Gly Leu Asn

325 330 335

His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Ile Ile Glu

340 345 350

Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Phe

355 360 365

Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn Phe Leu Asn Ser Ser

370 375 380

Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln

385 390

<210>9

<211>2042

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>9

agcttcggga ttcttagcta tatcaatttt gctataaact tgggaaagaa cgtcaataat 60

atcgagtaat tcactggatt ttacaggacg cttttctagt aagtgcaaga gagcttcgat 120

gttgttttta gattcagttt taatattgtc tttgtttgcc attttaatca cgtctccttt 180

tttatagtaa taaaaaaaac acaattaaat tagtgctttt ttatctggta attaacaaac 240

tccatgaccg ccattagcta gatggtttac tccacaagtc catgcttgcc cccaatttac 300

tgaacagccg tgagagttac agctaacgcc attaccatag tatttaccac ctgtaataga 360

tttcatttct tgaattgtta ggctttttgc gtttttcata aagaacatct ccaaattata 420

ttttttagtg attcttgaag ttctgttgta acgcagaatt ttggaagaat gagtacttgt 480

tagaaatttg ccgatttaaa taattaacaa accccatgac cgccattagc tagatgattt 540

accccacaag tccatgcttg cccccaattt actgaacaac catgagagtt acagctaaca 600

ccattaccat agtatttacc acctgtgatg gattttattt cttggatcgt taagctacgt 660

gtattcttca ttttgaatac ctcctgttaa ataattttta cacgatcagt gtagttctaa 720

tgtgaaattg tgtcaagttt agcaaatata tattttaggc atggaaaaac ttgcttttaa 780

ttcgacttga ctataacggt ataatactgg tattactata tttgtttagc ttcacaaaaa 840

aattaggaga cttatatatt gtttaatctg ttgagataca aaaaattata ttgttcacaa 900

gtggatgaag atgattgtgg aatcgcagct ttgaatatga tttttaaaaa ttttggttcc 960

gaatattcac tatcaaaatt gcgattctta gcaaaaacca gtcaacaagg gactactatt 1020

tttggactga taaaggctgc agaggaacta aatttagaag cgaatgcatt acaagctgat 1080

atgggcatct ttaaagatga aaatttaatg ctaccaatca ttgcacatgt tttaaagcaa 1140

ggaaaagttc tgcattacta cgttgtattt gatgtttcga aagacttttt aattattggt 1200

gacccagacc caacaatagg aattacggaa atctccaaaa aggattttga aaatgaatgg 1260

acgggtaatt tcataacatt ttcaaaagga aagaactttg tttcagagaa gcagagaaat 1320

aacagtttac tcaagtttat tcctattttg agacagcaaa aatccctaat attctggata 1380

gctttcgccg caatactatt gatgataatt agtattgcag gatcactttt tttagaacaa 1420

cttgtagata tatatatacc acacaaaaat atggatacat tggggattat ctcgatttgc 1500

ttaattggag cctatctttt acaggccgta atgacgtatt ttcagaattt tttactaact 1560

atatttggac aaaatctttc tagaaaaatt attttaaatt atattaatca cctttttgaa 1620

ttacccatgt ctttcttctc aacacgtaga gttggcgaaa tagtctctcg gtttacagat 1680

gcaagcaaga ttatagatgc tttggcaagt acgattttga ctctcttttt agatgtttgg 1740

atgttggtta caatctcaat cgttctcgta tttttaaata caaagttatt tatgatttct 1800

ctggtatcta taccggtgta ctcagttata atttatgcgt ttaaaaatac atttaatggc 1860

ctgaaccata aatcaatgga aaatgcagca ttattgaatt ctgcaataat cgaaaacgta 1920

actggcatag aaactgtaaa atcattaact tcagaagaat tttcctacaa tcaaatcact 1980

gatagattcg aaaattttct taacagttcc ttacggtata cgatagctga ccaaggacag 2040

ca 2042

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>10

aartattatg gnaayggngt 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>11

acatgatgnc cnccrttngc 20

<210>12

<211>37

<212>PRT

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>12

Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys Ser Val

1 5 10 15

Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala Asn Gly

20 25 30

Gly His Gly Val Cys

35

<210>13

<211>2214

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(2200)

<400>13

aaattaggag acttatata ttg ttt aat ctg ttg aga tac aaa aaa tta tat 52

Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr

1 5 10

tgt tca caa gtg gat gaa gat gat tgt gga atc gca gct ttg aat atg 100

Cys Ser Gln Val Asp Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met

15 20 25

att ttt aaa aat ttt ggt tcc gaa tat tca cta tca aaa ttg cga ttc 148

Ile Phe Lys Asn Phe Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe

30 35 40

tta gca aaa acc agt caa caa ggg act act att ttt gga ctg ata aag 196

Leu Ala Lys Thr Ser Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys

45 50 55

gct gca gag gaa cta aat tta gaa gcg aat gca tta caa gct gat atg 244

Ala Ala Glu Glu Leu Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met

60 65 70 75

ggc atc ttt aaa gat gaa aat tta atg cta cca atc att gca cat gtt 292

Gly Ile Phe Lys Asp Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val

80 85 90

tta aag caa gga aaa gtt ctg cat tac tac gtt gta ttt gat gtt tcg 340

Leu Lys Gln Gly Lys Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser

95 100 105

aaa gac ttt tta att att ggt gac cca gac cca aca ata gga att acg 388

Lys Asp Phe Leu Ile Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr

110 115 120

gaa atc tcc aaa aag gat ttt gaa aat gaa tgg acg ggt aat ttc ata 436

Glu Ile Ser Lys Lys Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile

125 130 135

aca ttt tca aaa gga aag aac ttt gtt tca gag aag cag aga aat aac 484

Thr Phe Ser Lys Gly Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn

140 145 150 155

agt tta ctc aag ttt att cct att ttg aga cag caa aaa tcc cta ata 532

Ser Leu Leu Lys Phe Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile

160 165 170

ttc tgg ata gct ttc gcc gca ata cta ttg atg ata att agt att gca 580

Phe Trp Ile Ala Phe Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala

175 180 185

gga tca ctt ttt tta gaa caa ctt gta gat ata tat ata cca cac aaa 628

Gly Ser Leu Phe Leu Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys

190 195 200

aat atg gat aca ttg ggg att atc tcg att tgc tta att gga gcc tat 676

Asn Met Asp Thr Leu Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr

205 210 215

ctt tta cag gcc gta atg acg tat ttt cag aat ttt tta cta act ata 724

Leu Leu Gln Ala Val Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile

220 225 230 235

ttt gga caa aat ctt tct aga aaa att att tta aat tat att aat cac 772

Phe Gly Gln Asn Leu Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His

240 245 250

ctt ttt gaa tta ccc atg tct ttc ttc tca aca cgt aga gtt ggc gaa 820

Leu Phe Glu Leu Pro Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu

255 260 265

ata gtc tct cgg ttt aca gat gca agc aag att ata gat gct ttg gca 868

Ile Val Ser Arg Phe Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala

270 275 280

agt acg att ttg act ctc ttt tta gat gtt tgg atg ttg gtt aca atc 916

Ser Thr Ile Leu Thr Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile

285 290 295

tca atc gtt ctc gta ttt tta aat aca aag tta ttt atg att tct ctg 964

Ser Ile Val Leu Val Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu

300 305 310 315

gta tct ata ccg gtg tac tca gtt ata att tat gcg ttt aaa aat aca 1012

Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr

320 325 330

ttt aat ggc ctg aac cat aaa tca atg gaa aat gca gca tta ttg aat 1060

Phe Asn Gly Leu Asn His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn

335 340 345

tct gca ata atc gaa aac gta act ggc ata gaa act gta aaa tca tta 1108

Ser Ala Ile Ile Glu Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu

350 355 360

act tca gaa gaa ttt tcc tac aat caa atc act gat aga ttc gaa aat 1156

Thr Ser Glu Glu Phe Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn

365 370 375

ttt ctt aac agt tcc tta cgg tat acg ata gct gac caa gga cag caa 1204

Phe Leu Asn Ser Ser Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln Gln

380 385 390 395

gct tta aaa gtg ggt ttg aag cta att ctt ata gtc ttt atc tta tgg 1252

Ala Leu Lys Val Gly Leu Lys Leu Ile Leu Ile Val Phe Ile Leu Trp

400 405 410

gct gga gca atc caa gtt atg agg ggg aat ctc aca gtc gga aga tta 1300

Ala Gly Ala Ile Gln Val Met Arg Gly Asn Leu Thr Val Gly Arg Leu

415 420 425

ttg gct ttt aat gct tta gta aca tac ttt tta aat ccc tta gag aat 1348

Leu Ala Phe Asn Ala Leu Val Thr Tyr Phe Leu Asn Pro Leu Glu Asn

430 435 440

att att aat tta caa cca aag cta caa act gca aga gtc gct aat att 1396

Ile Ile Asn Leu Gln Pro Lys Leu Gln Thr Ala Arg Val Ala Asn Ile

445 450 455

aga cta aat gaa gta tta tta gtg gat tct gag ttt aat agg ggg gga 1444

Arg Leu Asn Glu Val Leu Leu Val Asp Ser Glu Phe Asn Arg Gly Gly

460 465 470 475

cgc gac agc tca aca aac tta aat ggg gat atc gta ttt caa gat gta 1492

Arg Asp Ser Ser Thr Asn Leu Asn Gly Asp Ile Val Phe Gln Asp Val

480 485 490

gaa ttt agt tat ggt tac gga tcg aac gta ttg cac aac atc aat ata 1540

Glu Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Ser Asn Val Leu His Asn Ile Asn Ile

495 500 505

aaa ata caa aag aat agt agt aca acg att gtt ggt atg agc ggt tct 1588

Lys Ile Gln Lys Asn Ser Ser Thr Thr Ile Val Gly Met Ser Gly Ser

510 515 520

ggg aaa tcc aca tta gca aaa tta atg gtt ggt ttc tat caa gcc gga 1636

Gly Lys Ser Thr Leu Ala Lys Leu Met Val Gly Phe Tyr Gln Ala Gly

525 530 535

tca gga caa ata tta tta aat ggt aaa tta atc gat aac att gat cgt 1684

Ser Gly Gln Ile Leu Leu Asn Gly Lys Leu Ile Asp Asn Ile Asp Arg

540 545 550 555

cat gcc ctg aga caa tcg att acg tat gta cca cag gaa ccg gta atg 1732

His Ala Leu Arg Gln Ser Ile Thr Tyr Val Pro Gln Glu Pro Val Met

560 565 570

ttc gca ggt aca att tta gaa aat ctt att atg cag aat aaa aga aat 1780

Phe Ala Gly Thr Ile Leu Glu Asn Leu Ile Met Gln Asn Lys Arg Asn

575 580 585

tta tct att gat aaa gtg aaa gag gca tgt agg ata gcc gaa att gat 1828

Leu Ser Ile Asp Lys Val Lys Glu Ala Cys Arg Ile Ala Glu Ile Asp

590 595 600

aaa gat ata gaa aat ttt cct atg ggg tat gat aca gat att tcc gaa 1876

Lys Asp Ile Glu Asn Phe Pro Met Gly Tyr Asp Thr Asp Ile Ser Glu

605 610 615

cat ggg agt tca atc tca gta ggt caa aaa caa aga ctt tct att gca 1924

His Gly Ser Ser Ile Ser Val Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ser Ile Ala

620 625 630 635

aga tca ctg ctg aca gag tct aat gtt tta ctg ttt gat gaa tca acc 1972

Arg Ser Leu Leu Thr Glu Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp Glu Ser Thr

640 645 650

agt agt ttg gac sct att sct gag cag cga ata att gaa aac cta ttg 2020

Ser Ser Leu Asp Thr Ile Thr Glu Gln Arg Ile Ile Glu Asn Leu Leu

655 660 665

aat tta aat gac aaa aca tta ata ttc gtt gca cat cga ttg tca gtt 2068

Asn Leu Asn Asp Lys Thr Leu Ile Phe Val Ala His Arg Leu Ser Val

670 675 680

gct aag caa act gaa aat att atc gtt atg gat cac ggt gga att gtt 2116

Ala Lys Gln Thr Glu Asn Ile Ile Val Met Asp His Gly Gly Ile Val

685 690 695

gaa aca ggt tcg cat gat aaa tta ata ttg gaa aat gga tat tat aaa 2164

Glu Thr Gly Ser His Asp Lys Leu Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Tyr Lys

700 705 710 715

gaa tta tgt act gtg aag acg aag aaa aaa gaa ttt tagataaaac aaaa 2214

Glu Leu Cys Thr Val Lys Thr Lys Lys Lys Glu Phe

720 725

<210>14

<211>727

<212>PRT

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>14

Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr Cys Ser Gln Val Asp

1 5 10 15

Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met Ile Phe Lys Asn Phe

20 25 30

Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Ala Lys Thr Ser

35 40 45

Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys Ala Ala Glu Glu Leu

50 55 60

Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met Gly Ile Phe Lys Asp

65 70 75 80

Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val Leu Lys Gln Gly Lys

85 90 95

Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser Lys Asp Phe Leu Ile

100 105 110

Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr Glu Ile Ser Lys Lys

115 120 125

Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile Thr Phe Ser Lys Gly

130 135 140

Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn Ser Leu Leu Lys Phe

145 150 155 160

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165 170 175

Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser Leu Phe Leu

180 185 190

Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys Asn Met Asp Thr Leu

195 200 205

Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Val

210 215 220

Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile Phe Gly Gln Asn Leu

225 230 235 240

Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His Leu Phe Glu Leu Pro

245 250 255

Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu Ile Val Ser Arg Phe

260 265 270

Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Thr

275 280 285

Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile Ser Ile Val Leu Val

290 295 300

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305 310 315 320

Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr Phe Asn Gly Leu Asn

325 330 335

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340 345 350

Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Phe

355 360 365

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370 375 380

Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln Gln Ala Leu Lys Val Gly

385 390 395 400

Leu Lys Leu Ile Leu Ile Val Phe Ile Leu Trp Ala Gly Ala Ile Gln

405 410 415

Val Met Arg Gly Asn Leu Thr Val Gly Arg Leu Leu Ala Phe Asn Ala

420 425 430

Leu Val Thr Tyr Phe Leu Asn Pro Leu Glu Asn Ile Ile Asn Leu Gln

435 440 445

Pro Lys Leu Gln Thr Ala Arg Val Ala Asn Ile Arg Leu Asn Glu Val

450 455 460

Leu Leu Val Asp Ser Glu Phe Asn Arg Gly Gly Arg Asp Ser Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Asn Gly Asp Ile Val Phe Gln Asp Val Glu Phe Ser Tyr Gly

485 490 495

Tyr Gly Ser Asn Val Leu His Asn Ile Asn Ile Lys Ile Gln Lys Asn

500 505 510

Ser Ser Thr Thr Ile Val Gly Met Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu

515 520 525

Ala Lys Leu Met Val Gly Phe Tyr Gln Ala Gly Ser Gly Gln Ile Leu

530 535 540

Leu Asn Gly Lys Leu Ile Asp Asn Ile Asp Arg His Ala Leu Arg Gln

545 550 555 560

Ser Ile Thr Tyr Val Pro Gln Glu Pro Val Met Phe Ala Gly Thr Ile

565 570 575

Leu Glu Asn Leu Ile Met Gln Asn Lys Arg Asn Leu Ser Ile Asp Lys

580 585 590

Val Lys Glu Ala Cys Arg Ile Ala Glu Ile Asp Lys Asp Ile Glu Asn

595 600 605

Phe Pro Met Gly Tyr Asp Thr Asp Ile Ser Glu His Gly Ser Ser Ile

610 615 620

Ser Val Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ser Ile Ala Arg Ser Leu Leu Thr

625 630 635 640

Glu Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp Glu Ser Thr Ser Ser Leu Asp Thr

645 650 655

Ile Thr Glu Gln Arg Ile Ile Glu Ash Leu Leu Asn Leu Asn Asp Lys

660 665 670

Thr Leu Ile Phe Val Ala His Arg Leu Ser Val Ala Lys Gln Thr Glu

675 680 685

Asn Ile Ile Val Met Asp His Gly Gly Ile Val Glu Thr Gly Ser His

690 695 700

Asp Lys Leu Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Tyr Lys Glu Leu Cys Thr Val

705 710 715 720

Lys Thr Lys Lys Lys Glu Phe

725

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<211>3055

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>15

agcttcggga ttcttagcta tatcaatttt gctataaact tgggaaagaa cgtcaataat 60

atcgagtaat tcactggatt ttacaggacg cttttctagt aagtgcaaga gagcttcgat 120

gttgttttta gattcagttt taatattgtc tttgtttgcc attttaatca cgtctccttt 180

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tgaacagccg tgagagttac agctaacgcc attaccatag tatttaccac ctgtaataga 360

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ttttttagtg attcttgaag ttctgttgta acgcagaatt ttggaagaat gagtacttgt 480

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gtattcttca ttttgaatac ctcctgttaa ataattttta cacgatcagt gtagttctaa 720

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ttcgacttga ctataacggt ataatactgg tattactata tttgtttagc ttcacaaaaa 840

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atgggcatct ttaaagatga aaatttaatg ctaccaatca ttgcacatgt tttaaagcaa 1140

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gctttcgccg caatactatt gatgataatt agtattgcag gatcactttt tttagaacaa 1440

cttgtagata tatatatacc acacaaaaat atggatacat tggggattat ctcgatttgc 1500

ttaattggag cctatctttt acaggccgta atgacgtatt ttcagaattt tttactaact 1560

atatttggac aaaatctttc tagaaaaatt attttaaatt atattaatca cctttttgaa 1620

ttacccatgt ctttcttctc aacacgtaga gttggcgaaa tagtctctcg gtttacagat 1680

gcaagcaaga ttatagatgc tttggcaagt acgattttga ctctcttttt agatgtttgg 1740

atgttggtta caatctcaat cgttctcgta tttttaaata caaagttatt tatgatttct 1800

ctggtatcta taccggtgta ctcagttata atttatgcgt ttaaaaatac atttaatggc 1860

ctgaaccata aatcaatgga aaatgcagca ttattgaatt ctgcaataat cgaaaacgta 1920

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gatagattcg aaaattttct taacagttcc ttacggtata cgatagctga ccaaggacag 2040

caagctttaa aagtgggttt gaagctaatt cttatagtct ttatcttatg ggctggagca 2100

atccaagtta tgagggggaa tctcacagtc ggaagattat tggcttttaa tgctttagta 2160

acatactttt taaatccctt agagaatatt attaatttac aaccaaagct acaaactgca 2220

agagtcgcta atattagact aaatgaagta ttattagtgg attctgagtt taataggggg 2280

ggacgcgaca gctcaacaaa cttaaatggg gatatcgtat ttcaagatgt agaatttagt 2340

tatggttacg gatcgaacgt attgcacaac atcaatataa aaatacaaaa gaatagtagt 2400

acaacgattg ttggtatgag cggttctggg aaatccacat tagcaaaatt aatggttggt 2460

ttctatcaag ccggatcagg acaaatatta ttaaatggta aattaatcga taacattgat 2520

cgtcatgccc tgagacaatc gattacgtat gtaccacagg aaccggtaat gttcgcaggt 2580

acaattttag aaaatcttat tatgcagaat aaaagaaatt tatctattga taaagtgaaa 2640

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acagatattt ccgaacatgg gagttcaatc tcagtaggtc aaaaacaaag actttctatt 2760

gcaagatcac tgctgacaga gtctaatgtt ttactgtttg atgaatcaac cagtagtttg 2820

gacactatta ctgagcagcg aataattgaa aacctattga atttaaatga caaaacatta 2880

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aaagaattat gtactgtgaa gacgaagaaa aaagaatttt agataaaaca aaaac 3055

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>16

ccttggtcag gctatcg 17

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)

<400>17

atcacctttt tgaattaccc 20

Claims

1.分离多肽，特征为它是由在2000年5月25日以保藏号I-2479保藏在国家微生物培养物保藏中心的清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)2512衍生的、称为sakacin G的细菌素，其中所述多肽包含选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12中的序列。

2.一种核酸，特征为它包含编码依照权利要求1的多肽的核苷酸序列。

3.依照权利要求2的核酸，特征为它包含SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：3。

4.权利要求1的多肽用于在食品中抑制李斯特菌(Listeria)的生长和繁殖的用途。

5.权利要求4的用途，其中所述多肽用于抑制单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的生长和繁殖。

6.依照权利要求4或5的用途，特征为在食品中由在2000年5月25日以保藏号I-2479保藏在国家微生物培养物保藏中心的菌株清酒乳杆菌2512生成所述多肽。

7.于2000年5月25日以保藏号I-2479保藏在国家微生物培养物保藏中心的菌株清酒乳杆菌2512在食品中用于在其中生成依照权利要求1的细菌素多肽的用途。

8.于2000年5月25日以保藏号I-2479保藏在国家微生物培养物保藏中心的清酒乳杆菌2512。