CN1299767C - 禽白细胞干扰素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禽白细胞干扰素的制备方法，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康禽白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分离、纯化等工艺，制成禽白细胞干扰素冻干粉针剂。本发明成功利用了禽新鲜全血作为原料，制备工艺简便及经冻干后易运送和保藏，产品质量可靠。禽白细胞干扰素注射禽机体后，具有疗效好、安全可靠和无毒副作用等特点。可用于治疗禽流感、新城疫、禽传染性支气管炎、小鹅瘟、鸭瘟等病毒性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物制剂，具体是用于紧急预防和治疗家禽病毒性传染病如禽流感、新城疫、禽传染性支气管炎、小鹅瘟、鸭瘟等病的禽白细胞干扰素。
背景技术
目前对家禽的病毒性传染病控制，常规使用疫苗、化学药品和抗生素。然而，化学制品和抗生素的广泛应用，尤其是食物链中耐药菌的出现，已经引起人们对环境和人类健康的担忧。细胞因子如干扰素作为机体免疫应答的自然介质抗病毒作用，相对于传统的治疗方式，提供了令人兴奋的选择余地。干扰素是在特定的诱生剂作用下，由细胞产生的一组具有多种功能的免疫活性蛋白，主要是糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节三大功能。干扰素的研究是现代兽医学和现代生物学中比较活跃的一个新领域。
至今市场上未见有一种价格合理，疗效显著的禽白细胞干扰素制剂。
发明内容
本发明的目的是在本室具有制备人α型白细胞干扰素(interferon，IFN)成功的理论和实践基础上，研制和开发的禽白细胞干扰素制品，为禽类抗病毒性疾病用生物制品市场注入新的治疗用品。
本发明技术方案如下：
禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、无菌采集禽的新鲜抗凝血、分离收集白细胞悬液；
(2)、禽白细胞悬液中加入启动用粗纯制禽白细胞干扰素进行短时启动超诱导培养；
(3)、加入诱导剂——鸡新城疫病毒(NDV)及含有禽血清或血浆的营养液进行诱生培养18-24小时；
(4)、收集上清液，灭活鸡新城疫病毒等，滤过除菌；
(5)分装好的禽白细胞干扰素粗制品，冷冻保存。
上述的禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于：
(1)、以800rpm～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集血灰黄层，得到富含禽全血白细胞悬液，用已预温的培养液将细胞悬液浓度稀释成1×107/ml细胞悬液；
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯制禽白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；
(3)、在启动后的禽白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血1～1.5倍体积量的含10％禽血清或禽血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液酸碱度至pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；
(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH 2.0，置4℃ 4～5天，每日振摇2～3次。再用6N NaOH调至pH7.2，即得到禽白细胞干扰素粗制品。
本发明中：“预温的培养液”是指：把保存在4℃ RPMI 1640等置室温或水浴锅中加热到接近37℃；“过夜”在本技术领域内通常指在4℃或37℃放置12小时～18小时；PB是含0.5M KCNS溶液；本发明所称的“禽”包括鸡、鹅、鸭等。
本发明制备的禽白细胞干扰素，经分离纯化后，制成冻干粉针剂，规格为：干扰素效价≥2万单位/瓶；2～8℃或室温≤25℃保存。使用时，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，轻轻摇匀后可进行肌肉注射。幼禽500～1000单位/只/天；成年禽10000～20000单位/只/天。每日注射1次，一个疗程3～5次。
本发明成功地解决了禽新鲜血源来源及污染等问题，经过严格田间实验和区域实验证实，无可见不良反应。禽白细胞干扰素注入动物机体后，治疗禽流感、新城疫、禽传染性支气管炎、小鹅瘟、鸭瘟等病毒性疾病，具有疗效好、安全可靠、无毒副作用和不污染环境等特点。
在治疗已发病禽的同时，应及时隔离未发病禽，并给予等量药物预防注射。使用本发明制备的禽白细胞干扰素时，应同时实施环境的消毒等综合预防办法，防止再感染或疫病的复发。
具体实施方式
禽白细胞干扰素制备工艺
一、配制抗凝剂(每支12500单位的肝素钠加Hank’s液10ml，每毫升为1250单位)及抗生素(卡那霉素，使用时终浓度为100μg/ml)。
二、在事先已加有抗凝剂和抗生素的无菌容器中，无菌采集禽全血，摇匀，在4℃冰箱放置备用。
三、制备鸡新城疫病毒(F系)，并滴定其效价。
四、按产品说明书规定溶解RPMI 1640粉剂，经蔡氏滤器加压过滤，无菌检测后在4℃冰箱放置备用。
五、粗制品干扰素制备
(1)、以800rpm～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107/ml细胞悬液；
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯禽白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；
(3)、在启动后的禽白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血1～1.5倍体积量的含10％禽血清或禽血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调整该悬液酸碱度至pH7.4，37摇床搅拌培养18～24小时；
(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH 2.0，4℃放置4～5天，每日振摇2～3次。再用6N NaOH调至pH7.2，即得到禽白细胞干扰素粗制品。留取样品进行无菌检验、余毒检验等。
将上述粗制白细胞干扰素在4℃下经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液用蔡氏滤器加压过滤，无菌收集滤液，再取样进行无菌检验、余毒检验、安全检验、外源病毒检验和效价测定等均合格后，加入终浓度含5％无菌脱脂牛奶、5％GS和10％禽血清(或血浆)作为冻干保护剂混匀后，置入冻干机保存。
干扰素粗制品依下列步骤精制(硫氰酸钾盐析纯化)：
(1)、在粗制干扰素中加1/10量4℃预冷的5M KCNS，慢加搅拌，加完后用4℃预冷2N HCl调pH至3.5(慢加3ml/min)4℃过夜。
(2)、弃去上清，取沉淀，4℃ 2000rpm 20min。
(3)、弃上清，沉淀中加1/15量-20℃预冷95％酒精。先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0。
(4)、4℃ 2500rpm 20min，弃沉淀。
(5)、上清用1N NaOH调至pH5.0～5.5。
(6)、4℃ 2000rpm 20min，弃沉淀。
(7)、上清用0.1N NaOH调至pH5.6。
(8)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃沉淀。
(9)、上清用1N NaOH调至pH8.0。
(10)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃上清。
(11)、沉淀物中加入原体积1/10～1/15量pH8.0 0.1M PB(含0.5MKCNS)。
(12)、电磁搅拌过夜，使之充分溶解。
(13)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃沉淀。
(14)、上清用2N HCl调至pH3.0。
(15)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃上清。
(16)、沉淀物中加入1/100量pH8.0 0.1M PB溶解用pH7.6PB透析，除去CNS。
(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止。
(18)、30000×g离心1h，弃沉淀。
(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格。
(20)、无菌分装，-70℃保存。此即为禽白细胞干扰素实验室参比标准品。
Claims (2)
1、禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于：
(1)、以800rpm～2500rpm离心装有禽新鲜抗凝血瓶30min，收集血灰黄层，得到富含禽全血白细胞悬液，用已预温的培养液将细胞悬液浓度稀释成1×107/ml细胞悬液；
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯制禽白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；
(3)、在启动后的禽白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血1～1.5倍体积量的含10％禽血清或禽血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液酸碱度至pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；
(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH 2.0，置4℃4～5天，每日振摇2～3次，再用6N NaOH调至pH7.2，即得到禽白细胞干扰素粗制品。
2、根据权利要求1所述的禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于：对禽白细胞干扰素粗制品依下列步骤精制：
(1)、在粗制干扰素中加1/10量4℃预冷的5M KCNS，慢加搅拌，加完后用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，4℃过夜；
(2)、弃去上清，取沉淀，4℃2000rpm 20min；
(3)、弃上清，沉淀中加1/15量-20℃预冷95％酒精，先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0；
(4)、4℃2500rpm 20min，弃沉淀；
(5)、上清用1N NaOH调至pH5.0～5.5；
(6)、4℃2000rpm 20min，弃沉淀；
(7)、上清用0.1N NaOH调至pH5.6；
(8)、4℃2000rpm 20min离心，弃沉淀；
(9)、上清用1N NaOH调至pH8.0；
(10)、4℃2000rpm 20min离心，弃上清；
(11)、沉淀物中加入原体积1/10～1/15量pH8.00.1M PB，PB中含0.5MKCNS；
(12)、电磁搅拌过夜，使之充分溶解；
(13)、4℃2000rpm 20min离心，弃沉淀；
(14)、上清用2N HCl调至pH3.0；
(15)、4℃2000rpm 20min离心，弃上清；
(16)、沉淀物中加入1/100量pH8.0 0.1M PB溶解用pH7.6 PB透析，除去CNS-；
(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；
(18)、3万g离心1h，弃沉淀；
(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；
(20)、无菌分装，-70℃保存，此即为禽白细胞干扰素实验室参比标准品。
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