CN103667345A - 一种抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒及制备方法，通过PCR扩增得到Egr1和Hsp70启动子及HSVTK基因，经酶切、连接等步骤连接至pCDNA3.1质粒中，并以磁性纳米粒为基因载体将构建的基因导入HEK293细胞，定量观察在辐射、磁热疗或二者共同诱导后HSV-TK基因的表达。该质粒的Egr1启动子在2GyＸ射线诱导后６小时后，靶基因的表达量最高。Egr1和Hsp70启动子都具有诱导表达活性，可在辐射和热激分别及联合作用下诱导目的基因的表达，且联合作用时对基因诱导表达的能力更强，为进一步进行癌症的综合治疗提供了实验依据。

Description

一种抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种作为治疗癌症的辐射、热激诱导的双启动子pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK基因的构建及磁性复合纳米颗粒及其制备。

背景技术

近年来，许多新的基因治疗方法（包括辐射-基因治疗、基因-过热治疗）被相继运用于肝癌治疗研究中，其中应用较多、疗效较为肯定的目的基因是HSV-TK/GCV***。它所采用的目的基因是***基因（Suicide gene）或称药物敏感基因，其治疗原理是可使无毒的药物前体（如GCV等）转化为有毒性的药物，通过掺入细胞DNA，阻断细胞DNA的合成，从而选择性地杀死快速增殖的肿瘤细胞。然而，在基因传递问题没有很好的解决以前，要实现全面的肿瘤基因治疗并获得理想的疗效是很困难的。病毒载体***是迄今为止最有效的基因转移方法。但是，由于其局限性（如缺乏高效和定向的载体***、基因进入体内的可控性问题等），尤其是安全问题的存在，使其临床运用受到严格控制；非病毒载体***尽管避免了重大的安全隐患，但其转染效率一直不如病毒载体***，难以获得有意义的基因表达。因此，如何突破基因转移瓶颈已成为基因治疗领域的当务之急。

随着纳米技术的发展，以纳米颗粒为基因转移载体的研究引起了广泛关注。纳米技术的出现为解决基因转移载体问题提供了新的思路。以纳米颗粒为基因转移载体就是将DNA、RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒中或吸附在其表面，在细胞摄粒作用下进入细胞内释放基因治疗分子。国际国内已相继研制出多种纳米基因转移载体，并向着无机、有机以及生物材料杂化的趋势发展。本研究组也较早地涉足这一领域，并研制出具有自主知识产权的磁性锰锌铁氧体纳米颗粒、纳米磁性脂质体等多种磁性纳米载体。前期研究表明磁性纳米载体制备简单、无组织细胞毒性、易于表面修饰使其具有很高的生物相容性。磁性纳米载体除了具有一般纳米颗粒的特性以外，还具有超顺磁性，可在外加磁场的作用下，定向移动，从而进行靶向基因治疗。不仅如此，磁性纳米颗粒还可在外加磁场作用下磁感应升温用于肿瘤热疗。

放疗联合热疗治疗恶性肿瘤在20世纪80年代已经开始用于临床，随着研究的深入，对放疗联合热疗治疗恶性肿瘤的机制有了更深人的研究。放疗和热疗的联合应用，不仅可发挥各自的细胞毒作用，而且热疗有放射增敏作用。恶性肿瘤体积大，瘤体中心处于乏氧状态，对放射线抗拒，对瘤体周围的富氧部分敏感，因此在单纯放射治疗到一定程度后，肿瘤体积退缩程度减慢或不再退缩。而热疗可以抑制肿瘤细胞的呼吸，在乏氧状态下增强无氧糖酵解，使环境酸度增高，在酸性环境中，容易激活溶酶体的活性，抑制DNA、RNA和蛋白合成，使细胞膜破坏，骨架散乱，细胞功能受损，最后导致癌细胞死亡。相反，对肿瘤周围血液循环较好的细胞，由于难于达到有效热度，而疗效相对较差，但却是放疗的敏感区。s期肿瘤细胞对放射治疗抵抗最强，而对热疗却最敏感。因此，放疗和热疗联合治疗有疗效互补和相加的作用。热疗在放疗后30min进行，还可以抑制肿瘤细胞对放射线所致亚致死损伤和潜在致死损伤的修复，可以明显提高肿瘤的氧含量，增强肿瘤放射治疗的敏感性。

热激蛋白70（热休克蛋白70）启动子（Hsp70promoter）具有热激诱导性,其启动子序列经热作用（如42℃-45℃）后可诱导下游基因表达。IsomotoH等利用热作用诱导热激蛋白(heat stress protein)高表达的特点,将***基因与Hsp70启动子结合,构建相应腺病毒载体后导入细胞内，在热作用后高表达***基因,然后予以甘昔洛韦杀伤细胞,体外研究显示有显著杀伤作用。这种新方法被称为基因-过热治疗。本课题组构建了一种新型纳米磁性基因载体，将其与P1730OR（哺乳动物表达载体，编码β-gal，由热激蛋白70启动子驱动）结合制备成复合材料，在磁感应加热条件下可有效升温至43℃，β-gal表达强度随着温度的升高而明显增加。在此基础上，本组构建了热激启动子调控的pHsp-HSV-TK/As₂O₃复合磁性纳米粒，在磁感应加热条件下诱导***基因表达，并与As₂O₃（三氧化二砷）共同作用杀伤肝癌细胞。由于该载体为无机非病毒载体，加之本身所特有的磁感应升温控温特性，可使基因-过热治疗方法更为安全、稳定，也更方便实用。

辐射-基因治疗(radio-genetic therapy)，又称放射-基因治疗，即将具有辐射诱导性的调控序列与治疗基因相偶联，在对肿瘤实施局部放疗/核素内照射时诱导基因表达，造成射线和基因对肿瘤的双重治疗。这样，一方面可相对降低等效照射剂量，减轻对正常组织的损伤；另一方面通过射线的局部照射来实现肿瘤杀伤基因的定位表达。利用Egr-1基因启动子调控序列的放射敏感性而进行的辐射-基因治疗的研究取得了令人鼓舞的成绩，但是该方法仍然面临着基因治疗中存在的特异性、安全性、基因表达效率低时间短、细胞毒作用小、转移后基因表达缺乏有效的调控手段等问题。而且，由于实体瘤普遍存在的缺氧环境也可使辐射启动子的诱导活性降低，影响了这一疗法的疗效和应用。

令人感兴趣的是，研究发现通过增加启动子的数目可提高目的基因的表达水平，较多采用的方法是将二个单启动子串联形成双启动子，这为解决基因治疗过程中如何提高目的基因的表达及时空调控等关键问题提供了一个新的策略。J Finn等人的发现显示双启动子可有效提高非病毒载体的基因表达水平，因此更具有重要的临床应用价值。研究认为双启动子启动功率增强可能是多个顺式作用元件在调控基因转录水平上相互影响、共同作用的结果。据此，本研究设想：将辐射启动子和热激启动子组合形成双启动子来加强诱导和调控基因的表达，在核素内照射和热疗联合的基础上，使辐射-基因疗法、基因-过热疗法和纳米技术有机结合，优势互补，有可能形成一种新的肿瘤综合基因疗法：辐射-过热-基因治疗。而且，热疗能加强肿瘤局部的血供，提高氧供给，从而起到辐射对乏氧环境下肿瘤细胞治疗的增敏作用。

本研究设目标：将辐射启动子和热激启动子组合形成双敏感启动子来加强诱导和调控基因的表达，在辐射和热疗联合的基础上，使辐射-基因疗法、基因-过热疗法和纳米技术有机结合，优势互补，有可能形成一种新的肿瘤综合基因疗法：辐射-过热-基因治疗。而且，热疗能加强肿瘤局部的血供，提高氧供给，从而起到辐射对乏氧环境下肿瘤细胞治疗的增敏作用。

发明内容

技术问题：本发明提供一种可用于辐射，热激双敏感启动子来加强诱导和调控抗肿瘤基因表达的抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒，同时提供了一种上述抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒的制备方法。

技术方案：本发明的制备抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒的方法，包括如下步骤：

1）以pIRES-CMVE-Egr1p真核表达质粒为模板，进行聚合酶链式反应，得到辐射诱导启动子片段，将其亚克隆至pCDNA3.1-EGFP质粒上，得到pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒；

2）以载有热启动子和***基因的质粒为模板，进行聚合酶链式反应，得到热启动子片段和抗肿瘤基因片段；

3）将抗肿瘤基因片段亚克隆至步骤1）中得到的pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒中，取代EGFP，得到pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK真核表达质粒；

4）将热启动子片段亚克隆至pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK真核表达质粒上，得到pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK真核表达质粒；

5）按多聚乙烯亚胺负载的Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄纳米粒与pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSV-TK真核表达质粒质量比为20：1～50：1，将二者分别用无血清培养基稀释，室温放置5分钟以上，然后将二者的稀释溶液混和均匀，室温下孵育30分钟以上，获得pEgr1-Hsp70-HSV-TK/PEI-MZF-NPs复合物，即为抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒。

本发明的肿瘤基因磁性复合纳米颗粒，是按照上述方法制备得到。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒，经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，***载***置正确，测序发现***片段序列无改变，且开放读码框正确，得到双启动子质粒pEgr1-Hsp70-HSV-TK。测序结果具体见附图(图1-4)。

2、改良化学共沉淀法制备的Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄磁性纳米粒为棕色粉末状，高分辨电镜(High Resolution Electron Microscopy,HREM)显示纳米粒大小较均匀、电子密度高，粒径在30nm-40nm之间(图5)；能谱分析（EDS）证实制备的MZF纳米粒中含有Mn,Zn,Fe与O四种元素，且Mn,Zn,Fe的摩尔比约为1:1:4（图6）。傅立叶红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）表征显示：修饰后粒子的红外光谱图出现了—NH₂和—CH₂—的特征小峰，证明了PEI在颗粒表面能够产生吸附（图7）。且体外升温实验显示，10mg/mL的MZF磁性纳米粒和PEI-MZF复合纳米粒的磁流体在相同强度的AMF作用下，40Min后可上升到43℃且保持稳定，可用于热疗（图8）。

3、在进行辐射敏感启动子效率的研究中，首先将转染了Egr1-Hsp70-HSV-TK/PEI-MZF复合物的HEK293细胞置于粒子加速器下给予2Gy剂量的X线照射，然后观察TK基因的表达情况。在处理后1h，6h，12h,24h，48h时收集细胞，用QPCR检测TK基因的相对表达量发现，在诱导后1h，TK基因的表达量即开始升高，6h升到最高值（图9）。各组荧光强度分别为1.86±0.21(1h)，4.53±0.29(6h)，3.72±0.30(12h)，1.31±0.19(24h)和0.33±0.15(48h)。对比结果后发现，在6h之前，Egr1启动子驱动下的TK表达强度随时间的延长而增加，之后逐渐降低。如果取最高表达水平与最低表达水平相比较，在6h时，TK的表达是48h时的5.8倍，是1h时的2.35倍，是12h时的1.19倍。随之48h后其表达量降到1h水平时的2/5。辐射诱导后，TK的表达量均有提高，与48h组相比其他组P＜0.05；6h组TK的表达量与24h和48h组相比P＜0.05,结果见图9。

4、研究不同辐射剂量诱导后基因转录表达情况，将转染了Egr1-Hsp70-HSVTK/PEI-MZF复合物的HEK293细胞置于粒子加速器下分别给予0Gy，1Gy，2Gy，4Gy，8Gy，16Gy剂量的X线照射，在处理后6h时收集细胞，用QPCR检测TK基因的相对表达量发现：荧光强度分别为0.47±0.04，0.56±0.02，2.78±0.12，1.95±0.05，1.81±0.09和1.67±0.18。比较后发现，2Gy时的表达量最高（见附图）。在1Gy时，Egr1启动子驱动下的TK表达强度随着辐射剂量的增加开始增加，之后略有降低。如果取最高表达水平与最低表达水平相比较，在2Gy时，TK的表达是0Gy时的5.91倍，是1Gy时的4.96倍。随之2Gy甚至8、16Gy其表达量降到2Gy水平时的0.7。各辐射组与未受辐射组相比，TK的表达量均有提高，且P＜0.05；2Gy诱导组TK的表达量与其他5组相比P＜0.05（图10）。

5、研究单、双启动子对基因调控效率的差别，分别将转染了Egr1-HSVTK，Hsp70-HSVTK和Egr1-Hsp70-HSVTK的HEK293细胞置于直线加速器下给予不同的处理条件：2Gy剂量的X线照射，置于交变磁场下进行磁热疗和2Gy的辐射加磁热疗双重作用及不给予任何诱导，然后观察TK基因的表达情况。处理后收集细胞，用QPCR检测TK基因的相对表达量发现，在给予热激、辐射双重诱导后TK基因的表达量最高，是不给予任何诱导时的2.4倍，是单纯辐射诱导时的1.68倍，是单纯热诱导时的1.4倍（图14）。单纯热诱导时TK的表达量略高于单纯辐射时，约为其1.18倍。诱导组与未诱导组相比，TK的表达量均有提高，且P＜0.05；双重诱导组TK的表达量与其他三组相比，P＜0.05，结果见图11。

6、RT-PCR检测pEgr1-Hsp70-HSVTK转染细胞中TK基因的整合表达

磁性转染法将双启动子的pEgr1-Hsp70-HSV-TK质粒导入HEK293，辐射、加热诱导后，PCR法检测TK基因的整合。之后以HSV-TK基因为模板设计引物，经PCR扩增，产物大小为469bp。提取RNA并反转录扩增后，转染的SMMC7721细胞均出现阳性条带。而未转染的细胞没有检测到TK基因相应条带仅检测到内参GAPDH（图12）。证实pEgr1-Hsp70-HSVTK能成功转染SMMC-7721肝癌细胞并在其内表达。

本发明得到一种pEgr1-Hsp70-HSV-TK质粒，是将辐射敏感启动子Egr1和热敏启动子Hsp70相偶联，形成辐射、热激双启动子，连接于抗肿瘤基因HSV-TK上游。利用热激和辐射双重诱导调控，以期做到将目的基因控制在适当的部位、适当的时间、甚至适当的水平表达。采用本发明方法制备的抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒，在辐射和热疗联合的基础上，使辐射-基因疗法、基因-过热疗法和纳米技术有机结合，将基因治疗的效果最大程度的发挥，并尽可能减少毒副作用，有可能形成一种新的肿瘤综合基因疗法。

附图说明

图1为采用比对软件：Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egr1-EGFP测序比对图。

图2为采用比对软件：Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK测序比对-图的第一部分。

图3为采用比对软件：Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egr1-HSVTK测序比对图的第二部分。

图4为采用比对软件：Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egr1-HSP70-EGFP测序比对图。

图5为10mg/mL的PEI-Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄与Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄体外磁感应升温曲线图。

图6为Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄磁性纳米粒高分辨电镜图。

图7为Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄的能谱分析图。

图8为修饰前后Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄纳米粒的FTIR图谱。

图9为2Gy辐射诱导后不同时间TK基因的相对表达量示意图图10为不同辐射剂量诱导后TK基因的相对表达量示意图。

图11为不同诱导条件对TK表达量的影响示意图。

图12为HSV-TK扩增产物。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案做进一步具体说明。

实施例1：

本发明的抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒的制备方法：

1）以带有辐射诱导启动子的真核表达质粒（即pIRES-CMVE-Egr1p真核表达质粒）为模板，进行聚合酶链式反应，得到辐射诱导启动子片段（即CMVE-Egr1片段），将其亚克隆至一种商品化的载有荧光蛋白的质粒（即pCDNA3.1-EGFP质粒）上，得到辐射诱导的载有荧光蛋白的真核表达质粒（即pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒）。其中，pIRES-CMVE-Egr1p真核表达质粒为载有辐射启动子的真核表达质粒，pIRES是指代一种可以允许二种基因同时表达的真核质粒,最早由西方生物公司合成并应用，目前没有对应的中文名称，CMVE是指代巨细胞病毒启动子，Egr1p是指代辐射诱导的启动子。pCDNA3.1-EGFP质粒是一种载有荧光蛋白的质粒，pCDNA3.1是一个常用的基因克隆质粒的名称，最早由西方生物公司合成并应用，目前没有对应的中文名称，EGFP是指代绿色荧光蛋白。pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒中，Egr1是指代辐射诱导的启动子。

CMVE-Egr1启动子片段的扩增：

PCR引物以pIRES-CMVE-Egr1p序列中的CMVE-Egr1片段为模板设计。

引物序列如下：

Egr1-f：

5’-CCG CTCGAG CG ACGCGT GATCTTCAATATTGGCCATTAGC-3’

---MluI：CG ACGCGT

---XhoI：CCG CTCGAG

Egr1-r：

5’-CCG CTCGAG CTA GCTAGC CCAAGTTCTGCGCGCTGGGAT-3’

---NheI：CTA GCTAGC

---XhoI：CCG CTCGAG

Product：Length=1117+17+18=1152bp,GC%=52.3,Ta=55.8

PCR扩增得到1152bp大小的CMVE-Egr1片段。

pCDNA3.1-Egr1-EGFP质粒的构建和鉴定：

用Mlu I和Nhe I双酶切pCDNA3.1-EGFP质粒，将第一步中回收的CMVE-Egr1片段连接于载体，构建pCDNA3.1-Egr1-EGFP。选取阳性克隆，小量提取质粒，进行双酶切及测序鉴定。

图1为pCDNA3.1-Egr1-EGFP的测序图谱，将其序列与Egr1模板序列比对，可知Egr1序列完全正确，表明pCDNA3.1-Egr1-EGFP构建成功。（Sequence0：Egr1启动子序列（CMVE序列未列入）Sequence1：pCDNA3.1-Egr1-EGFP-EGFP-N-3.ab1反向互补序列）

2）以载有热启动子和***基因的质粒（即pD3SX-Hsp70-HSVTK质粒）为模板，进行聚合酶链式反应，得到热启动子片段（即Hsp70片段）和抗肿瘤基因片段（即HSV-TK片段）。pD3SX-Hsp70-HSVTK质粒为载有热启动子和***基因的质粒，pD3SX是指代一种带有应激启动子的质粒载体，最早由西方生物公司合成并应用，目前没有对应的中文名称，Hsp70是指代热启动子，HSVTK是指代***基因即本专利中的抗肿瘤基因。

2.1）HSV-TK片段的PCR扩增

以本室保存的pD3SX-HSP70-HSVTK质粒为模板，PCR扩增HSV-TK片段。

引物对：

HSV-TK-f：

5’-G GAATTC GCC ACC ATGGCCTCGTACCCCGGCCAT-3’（EcoRI）

（GCC ACC为Kozak序列，增强基因表达用）

HSV-TK-r：

5’-CCG CTCGAG TCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3’（XhoI）

Product：Length=1131+13+9=1153bp,GC%=65.4,Ta=59.7

扩增得到1153bp的HSV-TK片段。

2.2）PCR扩增Hsp70片段

以pD3SX-Hsp70-HSV-TK质粒为模板，PCR扩增Hsp70片段。

引物对：

Hsp70-f：

5’-CCC AAGCTT CTCGAGGCGCGTCCTCAGA-3’（HindIII）

Hsp70-r：

5’-G GAATTC GGTCGACTAGAGAGCTTCTT-3’（EcoRI）

Product：Length=418+9+7=434bp,GC%=70.6,Ta=58

得到大小为434bp的Hsp70启动子片段。

3）将抗肿瘤基因片段亚克隆至步骤1）中得到的辐射诱导的pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒中，取代荧光蛋白片段（即EGFP），得到辐射诱导的抗肿瘤基因真核表达质粒（即pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK真核表达质粒）；

3.1）将HSV-TK片段亚克隆至pCDNA3.1-Egr1-EGFP中，构建pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK

按照前述方法回收HSV-TK片段，然后以EcoRI、XhoI为亚克隆位点，将HSV-TK片段构建至pCDNA3.1-Egr1-EGFP中，取代原来的EGFP，构建pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK。

转化后，挑取若干个克隆，提取质粒，进行PCR鉴定。

引物对：

HSV-TK-f：

5’-G GAATTC GCC ACC ATGGCCTCGTACCCCGGCCAT-3’

HSV-TK-r：

5’-CCG CTCGAG TCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3’

Product：Length=1153bp,GC%=65.4,Ta=59.7

将pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK①送去测序，测序引物为Egr1-f、BGH-r，由于HSV-TK基因序列比较长，所以需要分别从二端进行测序，将二次测序分别得到的结果与HSV-TK模板序列比对，可知序列完全正确，图2为5’-3’的测序结果比对图，图3为3’-5’的测序结果对比图（Sequence0：HSVTK序列，Sequence1：pCDNA3.1-Egr1-HSVTK-Egr1-f.ab1序列，比对软件：Dnassit2.0）。表明pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK构建成功。

4）将热启动子片段亚克隆至pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK真核表达质粒上，得到辐射、热激双启动子诱导的抗肿瘤基因真核表达质粒（即pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSV-TK真核表达质粒）。

4.1）构建pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSV-TK

回收Hsp70片段，以HindIII、EcoRI为亚克隆位点，将Hsp70片段构建至pCDNA3.1-Egr1-EGFP（单启动子对照）中，构建pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-EGFP。

转化后，挑取若干个克隆，提取质粒，进行PCR鉴定。

引物对：

Hsp70-f：

5’-CCC AAGCTT CTCGAGGCGCGTCCTCAGA-3’（HindIII）

Hsp70-r：

5’-G GAATTC GGTCGACTAGAGAGCTTCTT-3’（EcoRI）

Product：Length=418+9+7=434bp,GC%=70.6,Ta=58

扩增得到434bp的Hsp70片段。

将pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-EGFP①送去测序，测序引物为Egr-f，将其序列与HSV-TK模板序列比对，可知序列完全正确，表明pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK构建成功图4（Sequence0：HSP70序列，Sequence1：pCDNA3.1-Egr1-HSP70-EGFP测序.ab1，比对软件：Dnassit2.0）。

4.2）构建pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSV-TK真核表达质粒

以HindIII、EcoRI为亚克隆位点，将Hsp70片段从pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-EGFP上亚克隆至pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK上，转化入DH5α后，挑取若干个克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。

先用HindIII、EcoRI酶切鉴定，切出一约450bp的小条带，表明是正确克隆。

选取可切得450bp条带的质粒，进一步用MluI单酶切鉴定，可切出一约1.6K的小条带。

5）按多聚乙烯亚胺负载的Mn₀₅Zn_0.5Fe₂O₄纳米粒与辐射、热激双启动子诱导的抗肿瘤基因真核表达质粒（即pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSV-TK真核表达质粒）质量比为20：1，将二者分别用无血清培养基稀释，室温放置5分钟以上，然后将二者的稀释溶液混和均匀，室温下孵育30分钟以上，获得辐射热激诱导的双启动子质粒磁性复合纳米粒（即pEgr1-Hsp70-HSV-TK/PEI-MZF-NPs复合物），即为抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒。其中，pEgr1-Hsp70-HSV-TK指代辐射热激诱导的双启动子质粒，PEI指代多聚乙烯亚胺，MZF指代Mn₀₅Zn_0.5Fe₂O₄，NPs是英文nanoparticles的缩写，表示纳米粒。

磁性基因载体PEI-Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄纳米粒的制备和特性检测：

采用改良的化学共沉淀法，其基本步骤如下：按照Mn：Zn：Fe的摩尔比为0.5：0.5：2的化学配比，称取原料ZnSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O，MnSO₄·H₂O，混合后倒入高速研磨杯磨成粉状，按n（M）：n（OH–）=1：2.4（M代表所有金属离子）的比例称取所需NaOH的量，倒入上述粉末中并混匀，加入适量双蒸水，不断搅拌成糊状至反应完全，室温放置12h后，80℃干燥，研钵内研磨成粉末状前驱体，放入马弗炉中400℃焙烧1h，自然冷却后用热蒸馏水浸洗，过滤，用BaCl₂检测直至滤液中无白色沉淀后，用无水乙醇淋洗一遍，60℃烘干备用。称量Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄4g放入100mL去离子水中配成质量分数为4%的磁流体，超声分散后磁性分离弃上清。沉淀重悬于PBS液中，超声分散处理后缓慢加入一定量的PEI充分混匀，然后室温磁力搅拌3h，使反应充分，形成稳定的PEI修饰的Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄。用磁分离法将复合磁性粒子从溶液中分离，并用蒸馏水反复洗涤，最后乙醇洗涤一次，干燥后得到表面修饰过的MZF纳米粒，存放于干燥皿内待用。制备的磁性纳米材料接近圆形，电镜图见图5，能谱分析发现Mn，Zn，Fe的摩尔比符合1;1:4(见图6)，将修饰前后的磁性材料置于交变磁场中，进行升温实验检测，二者在40min后上升到43°并保持稳定（图7），多聚乙烯亚胺修饰前后的纳米粒红外图谱见图8，修饰后增加了几个特征性的小峰.

抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒的制备方法及其体外生物学特性检测：

按照上述磁性转染法将pEgr1-Hsp70-HSV-TK基因导入HEK293细胞，2GyX线照射1h、6h、12h、24h和48h后，Real-time PCR法检测TK基因表达量的差异。HEK293细胞经1Gy，2Gy，4Gy，8Gy，16Gy不同剂量Ｘ射线照射，6h后收集各组细胞，检测TK基因表达量的差异.。同样转染方法将双启动子质粒pEgr1-Hsp70-HSV-TK导入HEK293细胞，比较经2Gy X线照射联合磁热疗，单纯辐射，单纯磁热疗处理6h后，观察不同诱导条件对TK表达量的影响。磁性转染法将双启动子的pEgr1-Hsp70-HSV-TK质粒导入SMMC7721肝癌细胞，辐射、加热诱导后，PCR法检测到TK基因在细胞内表达。

实施例2：基本流程和步骤同实施例1，不同之处在于，步骤5）中按多聚乙烯亚胺负载的Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄磁性纳米颗粒与辐射、热激双启动子诱导的抗肿瘤基因真核表达质粒（即pEgr1-Hsp70-HSV-TK真核表达质粒）质量比为35：1进行操作。最终产物的检验结果同上。

实施例3：基本流程和步骤同实施例1，不同之处在于，步骤5）中按多聚乙烯亚胺负载的Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄磁性纳米颗粒与辐射、热激双启动子诱导的抗肿瘤基因真核表达质粒（即pEgr1-Hsp70-HSV-TK真核表达质粒）质量比为50：1进行操作。最终产物的检验结果同上。

Claims (2)

1.一种抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

1）以pIRES-CMVE-Egr1p真核表达质粒为模板，进行聚合酶链式反应，得到辐射诱导启动子片段，将其亚克隆至pCDNA3.1-EGFP质粒上，得到pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒；

2）以载有热启动子和***基因的质粒为模板，进行聚合酶链式反应，得到热启动子片段和抗肿瘤基因片段；

3）将抗肿瘤基因片段亚克隆至所述步骤1）中得到的pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒中，取代EGFP，得到pCDNA3.1-Egr1- HSV-TK真核表达质粒；

4）将热启动子片段亚克隆至所述pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK真核表达质粒上，得到pCDNA3.1-Egr1- Hsp70- HSV-TK真核表达质粒； 

5）按多聚乙烯亚胺负载的Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄纳米粒与pCDNA3.1-Egr1-Hsp70- HSV-TK真核表达质粒质量比为20：1~50：1，将二者分别用无血清培养基稀释，室温放置5分钟以上，然后将二者的稀释溶液混和均匀，室温下孵育30分钟以上，获得pEgr1-Hsp70-HSV-TK/PEI-MZF-NPs复合物，即为抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒。

2.一种抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒，其特征在于，该复合纳米颗粒按照权利要求1所述方法制备得到。

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