CN1294273C - 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。

Description

制备作为动物饲料添加剂的D-泛酸和/或其盐的方法
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。
作为生物合成辅酶A的原料，D-泛酸盐广泛分布于植物界和动物界中。与通过膳食消耗足量泛酸的人类不同，D-泛酸盐缺乏症状常常不仅见于植物，而且也见于动物。因此，D-泛酸盐的可利用性具有重大经济价值，特别是在动物饲料工业中。
传统上，D-泛酸盐通过化学合成由D-泛内酯和β-丙氨酸钙来制备(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(Ullmann工业化学大全)，第六版，1999，电子版，“维生素”一章)。D-泛内酯的制备需要经由非对映盐的复杂且经典的外消旋体拆分。由该化学合成得到的工业产物通常是D-泛酸的钙盐，即D-泛酸钙。
与化学合成相比，使用微生物的生物技术生产方法的优点在于选择性(对映体纯)生产可用于高级生物的D型泛酸。因此，如化学合成中所需的复杂的外消旋体拆分就不必要了。
已知有大量使用微生物来制备D-泛酸的发酵方法，包括EP-0 590857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1001 027、EP 1 006 189、EP 1 006 192和EP 1 006 193中所述的方法。
因此，EP 1 006 189和EP 1 001 027描述了制备泛酸盐的方法，其中在发酵溶液中得到的最大D-泛酸含量为1g/l。然而，对于经济地制备含有D-泛酸的动物饲料添加剂，发酵溶液中这样低的泛酸含量(即以固含量计不到10重量％)是不适用的。迄今所述方法的另一缺点在于产物从发酵培养基中的分离需要许多复杂的后处理步骤。尚不知在工业规模上经济的制备方法。
德国公开申请DE 100 16 321描述了一种制备含有D-泛酸的动物饲料添加剂的发酵方法。然而，与上述制备D-泛酸的发酵方法一样，该方法的一个重大缺点在于必须将该泛酸的前体-β-丙氨酸经由发酵培养基供入微生物中以得到所需产物的经济产率。
另外，US 6,013,492和WO 96/332839描述了通过从培养基中滤除不溶性成分(例如细胞物质)，将滤液吸附到活性炭上，随后用有机溶剂、优选甲醇洗脱D-泛酸，用氢氧化钙中和以及随后将D-泛酸钙结晶而从发酵溶液中对D-泛酸进行后处理。其重大缺点在于结晶过程中损失有价值的产物以及使用从产物中难以除去且需要复杂的溶剂回收步骤的有机溶剂。
EP 0 590 857描述了一种制备D-泛酸的发酵方法，其中培养微生物需要供入β-丙氨酸。将该发酵溶液过滤以分离除去生物质，然后使其通过阳离子交换剂并然后通过阴离子交换剂，之后用氢氧化钙中和，蒸发浓缩，加入活性炭，再次过滤以及加入甲醇和氯化钙以结晶。所得含有泛酸钙的产物除了含有钙盐形式的D-泛酸外，还含有摩尔比为1∶1的氯化钙。降低氯化钙含量需要电渗析和随后的喷雾干燥。该方法的缺点在于：由于大量复杂的工艺步骤和有机溶剂的使用使得既不经济又不生态。
本发明的目的是提供一种含有D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂以及通过没有上述缺点的制备D-泛酸和/或其盐的改进方法来制备它的方法。出于经济上的原因，此处理想的方法是，其中β-丙氨酸的供入大大降低或根本不需要。另外，制备其二价盐形式且尤其是碱土金属盐形式的D-泛酸是所需的，因为该泛酸的二价盐与其一价盐相比具有更低的吸湿性，因而对于进一步应用例如用作动物饲料添加剂具有不太显著的团聚趋势。
我们发现该目的通过本发明有利地实现。
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的方法，其包括如下步骤：
a)使用至少一种生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)通过施加电场使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过一个或多个离子选择膜，其中低分子量离子从该含有D-泛酸盐的溶液中除去，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为5-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
在本发明方法的变体中，在步骤c)或d)中，得到或加入含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
本发明步骤a)中的发酵可使用本身已知的程序以分批、补料分批或反复的补料分批方式或连续方式进一步进行。在这种情况下使用常规缓冲体系如含有NaOH、KOH或氨的磷酸盐缓冲液将所得泛酸中和。
在本发明方法的其它变体中，在步骤a)中，通过发酵在培养基中生成至少10g/l、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/l D-泛酸盐。
对本发明而言，词语“产生”指所述生物可合成比其自身代谢需要所需量要大的D-泛酸和/或其盐。在本发明的有利变体中，所合成的D-泛酸和/或其盐的量不存在于细胞内部，但理想的是通过生物全部释放到培养基中。该释放通过本身公知的机理可以是主动的或被动的。
根据本发明，所用产生D-泛酸的生物是微生物。这些微生物根据本发明包括真菌、酵母和/或细菌。根据本发明，优选使用真菌如毛霉菌属或酵母如酵母属(Saccharomyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，在这当中优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根据本发明，有利地使用棒状杆菌(coryneform bacteria)或芽孢杆菌科(Bacillaceae)。在本发明范围内优选的例如是棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Bevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、不动杆菌属(Acinetobacter)或根瘤菌属(Rhizobium)的细菌。此处特别优选的例如是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、短杆菌(Brevibacteriumbreve)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、泛酸芽孢杆菌(B.pantothenticus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和一组以其16sRNA表征的其它芽孢杆菌种，或Actinum mycetalis。该列举目的在于解释，决不是对本发明的限制。
此外，本发明还包括使用基因修饰生物以用于本发明制备含有游离D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂。这类基因修饰生物例如可通过化学诱变和随后使用合适的“筛选法”筛选来分离。根据本发明，称作“生产菌株”的也包括在内，它们适于制备本发明产物且在D-泛酸方向的代谢通量方面具有基因修饰，其中在D-泛酸和/或其盐经由细胞膜排出方面的修饰也包括在内。这例如可通过对所用生物的相关代谢生物合成途径中的关键位置的修饰来实现。
也可使用由必需的或可能需要的同源和/或异源核苷酸序列转移得到的转基因生物来合成所需产物。在这种情况下，单独和/或组合位于基因组中的和/或位于载体上的一个或多个基因可以超表达和/或去调节。
这类转基因生物可有利地含有额外的拷贝和/或基因修饰的基因，所述基因选自panB、panC、panD、panE和/或其组合和/或甚至是象panBCD操纵子那样的组织单元。另外，如EP 1 006 189、EP 1 006192、EP 1 006 193或EP 1 001 027所述，可有利地在生物中操作其它代谢途径，例如异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径。结果，泛酸生物合成的支化链前体物质越发可利用。合适的话，将用于该生物合成途径的基因，即ilvB、ilvN、ilvC和/或ilvD有利地超表达。
另外，本发明还包括在所用的产生D-泛酸的生物中对天冬氨酸α-脱羧酶(panD)例如通过超表达和/或去调节进行基因修饰。
对本发明而言，词语“去调节”指在生物合成代谢途径中改变或修饰至少一个编码一种酶的基因，使得改变或修饰该酶在该微生物中的活性。优选改变至少一个编码一种生物合成代谢途径的酶的基因，使得该基因产物以更大程度形成，或者具有增加的活性。术语“去调节的代谢途径”也包括其中改变或修饰一个以上编码一种以上酶的基因以改变或修饰该一种以上酶的活性的生物合成代谢途径。
改变或修饰可包括但不限于：除去内源启动子或调节成分；同时引入强启动子、诱导型启动子或多个启动子；除去调节序列以改变该基因产物的表达；改变该基因的染色***置；改变在该基因附近或该基因内的DNA序列，例如核糖体结合位点(RBS)；增加该基因组中该基因的拷贝数或引入数目不等的质粒拷贝；修饰蛋白(例如调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活因子等)，它们在基因转录和/或在翻译得到基因产物中起着作用。这也包括所有属于现有技术的其它去调节基因的表达的可能方式，例如使用反义寡核苷酸或阻断阻抑蛋白。
去调节也可包括对例如导致除去基因产物中的反馈调节或导致基因产物的更大或更小比活性的基因的编码区的改变。
此外，对酶的基因修饰根据本发明是有利的，这些修饰影响泛酸前体的流出和/或泛酸流出产生辅酶A。编码这些酶的基因的实例是：alsD、avtA、ilvE、ansB、coaA、coaX等。该列举目的在于解释，决不是对本发明的限制。
另外，基因修饰是有利的，这些修饰保证辅因子(例如亚甲四氢叶酸、氧化还原等同物等)以对于泛酸产生而言最优的量的细胞生产。
因此，β-丙氨酸有利地已经以与相应的非基因修饰生物相比增加的浓度存在于细胞中，因此不必将其作为前体加入培养基中，例如EP-A 0590857中所要求的。其中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或天冬氨酸α-脱羧酶(panD)的生物合成的微生物是有利的。而且，微生物中酮泛解酸还原酶(panE)的额外超表达是有利的。
根据本发明，合适的话，若合成辅酶A所需的coaA基因的活性降低或者该基因被彻底切断(例如在芽孢杆菌属种中)，则将额外有利。这是因为芽孢杆菌属除含有coaA外还含有其它提供这种酶催功能的基因(＝coaX)。该coaX基因或相应酶的活性也可改变，优选降低，或者甚至消除，条件是coaA本身仍旧具有足够的酶活性，即使是降低的酶活性，也就是说coaA的酶活性没有彻底丧失。除各种基因的超表达之外，这些基因的启动区的基因操作也是有利的，条件是该操作导致该基因产物的超表达。
在本发明实施方案中，使用根据附件(PCT/US 0025993)描述的细菌菌株，例如枯草芽孢杆菌PA 824和/或其衍生物。在另一实施方案中，根据本发明在本发明方法中使用如附件(US 60/262,995)中所述的枯草芽孢杆菌PA 668微生物。这些枯草芽孢杆菌PA 824和PA 668菌株按如下方式生产：
从具有基因型trpC2(Trp-)的枯草芽孢杆菌168菌株(Marburg菌株ATCC 6051)开始，通过Trp+标记(来自枯草芽孢杆菌野生型W23)转导生产PY79菌株。经典的基因工程方法(例如Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)在Molecular Biological Methods for Bacillus(芽孢杆菌属的分子生物学方法)(1990)(John Wiley & Sons，Ltd.，Chichester，英国)中所述)将ΔpanB和ΔpanE1突变引入PY79菌株中。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的基因组DNA和枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的基因组DNA将所得菌株转化。所得菌株PA327具有基因型P26panBCD、P26panE1，且为色氨酸营养缺陷体(Trp-)。使用枯草芽孢杆菌菌株PA327，在10ml含有SVY培养基(将25g/l Difco Veal肉浸汁、5g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、2.7g/l硫酸铵加入740ml水中，将该混合物高压灭菌，然后加入200ml 1M磷酸钾(pH7.0)和60ml 50％无菌的葡萄糖溶液)的培养物中，得到不超过3.0g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的生产描述在下列部分：
借助E.Coli的βanBCD操纵子的序列信息(见Merkel等人，FEMSMicrobiol.Lett.，143，1996：247-252)，从枯草芽孢杆菌GP275质粒文库开始，使用经典的基因工程方法来克隆芽孢杆菌属的panBCD操纵子。为了进行克隆，使用E.coli菌株BM4062(birts)和该芽孢杆菌属操纵子靠近birA基因的信息。将该panBCD操纵子引入可在E.coli中复制的质粒中。为了改善该panBCD操纵子的表达，使用枯草芽孢杆菌噬菌体SP01(P26)的强组成型启动子，并将panB基因前面的核糖体结合位点(＝RBS)用人工RBS替换。在芽孢杆菌属中紧邻天然panB基因上游的DNA片段连接在质粒上的P26panBCD盒前面。将该质粒转化成枯草芽孢杆菌菌株RL-1(通过经典的诱变得到的枯草芽孢杆菌168的衍生物(Marburg菌株ATCC 6051)，基因型trpC2(Trp-))，并且通过同源重组，用P26panBCD操纵子代替天然panBCD操纵子。所得菌株称作PA221，并且具有基因型P26panBCD，trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过0.92g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的生产描述在下列部分：
利用E.Coli panE基因序列，通过类似方法克隆芽孢杆菌属panE序列。发现在枯草芽孢杆菌中存在两种同源E.Coli panE基因，称作panE1和panE2。缺失分析发现panE1基因负责90％的泛酸产生，而缺失panE2基因对泛酸产生并无重大影响。此处与克隆panBCD操纵子相似，用强组成型启动子P26代替该启动子，并用人工结合位点代替panE1基因前面的核糖体结合位点。将P26panE1片段克隆到载体中，该载体的构建使得该P26panE1片段能整合至枯草芽孢杆菌基因组中的原始panE1基因座。转化和同源重组之后所得的菌株称作PA303，并且具有基因型P26panE1。使用枯草芽孢杆菌菌株PA303，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过1.66g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
通过用含有P26ilvBNC操纵子和壮观霉素的标记基因的质粒将PA327转化而进一步构建所述菌株。该P26ilvBNC操纵子整合入amyE基因座中，这通过PCR来显示。将一种转化体称作PA340(基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、specR、trpC2(Trp-))。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA340，在10ml含有仅补加有5g/lβ-丙氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过3.6g/l(24h)的泛酸滴定度；在10ml含有补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过4.1g/l(24h)的泛酸滴定度。
另外，将去调节的ilvD盒引入菌株PA340中。为此，将含有ilvD基因的质粒在控制含有人工RBS2的P26启动子的情况下转化入PA340。通过同源重组将P26ilvD基因整合入原始ilvD基因座中。所得菌株PA374具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA374，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过2.99g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中仅补加有5g/lβ-丙氨酸。
为了在不供入β-丙氨酸的情况下使用菌株PA374来产生泛酸，将编码天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD的附加拷贝引入菌株PA374中。为此，将菌株PA401的染色体DNA转化入PA374。通过在四环素上的选择得到菌株PA377。
所得菌株PA377具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和trpC2(Trp-)。
在不供入前体的情况下，使用枯草芽孢杆菌菌株PA377，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过1.31g/l(24h)的泛酸滴定度。
枯草芽孢杆菌菌株PA401(基因型P26panD)的制备描述在下列部分：
由panBCD操纵子将枯草芽孢杆菌panD基因克隆入带有四环素标记基因的载体。将启动子P26和上述人工RBS克隆在panD基因前面。限制酶切消化产生含有四环素标记基因和panD基因的片段。将该片段重新连接，并转化到上述菌株PA221。将该片段整合入菌株PA211的基因组中。所得菌株PA401具有基因型P26panBCD、P26panD、tetR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA401，在10ml含有已补加有5g/lα-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过0.3g/l(24h)的泛酸滴定度。在10ml含有已补加有5g/l D-泛解酸和10g/l L-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过2.2g/l(24h)的泛酸滴定度。
从菌株PA377开始，用菌株PY79的染色体DNA的转化来产生色氨酸-原养菌株。该菌株PA824具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和Trp+。
在不供入前体的情况下，使用枯草芽孢杆菌菌株PA824，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过4.9g/l(48h)的泛酸滴定度(对照PA377：不超过3.6g/l(48h))。
PA668的制备描述在下列部分：
由野生型panBCD操纵子将芽孢杆菌属panB基因克隆并***除含有氯霉素抗性基因外还含有vpr基因座的枯草芽孢杆菌序列的载体中。
在panD基因5’端之前引入强组成型启动子P26。通过限制酶切消化得到一个含有P26panB基因、氯霉素抗性的标记基因以及枯草芽孢杆菌vpr序列的片段。将分离出来的片段重新连接并用于转化菌株PA824。所得菌株称作PA668。PA668的基因型为：P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、P26panB、specR、tetR、CmR和Trp+。
分离PA668的两种菌落并分别称作PA668-2A和PA668-24。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-2A，在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中，在48h内得到1.5g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/l天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过5g/l的滴定度。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-24，在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中，在48h内得到1.8g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/l L-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过4.9g/l的滴定度。
所述菌株的确切构建参见PCT/US 0025993和US 60/262,995的附件。
使用上述菌株PA377，在SVY培养基(25g/l Difco Veal肉浸汁，5g/lDifco酵母提取物，5g/l色氨酸，5g/l谷氨酸钠，2g/l(NH4)2SO4，10g/lKH2PO4，20g/l K2HPO4，0.1g/l CaCl2，1g/l MgSO4，1g/l柠檬酸钠，0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l组成如下的痕量盐溶液：0.15gNa2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中，在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为18-19(22-25g/l)。
在PA824(PA377的色氨酸-原养衍生物)的葡萄糖限制发酵的情况下，在酵母提取物培养基(10g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、8g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下，在36h、48h和72h内在发酵液中得到的泛酸浓度分别为20g/l、28g/l和36g/l。
通过培养基的进一步优化，使用菌株PA824，在由10g/l Difco酵母提取物、10g/l NZ胺A(Quest International GmbH，Erftstadt)、10g/l谷氨酸钠、4g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液组成的培养基中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中，在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为37g/l(48g/l)。
通过培养基的进一步优化、通过增加发酵时间、通过工艺和菌株改进以及通过各步骤的组合可以进一步提高发酵液中泛酸的浓度。因此，通过将为上述PA824的衍生物的菌株发酵也可得到上述泛酸浓度。衍生物可通过经典的菌株发育和通过其它基因工程操作来制备。通过培养基、菌株和发酵方法的发展，可将发酵液中泛酸滴定度增加到大于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l。
本发明方法的本质优点在于发酵在培养基中进行，该培养基除含有至少一种碳源和氮源之外就不再含有其它作为起始化合物的前体。也就是说，D-泛酸的生物合成与其它前体的供入没有关系。对本发明而言，这些前体是诸如β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸和/或L-缬氨酸和/或α-酮异戊酸和/或其混合物的物质。
在本发明方法的优选变体中，产生D-泛酸的生物的发酵在培养基中进行，该培养基含有碳源和氮源，但在发酵过程中不向其中加入或供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。也就是说，为了产生至少10g/l培养基、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/l的D-泛酸，根据本发明不需要供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
与前体的供入无关这一点尤其是本发明方法与已知方法相比的重大经济优点，因为许多前体是非常昂贵的。
然而，本发明不排除加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，因此使得通过加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐可进一步提高D-泛酸的产率。若例如假定泛酸所有的所需前体都以足量存在，则只有panD基因的活性限制泛酸产生的进一步增加，因此例如可通过加入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐将泛酸的产率再提高50％。
在本发明的有利变体中，可向培养基中加入不超过20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，以将泛酸的产率额外提高50％以上。优选向培养基中加入约15g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
根据本发明，适合用于培养基中以将上述生物发酵的碳源的实例是糖类如淀粉水解产物(单-、二-、低聚糖)，优选葡萄糖或蔗糖，以及甜菜或甘蔗糖蜜，蛋白质，蛋白质水解产物，大豆粉，玉米浆，脂肪，游离脂肪酸，从前面的发酵再循环的细胞或其水解产物，以及酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外，本发明方法有利的特征在于到发酵结束时总的糖含量降至最低，因为否则的话这将由于粘连使随后发酵溶液的干燥和/或配制变得困难。根据本发明，这可通过在碳源被消耗后(在分批培养的情况下)或在碳进料(在以补料分批或反复的补料分批方式的工艺工序的情况下)被中断和/或被调节以使该碳源的浓度基本为零(在补料分批、反复的补料分批或连续工艺工序的情况下)之后继续发酵一段时间而实现。
根据本发明，这通过在中断加入碳源(例如糖溶液)之后，继续发酵直到在该发酵溶液中溶解氧浓度(pO2)为其饱和值的至少80％，优选90％，特别优选95％而达到。
根据本发明，合适的氮源的实例是氨、硫酸铵、尿素、蛋白质、蛋白质水解产物或酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外，发酵培养基含有无机盐和/或微量元素，例如氨基酸和维生素。合适的发酵培养基的确切组成大量公知，并且对本领域熟练技术人员而言是可得的。
在用适合的产生D-泛酸的生物对发酵培养基进行接种(以本领域熟练技术人员公知的细胞密度)之后，合适的话加入消泡剂，培育该生物。培养基pH的任何必要调节都可使用各种无机或有机碱或酸如NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质来实现。
考虑到发酵过程中所用的缓冲体系(该缓冲体系如上所述例如可以是NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质)，所生成的D-泛酸取决于所用的缓冲体系而以各自的盐的形式存在于发酵溶液中。由于根据本发明这种情况下，尤其是D-泛酸的一价阳离子形式的盐是不利的，或者呈钙盐或镁盐形式的D-泛酸是优选的，因此根据本发明使用电隔膜分离法来制备发酵溶液。
本发明此处包括所有可得类型的电隔膜分离法，如膜电解或电渗析。凭借本领域熟练技术人员的部分知识就可作出合适的选择。
根据本发明，优选使用电渗析。此处，不仅可使用只使用单极膜的电渗析，而且也可使用使用单极和/或偶极膜的电渗析。特别优选只使用单极膜的电渗析，尤其是具有对一价离子具有选择性的称作单选择膜的单极膜的电渗析。
原则上，可将任何常用于电渗析方法中的膜用于进行本发明方法。本发明电渗析上下文中使用的膜优选是市购的常规离子交换膜。
可使用的阴离子交换膜例如是Tokuyama Corp.的Neosepta AM1、AM2、AM3、AMX、AMH、AFN和Asahi Glass的AMV。
阳离子交换膜的实例是Neosepta CM1、CM2、CMX、CMH、CMB、Asahi Glass CMV以及Du Pont de Nemours的Nafion 435或350。
可提及的单选择阳离子交换膜例如是Neosepta CMS膜。
可使用的单选择阴离子交换膜例如是Tokuyama Corp.的NeoseptaACS膜或Asahi Glass的Selmion ASV膜。
所用电极可以是不锈钢的、镍的、贵金属的，例如铂或其它本领域熟练技术人员公知的适合的材料。
根据本发明，使用单极电渗析，可不仅将阴离子，而且还将阳离子通过在电场中迁移通过阴离子或阳离子交换膜而从含有泛酸盐的溶液中转移到第二溶液(浓溶液，CONC)中，于是从含有泛酸的溶液(稀溶液，DIL)中除去。根据本发明，有利的是，低分子量离子从含有泛酸的溶液中除去。对本发明而言，低分子量离子是通过培养基和/或缓冲体系的组合物引入发酵液中的但终产物中不需要的离子。例如这些离子是下列离子：铵离子、钾离子、钠离子、铁离子、氯离子、磷酸根离子或硫酸根离子。
在本发明的另一方案中，可进行一价阳离子如Na+或铵离子的离子交换，而保留多价阳离子如Ca2+。为此，使用对一价离子具有选择性的阳离子交换膜。因此，例如将CaCl2溶液加入回路I中，在通过阳离子交换膜与回路I分开的第二回路II中加入含有一价阳离子的泛酸溶液。然后，通过对一价离子具有选择性的且位于室II和室III之间的阳离子交换膜，优选将一价阳离子转移到第三室III中。同时，阴离子如氯离子从室I通过位于室I和室III之间的阴离子交换膜转移到室III中。钙离子从室I通过阳离子交换膜转移到室II中。这样直接得到D-泛酸钙。当存在弱酸如泛酸的盐时，若代替CaCl2，将HCl水溶液加入室I中，则也可以以这种排列得到游离D-泛酸。
本发明还包括使用无机或有机阴离子形式的钙盐和/或镁盐。根据本发明，有利的是使用氯化钙和/或镁、硝酸钙和/或镁、氢氧化钙和/或镁、甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁或乳酸钙和/或镁。
在本发明的替代实施方案中，当使用偶极电渗析时，阳离子可有利地从含有泛酸盐的溶液中通过阳离子交换膜转移到第二溶液中，于是从该含有泛酸的溶液中除去，而通过解离偶极膜中的水同时提供质子。在第二溶液中，使用由解离偶极膜中的水提供的氢氧根离子形成已转移的阳离子的相应的碱。
在本发明的另一实施方案中，当使用偶极电渗析时，阴离子可有利地从含有泛酸盐的溶液中通过阴离子交换膜转移到第二溶液中，于是从该含有泛酸的溶液中除去，而通过解离偶极膜中的水同时提供氢氧根离子。在第二溶液中，使用由解离偶极膜中的水提供的质子形成已转移的阴离子的相应的酸。
本发明还包括另一替代实施方案，其中通过使用偶极电渗析，首先，阴离子有利地从含有泛酸盐的溶液中通过阴离子交换膜转移到第二溶液中，于是从该含有泛酸的溶液中除去，而通过解离偶极膜中的水同时提供氢氧根离子；其次，阳离子从含有泛酸盐的溶液中通过阳离子交换膜转移到第三溶液中，于是从该含有泛酸的溶液中除去，而通过解离偶极膜中的水同时提供质子。在第二溶液中，使用由解离偶极膜中的水提供的质子再形成已转移的阴离子的相应的酸；在第三溶液中，使用由解离偶极膜中的水提供的氢氧根离子形成已转移的阳离子的相应的碱。
根据本发明，优选在本发明方法中，使用酸或碱将含有泛酸盐的溶液的pH设定为泛酸的等电点。由此可进一步增加游离D-泛酸的产率，或进一步将损失降至最低。
单极电渗析是特别优选的变体，因为与偶极单渗析相比它高度成本有效。
也可使用偶极电渗析，尤其当不加入酸或碱来调节pH时，或者当已经存在的酸或碱金属氢氧化物溶液可进一步使用时。
根据本发明，所有电渗析变体都具有离子交换树脂再生过程中不产生废水的优点。
本发明电分离法的使用优选从含有D-泛酸盐的溶液中除去不需要的低分子量离子(外来离子)，如铵离子、钾离子、钠离子、铁离子、氯离子、磷酸根离子或硫酸根离子。也就是说，优选形成游离D-泛酸或其所需的盐，如D-泛酸钙和/或D-泛酸镁。
根据本发明，一价阳离子，优选铵离子、钾离子和/或钠离子的含量降至≤1g/kg溶液的浓度。
不需要的阴离子，例如氯离子、硫酸根离子或磷酸根离子的含量也可通过选择离子交换膜、优选通过使用阴离子交换膜而显著降低。
在步骤b)中，当使用单极离子交换膜时，该膜的电流密度设定为1-100mA/cm2，优选10-80mA/cm2，特别优选20-40mA/cm2；当使用偶极离子交换膜时，该膜的电流密度设定为1-150mA/cm2，优选30-100mA/cm2，特别优选70-90mA/cm2。
根据本发明，通过加入钙碱和/或镁碱将所得含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10。pH为5-10是有利的。优选将该pH设定为5-9，特别优选6-9，非常特别优选6-8。这样得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液。为了中和，优选将氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁和/或碱式碳酸镁以固体和/或水悬浮液形式加入该溶液中。
根据本发明，在这种情况下优选用钙碱和/或镁碱的水悬浮液中和该含有游离D-泛酸的溶液。与使用相应固体的情形相比，作为使用水悬液的结果，该中和进行得更迅速，并且没有较大的pH波动。
根据本发明，本发明方法的特征在于将包含2-55重量％、优选10-50重量％、特别优选20-40重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。本发明另外还包括一种其中将包含2-65重量％、优选10-50重量％、特别优选20-40重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中的方法。在本发明的另一实施方案中，将包含2-60重量％、优选10-50重量％、特别优选20-40重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入本发明方法步骤c)的溶液中。本发明还包括一种其中将包含2-25重量％、优选10-20重量％的碱式碳酸镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中的方法。
使用本身已知的方法，例如喷雾干燥、喷雾粒化、流化床干燥、流化床粒化、转鼓式干燥或旋转急骤干燥(Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第六版，1999，电子版，“固体材料的干燥”一章)将发酵溶液干燥和/或配制。对流干燥中气体入口温度为100-280℃，优选120-210℃。气体出口温度为50-180℃，优选60-150℃。为了建立所需粒度分布和有关的产物性能，可分离出细颗粒并再循环。另外，可将粗材料在磨产研磨，并且然后同样再循环。
根据本发明，在上述方法中，在产生具有高生物价值的所需产物的同时，减少复杂的后处理步骤是有利的，尤其是避免使用有机溶剂。另外，根据本发明，所产生的废水量显著减少。因此这导致进一步节省复杂的后处理和处理车间。因此，本发明方法的优点在于与传统方法相比它更简单、不易出错、耗时更少、显著便宜并因而更经济。
然而，这并不排除本发明方法可以变化。本文开头提及的本发明的工艺步骤a)-d)可通过一个或多个本领域熟练技术人员熟悉的下列工艺步骤来补充。在这种情况下，本发明涵盖额外(操作)工艺步骤与(必需)工艺步骤a)-d)的所有可能组合。
因此，例如可通过加热(灭菌)或其它方法如巴氏消毒法或无菌过滤将来自工艺步骤a)-c)的溶液消毒。
在本发明方法的其它变体中，在干燥和/或配制所述溶液之前，可进行至少一个下列步骤和/或这些步骤的组合：生物质的溶菌和/或灭菌和/或从发酵溶液中分离除去该生物质和/或加入其它添加剂和/或优选通过除去水将该发酵溶液浓缩。
因此，本发明还涉及一种其中在发酵溶液中仍旧进行生物质的溶菌和/或灭菌或直到从该发酵溶液中分离除去该生物质之后才进行前述步骤的方法。这例如可通过优选80-200℃下的温度处理和/或优选用硫酸或盐酸的酸处理和/或优选用溶菌酶的酶催方式来进行。
在本发明的另一实施方案中，可通过过滤、分离(例如离心分离)和/或倾析从本发明方法步骤a)、b)或c)的溶液中除去发酵微生物的细胞。也可通过施加电场使步骤a)、b)或c)的溶液不经分离除去所存在的生物而直接通过一个或多个离子选择膜。
经由膜电解或电渗析后处理得到的溶液可在中和之后通过合适的蒸发器如降膜式蒸发器、薄膜式蒸发器或旋转式蒸发器浓缩。这些蒸发器例如由GIG(4800 Attnang Puchheim，奥地利)、GEA Canzier(52303 Düren，德国)、Diessel(31103 Hildesheim，德国)和Pitton(35274 Kirchhain，德国)制造。
为了改善终产物的颜色性能，可进行其中将少量活性炭加入该工艺过程中所得的溶液中的额外过滤步骤，并然后将该悬浮液过滤。或者，可使发酵过程中所得的溶液通过小活性炭床。为此所需的活性炭用量为该溶液重量的百分之几，并且该量凭借本领域熟练技术人员的知识和经验是已知的。
这些过滤通过在过滤之前向各溶液中加入工业助凝剂而得以简化(例如Sedipur CF 902或Sedipur CL 930，产自BASF AG，Ludwigshafen)。
在本发明的有利实施方案中，发酵排出物(发酵液)通过加热来灭菌，然后通过离心分离、过滤或倾析除去细胞物质。在基于发酵排出物加入50-1000mg/kg、优选100-200mg/kg工业上传统的助凝剂之后，将该混合物过滤通过活性炭与砂子的短床以得到具有高D-泛酸含量的不含生物质的溶液。然后通过施加电场使该处理后的溶液通过一个或多个离子选择膜。
然后将该溶液例如通过喷雾干燥而干燥。这可以并流、逆流或混合流进行。为了雾化，可使用所有已知的雾化器，尤其是离心雾化器(雾化盘)、单流喷嘴或双流喷嘴。优选的干燥温度条件是150-250℃的塔入口温度和70-130℃的塔出口温度。然而，干燥也可在更高或更低的温度水平下进行。为了得到非常低的残留湿气，可以在流化床下游提供另一干燥步骤。
喷雾干燥也可在FSD或SBD干燥器中进行(FSD：流化床喷雾干燥器；SBD：喷雾床干燥器)，如由Niro(丹麦哥本哈根)和APV-Anhydro(丹麦哥本哈根)制造的，它们是喷雾干燥器与流化床的组合。
在喷雾干燥过程中，可添加防结块剂。这可减少干燥器壁上的沉积并改善流动特性，确切地在细粒粉末的情况下。可使用的防结块剂尤其是硅酸盐、硬脂酸盐、磷酸盐和玉米淀粉。
原则上，干燥也可在喷雾的流化床中进行，在这种情况下这不仅可连续进行，还可分批进行。可将溶液不仅从顶部(顶部喷雾)和从底部(底部喷雾)喷雾，而且还可从侧面(侧面喷雾)进行喷雾。
本发明还涉及一种用作动物饲料添加剂和/或动物饲料添加物的组合物，这种情况下它可通过如下步骤制备：
a)使用至少一种生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l、优选0g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)通过施加电场使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过一个或多个离子选择膜，其中低分子量离子从该含有D-泛酸盐的溶液中除去，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
在本发明的变体中，所述组合物的特征在于在步骤c)或d)中得到或加入含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
根据本发明，所述组合物的进一步特征在于它包含浓度为至少1-100重量％、优选至少20-100重量％、特别优选至少50重量％的D-泛酸盐。本发明涉及一种包含D-泛酸的二价阳离子形式的盐，优选D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的组合物。根据本发明，优选D-泛酸的一价阳离子形式的盐的含量≤1g/kg的组合物。
根据本发明，通过上述方法，得到满足饲料添加剂要求的D-泛酸钙或D-泛酸镁。这些要求例如是较高含量的D-泛酸盐和与目标生物的高相容性以及高的表示本发明产物的“维生素活性”的生物价值。
本发明将通过下列实施例更详细地描述，然而这些实施例不是对本发明的限制。
实施例1：
在容量为14升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基：
  原料   浓度[g/l]
  酵母提取物   10
  谷氨酸钠   5
  硫酸铵   8
  消泡剂   1ml/l
灭菌后，额外加入下列无菌培养基成分：
  原料   浓度[g/l]
  KH2PO4   10
  K2HPO4   20
  葡萄糖   2.5
  氯化钙   0.1
  氯化镁   1
  柠檬酸钠   0.1
  FeSO4·7H2O   0.1
  痕量盐溶液   1ml/l
所述痕量盐溶液具有下列组成：
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为8.4升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中，加入160ml枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD＝10，在SVY培养基(SVY培养基：25g  Difco Veal肉浸汁、5gDifco酵母提取物、5g谷氨酸钠、2.7g(NH4)2SO4在740ml水中的溶液，灭菌；加入200ml无菌的1M K2HPO4(pH 7)和60ml无菌的50％葡萄糖溶液(终体积1升))中)，并将所得混合物于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993的附件进行描述。
在52h内，加入6升无菌水溶液，其组成如下：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   500
  氯化钙   0.6
  痕量盐溶液   7ml/l
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或20％浓度的磷酸将pH保持为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30％。通过随时加入消泡剂以控制起泡。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。然后结束发酵，并将该生物加热破坏。为此，将该发酵溶液灭菌60分钟。通过沉积出来表明已破坏。然后通过离心分离将细胞分离除去。在细胞分离之后，D-泛酸盐的浓度在52h后为24.7g/l。
按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
将上述通过加热灭菌的且通过离心分离基本除去生物质的发酵排出物与额外的D-泛酸混合，并用硫酸将pH设定为约2。将所得溶液过滤通过砂子/活性炭的小床。溶液中D-泛酸的含量为67.7g/l。
将900g该滤液按如下进行电渗析处理：在有效池面积为1.85dm2且具有5个室的电渗析池(装有阴离子-和阳离子交换膜(类型分别为Tokuyama Corp.的Neosepta AMX Sb和CMX Sb)中，将滤液以29mA/cm2的初始电流密度脱盐。在达到预设极限电压20V之后，在实验流程中将电流密度连续降低。温度为33-40℃。加入作为浓缩进料的0.5％浓度(w/w)NaCl溶液。该浓缩物(CONC)富集在实验流程中，而外来离子(例如铵离子、氯离子、铁离子、钾离子、钠离子或磷酸根离子)从该滤液(稀溶液，DIL)中除去。在电解液循环中，为了冲洗电极，加入5％浓度(w/w)的硫酸钠溶液。在该实验流程中，在不同的稀溶液离子电导率值下，从含有稀溶液的室中取样并分析。分析给出在下表中，并表明随着实验时间的推移，所述离子从该稀溶液中除去，该稀溶液的电导率相应下降。小的一价离子如氯离子与大体积的多价离子如磷酸根离子相比更快地被除去。
稀溶液的分析结果给出在下表中。
  PTAg/l   离子(U实验室分析)
  NH4 +   Cr-   正磷酸根   Ca2+   Fe离子   K+  Mg2+   Na+
  原料(mS/cm)   67.7   0.35-0.40％   0.90-0.97％   0.61-0.79％  0.009％   ＜0.001％   0.45％  0.002％   -
  4831/00/196DIL 25mS/cm   67.9   0.22％   0.65％   0.56％  0.005％   ＜0.001％   0.30％  0.002％   0.089％
  4831/00/196DIL 20mS/cm   70.7   0.16％   0.49％   0.53％  0.004％   ＜0.001％   0.23％  0.002％   0.077％
  4831/00/196DIL 15mS/cm   64.1   0.12％   0.32％   0.54％  0.003％   ＜0.001％   0.16％  0.001％   0.063％
  4831/00/196DIL 10mS/cm   73.2   0.08％   0.16％   0.48％  0.002％   ＜0.001％   0.099％  0.001％   0.047％
  4831/00/196DIL 5mS/cm   79.9   0.03％   0.04％   0.35％  0.001％   ＜0.001％   0.038％  0.001％   0.025％
  4831/00/196DIL 3mS/cm   75.6   0.02％   0.01％   0.26％  0.001％   ＜0.001％   0.016％  ＜0.001％   0.015％
  4831/00/196DIL-结束   76.0   0.01％   ＜0.01％   0.21％  ＜0.001％   ＜0.001％   0.009％  ＜0.001％   0.010％
PTA＝泛酸
所有稀溶液样品的pH都为2-3。771g稀溶液排出物含有76g/l的游离D-泛酸。
此处表明，发酵所得的D-泛酸溶液可通过电解成功地除去干扰阳离子。可由所得的经脱盐的D-泛酸制备如实施例2所述的非吸湿性D-泛酸钙粉末。
实施例2：
在容量为14升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基：
  原料   浓度[g/l]
  酵母提取物   10
  谷氨酸钠   5
  硫酸铵   8
  KH2PO4   8.4
  K2HPO4   15
灭菌后，额外加入下列无菌培养基成分：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   2.5
  氯化钙   0.1
  氯化镁   1
  柠檬酸钠   1
  FeSO4·7H2O   0.01
  痕量盐溶液   1ml
所述痕量盐溶液具有下列组成：
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3gZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为5.5升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中，加入55ml枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD＝10，在SVY培养基(SVY培养基：25g  Difco Veal肉浸汁、5gDifco酵母提取物、5g谷氨酸钠、2.7g(NH4)2SO4在740ml水中的溶液，灭菌；加入200ml无菌的1M K2HPO4(pH 7)和60ml无菌的50％葡萄糖溶液(终体积1升))中)，并将所得混合物于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993的附件进行描述。
在48h内，加入6升无菌水溶液，其组成如下：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   550
  氯化钙   0.6
  痕量盐溶液   6ml
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或25％浓度的磷酸将pH保持为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30％。通过随时加入消泡剂以控制起泡。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。然后结束发酵，并将该生物加热破坏。为此，将该发酵溶液灭菌30分钟。通过沉积出来表明已破坏。然后通过离心分离将细胞分离除去。在细胞分离之后，D-泛酸盐的浓度在48h后为24.1g/l。
按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
将2817ml发酵罐排出物与1183ml浓度为178.9g/l的泛酸溶液混合，并用25％浓度的氢氧化铵溶液(pH 6.5)中和。然后将该混合物过滤通过砂子/活性炭。滤液中D-泛酸的含量为67g/l，主要呈铵盐形式。将约720g该溶液按照实施例1进行电渗析处理：
使用3.5g 40％浓度的氢氧化钙悬浮液将550g稀溶液排出物(密度为1.017g/ml)的pH调节至7.5。得到D-泛酸钙水溶液(551.03g，D-泛酸钙含量为40.9g/l)。
将该D-泛酸钙水溶液在Niro Minor实验室喷雾干燥器中干燥。塔入口温度为约200℃，塔出口温度为90℃。使用双流喷嘴在2巴压力下进行雾化。所添加的隔离剂是Sipernat 22F。得到具有下列技术指标的粉末产物(数据以重量％表示)：
水含量：2.3％
D-泛酸钙：46.1％
铵离子：0.60％
钾离子：0.47％
钠离子：1.1％
实施例3：
在容量为200升的装有搅拌器和气体引入装置的发酵罐中，将800g50％浓度的酵母提取物、438g谷氨酸钠、3200g大豆粉、640g硫酸铵、800g KH2PO4、1600g K2HPO4和50ml消泡剂Tego KS与70升水混合，并将该混合物在121℃下灭菌30分钟。
然后加入溶液1和2。
溶液1按如下制成：将1670g葡萄糖·H2O、10.2g CaCl2·2H2O和170.7g MgCl2·6H2O溶解在9升水中，并灭菌30分钟。
溶液2按如下制成：将800ml柠檬酸亚铁溶液(200g/l柠檬酸钠、2g/lFeSO4·7H2O，无菌过滤)与80ml痕量盐溶液(0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6gMnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升，并无菌过滤)混合。
向该溶液中，加入2升枯草芽孢杆菌PA668的接种培养物(OD＝10，在SVY培养基(SVY培养基：25g Difco Veal肉浸汁、5g Difco酵母提取物、5g谷氨酸钠、2.7g(NH4)2SO4在740ml水中的溶液，灭菌；加入200ml无菌的1M K2HPO4(pH 7)和60ml无菌的50％葡萄糖溶液(终体积1升))中)，并将所得混合物于43℃和剧烈搅拌下在3m3/min的气体流速下发酵。该菌株按照US 60/262,995的附件进行描述。
在48h内，加入约10升无菌的葡萄糖水溶液。该水溶液按如下制成：将90kg葡萄糖·H2O和55kg水混合，并灭菌30分钟。然后，加入300ml痕量盐溶液(组成见上)和3升柠檬酸亚铁溶液(组成见上)。然后加入1升无菌过滤的90g/l CaCl2·2H2O溶液和2升无菌过滤的375g/l谷氨酸钠溶液。
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或20％浓度的磷酸将pH保持为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30％。通过随时加入消泡剂以控制起泡。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。然后结束发酵。通过在碟式分离机中分离将细胞除去。上清液中残留细胞通过加热灭菌而破坏。在48h后停止时，D-泛酸盐的浓度为13.7g/l。在分离和灭菌之后，D-泛酸盐的浓度为10.7g/l。按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
将3000g经这样预处理的发酵溶液按如下进一步处理：将该批料的三分之二在约10℃下用相当于相等浓度的多价阴离子(40％溶液)的CaCl2沉淀；将该批料的三分之一用等量的Ca(OH)2(固体)相应沉淀。将溶液在冰箱中储存一夜，然后通过压滤器(Seitz深度过滤器700)与沉淀的沉降物分离。然后将各溶液混合，并通过在约10℃下加入另外10g Ca(OH)2使其呈碱性(pH＝8.7)并再沉淀。同样过滤除去再沉淀的沉降物。
然后，将1800g该溶液在35℃下在三回路电渗析组件中进行盐交换。在这种情况下，使发酵液通过由两个阳离子交换膜连接的产物室。在阴极侧上，单选择阳离子交换膜(Tokuyama Soda，CMS)将产物从浓缩物回路中分离，在阳极侧上，产物室通过常规阳离子交换膜(TokuyamaSoda，CMX)与CaCl2回路分开。浓缩物和CaCl2回路通过阴离子交换膜(Tokuyama Soda，AMX)分离。在该浓缩物中，充有750g 0.5％浓度的NaCl溶液，在该CaCl2回路中，充有900g 3.05％浓度的CaCl2溶液。在电极冲洗回路中，有0.1M Na2SO4溶液在循环。该实验以30mA/cm2在总膜面积为500cm2的由5个上述基本单元组成的组件中以分批方式恒电流进行。所选择的停止标准是在CaCl2回路中最小电导率为4mS/cm。对产物和浓缩物回路中的阳离子的分析结果总结在下表中。
  PTA[g/l]   Ca2+   Na+   K+   NH4 +
  5329/01/82产物t＝0   9.27   0.24％   0.15％   0.65％   0.24％
  5329/01/82产物t＝0.83h   9.01   0.43％   0.07％   0.25％   0.06％
  5329/01/82浓缩物t＝0h   0.0   0.0％   0.2％   0.0％   0.0％
  5329/01/82浓缩物t＝0.83h   0.015   0.02％   0.47％   0.71％   0.29％
由此计算出，除去了51％的钠、66％的铵离子和61％的钾。平均电流产率为82％。两个相邻回路中泛酸的损失在每种情况下为所用物质量的0.08％。在实验过程中产物回路的pH为7-7.5，在浓缩物和CaCl2回路中pH为约6。
在实验过程中，根据CaCl2回路中的电导率从大约11V降至16V，总的电压降增加。
然后，将这样通过电渗析处理的溶液成功地喷雾干燥，得到终产物。此处表明，在适当预处理的情况下，利用单选择阳离子交换膜的三回路电渗析可用于一价阳离子的离子交换，而保留二价阳离子，以增加终产物的喷雾干燥能力。

Claims (42)

1.一种制备D-泛酸和其盐的方法，其包括如下步骤：
a)使用至少一种选自枯草芽孢杆菌PA824的生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)通过施加电场使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过一个或多个离子交换膜，其中低分子量离子从该含有D-泛酸盐的溶液中除去，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基中没有供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中，生成D-泛酸和其盐，含量为至少10g/l培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述含量为至少20g/l培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述含量为至少40g/l培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述含量为至少60g/l培养基。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，将溶液的pH设定为5-10。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，将溶液的pH设定为5-9。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述pH为6-9。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述pH为6-8。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，使用单极和/或偶极离子交换膜。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，使用单极离子交换膜。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，使用对一价离子具有选择性的单极膜。
14.如权利要求1或2所述的方法，其中将含有D-泛酸的发酵液的pH在步骤b)处理之前设定为D-泛酸的等电点pH。
15.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，将单极离子交换膜的电流密度设定为1-100mA/cm2。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述单极离子交换膜的电流密度为10-80mA/cm2。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述单极离子交换膜的电流密度为20-40mA/cm2。
18.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，将偶极离子交换膜的电流密度为1-150mA/cm2。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述偶极离子交换膜的电流密度为30-100mA/cm2。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述偶极离子交换膜的电流密度为70-90mA/cm2。
21.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，将一价阳离子的含量降至≤1g/kg溶液的浓度。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述一价阳离子为铵离子、钾离子和/或钠离子。
23.如权利要求1或2所述的方法，其中为了中和，将氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁和/或碱式碳酸镁以固体和/或水悬浮液形式加入步骤c)的溶液中。
24.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-55重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
25.如权利要求24所述的方法，其中将包含10-50重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
26.如权利要求25所述的方法，其中将包含20-40重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
27.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-65重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
28.如权利要求27所述的方法，其中将包含10-50重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
29.如权利要求28所述的方法，其中将包含20-40重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
30.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-60重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
31.如权利要求30所述的方法，其中将包含10-50重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
32.如权利要求31所述的方法，其中将包含20-40重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
33.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-25重量％的碱式碳酸镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
34.如权利要求33所述的方法，其中将包含10-20重量％的碱式碳酸镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
35.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)或d)中，得到或加入含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
36.一种用作动物饲料添加剂的组合物，其中它通过如下步骤制备：
a)使用至少一种选自枯草芽孢杆菌PA824的生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)通过施加电场使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过一个或多个离子交换膜，其中低分子量离子从该含有D-泛酸盐的溶液中除去，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH调节至3-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述培养基中没有供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
38.如权利要求36或37所述的组合物，其中在步骤c)或d)中，得到或存在含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
39.如权利要求36或37所述的组合物，包含浓度为1-50重量％的D-泛酸盐。
40.如权利要求39所述的组合物，包含浓度为1-20重量％的D-泛酸盐。
41.如权利要求39所述的组合物，包含浓度为20-50重量％的D-泛酸盐。
42.如权利要求36或37所述的组合物，其中D-泛酸的一价阳离子形式的盐的含量≤1g/kg组合物。
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