详细描述
实施例之一中,本发明是减小血管直径或防止20-HETE减小血管直径的方法,包括给予患者有效量的20-HETE拮抗剂或激动剂。
在本发明优选实施例之一中,所述化合物如以下通式所示:
R1选自羧酸、苯酚、酰胺、亚酰胺、磺酰胺、亚磺酰胺、活性亚甲基、1,3-二羰基、醇、硫醇、胺、四唑或其他杂芳基。
R2选自羧酸、苯酚、酰胺、亚酰胺、磺酰胺、亚磺酰胺、活性亚甲基、1,3-二羰基、醇、硫醇、胺、四唑或其他杂芳基。
W是C1-25碳链,可以是线形、环状或分支的,可以包含诸如S、O、N或Se的杂原子,或可包含芳基或杂芳基。
Y是C1-25碳链,可以是线形、环状或分支的,可以包含诸如S、O、N或Se的杂原子,或可包含芳基或杂芳基。
sp<3中心选自乙烯基、芳基、杂芳基、环丙基和炔基。
X是线形、分支、环状或多环烷基;或者是乙烯基、芳基、杂芳基、环丙基或炔基;亦可包含杂原子。
m=0、1、2、3、4或5,n=0、1、2、3、4或5。
在本发明全部实施例中,第一个碳都是羧基。然而,它可用其他类型的可离子化基团代替,例如在本发明总结构中所详细列举的(图6A)。如果碳链的20-21碳原子处有一对双键和羟基,则该化合物是激动剂。(可离子化基团C1至反应性基团C20或C21的总距离等于C20-21碳链的长度,但该链可含有其他原子,例如O、S或N)。如果在上述位置没有羟基,则该化合物是拮抗剂。
通过以上结构活性研究,我们提出了一种20-HETE作用激动剂和拮抗剂的大致结构,见图6A。激动剂和拮抗剂都必需有一个位于分子一端的羧基或其他可离子化基团,作为与推定受体的锚着位点。他们还必需在距离C1(羧基或可离子化基团)14-15碳处有一个双键或其他官能团,要求能够形成π键,以在受体处稳定分子。激动剂在距离C1可离子化基团20或21碳的位置还有一个羟基或其他可离子化官能团,要求能够与受体相互作用形成氢键。拮抗剂具有类似结构,但在20-21碳处没有反应性基团。
此外,我们的原形实施例显示,碳链19-碳位置上的羟基或其他官能团增强拮抗剂活性。
以下实施例中,我们合成了各种类似化合物,并在显微解剖所得大鼠肾小叶间动脉中试验评价了血管收缩反应的结构决定因素。通过以上研究,我们还发现了特定的20-HETE激动剂和拮抗剂。
实施例之一中,本发明是使用以上通式所示各种化合物的方法,所述化合物是20-HETE激动剂或拮抗剂。
实施例之一中,化合物是激动剂,血管直径被减小。较好的是,化合物距离双键5或6个碳原子处有个羟基,所述化合物选自21-HETE、ps20-HETE和二甲基20-HETE。
另一实施例中,化合物是20-HETE拮抗剂,避免了血管直径被20-HETE减小。较好的是,化合物在距离双键5或6个碳原子以外的位置有一羟基,所述化合物选自5(S)-HETE、15(S)-HETE、19(S)-HETE、19-羟基十九碳-5(Z)、8(Z)、11(Z)、14(Z)-四烯酸和20羟基二十碳-6(Z)、15(Z)-二烯酸。
可根据以下实施例所述的化合物合成,以类似方法合成本发明的化合物。
根据后文实施例,可最简便地确定某化合物是20-HETE激动剂还是拮抗剂。如果化合物减小患者的血管直径,就是20-HETE激动剂。
“减小患者的血管直径”是后文方法中所述的减小。申请人描述了分离血管试验***,其中,将血管套在玻璃微量移液管上,与各种测试化合物接触。据信,血管直径减小至少20%指示该化合物是20-HETE激动剂。
我们还揭示了一种20-HETE拮抗剂活性的试验。该分析中,用加测试化合物前后的对20-HETE的累积剂量应答曲线来分析测试化合物。拮抗剂,例如5-HETE或15-HETE的加入抑制了对20-HETE的血管收缩反应。我们还预计了类似抑制血管收缩反应的合适的拮抗剂。
我们认为,20-HETE的激动剂和拮抗剂可体内用于人的治疗。已知,体外在分离的血管中减小血管直径的药物在体内同样有效。(Zou,A.P.,Am.J.Physiol.,270:R226-237,1996;Zou,A.P.,Am.J.Physiol.,266:F275-282,1994;Harder,D.R.,同上,1997;Alonso-Galicia,M.,Hypertension 29∶320-325,1997)。
另一实施例中,本发明是20-HETE激动剂和拮抗剂在某些治疗中的应用。较好的是,所述20-HETE拮抗剂和激动剂如以上通式所示。
我们预计,20-HETE拮抗剂可用于减少患者过量的20-HETE内源性产生,详见后文实施例所述。这种调整对患有冠状动脉疾病、糖尿病、妊娠毒血症(先兆子痫)、肝肾综合征、环孢菌素诱导的肾毒性、脑血管痉挛中风或高血压的患者将是有利的。
我们还预计,20-HETE拮抗剂可用于治疗患有脓毒性休克或其他与诱导一氧化氮合成相关炎症的患者,详见后文实施例所述。
另一实施例中,我们还预计,20-HETE拮抗剂可抑制肉芽组织或肿瘤组织的血管化,因而可用于治疗癌症,详见后文实施例所述。
我们还预计,20-HETE激动剂具有一定的治疗用途,详见后文实施例所述。实施例之一中,激动剂具有利尿作用,可用于充血性心力衰竭、肺水肿、肝肾综合征和高血压患者。
另一实施例中,20-HETE激动剂可用于哮喘患者。较好的是,如实施例所述,化合物通过吸入给予。
另一实施例中,患者患有高肺压,注射20-HETE或20-HETE激动剂来舒张肺循环。
另一实施例中,患者患有脑血管损伤、血管痉挛、偏头痛或偏头神经痛、中风或***诱导的血管痉挛,以20-HETE拮抗剂治疗以增加血流量,缓解症状。
另一实施例中,本发明是含以下化合物之一和药学上认可的载体的药物制剂:
20-羟基二十烷酸S(20-HETE),
19-羟基十九烷酸(sC19类似物),
19S-HETE,
20,20-二甲基-20-HETE,
20-羟基二十碳-5(Z),14(Z)-二烯酸(ps 20-HETE),
20-羟基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酸(ps rev 20-HETE),
19-羟基十九碳-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)-四烯酸(C19类似物),
21-羟基二十一碳-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)-四烯酸(21-HETE),
N-甲基磺酰基-20-羟基二十碳-5(Z),14(Z)-二烯酰胺,和
N-甲基磺酰基-20-羟基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酸。
实施例总述
最近的研究显示,在肾和外周血管***中,花生四烯酸(AA)主要通过P4504A依赖性路径代谢成20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE),20-HETE是调节肾脏和外周血管紧张性、肾功能和长期控制动脉压中重要的第二信使。就此而言,20-HETE是一种强效血管收缩剂,它抑制血管平滑肌细胞中Ca2+激活的K+通道的打开。它通过继Kca通道封闭而去极化VSM细胞和提高L型Ca2+通道导通性,促进Ca2+的进入(Harder,D.,R.同上,1997;Roman,R.J.,同上,1999,在印)。在体内,20-HETE形成的抑制剂抑制肾、脑和外周动脉对透壁压力升高和肾、脑的血流量自身调节所作出的肌原性应答。(Harder,D.R.,同上,1997;Zou,A.等,同上,1996;Zou,A.P.等,同上,1994)。它们还降低对内皮肽、AII和NO合成酶抑制剂的血管收缩反应(Oyekan,A.O.,Am.J.Physiol.,274:R52-R61,1988;Sun,D.W.,等,Circ.Res.,83∶1069-1079,1998),对组织PO2升高的血管收缩反应(Harder,D.R.,Circ.Res.,79∶54-61,1996;Lombard,J.H.,Am.J.Physiol.,276:H503-H507,1999),血管平滑肌和肾小球膜细胞内生长因子的有丝***作用(Lin等,Am.J.Physiol.,269:F806-F816,1995;Uddin等,Hypertesion 31∶242-247,1998),和原发性高血压大鼠和其他高血压实验模型中高血压的发展(Roman等,Am.J.Hypertesion,10∶638-678,1997)。
在肾中,肾小管细胞也产生20-HETE,它在此参与调节近曲小管和亨勒襻粗升支内的钠转运。(Roman R.S.,同上,1999),人和兔肺内的气道也产生20-HETE,在此,它是内源性强效支气管收缩剂。(Zhu等,同上,1998;Jacobs等,同上,1999)。
尽管20-HETE在血管紧张度、肾功能、和气道阻力的调节中很重要,但对其作用机制却知之甚少。最近的研究显示:对20-HETE的促有丝***作用,极其对血管紧张性和钠转运的作用与PKC和MAP激酶信号传导级联被激活有关(Sun,C.W.,Hypertension 33∶414-418,1999)。上述路径的激活一般由受体所介导的事件激发,然而,目前还没有发现20-HETE受体。迄今为止,还没有公开的研究涉及测定20-HETE是否结合细胞膜蛋白,或涉及测定20-HETE的血管收缩反应是否可由密切相关类似物来模拟。
所以,本发明的目的是在显微解剖所得大鼠肾脏小叶间动脉中对一系列20-HETE类似物进行的结构活性研究,确定引起血管收缩反应的结构性决定因素。方法
概述
用购自Harlan Sprague-Dawley实验室(Indianapolis,IN)的10至12周龄雄性Sprague-Dawley大鼠进行实验。大鼠被饲养在Medical College of Wisconsin的动物看护所内,这是一家得到美国实验动物看护认定协会批准的机构。大鼠自由进食和饮水。所有用到动物的实验都得到Medical College of Wisconsin动物看护委员会的同意。
分离血管
用显微解剖法从大鼠的肾脏分离出小叶间动脉(内径70-120μm)。将血管套在玻璃微量移液管上,灌注腔内含有以95%O2和5%CO2混合气平衡的生理盐水,并于37℃保温。将血管固定在移液管上,侧枝用10-0号丝缝合线扎住。流入移液管与加压储液器相连以控制腔内灌注压力,用转换器监测压力(Cobe,Lakewood,CO)。将血管拉伸到显微解剖前测定的体内长度。将流出管夹住,在实验过程中,将腔内压力保持在90mmHg。用一图象***测定血管直径,该***包括一立体显微镜(Carl Zeiss,Inc.,Germany),CCTV摄象机(KP-130AU,Hitachi,Japan),录象机(AG-7300,Panasonic,Japan),监视器(CVM-1271,Sony,Japan)和图象测量***(VIA-100,Boeckeler Instrument Co.,Tucson,AZ)。
灌注液和浴液组合物是(单位为mM):119NaCl、4.7KCl、1.17MgSO4、1.6CaCl2、12NaHCO3、1.18NaH2PO4、0.03EDTA和10葡萄糖,pH7.4。在浴液中加入吲哚美辛(5μM)、baicalein(0.5μM)和17-ODYA(1μM),以抑制类二十烷酸通过环加氧酶、脂氧合酶和细胞色素P450路径内源形成和代谢。平衡一段时间后,得到对各种20-HETE类似物的累积剂量应答曲线。
羟基位置对20-HETE所激发血管收缩反应的影响
以下实验研究提高5(S)-、8(S)-、12(S)-、15(S)-和19(S)-HETE浓度对分离的、加压大鼠肾小叶间动脉直径的影响。以上类似物的碳原子数、双键数和分子量与20-HETE相似(图1)。它们与20-HETE主要区别在于羟基在碳链上的位置。另外用结构与20-HETE类似但没有碳20上羟基的花生四烯酸和20-羧基花生四烯酸,以及碳1和碳20上的羧基和羟基互换的20-羟基二十碳-6,15-二烯酸(互换20-HETE)进行了实验。得到吲哚美辛、baicalein和17-ODYA存在下各化合物(10-8至10-6M)的累积剂量应答曲线。化合物加入浴液中2至3分钟后记录血管直径。
双键和碳链长度对20-HETE所激发血管收缩反应的影响
我们进一步研究了双键和碳链长度对20-HETE所激发血管收缩反应的重要性。在以下研究中,20-HETE分子内的双键被去除,形成部分和完全饱和的20-HETE衍生物(20-羟基二十碳-6(Z),15(Z)二烯酸;20-羟基二十烷酸;图1)。还将20-HETE缩短1个碳原子,得到19个碳原子的类似物(19-羟基十九碳-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)四烯酸,图1),还去除双键得到饱和的19碳类似物(19-羟基十九烷酸,图1)。此外,还为20-HETE增加一个碳原子,得到21个碳原子的类似物(21-羟基二十一碳-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)四烯酸,图1),最后,用甲基代替碳20上的氢原子(20,20-二甲基-20-HETE)。平衡一段时间后,得到吲哚美辛、baicalein和17-ODYA存在下对各化合物(10-8至10-6M)的累积剂量应答曲线。化合物加入浴液中2至3分钟后记录血管直径。
20-HETE拮抗剂的活性
进一步试验不活泼的20-HETE类似物的拮抗剂活性。在以下实验中,分别获得向浴液添加5(S)-HETE(0.5μM)、8(S)-HETE(1μM)、12(S)-HETE(0.5μM)、15(S)-HETE(1μM)、19(S)-HETE(1μM)、C19类似物(1μM)、花生四烯酸(1μM)、20-羧基-花生四烯酸(1μM)、互换20-HETE(1μM)、饱和20-HETE(1μM)和饱和C19类似物(1μM)前后,对20-HETE(10-8至10-6M)的累积剂量应答曲线。各剂量20-HETE加入浴液中2至3分钟后记录血管直径。
药物和试剂
所有试剂都是分析级的。吲哚美辛购自Sigma Chemicals(St.Louis,MO)。5(S)-HETE、8(S)-HETE、12(S)-HETE、15(S)-HETE、19(S)-HETE、baicalein和17-ODYA购自Biomol Corp.(Plymouth Meeting,PA)。20-HETE、互换20-HETE、C19类似物、二甲基20-HETE、21-HETE、20-羧基-花生四烯酸和完全及部分饱和C19和20-HETE类似物、都是如下合成的。
20-HETE及其类似物的化学合成
以下制备与图1,8A、B、C、D、E和F相关。
20-HETE(9b)的制备:剧烈搅拌14,15-二羟基二十碳三烯酸甲酯(1)(700mg,1.98mmol)的-40℃无水CH2Cl2(30ml)溶液,在2分钟内分批向其中加入Pb(OAc)4(890mg,2.00mmol)(方案1;图8A)。30分钟后,用硅胶垫过滤反应混合物,去除无机盐。用EtOAc/己烷(1∶1,30ml)洗涤滤饼,合并滤液,真空蒸发,得到醛2(435mg,87%),这是一种不稳定的无色油,被立即用于下一步。1HNMR(250MHz,CDCl3):δ1.60-1.78(m,2H),2.00-2.15(m,2H), 2.30(t,J~7.4Hz,2H),2.70-2.85(m,4H),3.18-3.28(m,2H),3.65(s,3H),5.28-5.75(m,6H),9.65(t,J~1.8Hz,1H);TLC:EtOAc/己烷(1∶1), Rf~0.5。
搅拌粗制产物2(435mg,1.76mmol)的MeOH/CH2Cl2(1∶2,10ml)溶液,分批加入硼氢化钠(139mg,3.65mmol)。45分钟后,减压浓缩混合物,以EtOAc/己烷(2∶3)洗脱的SiO2柱层析纯化残留物,得到醇3无色油(350mg,80%)。1HNMR(250MHz,CDCl3):δ1.60-1.75(m,2H),2.04-2.15(m,2H),2.25-2.38(m,4H),2.72-2.85(m,4H),3.65(t,J~7.2Hz,2H),3.68(s,3H),5.28-5.60(m,6H);TLC:EtOAc/己烷(1∶1), Rf~0.39。
搅拌3(340mg,1.35mmol)和四溴化碳(585mg,1.75mmol)的0℃无水CH2Cl2(15ml)溶液,分批加入三苯基膦(495mg,1.89mmol)。40分钟后,真空去除溶剂,用CH2Cl2洗脱的SiO2柱层析纯化残留物,得到溴化物4(375mg,88%),这是一种可流动的无色油。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.64-1.75(m,2H),2.04-2.15(m,2H),2.25-2.36(m,2H),2.60-2.70(m,2H),2.75-2.84(m,4H),3.38(t,J~7.2Hz,2H),3.65(s,3H),5.30-5.60(m,6H);TLC:EtOAc/己烷(1∶1),Rf~0.61。
将LiOH水溶液(1M,2ml)滴加到4(375mg,1.19mmol)的0℃四氢呋喃(THF)/H2O(5∶1,20ml)溶液中。常温搅拌12小时后,用1M的草酸水溶液将pH调节至4.5,减压蒸发THF。残留物用H2O(15ml)稀释,用EtOAc萃取(3×10ml)。合并有机萃取液,用H2O(15ml)洗涤,用Na2SO4干燥,蒸发得无色油状溴化物5(318mg,89%)。 1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.63-1.76(m,2H),2.08-2.16(m,2H),2.40(t,J~7.1Hz,2H),2.60-2.70(m,2H),2.75-2.86(m,4H),3.40(t,J~7.2Hz,2H),5.30-5.55(m,6H);TLC:EtOAc/己烷(3∶1),Rf~0.34。
三苯基膦(524mg,2mmol,3.5当量)和溴-酸5(305mg,1mmol)的无水CH3CN(6ml)溶液在密封试管内于85℃加热60小时。蒸发去除溶剂,经MeOH/CH2Cl2(5∶95)洗脱的SiO2柱层析纯化得到鏻盐6(530mg,92%),这是一种粘稠的吸湿性的油。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.55-1.70(m,2H),1.96-2.10(m,2H),2.40(t,J~7.1Hz,2H),2.42-2.60(m,2H),2.62-2.70(m,4H),3.75-3.88(m,2H),5.20-5.50(m,6H),7.65-7.80(m,15H);TLC:MeOH/CH2Cl2(1∶7), Rf~0.21。将二(三甲基甲硅烷基)酰胺锂(0.32ml 1M的THF溶液)滴加到6(90mg,0.16mmol)的-78℃THF/六甲基磷酰胺(HMPA)(4∶1,2.5ml)溶液中。混合物逐渐形成内鎓盐特有的深黄色。反应混合物在-40℃保温1小时,重新冷却至-78℃,向其中滴加醛12b(30mg,0.133mmol)的无水THF(1ml)溶液。1.5小时后,用50%NH4OAc水溶液终止反应,用EtOAc萃取(3×10ml),合并有机萃取液,用水(2×5ml)、盐水(5ml)洗涤,用Na2SO4干燥,真空去除溶剂。将残留物重溶于MeOH/Et2O(1∶5,4ml),并用过量的重氮甲烷醚在0℃处理0.5小时。去除所有挥发性物质,并进行EtOAc/己烷(1∶10)洗脱的SiO2层析纯化,得到甲硅烷酯7b和△14,15-反式-7b的混合物(8∶1,73%),该混合物在下一步后更容易拆分。7b和△14,15-反式-7b的混合物的1H NMR(250MHz,CDCl3):δ0.84(s,9H),1.20-1.75(m,8H),2.00-2.18(m,4H),2.30(t,J~7.5Hz,2H),2.72-2.85(m,6H),3.6(t,J~7.3Hz,2H),3.65(s,3H),5.30-5.40(m,8H),7.38-7.45(m,6H),7.59-7.68(m,4H);TLC:EtOAc/己烷(1∶2),Rf~0.62。
7b/△14,15-反式-7b(63mg,0.11mmol)和氟化正四丁基铵(0.22mmol,5当量)的THF(8ml)溶液室温下放置3小时。蒸发去除溶剂,将残留物溶于EtOAc(10ml),然后用水(2×5ml)、盐水(5ml)洗涤,用Na2SO4干燥,真空浓缩。用Et2O/己烷(7∶3)洗脱的SiO2柱层析纯化残留物,得到酯8b及其△14,15-反式异构体(77%)的无色油,在Varian Microsorb Si 5μ(10×250mm)柱上进行HPLC拆分,用己烷/EtOH(99.4∶0.6)以6ml/min的速度进行无梯度洗脱,并在205nm处进行监测(8b:Rt~32.4min;△14,15-反式8b:Rt~34.8min)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.25-1.75(m,8H),2.00-2.20(m,5H),2.30(t,J~7.5Hz,2H),2.72-2.85(m,6H),3.65(t,J~7.3Hz,2H),3.70(s,3H),5.30-5.50(m,8H)。
将NaOH(1M,0.149ml,0.149mmol)水溶液加入8b(12.4mg,0.037mmol)的0℃THF/H2O(3∶1,2ml)溶液中。常温搅拌过夜,用H2O(3ml)稀释反应混合物,滴加1M草酸水溶液将pH调节至6.5,然后以EtOAc(3×3ml)萃取。合并有机萃取液,用H2O(10ml)洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发得到20-HETE(9b)(8.5mg,72%)的无色油,各方面均和正品相同。1HPLC:Phenomenex Nucleosil 5μ C18(4.6×250mm)柱,用CH3CN/H2O/HOAc(49.95∶49.95∶0.1)至CH3CN/HOAc(99.9∶0.1)线性洗脱,速度为1ml/min,共40分钟,并在205nm处监测(Rt~18min)。TLC:MeOH/CH2Cl2(1∶10),Rf~0.45。
制备醛12b:将叔丁基氯二苯基硅烷(400mg,1.45mmol)和AgNO3(250mg,1.47mmol)加入1,6-己二醇(10b)(343mg,2.90mmol)的THF/吡啶(15∶1,32ml)(1当量)溶液中。黑暗中搅拌12小时后,用CELITE床过滤反应混合物,用THF(10ml)洗涤滤饼。蒸发合并的有机滤液,用MeOH/CH2Cl2(1∶49)洗脱的SiO2柱层析纯化残留物,得到11b(495mg,根据硅烷化剂的得率为96%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.04(s,9H),1.16-1.70(m,8H),3.48-3.76(m,4H),7.38-7.44(m,6H),7.61-7.66(m,4H);TLC:MeOH/CH2Cl2(5∶95),Rf~0.49。
将刚蒸馏得到的草酰氯(353mg,2.78mmol)加入二甲亚砜(DMSO)(543mg,6.95mmol)的-78℃无水CH2Cl2(5ml)溶液中。10分钟后,滴加甲硅烷基醚11b(495mg,1.39mmol)的CH2Cl2(3ml)溶液,再搅拌混合物1.5小时。加入三乙胺(702mg,6.95mmol),在30分钟内将混合物加热至20℃,然后倒入NaHCO3饱和水溶液中,分层。用CH2Cl2萃取(2×10ml)水层。合并有机萃取液,用盐水(15ml)洗涤,用Na2SO4干燥,蒸发,用CH2Cl2洗脱的SiO2柱层析纯化,得到醛12b(450mg,92%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.04(s,9H),1.36-1.80(m,8H),2.24-2.52(m,2H),3.64(t,J~6Hz,2H),7.32-7.44(m,6H),7.63-7.70(m,4H),9.72(t,J~1.8Hz,1H);TLC:MeOH/CH2Cl2(1∶49),Rf~0.71。
制备19-羟基十九碳-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)-四烯酸(9a)和21-羟基二十一碳-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)-四烯酸(9c):用维悌希盐6和醛12a和12c(1当量),按照9b的制备方法(方案1)制备C19-同系物9a和C21-同系物9c,得率与9b相当。9a和9c的TLC特征和NMR谱,积分除外,与9b几乎相同。
制备20,20-二甲基-20-HETE(19):氩气氛下,搅拌6-庚酸甲酯(13)(946mg,6.65mmol)的室温无水Et2O(30ml)溶液,向其中滴加MeLi(1.4M的Et2O溶液,10.4ml,14.6mmol)(方案2;图8B)。12小时后,加5%盐酸将反应混合物调至pH4,用EtOAc(3×10ml)萃取。合并有机萃取液,用Na2SO4干燥,真空去除所有挥发性物质,得到醇14(950mg,100%),它具有足够的纯度,可直接用于下一步。1HNMR(250MHz,CDCl3):δ1.22(s,6H),1.26-1.46(m,6H),2.03-2.18(m,2H),4.92-5.08(m,2H),5.72-5.90(m,1H);TLC:EtOAc/己烷(1∶4),Rf~0.38。
醇14(870mg,6.1mmol)、3,4-二氢-2H-吡喃(DHP)(1.12ml,12.2mmol)和对甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS)(153mg,0.61mmol)在CH2Cl2(43ml)中所成的混合物常温搅拌12小时,然后以Et2O(50ml)稀释,并过滤。真空蒸发滤液,用EtOAc/己烷(5∶95)洗脱的SiO2柱层析纯化残留物,得到无色油状THP醚15(1.13g,83%)。1HNMR(250MHz,CDCl3):δ1.19(s,3H),1.21(s,3H),1.30-1.42(m,4H),1.42-1.58(m,6H),1.60-1.68(m,1H),1.75-1.90(m,1H),2.01-2.12(m,2H),3.38-3.44(m,1H),3.90-3.99(m,1H),4.67-4.70(m,1H),4.92-5.08(m,2H),5.72-5.90(m,1H);TLC:EtOAc/己烷(15∶85),Rf~0.64。
THP醚15(565mg,2.5mmol)的0℃CH2Cl2(10ml)溶液用O3饱和10分钟。吹氮气驱除过量O3后,加入纯Me2S(1ml),混合物室温搅拌2小时。真空蒸发去除所有挥发性溶剂,用EtOAc/己烷(15∶85)洗脱的SiO2层析纯化残留物,得到无色油状醛16(390mg,68%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.18(s,3H),1.21(s,3H),1.40-1.80(m,12H),2.43(dt,J~1.5,6.4Hz,2H),3.40-3.52(m,1H),3.90-4.00(m,1H),4.68-4.74(m,1H),9.78(t,J~1.5Hz,1H);TLC:EtOAc/己烷(1∶9),Rf~0.19。
氩气氛下,将二(三甲基甲硅烷基)酰胺锂(0.3ml,1M,0.30mmol)缓慢加入鏻盐6(82mg,0.15mmol)的-78℃THF/HMPA(4∶1,5ml)溶液。反应混合物在-78℃继续搅拌30分钟,加热至-40℃1小时,然后再冷却至-78℃。在-78℃,向以上黄色内鎓盐溶液中滴加醛16(43mg,0.19mmol)的THF(1.5ml)溶液。1.2小时后,用50%NH4OAc水溶液终止反应,用EtOAc萃取(3×20ml)。合并有机萃取液,用水(5ml)、盐水(5ml)洗涤,Na2SO4干燥,真空蒸发。将残留物溶于Et2O,用过量的CH2N2醚处理15分钟。真空蒸发掉所有挥发性溶剂,残留物经PTLC[SiO2:Et2O/己烷(7∶3),Rf~0.56]纯化得无色油状的THP酯17(35mg,53%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.20(s,3H),1.23(s,3H),1.23-1.85(m,12H),1.95-2.20(m,4H),2.34(t,J~7.6Hz,2H),2.70-2.90(m,6H),3.35-3.50(m,1H),3.68(s,3H),3.85-4.00(m,1H),4.68-4.74(m,1H),5.20-5.45(m,8H)。
THP酯17(35mg,0.08mmol)和PPTS(2mg)在MeOH(1ml)中所成的混合物室温搅拌1小时。真空蒸发溶剂,残留物经PTLC[SiO2:Et2O/己烷(7∶3),Rf~0.38]纯化得无色油状的羟基酯18(23mg,80%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.23(s,6H),1.31-1.52(m,6H),1.71(quintet,J~7.2Hz,2H),2.02-2.20(m,4H),2.35(t,J~7.4Hz,2H),2.74-2.90(m,6H),3.67(s,3H),5.25-5.46(m,8H)。
酯18(11mg,0.03mmol)和LiOH水溶液(0.17ml,1M,0.17mmol)在THF/H2O(4∶1,2.5ml)中所成的混合物室温搅拌12小时。加1M草酸水溶液将反应调至pH4,用EtOAc萃取酸化后的溶液(3×5ml)。合并有机萃取液,用H2O(10ml)、盐水(10ml)洗涤,真空蒸发后得到无色油状的酸20,20-二甲基-20-HETE(19)(9.8mg, 93%)。 1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.21(s,6H), 1.30-1.52(m,6H),1.71(quintet,J~7.3Hz,2H),2.03-2.20(m,4H),2.33(t,J~7.6Hz,2H),2.72-2.87(m,6H),5.25-5.45(m,8H)。
制备14,15-二氢-20-HETE(26):酯7b(1.0g,1.74mmol)和LiOH(9ml,1M,9mmol)在THF/H2O(4∶1,20ml)中所成的混合物室温搅拌12小时,然后真空蒸发有机溶剂(方案3;图8B)。残留物以H2O(10ml)稀释,用1M草酸酸化至pH5.5,用EtOAc萃取(3×50ml)。合并有机萃取液,用H2O(50ml),盐水(50ml)洗涤,Na2SO4干燥,真空蒸发,得到无色油状的酸20(960mg,98%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.03(s,9H),1.20-1.42(m,4H),1.44-1.60(m,2H),1.67(quintet,J~7.1Hz,2H),1.92-2.18(m,4H),2.34(t,J~7.2Hz,2H),2.68-2.88(m,6H),3.63(t,J~7.4Hz,2H),5.25-5.46(m,8H),7.28-7.47(m,6H),7.55-7.70(m,4H) ;TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶4),Rf~0.15。
酸20(960mg,1.72mmol)和1,1’-羰基二咪唑(Im2CO)(418mg,2.58mmol)在无水CH2Cl2(35ml)中所处的混合物室温搅拌40分钟,然后通过管道转移到搅拌着的0℃3.5M H2O2醚溶液(20ml,69mmol)中,该溶液中含有催化量的咪唑锂。5分钟后,以CH2Cl2(25ml)稀释反应混合物,加入KH2PO4粉末(1.4g,10.32mmol),在0℃继续搅拌5分钟。所得悬浮液通过棉花塞过滤到一充满氩气的烧瓶中,该烧瓶中含有无水Na2SO4(3g)在CH2Cl2(30ml)中所成的悬浮液。反应混合物在氩气下室温保存12小时,用(40ml)盐水过滤和洗涤,直到淀粉-I2试纸检测水层的过氧化氢呈阴性。真空蒸发掉有机层,将残留物溶于Et2O/MeOH(3∶1,15ml),在0℃,向其中缓慢加入过量的CH2N2醚,直至黄色持续15分钟。真空去除溶剂,残留物经SiO2柱层析得无色油状环氧化物21(650mg,65%),并回收到7b(200mg)。1HNMR(250MHz,CDCl3):δ1.05(s,9H),1.29-1.65(m,8H),1.73(quintet,J~7.2Hz,2H),2.12(dt,J~6.3,12.5Hz,2H),2.18-2.47(m,2H),2.34(t,J~7.4Hz,2H),2.67-3.00(m, 6H),3.64(s,3H),3.66(t,J~7.1Hz,2H),5.28-5.58(m,6H),7.30-7.50(m,6H),7.60-7.74(m,4H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶4),Rf~0.39。
氩气氛下,将环氧化物21(650mg,1.1mmol)在无过氧化物的THF(5ml)中所成的溶液滴加到搅拌着的AcOH/THF/KBr饱和水溶液(20∶4∶3,27ml)的0℃混合物中。10小时后,将反应混合物真空蒸发至四分之一体积,用H2O(10ml)稀释,用Et2O萃取三次。合并醚萃取液,用10%的NaHCO3水溶液、H2O、盐水洗涤,Na2SO4干燥,真空蒸发至干。残留物通过一SiO2短柱,得到溴代醇22(700mg,94%),这是不可拆分的区域异构体的混合物。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.05(s,9H),1.16-1.48(m,4H),1.49-1.64(m,2H),1.71(quintet,J~7.3Hz,2H),1.80-2.07(m,2H),2.13(dt,J~6.5,13.3Hz,2H),2.35(t,J~7.3Hz,2H),2.42(t,J~6.5Hz,1H,D2O可交换),2.66-2.95(m,4H),3.41-3.57(m,1H),3.64(t,J~7.2Hz,2H),3.65(s,3H),4.00-4.15(m,1H),5.27-5.61(m,6H),7.27(m,6H),7.59-7.70(m,4H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶4),Rf~0.39。
将溴代醇22(700mg,1.05mmol)的丙酮(4ml)溶液滴加到Jones试剂(0.7ml,2M,1.57mmol)的-20℃丙酮(15ml)溶液中。30分钟后,缓慢加入过量i-PrOH终止反应,过滤去除铬盐,真空蒸发滤液。将残留物分配在H2O(10ml)和Et2O(8ml)之间。分离各层,用Et2O萃取水层两次。合并醚萃取液,用盐水(10ml)洗涤,Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经SiO2柱层析纯化得到无色油状的溴代酮23(500mg,72%),立即将其用于下一步。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.07(s,9H),1.20-1.80(m,8H),2.02-2.17(m,2H),2.34(t,J~7.4Hz,2H),2.64-2.91(m,4H),3.40-3.54(m,2H),3.64(s,3H),3.66(t,J~6.1Hz,2H),4.17-4.85(m,1H),5.25-5.70(m,6H),7.30-7.48(m,6H),7.60-7.78(m,4H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶4),Rf~0.46。
室温下,氩气氛下,搅拌溴代酮23(400mg,0.599mmol)、甲苯磺酰肼(224mg,1.199mmol)和氢醌(7mg,0.06mmol)在CH2Cl2/HOAc(2∶1,9ml)中所成的混合物32小时,然后以H2O(20ml)稀释,用Et2O萃取(3×50ml)。合并醚萃取液,用H2O、盐水洗涤,Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经SiO2柱层析纯化得到无色油状的乙炔24(140mg,41%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.05(s,9H),1.41-1.60(m,6H),1.72(quintet,J~7.2Hz,2H),1.97-2.19(m,4H),2.31(t,J~7.3Hz,2H),2.68-2.84(m,4H),2.85-2.98(m,2H),3.63(t,J~7.1Hz,2H),3.65(s,3H),5.29-5.50(m,6H),7.33-7.48(m,6H),7.63-7.72(m,4H);TLC:SiO2,Et2O/己烷(1∶1),Rf~0.53。
甲硅烷甲基酯24(140mg,0.245mmol)和氟化四正丁基铵(1.2ml,1M,1.2mmol)在无水THF(5ml)中的混合物在0℃、氩气氛下搅拌12小时,然后真空蒸发至干。将残留物溶于EtOAc(50ml),用H2O(30ml)、盐水(30ml)洗涤,Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经SiO2柱层析纯化得到不稳定的、无色油状的羟基酯25(50mg,62%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.36-1.67(m,6H),1.72(quintet,J~7.3Hz,2H),2.02-2.24(m,4H),2.33(t,J~7.5Hz,2H),2.75-2.88(m,4H),2.89-3.00(m,2H),3.65(t,J~6.8Hz,2H),3.67(s,3H),5.30-5.53(m,6H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶3),Rf~0.14。
酯25(4.8mg,0.014mmol)和LiOH(72μl,1M,0.072mmol)在THF/H2O(5∶2,1.5ml)中氩气氛下室温搅拌12小时。以1M的草酸将反应混合物调至pH6.5,用EtOAc萃取三次。合并有机萃取液,用H2O、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发后得不稳定的、无色油状炔属酸26(4.7mg,>95%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.35-1.65(m,6H),1.71(quintet,J~7.3Hz,2H),2.02-2.24(m,4H),2.37(t,J~7.3Hz,2H),2.70-2.88(m,4H),2.89-2.99(m,2H),3.67(t,J~6.4Hz,2H),5.28-5.54(m,6H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(3∶7),Rf~0.15。
制备19(S)-HETE(34)和19(R)-HETE(36):将4-溴丁烯(1. 31g,9.76mmol)的醚溶液(2ml)滴加到0℃的刚激活的镁屑(238mg,9.79mmol)的Et2O(7ml)悬浮液中(方案4,图8D)。将反应加热至室温,保温3小时。得到均匀的浅黄色Grignard试剂28溶液,在氮气正压下用导管将其转移到搅拌着的CuCN(88mg,0.98mmol)的无水THF(10ml)-20℃悬浮液中。20分钟后,将(S)-(-)-环氧丙烷(27)(94.6mg,1.62mmol)加入均匀的铜酸盐溶液中,然后在0℃搅拌12小时。用NH4Cl饱和水溶液终止反应,用EtOAc萃取(3×10ml)。合并有机萃取液,用H2O(2×10ml)、盐水(50ml)洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经SiO2柱层析纯化得到醇29(623mg,81%)的无色油。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.20(d,J~6.7Hz,2H),1.32-1.37(m,4H),1.91-2.12(m,2H),3.80-3.82(m,1H),4.93-5.05(m,2H),5.79-5.88(m,1H);TLC:SiO2,Et2O/己烷(1∶1),Rf~0.52。
将AgNO3(543mg,3.21mmol)和叔丁基氯二苯基甲硅烷(840mg,3.05mmol)先后加入醇29(317mg,2.78mmol)的THF/吡啶(14∶1,10ml)室温溶液。12小时后,用CELITE垫过滤反应混合物,用Et2O(10ml)洗涤滤饼。分离水性滤液层,用Et2O萃取(2×10ml),合并醚萃取液,用CuSO4饱和水溶液、H2O(2×50ml)、盐水(50ml)洗涤,用Na2SO4干燥,减压去除所有挥发性溶剂。残留物经SiO2柱层析纯化(5%Et2O/己烷)得到可流动的无色油状甲硅烷醚30(820mg,84%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.05(s,9H),1.08(d,J~6.4Hz,3H),1.32-1.60(m,4H),1.92-2.01(m,2H),3.80-3.92(m,1H),4.91-5.00(m,2H),5.70-5.81(m,1H),7.33-7.48(m,6H),7.64-7.75(m,4H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶9),Rf~0.9。
在30(500mg,1.42mmol)的无水CH2Cl2(5ml)溶液中以臭氧鼓泡15分钟,至TLC分析显示无起始物残留。在反应混合物中通以氩气,然后搅拌加入过量的Me2S(2ml),同时将混合物升至室温。12小时后,真空去除所有挥发性溶剂,残留物经SiO2柱层析纯化得到醛31(387mg,77%)的无色油。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.05(s,9H),1.08(d,J~6.2Hz,3H),1.39-1.50(m,2H),1.51-1.70(m,2H),2.29(dt,J~1.8,7.1Hz,2H),3.78-3.95(m,1H),7.32-7.49(m,6H),7.62-7.73(m,4H),9.67(t,J~1.8Hz,1H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶9),Rf~0.39。
醛31(1.81mg,0.507mmol)与内鎓盐6(220mg)的维悌希缩合,如12向7转化(方案1)那样用重氮甲烷酯化该加合产物,PTLC[SiO2:EtOAc/己烷(1∶4),Rf~0.64)]纯化后得到无色油状加合产物32(144mg,66%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.05(s,9H),1.07(d,J~6.2Hz,3H),1. 30-1.49(m,4H),1.72(quintet,J~7.3Hz,2H),1.90-2.03(m,2H),2.05-2.15(m,2H),2.33(t,J~7.4Hz,1H),2.64-2.89(m,6H),3.67(s,3H),3.75-3.90(m,1H),5.20-5.47(m,8H),7.28-7.49(m,6H),7.62-7.71(m,4H)。
按照将7转化为8的过程(方案1),将32(450mg)去硅烷化得到羟基酯33(210mg,78%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.20(d,J~6.3Hz,3H),1.40-1.53(m,4H),1.71(quintet,J~7.4Hz,2H),2.06-2.17(m,4H),2.33(t,J~7.4Hz,2H),2.74-2.88(m,6H),3.68(s,3H),3.75-3.86(m,1H),5.32-5.49(m,8H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶3),Rf~0.23。
氩气氛下,室温下搅拌醇33(100mg,0.299mmol)、Ph3P(102mg,0.389mmol)和苯甲酸(48mg,0.299mmol)的无水苯(3ml)溶液,向其中加入纯的偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)(68mg,0.387mmol)。2小时后,真空去除所有挥发性溶剂,残留物经SiO2柱层析纯化得无色油状苯甲酸酯35(109mg,83%)。1H NMR(250MHz,CDCl3):δ1.37(d,J~6.2Hz,3H),1.41-1.53(m,2H),1.61-1.79(m,4H),2.10(q,J~7.3Hz,4H),2.32(t,J~7.4Hz,2H),2.75-2.90(m,6H),3.69(s,3H),5. 18(m,1H),5.34-5.46(m,8H),7.45(t,J~7.1Hz,2H),7.56(t,J~7.1Hz,1H),8.04(d,J~7.1Hz,2H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶3),Rf~0.54。
按照将18转化为19所述(方案2;图8B),将酯33和35水解成相应的19(S)-HETE(34)和19(R)-HETE(36)。
制备20-羟基二十碳-5(Z),14(Z)-二烯酸(50):氩气氛下搅拌0℃的LiAlH4(860mg,22.7mmol)的Et2O(20ml)溶液,向其中滴加5-己炔酸(37)(3.4g,30.35mmol)的Et2O(6ml)溶液(方案5,图8E)。将反应混合物升至室温,保温3小时,然后冷却至0℃,用饱和Na2SO4溶液终止反应。用CELITE垫过滤所得的悬浮液,滤饼用Et2O洗涤。合并醚萃取液,以Na2SO4干燥,真空蒸发得无色油状5-己炔-1-醇(38)(3.02g,91%),其纯度足以不经纯化而直接用于下一步。1HNMR(250MHz,CDCl3):δ3.67-3.69(m,2H),2.25(dt,J~2.4Hz,6.4Hz,2H),1.96(t,J~2.4Hz,1H),1.57-1.72(m,4H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(3∶7),Rf~0.38。
用5分钟将叔丁基氯二苯基甲硅烷(10.1g,36.97mmol)加入醇38(3.02g,30.81mmol)和咪唑(2.51g,36.97mmol)的CH2Cl2(25ml)室温溶液中。12小时后,用CH2Cl2(70ml)稀释反应混合物,用H2O、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经SiO2柱层析纯化(5%EtOAc/己烷)得浅黄色油状甲硅烷醚39(8.4g,86%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.65(dd,J~1.6,7.6Hz,4H),7. 35-7.42(m,6H),3.65(t,J~6.8Hz,2H),2.19-2.22(m,2H),1.92-1.94(m,1H),1.55-1.71(m,4H),1.10(s,9H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(15∶85),Rf~0.56。
将n-BuLi(1.6M己烷溶液0.66ml,1.05mmol)滴加到甲硅烷醚39(320mg,0.96mmol)的-40℃THF(6ml)溶液中,然后加入无水HMPA(1.5ml)。1小时后,缓慢加入1-溴-7-(四氢吡喃基氧)庚烷(40)(Neeland等,J.Org.Chem.,59:7383-7394,1994)(291mg,1.05mmol)的THF(2ml)溶液。2小时内将反应混合物升至室温,保温12小时,然后在0℃用NH4Cl饱和水溶液终止反应。混合物以Et2O萃取3次,合并醚萃取液,用H2O、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经SiO2柱层析纯化(5%EtOAc/己烷)得可流动的油状加合产物41(310mg,63%)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.66(dd,J~1.6,7.6Hz,4H),7. 35-7.42(m,6H),4.56-4.58(m,1H),3.83-3.88(m,1H),3.71-3.75(m,1H),3.67(t,J~6Hz,2H),3.46-3.50(m,1H),3. 34-3.39(m,1H),2.11-2.16(m,4H),1.78-1.88(m,2H),1.42-1.77(m,12H),1.29-1.41(m,6H),1.08(s,9H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(15∶85),Rf~0.70。
室温下搅拌炔41(2.01g,3.93mmol)和对甲苯磺酸吡啶鎓(98mg,0. 393mmol)在MeOH(12ml)中所成的混合物12小时,然后真空浓缩。残留物经EtOAc/己烷(1∶9)洗脱的SiO2柱层析纯化得到无色油状醇42(1.61g,92%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.66(dd,J~1.6,7.6Hz,4H),7.35-7.41(m,6H),3.67(t,J~6.4Hz,2H),3.59-3.65(m,2H),2.11-2.17(m,4H),1.62-1.68(m,2H),1.52-1.60(m,4H),1.41-1.49(m,2H),1. 32-1. 39(m,6H),1.04(s,9H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(2∶3),Rf~0. 33。
在醇42(140mg,0.311mmol)的0℃CH2Cl2(5ml)溶液中依次加入四溴化碳(124mg,0.373mmol)、PPh3(98mg,0.373mmol)和吡啶(31μl,0.373mmol)。3小时后,真空去除所有挥发性溶剂,残留物经SiO2柱层析纯化(2%EtOAc/己烷)得无色油状溴化物43(148mg,91%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.66(dd,J~1.6Hz,8Hz,4H),7.35-7.41(m,6H),3.67(t,J~6.2Hz,2H),3.38(t,J~6.4Hz,2H),2.11-2.16(m,4H),1.84(quintet,J~7.4Hz,2H),1.62-1.67(m,2H),1.55-1.61(m,2H),1.31-1.48(m,8H),1.04(s,9H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶9),Rf~0.58。
氩气氛下,将n-BuLi(0.45ml,1.6M己烷溶液,0.72mmol)滴加到7-(四氢吡喃-2-基氧)-1-庚炔(Bestmann,H.J.等,Synthesis 1239-1241,1992)(44)(60mg,0.65mmol)在THF(8ml)和HMPA(2ml)中所成的-40℃溶液中。1小时后,加入溴化物43(376mg,0.72mmol)的THF(1ml)溶液,1小时内将反应升至室温。常温反应16小时,然后用NH4Cl饱和水溶液终止反应,用Et2O萃取(3×6ml)。合并有机萃取液,用水、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经5%EtOAc/己烷洗脱的SiO2柱层析纯化得浅黄色油状二炔45(84mg,61%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.66(dd,J~1.6,8Hz,4H),7.35-7.41(m,6H),4.55-4.57(m,1H),3.84-3.89(m,1H),3.70-3.76(m,1H),3.67(t,J~6.2Hz,2H),3.47-3.52(m,1H),3.35-3.41(m,1H),2.10-2.17(m,8H),1.88-1.92(m,1H),1.41-1.65(m,19H),1.28-1.40(m,6H),1.04(s,9H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶9),Rf~0.7。
氢气氛下搅拌四水合乙酸镍(II)(200mg,0.8mmol)的EtOH(600ml)溶液,向其中分批加入NaBH4(32mg,0.8mmol)。30分钟后,先加入45(5.80g,16mmol)的EtOH(50ml)溶液,然后加入刚蒸馏得到的乙二胺(4.8g)。混合物在氢气下室温放置3小时,然后用Et2O(600ml)稀释,并用SiO2垫过滤。真空浓缩滤液得到无色油状二烯46(4.40g,84%),无需纯化可直接用于下一步。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ.66(dd,J~1.6,8Hz,4H),7.35-7.41(m,6H),5. 30-5. 35(m,4H),4.55-4.57(m,1H),3.70-3.76(m,1H),3.65(t,J~6.4Hz,2H),3. 47-3.50(m,1H),3. 35-3.40(m,1H),1.96-2.09(m,8H),1.80-1.91(m,1H),1.65-1.79(m,1H),1.51-1.62(m,8H),1.21-1.42(m,16H),1.04(s,9H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(1∶9),Rf~0.75。
46(196mg,0.311mmol)与氟化正丁基铵(1.55ml,1M的THF溶液,1.55mmol)在THF(4ml)中所成的混合物室温搅拌3小时,然后真空蒸发至干。残留物经10%EtOAc/己烷洗脱的SiO2柱层析纯化得浅黄色油状醇47(102mg,84%)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ5. 34-5.40(m,4H),4.56-4.58(m,1H),3.84-3.89(m,1H),3.70-3.76(m,1H),3.62-3.65(m,2H),3.47-3.52(m,1H),3.35-3.41(m,1H),1.96-2.09(m,8H),1.79-1.90(m,1H),1.62-1.78(m,1H),1.51-1.61(m,8H),1.22-1.43(m,16H);TLC:SiO2,EtOAc/己烷(3∶7),Rf~0.52。
醇47(11.4mg,0.036mmol)和重铬酸吡啶鎓(PDC)(81mg,0.216mmol)的无水DMF(1.5ml)溶液室温搅拌20小时,然后用水(2ml)稀释,并用EtOAc萃取(3×5ml)。合并有机萃取液,用水、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,蒸发。将残留物溶于Et2O/MeOH(4∶1,3ml),与过量CH2N2在0℃反应30分钟。真空去除所有挥发性溶剂,残留物经PTLC[SiO2,EtOAc/己烷(2∶3),Rf~0.65]纯化得无色油状酯48(7mg,62%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.35-5.41(m,4H),4.56-4.58(m,1H),3.84-3.89(m,1H),3.70-3.76(m,1H),3.66(s,3H),3.47-3.52(m,1H),3. 35-3.41(m,1H),2. 31(t,J~7.6Hz,2H),1.94-2.09(m,8H),1.78-1.90(m,1H),1.64-1.78(m,1H),1.45-1.62(m,6H),1.22-1.42(m,16H)。
室温下搅拌以上THP-酯48(7mg,0.016mmol)和PPTS(1mg)的MeOH(1ml)溶液。12小时后,真空去除溶剂,将残留物溶于EtOAc(4ml),用水、盐水洗涤,干燥,并蒸发至干。残留物经PTLC[SiO2,EtOAc/己烷(2∶3),Rf~0.42]纯化得无色油状羟基酯49(4.3mg,80%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5. 36-5.42(m,4H),3.67(s,3H),3.66(t,J~6.8Hz,2H),2. 31(t,J~7.2Hz,2H),1.99-2.08(m,8H),1.68(quintet,J~7.2Hz,2H),1.55-1.61(m,2H),1.28-1. 39(m,15H)。
用NaOH(0.134ml,1M的水溶液)在THF/H2O(5∶1,2ml)中室温下水解羟基酯49(11mg,0.034mmol)过夜。真空去除THF,留下的水相混合物用1M草酸酸化至pH4。用EtOAc萃取所得的浑浊悬浮液(3×5ml),合并萃取液,用H2O、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发。残留物经PTLC[SiO2,EtOAc/己烷(1∶1),Rf~0.3]纯化得浅黄色油状的20-羟基二十碳-5(Z),14(Z)-二烯酸(50)(8mg,78%)。1HNMR(300MHz,CDCl3):δ5. 36-5.42(m,4H),3.66(t,J~6.8Hz,2H),2. 35(t,J~7.5Hz,2H),1.99-2.11(m,8H),1.69(quintet,J~7.5Hz,2H),1.56-1.60(m,2H),1.28-1. 39(m,15H)。
制备20羟基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酸(54):二烯46(92mg,0.146mmol)与PPTS(10mg)在MeOH(4ml)中的混合物室温下放置过夜,真空蒸发去除甲醇,用EtOAc(20ml)稀释,用H2O、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,真空蒸发至干(方案6)。残留物经SiO2柱层析纯化得无色油状醇51(62mg,79%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.66(dd,J~1.6,8Hz,4H),7. 35-7.41(m,6H),5.36-5.42(m,4H),3.61-3.67(m,4H),1.96-2.09(m,8H),1.55-1.66(m,6H),1.22-1.42(m,15H),1.04(s,9H);TLC:EtOAc/己烷(2∶3),Rf~0.45。
按照将47转化为48所述,将醇51(62mg)转化为酯52(65%)(方案5)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.66(dd,J~1.6,8Hz,4H),7. 35-7.41(m,6H),5.35-5.42(m,4H),3.66(s,3H),3.63-3.66(m,2H),2.31(t,J~7.6Hz,2H),1.94-2.06(m,8H),1.60-1.65(m,2H),1.55-1.60(m,2H),1.26-1.48(m,14H),1.04(s,9H);TLC:EtOAc/己烷(1∶1),Rf~0.62。
按照将46转化为47所述,将甲硅烷酯52(28mg)去硅烷化,得到醇53(11mg,80%)(方案5,图8E)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.35-5.42(m,4H),3.66(s,3H),3.62-3.65(m,2H),2. 31(t,J~7.6Hz,2H),1.98-2.09(m,8H),1.51-1.69(m,4H),1.22-1.49(m,15H);TLC,SiO2:EtOAc/己烷(2∶3),Rf~0.45。
按照将49转化为50所述,将酯53(10mg)转化为酸54(8mg,78%)。1HNMR(300MHz,CDCl3):δ5.30-5.42(m,4H),3.66(dt,J~0.9,6.3Hz,2H),2.35(t,J~7.2Hz,2H),1.98-2.08(m,8H),1.54-1.67(m,4H),1.24-1.50(m,15H);TLC,SiO2:EtOAc/己烷(1∶1),Rf~0.3。
制备20-羟基二十烷酸(55)和19-羟基十九烷酸(56):酯8b(5mg)和10%Pd/C(2mg)在EtOH/EtOAc(9∶1,3ml)中的混合物在氢气氛(1个大气压)下搅拌8小时。用等体积的Et2O稀释,然后用CELITE垫过滤反应混合物,用Et2O(4ml)洗涤滤饼。合并滤液,蒸发后得到无色胶状20-羟基二十烷酸(5mg,98%)。1HNMR(250MHz,CDCl3):δ1.20-1.42(m,30H),1.51-1.68(m,4H),2.32(t,J~7.3Hz,2H),3.65(t,J~6.6Hz,2H),3.68(s,3H);TLC:EtOAc/己烷(3∶7),Rf~0.37。
搅拌上述酯(5.2mg,0.015mmol)的室温THF/H2O(5∶1,1.5ml)溶液,向其中加入LiOH(45μl 1M水溶液)。10分钟后,用1M草酸将pH调至4,用EtOAc萃取反应混合物(3×4ml)。合并有机萃取液,真空蒸发,得到固体的20-羟基二十烷酸55(4.5mg,92%),mp86℃。1H NMR(250MHz,CD3OD):δ1.20-1.45(m,30H),1.45-1.63(m,4H),2.28(t,J~7.4Hz,2H),3.55(t,J~6.5Hz,2H);TLC:EtOAc/己烷(3∶7),Rf~0.08。以同样方法由酯8a制备19-羟基十九烷酸(56)。
制备二十碳四烯-1,20-二酸:按照S.Manna等,Tetrahedron Lett.,24:33-36,1983中所述,制备20-HETE(9a),得率为84%。
统计
给出平均值±SEM。进行重复测定值的偏差分析,然后进行Duncan多量程检验,确定组间和组内平均值之间差异的显著性。双侧检验所得P值小于0.05,则认为是显著。结果羟基位置对20-HETE所激发血管收缩反应的影响
图2显示对20-HETE衍生物的血管收缩反应。在肾小叶间动脉中,20-HETE(10-8至10-6M)造成直径的浓度依赖性减小(-4.3±0.8至-22.5±1.5μm,n=7)(图2A)。20-HETE减小血管直径的阈值浓度为10nM。相比之下,5(S)-、8(S)-、12(S)-、15(S)-和19(S)-HETE,即使浓度达到1μM,对肾小叶间动脉的直径也没有显著作用(图2A)。其他结构特征对20-HETE所激发血管收缩反应的重要性
图2B显示碳链长度改变对20-HETE所激发血管收缩反应的影响。21-碳衍生物和二甲基衍生物的效力与20-HETE一样。然而,在碳20上没有羟基的花生四烯酸,20-HETE的19-碳类似物和20-羧基-花生四烯酸对血管直径没有显著作用。
与此类似,20-HETE的饱和衍生物没有双键而改变了分子的三级结构,它对血管直径没有作用(图2B)。相比之下,20-HETE的部分饱和衍生物,既4个双键中去除2个,其血管收缩剂效力与20-HETE一样强(图2B)。有趣的是,碳1和碳20上的羟基和羧基互换的部分饱和、互换20-HETE类似物丧失激动剂活性(图2B)。20-HETE拮抗剂活性的决定因素
我们还研究了不活泼的20-HETE类似物是否可作为20-HETE所激发血管收缩反应的拮抗剂。我们获取了向浴液中加0.5-1mM不同类似物前后,分离的、被灌注肾脏血管对20-HETE的剂量应答曲线。在对照条件下,20-HETE((10-8至10-6M)造成内径的剂量依赖性减小(-6.4±1.2至-21.8±1.0μm,n=10)(图3A)。向浴液中加5-HETE(n=5)或15-HETE(n=5)完全抑制了对20-HETE的血管收缩反应(图3A)。与此类似,向浴液中加入19-HETE、C19-类似物(n=6)或部分饱和互换20-HETE(n=3)后,完全消除了对20-HETE的应答(图3B)。
其他实验研究将羟基向20-HETE的疏水性头部移动对拮抗剂活性的影响。该实验中,20-HETE(10-8至10-6M)在对照条件下使血管直径从-5.3±0.6μm减小至-19.2±1.9μm,n=10)(图4A)。加入8(S)-HETE或12(S)-HETE(1μm)对20-HETE所激发的血管收缩反应没有明显作用(图4A)。在8(S)-HETE、20-HETE(10-8至10-6M)存在下,血管直径仍从-2.8±0.7μm减小至-16.9±0.2μm,n=3。与此类似,在12(S)-HETE、20-HETE(10-8至10-6M)存在下,血管直径仍从-5.5±1.7μm减小至-16.2±2.9μm,n=5(图4A)。
没有羟基的20-HETE类似物似乎是20-HETE所激发的血管收缩反应真正的竞争性拮抗剂。例如,花生四烯酸(1μM)将血管收缩反应减弱至1μM20-HETE,即预计的50%(图4B)。然而,20-羧基-AA没有显著的拮抗剂作用(图4B)。
我们继而评估双键是否对20-HETE的拮抗剂活性致关重要。在这些实验中,20-HETE(10-8至10-6M)使血管直径从-5.1±0.5μm减小至-18.9±0.8μm,n=10(图4B)。向浴液中加入饱和C19-类似物将对20-HETE的血管收缩反应减弱了约50%(图4B)。与此类似,饱和20-HETE也表现出竞争性拮抗剂活性(图4B)。在该化合物存在下,20-HETE(10-8至10-6M)只令血管直径从-0.9±1.3μm减小至-7.0±2.9μm,n=5(图4B)。
图5概括了我们已经证明具有激动剂或拮抗剂活性的化合物实例。如图5所示,已知具有激动剂或拮抗剂活性的这些化合物都必需和20-HETE一样具有一个头部非极性的回形结构,并在碳20附近有一个羟基或其他反应性基团。如果距离双键5或6个碳原子有一个羟基或反应性基团,则该化合物是激动剂。如果OH基团距离双键只有4个碳原子或在别处,则它是拮抗剂。根据这些具体例子,我们可以推导出激动剂或拮抗剂活性所需结构的更概括的描述,见图6。本发明还给出了相关结构的具体实例(图7),根据本发明的内容推断,用上述试验,这些化合物也将表现出激动剂或拮抗剂活性。讨论
本发明研究了一系列20-HETE类似物对血管的作用,以确定对该化合物的血管收缩反应的结构决定因素。我们的结果显示:花生四烯酸,与20-HETE的区别在于没有碳20上的羟基,不造成肾小叶间血管的收缩。与此类似,羟基在其他位置上的5-、8-、12-、19HETE对血管直径没有作用。此外,20-HETE的19碳衍生物对血管紧张性也没有作用。相比之下,21-HETE和二甲基20-HETE是和20-HETE一样强的血管收缩剂。这些结果表明:对20-HETE的血管收缩反应严格依赖于碳20或21上的羟基。
我们还研究了20-HETE三级结构对其血管收缩性能的重要性。分子内双键间的相互反应确定了20-HETE和其他二十酸特有的回形结构。所以,将20-HETE饱和和部分饱和类似物的血管应答与天然化合物的相比较。我们发现,饱和的20-HETE类似物对血管紧张性没有作用,而保留5、6和14、15碳原子之间双键的部分饱和类似物则保留了血管收缩活性。以上结果表明:20-HETE的回形结构也是其血管收缩性能所必需的。
此项研究中最令人兴奋的发现也许是:没有血管收缩活性的20-HETE类似物可作为拮抗剂。在这方面,花生四烯酸、5-、15-、19-HETE、19HETE和C19类似物都是很有效的20-HETE所激发血管收缩反应的拮抗剂。而且还可预计对于拮抗剂活性的结构决定因素。因此,看起来,保留20-HETE回形结构的疏水性对于拮抗剂活性十分重要。例如12-或8-HETE分子,它们的分子头部没有羟基,就不能与推定的20-HETE结合位点相互作用,因此对20-HETE激发的血管收缩反应没有拮抗作用。因此,可以推断:11(S)-和7(S)-HETE和8、9-和11、12-EET和DiHetes都不是20-HETE拮抗剂。
我们还发现,双键和完好的20-HETE回形结构是拮抗剂活性重要的决定因素。在这方面,20-HETE的饱和C19-和C20-类似物对20-HETE所激发的血管收缩反应不象其源本化合物那样有效。与我们有关激动剂活性类似物的发现相似,我们发现:保持拮抗剂活性只需要一对双键。在这方面,部分饱和的、互换20-HETE类似物完全抑制了对20-HETE的血管收缩反应。该化合物特别有意义,因为它比其他类似物更具有生物稳定性,这是因为去除了8、9-和11、12-碳间的双键抑制了环加氧酶和脂氧合酶对该化合物的代谢。为该化合物再增加一个可离子化的磺酰亚氨基以抑制β-氧化和酯化代谢更可增强其稳定性。据报道,增加该基团,增强了体内生物利用度,但不改变20-HETE、EET和基于机制的20-HETE合成抑制剂的生物活性(Imig等,Hypertension 33(第2部分):408-413,1999)。
20-HETE的血管收缩剂作用具有独特的结构要求,而且,密切相关的无活性类似物是20-HETE拮抗剂,以上发现第一次证明了20-HETE受体的存在。但是,该受体的特性还不确定。经典受体一般与细胞膜的胞外表面结合,并属于蛋白质的7个跨膜结构域家族。20-HETE对钾通道活性、血管紧张性和生长、以及肾小管内钠转运的作用与PKC和/或MAP激酶酪氨酸激酶活性被激活相关(Sun等,同上,1999)。20-HETE的作用似乎更象DAG,是激酶活性的胞内脂类活化剂而不是作用于胞外受体的激素或旁泌激素。
最近的研究已经指出:在肾血流量自身调节、肾小管肾小球反馈、肾脏钠转运、肺功能以及对多种血管作用激素和生长因子的有丝***和血管收缩反应中,20-HETE起着重要的第二信使作用(Roman,同上,1999)。在高血压(Stec,D.E.等,Hypertension 271∶1329-1336,1996;Sacerdoti,D.等,Science 243∶388-390,1989;Stec,D.E.等,Hypertension 27∶564-568,1996)、糖尿病(Imaoka,S.等,Biochem.Biophys.Res.Comm.152∶680-687,1988)、肝肾综合征(Sacerdoti,D.等,J.Clin.Invest.100∶1264-1270,1997)和妊娠毒血症的基因实验模型中,AA的P450代谢产物形成被改变。20-HETE还参与血管紧张素II(AII)、内皮肽和一氧化氮合成酶抑制剂的血管收缩作用,并参与PTH、多巴胺、AII、缓激肽、内皮肽、加压素和肿瘤坏死因子(TNF)对肾脏钠转运的抑制作用(Roman,R.J.,同上,1999)。因为该物质在肾脏和肺功能调节、血管紧张性和动脉压控制中具有重要作用,所以20-HETE拮抗剂及其稳定的类似物很可能在上述疾病的治疗中具有治疗作用。至少,这些类似物为研究者研究20-HETE信号路径及其在肾脏和心血管功能控制中的作用提供了非常重要的新工具。类似物及拮抗剂的用途
细胞色素P450对花生四烯酸的肾代谢
早已知道:环加氧酶和脂氧合酶代谢花生四烯酸(AA),所形成的产物影响着肾功能和血管紧张性(McGiff,J.C.,Ann,Rev.Pharmacol.Toxicol.,31∶339-369,1991)。然而,在过去的10年间,提出了一种新的AA代谢路径。实际上,最近的研究显示:在全身的小血管、肾小球和肾小管以及肺血管***和气道中,AA主要由细胞色素P450酶代谢成环氧二十碳三烯酸(EET)、二羟基二十碳三烯酸(DiHETE)和19-和20-羟基二十碳四烯酸(19-和20-HETE)。目前还已知:这些代谢产物在血管紧张性、肾功能、肺功能调节中是重要的第二信使,而且在多种疾病中介导有丝***对血管和肾脏造成的损伤(Harder D.R.等,J.Vasc.Rev.32:79-92,1995;Rahaman,M.等,Am.J.Hypertens.10∶356-365,1997;McGiff,J.C.,同上,1991)。
细胞色素P450 4A家族(CYP 4A)的酶催化20-HETE的形成。目前已经鉴定了多种生物的编码该酶家族中13种不同同工型的cDNA。CYP 4A11和CYP 4F2在人肾中表达,CYP 4F2似乎是人体内负责20-HETE形成的主要同工酶(Simpson,A.E. C.E.,Gen.Pharmac.,28∶351-359,1997)。已经克隆了大鼠肾脏的4种同工酶即CYP 4A1、4A2、4A3和4A8。其中除4A8外,以花生四烯酸培养时都产生20-HETE。在全身的小动脉、肾小球和肾小管以及肺血管和气道中都表达同工酶CYP 4A2和4A3的信使。与此类似,可在肾脏和脑部动脉、肾内和肺的气道和血管内检测到CYP 4A蛋白(Zhu等,同上,1998;Jacobs等,同上,1999)。当以AA培养时,小血管以及肾、肺组织都产生20-HETE。
许多因子调节着细胞色素P450酶的表达。CYP 4A1和4A3 mRNA和蛋白在新生鼠的肾内高水平表达,但表达水平在进入成年后下降。相比之下,CYP 4A2在新生鼠的肾内不表达,其表达水平随年龄升高,直至成为成年鼠肾内所表达的主要同工酶(Omata,K.等,Am.J.Physiol.,262:F8-16,1992)。在近曲小管中,血管紧张素II(A II)增加EET的形成,而表皮生长因子(EGF)、多巴胺和甲状旁腺素(PTH)则增加20-HETE的形成(Lin,F.,同上,1995;Ominato,M.J.,Membrane Biol.152:235-243,1996;Rahman,M.等,同上,1997)。在TALH中,多种肽激素增加20-HETE的形成(Frazier,L. W.和T.Yorio,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,201:229-243,1992;McGiff,J.C.,同上,1991)。在喂以高盐饮食的鼠中,肾脏和血管***内的CYP 4A表达被下调,但是如果通过注射来维持循环中的AII水平,则该下调可被避免。相比之下,高盐摄入增加了肾内CYP 2C23的表达和EET的形成(Makita,K.等,FASEB J.,10:1456-1463,1996)。
糖皮质素、盐皮质素和孕酮提高肾CYP 4A的活性。降血脂药,例如氯贝特,在肝和肾内诱导CYP 4A1和3的表达以及20-HETE的合成(McGiff,J.C.,同上,1991;Simpson,A.E.C.M.,同上,1997)。P450酶的其他诱导剂,例如***、3-methelchrolantherene和3,4-苯并(a)芘,不改变肾CYP 4A的活性(Simpson,A.E. C.M.,同上,1997)。许多重要的心血管激素,例如AII、加压素和内皮肽激活磷酸脂酶并增加20-HETE的合成与释放,20-HETE于是参与对这些激动剂的血管收缩反应(Simpson,A.E. C.M.,同上,1997)。
糖尿病、妊娠毒血症、肝肾综合征、环孢菌素诱导的肾毒性以及各种高血压模型中,CYP 4A的活性升高(Makita,K.等,同上,1996;Rahman,M.等,同上,1997)。妊娠毒血症、肝肾综合征、环孢菌素诱导的肾毒性和高血压其特征都在于可能由血管内20-HETE过量产生所介导的肾脏和外周血管收缩。20-HETE过量产生还作为生长因子造成血管壁肥厚和管腔狭窄。这将最终导致心脏病发作、中风和肾衰,这些都是上述疾病的长期后果。以上发现提示:20-HETE合成抑制剂或20-HETE作用拮抗剂将在避免上述疾病对肾脏和血管功能造成损害并最终导致高发病率和死亡方面具有治疗作用。
我们预计,患者可接受每日口服活性长效20-HETE拮抗剂的治疗,以降低血压和避免血管狭窄。
20-HETE对血管紧张性的调节
当以AA培养时,全身的小血管都表达CYP 4A2的mRNA和蛋白,并大量产生20-HETE。20-HETE是血管平滑肌细胞的一种强效收缩剂(EC50<10-8M)。它通过继KCa通道封闭后的肾VSM细胞去极化和提高L型Ca2+通道传导来促进Ca2+的进入(Harder,D.R.等,同上,1995)。20-HETE形成的抑制剂激活VSM细胞内的KCa通道。nM浓度的20-HETE即可逆转该效应。这表明:20-HETE通常产生于遍布全身的小血管,在其中,作为胞内第二信使调节KCa通道的活性(Zou.A.P.等,同上,1996)。
图9概括了20-HETE在血管紧张性调节中的作用。细胞膜拉伸、血管活性激素和丝裂原激活磷酸脂酶C,继而升高的IP3引发胞内Ca2+储备的释放。然而,胞内Ca2+浓度将激活KCa通道,造成膜的超极化,这将限制Ca2+通过电压敏感性通道的向内通量。这是反作用的,阻止血管收缩。所以,一定存在着某种机制,缓冲了继胞内Ca2+储备释放后VSM细胞内的KCa通道活化。我们认为20-HETE就是在该机制中起着重要作用。胞内Ca2+浓度升高激活Ca2+敏感性磷酸脂酶A和DAG脂酶,释放花生四烯酸。花生四烯酸被转化为20-HETE,后者抑制肾VSM细胞内的KCa通道,造成细胞膜去极化,Ca2+通量增加,和持续的血管收缩反应。根据这一过程,20-HETE是重要的第二信使,调节着对膜拉伸以及所有激活磷酸脂酶释放胞内钙的其他血管活性激素和生长因子的血管收缩反应。
现在有相当的证据表明:在体内和体外,20-HETE都在调节血管紧张性方面具有重要作用。在这方面,花生四烯酸增强分离的灌注动脉对透壁压力升高的肌原性应答,而20-HETE形成的抑制剂则完全抑制该应答(Harder,D.R.等,同上,1995)。20-HETE形成的抑制剂,在体内,抑制肾和脑血流量的自身调节(Zou,A.P.等,同上,1994)。它们,在体内和体外,还减弱对加压素、血管紧张素II、内皮肽和去甲肾上腺素的血管收缩反应。
20-HETE还是肾内肾小管肾小球反馈(TGF)应答的介导者或调节者。该结论的依据是:肾致密斑内表达负责20-HETE形成的酶(Ito.O.等,Am J Physiol.,274:F395-414,1998),而20-HETE是入肾小动脉的强收缩剂(Zou A.P.等,同上)。在大鼠体内,向灌注亨勒襻的液体内添加AA增强TFG应答,在小管灌注液中添加P450抑制剂抑制TGF应答,这些发现进一步支持了以上假设。而且,在阻断20-HETE的内源性产生后,用含有20-HETE的溶液灌注亨勒襻,在大鼠体内恢复了TGF应答。以上研究提示:20-HETE作为TFG介导者或作为第二信使,在入肾小动脉水平上,转导对致密斑所分泌的其他介导物的血管收缩反应(Zou,A.P.等,同上,1994)。
更新的研究提出:20-HETE还可能是血管氧传感器,介导着与氧向组织释放改变相关的血管紧张性改变。该结论的依据是我们的以下发现:肾及脑内小动脉内20-HETE的产生严格依赖于培养介质内的氧张力((Harder,D.R.等,同上,1996)。该反应的Km是50torr,与全身各组织内的PO2相当。而且,我们最近的研究显示:本文中的20-HETE形成抑制剂和部分20-HETE受体拮抗剂抑制对组织内PO2升高的血管收缩反应和对组织氧释放增加的全身性自身调节应答,这对于形成高血压的体积依赖性模型至关重要。以上发现提示:20-HETE拮抗剂将在治疗盐敏感型高血压方面具有治疗作用。
在这方面,以口服20-HETE拮抗剂治疗患者将抑制20-HETE对全身血管的血管收缩作用,从而降低血压。它还将抑制20-HETE对血管壁生长促进作用,从而减轻肾、脑和冠状动脉的狭窄,避免因此造成心脏病发作、中风及肾衰。
血管紧张性控制中的20-HETE与一氧化氮形成相互作用
各种研究表明,紧张性NO释放在缓冲全身性血管收缩中起着重要作用。虽然,一般假设对NO的血管扩张反应是cGMP升高引起的,但越来越多的证据表明NO对cGMP依赖性的K+通道和血管紧张性有作用。NO结合细胞色素P450 4A酶内的亚铁血红素,在肾脑小动脉内抑制20-HETE的形成(Sun等,同上,1998;Alonso-Galicia,M.等,Am.J.Physiol.,275:F370-F378,1998)。还有证据表明,20-HETE形成被抑制引起肾和脑循环中NO的cGMP依赖性作用。这一点上,NO激活VSM细胞这的Kca通道和舒张小血管。然而,这些作用是cGMP依赖性的,因为它们不能被鸟苷酸环化酶或PKG的抑制剂所抑制(Sun,C.M.等,同上,1998)。NO对K+通道和血管紧张性的作用可完全被向溶液中加入外源性20-HETE以防止NO诱导的20-HETE水平下降所抑制(Sun,C.M.等,同上,1998)。以上发现表明:NO抑制20-HETE的形成,这是通过激活肾VSM细胞内的KCa通道,介导对NO的血管扩张反应中的cGMP依赖性部分(Alonso-Galicia,M.等,同上,1998;Sun,C.W.,Circ.Res.,83:1-11,1998)。
其他研究发现,20-HETE形成的抑制剂抑制肾和脑循环内对一氧化氮的血管扩张反应和整个动物内的血压下降(Alonso-Galicia,M.等,同上,1997)。在脓毒性休克模型中,它们还防止与引入一氧化氮合成酶相关的血压下降和脑充血。以上发现表明,20-HETE受体的拮抗剂在治疗脓毒性休克和其他与引入一氧化氮合成酶相关的炎症模型中,具有治疗潜力。
在这方面,已知,休克时,一氧化氮过量产生,将血压降至无法维持器官功能的水平。因为20-HETE拮抗剂抑制NO的作用,以静脉注射20-HETE拮抗剂治疗脓毒性休克患者将减轻一氧化氮的作用,恢复心脏、肾、脑内的血压和灌注。可进行短期的以上治疗(1-3天),直至毒性物质或感染被消除。
20-HETE拮抗剂比之一氧化氮合成酶抑制剂的优越性在于,拮抗剂在效应物部位抑制一氧化氮的作用,因而可在患者已经发生休克后使用。而且,不象一氧化氮合成酶抑制剂,20-HETE拮抗剂不降低基线组织血流量。实际上,NO合成酶抑制剂产生的极端的血管收缩作用会造成极端的缺血性末端器官损伤,使得此类药物不适合用于治疗休克。
P450二十酸在肾功能调节中
最近,AA的P450代谢产物在各种肾单位内钠转运调节中作为第二信使的作用已经成为动力学中的一个新领域。此类化合物对近曲小管内钠转运作用的综述,参见Rman等,同上,1999。多家试验室报道,20-HETE是近曲小管产生的AA的初级代谢产物,20-HETE抑制肾单位内的Na-K-ATP酶活性,这是通过增强PKC诱导的Na-K-ATP酶α亚基的磷酸化(Aperia,A.等,Adv.Pharmacol.,42∶870-876,1998;Ominato,M.等,同上,1996)。
此后的研究提出,多巴胺和PTH对近曲小管内Na-K-ATP酶活性和钠转运的抑制作用与PLA2活化和20-HETE形成增加有关。还有证据表明,P450抑制剂能抑制AII对近曲小管再吸收的抑制作用。该作用与5,6-EET形成增加有关,影响着NH3、Na+-H+交换向近曲小管细胞顶端膜的转移(Rahman,M.等,同上,1997)。
20-HETE在TALH内的氯根运输调节中也起着重要作用。Escalante和McGiff首先报道(McGiff,J.C.等,同上,1991),20-HETE是TALH细胞内AA的主要代谢产物,并抑制该肾单位内Na+-H+-2Cl-的协同运输。其后的局部膜片钳研究揭示,20-HETE抑制TALH细胞顶端膜内的70-pS K+通道(Wang等,J.Gen.Physiol.,106∶727-743,1995)。该通道的阻断限制了Na+-H+-2Cl-运输者进行运输所用的K+,降低了管腔的阳性跨上皮电势,而该电势是TALH内离子(Na+、K+、Ca2+和Mg2+)被动重吸收的主要动力。与该观点一致的是,在体外灌注的分离的TALH内,P450抑制剂提高跨上皮电势和氯转运,而20-HETE则降低跨上皮电势和氯转运。更近的研究提出,P450抑制剂还抑制AII、缓激肽、内皮肽、加压素和胞内Ca2+浓度升高对TALH内钠转运的抑制作用。因为20-HETE在肾脏钠转运调节中十分重要,20-HETE的稳定类似物可能作为利尿剂,用于治疗钠滞留情况,例如充血性心力衰竭、肺水肿、肝肾综合征和高血压。
在上述以水肿和胞外体积膨胀为特征的钠滞留情况中,口服20-HETE的活性稳定类似物可能在肾内累积,并因20-HETE抑制近曲小管和TALH内的钠转运而抑制小管对钠和水的重吸收。通过在碳1上加一个葡糖醛酸苷基团在羧酸基团上增加了一个促进药物排入尿液的基团,如此,可促进以上过程。抑制肾小管重吸收将增加钠的***,降低血液和胞外的体积,降低上述情况中水肿的严重程度。
20-HETE在高血压发病机理中的作用
多项研究提出,肾内20-HETE形成的改变在形成高血压遗传和实验模型发展中起着重要作用。在这方面,P4504A2基因选择性地在原发性高血压大鼠(SHR)的肾内过量表达(Saderoti,D.等,同上,1989;Stec.,D.等,同上,1996),这与肾内20-HETE形成增加有关。给予20-HETE产生的抑制剂降低SHR的动脉压,能够防止高血压(Saderoti,D.等,同上,1989)。由于20-HETE是强血管收缩剂(Harder,D.R.,等,同上,1995;Zou,A.P.等,同上,1996),它可能通过提高肾脏血管阻力和TGF应答而参与重新建立SHR内的血压尿***作用关系(Roman,R.J.,Am.J.Hypertension,3:893-900,1990)。20-HETE形成的抑制剂逆转SHR肾血管的紧张性升高,这一发现支持了这一假设(Imig,J.等,Am.J.Physiol.,266:H1879-1885,1994)。最近,我们又完成了确定上述样群内P4504A基因型是否与基线平均动脉压共分离的基因连锁分析(Stec,D.F.等,同上,1996)。然而,在摄入高盐的F2鼠中,发现了P4504A基因型与动脉压改变之间的显著关联。这表明,20-HETE参与SHR内肾血管和外周血管紧张性的提高,P4504A基因型似乎是该模型中盐敏感性的决定因素。以上研究提出,20-HETE拮抗剂具有抗高血压作用,有助于避免某些与这种高血压模型相关的缺血性血管小球损伤。
Dahl盐敏感性(S)鼠排出等量的钠和水,比血压正常的大鼠需要更高的肾灌注压(Roman,R.J.等,Am.J.Hypertension,1997),这主要是因为亨勒襻粗升支Cl-转运的提高(Ito,等,Hypertension,33(第二部分):419-423,1999)。现在有5条证据提示P4504A家族的酶对AA的肾代谢异常造成襻Cl-转运的提高,造成了Dahl S鼠的高血压。在这方面,Dahl S鼠亨勒襻内的20-HETE形成和P4504A蛋白水平降低(Stec,D.E.等,同上,1997)。外源性20-HETE的给予可使襻Cl-转运正常化(Roman R.J.等,同上,1997)。P4504A2基因内的一遗传标记与Dahl S鼠的高血压发展相伴,以氯贝特诱导肾内20-HETE形成避免了Dahl S鼠的高血压(Stec,D.E.等,同上,1996),抑制肾内20-HETE形成在则在高盐饮食的血压正常大鼠中造成了高血压(Stec,D.E.等,Hypertension,29:315-320,1997)。
以上结果提示,P4504A2基因座是改变Dahl S鼠肾功能和造成高血压的候选基因,而且,用20-HETE激动剂进行的替代治疗可能治疗盐敏感性高血压。在这方面,口服稳定的口服活性20-HETE激动剂应能抑制肾小管钠的重吸收,增强钠***,降低血流量和血压。
还有证据表明,20-HETE提高血管紧张性,并造成高血压实验模型中的器官损伤。在这方面,抑制20-HETE的形成减弱长期服用血管紧张素II、内皮肽和一氧化氮合成酶被抑制造成的动脉压升高(Roman等,同上,1999)。抑制20-HETE的形成还缓解盐皮质素高血压的发展,避免这种类型高血压模型的肾损伤和心脏肥大(Oyekan,A.D.等,Am.J.Physiol.,276:R000-R000,1999)(在印)。以上研究表明,20-HETE受体拮抗剂具有作为抗高血压药物的潜力,而且可能具有防止各种高血压模型中肾及心末端器官损伤的良好作用。
20-HETE在肺功能调节中的作用
在兔和人的肺中,20-HETE的效果与在外周血管***中的相反。Jacob,E.A.等,同上,1999,最近报道:当以花生四烯酸培养是,人、兔和狗的肺动脉和支气管环都大量产生20-HETE。20-HETE是肺动脉和细支气管环的强扩张剂。对20-HETE的VASO扩张应答依赖于完整的内皮素,而且是环加氧酶依赖性的。20-HETE刺激肺组织产生血管扩张性的环加氧酶产物释放,或者,它本身被环加氧酶代谢成扩张性产物。以上研究表明,20-HETE和20-HETE激动剂都可用于扩张肺高压患者的肺血管***。
在人细支气管组织中,20-HETE拮抗剂是细支气管强扩张剂。Jacob,E. A.等,同上,1999。nM浓度的上述激动剂就可完全抑制卡巴胆碱造成的细支气管紧张性升高,这种升高是哮喘的标准临床测试。以上研究提示,稳定的20-HETE激动剂可作为吸入性细支气管扩张剂用于治疗哮喘。而且,对于对哮喘吸入剂中所用其他药物(β-激动剂、类固醇)的细支气管扩张作用具有抗性的患者,它们特别有用。
20-HETE的有丝***作用
除调节血管紧张性和肾脏钠转运之外,越来越多的证据表明20-HETE还介导血管活性药物和生长因子在肾脏和血管组织内的有丝***作用。在这方面,EET和20-HETE提高多种细胞内的胸腺嘧啶掺入。肾小球膜细胞培养物内,P450抑制剂减弱对血清、加压素、EGF和佛波酯的生长应答。20-HETE(10-9M)促进LLC-PK1和OK细胞培养物的生长,P450抑制剂抑制EGF在许多细胞内的有丝***作用(Lin,F.等,同时,1995)。最后,20-HETE激活MAP激酶信号传道级联,提高主动脉VSM细胞培养物内20-HETE产生所介导的有丝***作用(Uddin等,同上,1998)。以上现象说明,20-HETE在与高血压、糖尿病和免疫损伤相关的肾小球膜细胞增殖和肾小球硬化症中起着重要作用。在这方面,20-HETE拮抗剂可用于治疗以防止血管狭窄,血管狭窄会升高中风、心脏病和肾损伤的发病率,这些则与糖尿病、高血压、环孢菌素肾毒性和多种肾炎相关。而且,由于20-HETE介导许多参与肿瘤形成的生长因子的有丝***作用和拮抗作用,20-HETE拮抗剂可能可用作抗癌药物,抑制肿瘤组织的血管化和/或生长。
我们预计,可以给患者口服活性、稳定20-HETE拮抗剂,这些拮抗剂将限制血管生长和肥大,防止心脏、肾脏和脑内的缺血性器官损伤(心脏病发作、中风和肾病)。在癌症治疗中,阻断20-HETE路径可抑制血管向肿瘤内生长。
综述
AA的P450代谢产物在调节肾功能和血管紧张性方面的作用,这一领域正在逐步拓展,但已经得出了一些普遍性的概念。首先,VSM细胞产生20-HETE,该物质作为第二信使在对血管收缩剂和扩张剂的肌原应答、TGF、血管肥厚和血管应答中,通过调节K+通道活性起着重要作用。第二,AA的P450代谢产物由近曲小管和TALH大量产生,是钠转运调节中的第二信使。最后,在高血压、糖尿病、肝肾综合征和怀孕时,肾脏内AA的P450代谢产物的形成发生改变。由于上述路径在调节肾脏和血管功能,以及在介导多种丝裂原的促生长作用中的重要作用,可能,AA的P450代谢产物参与了与上述疾病相关的肾功能和血管紧张性改变。而且,可能20-HETE受体拮抗剂在治疗诸如脓毒性休克、高血压、糖尿病、哮喘、肾小球疾病和癌症等多种疾病方面具有广泛的治疗潜力。