CN105980861B - 肝病的区分性诊断 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基本上非侵入性的肝病诊断，特别是能够在早期阶段干预该疾病进展的基本上非侵入性的肝病诊断。本发明还涉及使用血浆生物标记物来将非酒精性脂肪性肝炎(NASH)区分于非酒精性脂肪肝(NAFL)和非‑非酒精性脂肪肝病(NAFLD)以及正常对照。具体而言，本发明涉及使用血浆中游离类二十烷酸和其他多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物水平来将NASH区分于NAFL和非‑NAFLD的正常对照。

Description

肝病的区分性诊断
相关申请数据
本申请根据35U.S.C§119(e)要求于2014年12月10日提交的美国专利申请No.61/914,345的优先权权益，其全部内容以引用方式并入本文中。
拨款信息
本发明是在美国国立卫生研究院颁给的政府支持K23DK090303和美国国立卫生研究院颁给的政府支持GM U54 069338下完成的。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本发明主要涉及肝病的诊断，具体涉及区分非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和正常对照。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是美国慢性肝病最常见的病因。它广义上可被细分为非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝(NAFL)被认为发展为肝硬化的风险最小，而非酒精性脂肪性肝炎(NASH)被认为发展为肝硬化的风险较大。目前用于区分患有NAFLD的患者患的是NAFL还是NASH的诊断黄金规则是肝活组织检查。然而，肝活组织检查是侵入性的过程，其被取样变化性、费用所限，且可能因病状和偶发的死亡而变得复杂化。
目前还没有可以准确且非侵入性的用于检测NASH的生物标记物。基本上非侵入性(例如除了取血之外)的NASH诊断是主要未得到满足的医疗需求。
以往的研究表明脂毒性在NASH的发病机制中起到了重要作用。最近的数据表明氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)及其他的脂质部分在患NASH的患者中比在患NAFL的患者中高。
氧化的多不饱和脂肪酸(PUFA)和它们的代谢物参与各种炎症性疾病，已经报道自氧化的亚油酸和亚麻酸在NAFLD中出现。随着目前基于液相色谱-质谱的脂质组学技术的发展，已经开发了一种稳健的综合性方法，其针对如下物质进行脂质组学分析：数百上千的脂肪酸、酰基乙醇胺和炎性类二十烷酸，包括它们源自于大量环氧合酶、脂肪氧合酶、细胞色素P450和产生异前列素的非酶促氧化的数量众多的代谢物、及其组合。类二十烷酸及源自于花生四烯酸(AA)和其他PUFA的相关氧化代谢物得到了特别关注。现在超过150种这样的代谢物可以被常规地量化。
被诊断为NASH的病人患者发展成肝硬化的风险增加。目前肝硬化无药可救，患者仅限于接受能够延缓疾病进展、降低最小化肝细胞损伤和减少并发症的治疗。NASH的早期诊断可以阻止疾病进展并防止进展为肝硬化。然而，目前用于可靠地诊断NASH的唯一方法是肝活组织检查，其是侵入性非常大的过程。
发明内容
本发明涉及基本上非侵入性的肝病诊断。本发明还涉及使用血浆生物标记物来将非酒精性脂肪性肝炎(NASH)区分于非酒精性脂肪肝(NAFL)和非-非酒精性脂肪肝病(NAFLD)以及正常对照。具体而言，本发明涉及使用血浆中游离类二十烷酸和其他多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物水平来区分NASH与NAFL和非-NAFLD的正常对照。
正如在此讨论的那样，本发明对血浆类二十烷酸和其他氧化的PUFA的谱分析可以区分患NASH的患者、患NAFL的患者和独特表型的正常对照(例如，通过基于磁共振成像(MRI)的测定，具有根据质子密度脂肪含量(MRI-PDFF)的文献记载的肝脏脂肪含量小于5％)。
在一个实施方式中，本发明提供一种预测或评估被诊断患有肝病的患者的肝病进展风险的方法。本方法通过测定从患者血浆样品中获得的脂质提取物中的一种或多种游离类二十烷酸和/或多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物的特性(identity)和数量来予以实施。一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物相比于适当对照的升高或降低，如本文进一步描述，表示增加的所述肝病进展风险，可以据此相应地调整疗法。
优选地，测量患者血浆样品(已从其中提取出含有靶分子的脂质)中的一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物。测定类二十烷酸和/或PUFA代谢物的特性和数量并与其在正常对照中的水平相比较。
在该实施方式的一个方面中，所述非酒精性肝病(NAFLD)为非酒精性脂肪肝(NAFL)。在另一方面，所述NAFLD为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在再一方面，所述肝病进展风险是进展为肝硬化。
再一方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物选自于由PGE2、dhkPGD2、四降12-HETE(tetranor 12-HETE)、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-oxoODE和12,13EpOME组成的组，或为其任意组合。在一个具体方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为11,12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-COOH AA，或为其任意组合。在一个优选方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为dhkPGD2和20-COOH AA。在另一个优选方面，所述一种游离类二十烷酸为20-COOH AA。
在一个另外的方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物用AUROC测量。在再一方面，所述AUROC约至少0.8。在另一方面，所述AUROC约至少0.9。在再另一方面，所述AUROC约至少0.99。
在一个另外的实施方式中，本发明提供一种在被诊断患有肝病的患者中区分非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝的方法。本方法通过测定从患者血浆样品中获得的脂质提取物中的一种或多种游离类二十烷酸和/或多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物的特性和数量来予以实施。
此外，优选测量患者血浆样品(已从其中提取了包含靶分子的脂质)中的一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物，尽管可以对非脂质提取的血浆样品进行测量。测定类二十烷酸和/或PUFA代谢物的特性和数量并与其在正常对照中的水平相比较。相比于正常对照以及(为区分)相比于从非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病获得的那些，一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物水平有统计学意义的升高或降低表明患者患有NASH。然后可以相应地实施疗法。
一方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物选自于由PGE2、dhkPGD2、四降12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-oxoODE、12,13EpOME组成的组，或为其任意组合。在一个具体方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为11,12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-COOH AA，或为其任意组合。在一个优选方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为dhk PGD2和20-COOH AA。
在一个另外的方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物用AUROC测量。在再一方面，所述AUROC为约至少0.8。在另一方面，所述AUROC为约至少0.9。在又另一方面，所述AUROC为至少0.99。
在再一个实施方式中，本发明提供一种将非酒精性脂肪性肝炎(NASH)区分于非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病的方法，所述方法包括测量从患者血浆样品中提取的脂质中的一种或多种游离类二十烷酸和/或多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物的水平。与正常对照和(为区分)在非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病所获得的那些相比较，一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物水平的升高表明患者患有NASH。然后可以相应地实施疗法。
一方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物选自于由PGE2、dhkPGD2、四降12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-oxoODE和12,13EpOME组成的组，或为其任意组合。在一个具体方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为11,12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-COOH AA。在一个优选方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为dhk PGD2和20-COOH AA。
在一个另外的方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物用AUROC测量。在再一方面，所述AUROC为约至少0.8。在另一方面，所述AUROC为约至少0.9。
有利地，通过对肝病的进展进行非侵入性的准确测试，本发明的方法能够让医生有可能在与以前可能的阶段相比在该病的更早阶段实施干预。
附图说明
图1给出了源自于花生四烯酸的代谢物。对每种代谢物以三个临床臂示出了血浆游离花生四烯酸(AA)及其源自于环氧合酶(COX)、5-脂肪氧合酶(5-LOX)、12-和15-脂肪氧合酶(12/15-LOX)和细胞色素P450(CYP)活性的代谢物的定量。结果显示为盒须图(Box-and-Whisker plot)，其中盒的下边界表示第25百分位，盒中的线表示中值，盒的上边界表示第75百分位。所述须表示数据范围的下限和上限。
图2给出了备选底物来源的代谢物。对于每种代谢物以三个临床臂示出了血浆游离亚油酸(LA)、α-亚麻酸(ALA)、二十碳三烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及其源自于5-LOX、12/15-LOX和CYP活性的代谢物的定量。结果显示为盒须图，其中盒的下边界表示第25百分位，盒中的线表示中值，盒的上边界表示第75百分位。所述须表示数据范围的下限和上限。
图3(表1)给出了研究人群中患者的基础人口统计学、临床、生物化学和组织学的特征。
图4(表2)给出了正常对照、非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎中的类二十烷酸代谢物。
图5(表3)给出了区分开NAFL和NASH的血清生物标记物的诊断准确性。
具体实施方式
本发明涉及肝病诊断。本发明还涉及使用血浆生物标记物来将非酒精性脂肪性肝炎(NASH)区分于非酒精性脂肪肝(NAFL)和无非-非酒精性脂肪肝的疾病(NAFLD)的正常对照。具体而言，本发明涉及使用血浆中游离类二十烷酸和其他多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物水平来将NASH区分于NAFL和非-NAFLD的正常对照。
在阐述本发明的组合物和方法之前，应该理解本发明并不限于所阐述的具体的组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应该理解此处使用的术语仅用于阐述具体的实施方式而并不意图进行限定，因为本发明的范围仅受所附的权利要求书的限制。
如本说明书和所附的权利要求书所使用的那样，单数形式的“a”、“an”和“所述”包括复数引用，除非上下文明确指出不是这样。因此，例如，“所述方法”包括在此阐述的一个或多个方法和/或步骤，这对阅读了本说明书等的本领域技术人员而言是显而易见的。
除非另行定义，在此使用的所有科技用语均与本发明所属的技术领域的技术人员通常所理解的具有相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中可以使用与此处所阐述的相似或相同的任何方法和材料，但还是阐述了优选的方法和材料。下面给出的定义用于理解本发明而不应被理解为代替本领域的技术人员对这些术语的理解。
肝病
肝病是一种肝脏损伤或肝脏疾病。有一百多种肝病。最广泛传播的肝病如下：肝片吸虫病；肝炎；酒精性肝病；脂肪肝病；肝硬化；肝脏；胆汁性；硬化性胆管炎；小叶中心坏死；布加氏综合征；遗传性肝病(涉及体内铁蓄积的血色病、和Wilson病)；与甲状腺素运载蛋白(transthyretin)相关的遗传性淀粉样变性；和Gilbert综合征。
正如在此使用的那样，术语“肝病”指影响肝脏的任何疾病或紊乱。肝病的例子包括但不限定于Alagille综合征；与酒精相关的肝病；Alpha-1抗胰蛋白酶缺乏；自体免疫性肝炎；肝脏良性肿瘤；胆管闭锁；肝硬化；半乳糖血症；Gilbert综合征；血色病；甲肝；乙肝；丙肝；肝细胞癌；肝性脑病；肝囊肿；肝癌；新生儿黄疸；非酒精性脂肪肝病(包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎)；原发性胆汁性肝硬变(PBC)；原发性硬化性胆管炎(PSC)；瑞氏综合征；I型糖原贮积病和Wilson病。
非酒精性脂肪肝病
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是脂肪肝的一个病因，其在脂肪蓄积在肝脏中(并非过量饮酒所致)时出现。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征有关，并且可能响应于最初开发用于其他胰岛素抗性状态(如2型糖尿病)治疗，如体重降低、二甲双胍(metformin)和噻唑烷二酮(thiazolidinedione)。NAFLD可被细分为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝(NAFL)。NASH是更严重类型的NAFLD，被认为是未知病因肝硬化的主要病因。
患NAFLD的患者大多没有或少有症状。患者可能抱怨疲劳、不适和不明显的右上角腹部不适。有时也发生轻度黄疸，尽管这很少见。最通常地，NAFLD在血常规测试中通过异常肝功能测试进行诊断。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征(肥胖、混合型高脂血症、糖尿病(II型)和高血压)有关。
通常的发现是肝酶升高和显示脂肪变性的肝脏超声。超声也可用于排除胆结石问题(胆石病)。肝活组织检查(组织检查)是被广泛接受为可明确将NASH与其他形式的肝病区分开的唯一测试，可用于评估炎症及所产生纤维变性的严重性。
非酒精性脂肪肝
非酒精性脂肪肝(NAFL)是一类NAFLD，是一种肝细胞中脂肪蓄积的病症。NAFL进展为肝硬化的风险最小。单纯的脂肪肝通常不损伤肝脏，而是一种可通过肝活组织检查鉴定出的病症。单纯的脂肪肝与任何其他的肝脏异常例如疤痕产生或炎症无关。其在体重过大或患有糖尿病的患者中是常见的发现。当脂肪达到肝脏的至少5％时，患者就具有脂肪肝。
非酒精性脂肪性肝炎
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种通常“沉默”的常见肝病。NASH的主要特点是肝脏中有脂肪，并伴有发炎和损伤。患有NASH的患者大多感觉良好，并没有意识到他们的肝脏有问题。尽管如此，NASH可能是严重的，并可能导致肝硬化，肝硬化的肝脏被永久性损伤，产生疤痕，不能再正常工作。
通常首先怀疑在包括在血常规测试项目中的肝脏测试中发现有例如丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)升高的人患有NASH。当进一步的评估并没有给出明显理由是肝病而当肝脏的X-射线或成像研究表明有脂肪时，就怀疑患有NASH。提供对NASH的确切诊断并将其与单纯的脂肪肝区分开的唯一方式就是肝活组织检查。当从活组织检查观察到有脂肪并伴随有发炎和肝脏细胞损伤时，就诊断为NASH。如果组织有脂肪而没有发炎和损伤，就诊断为NAFL或NAFLD。目前，没有血液测试或扫描能够可靠地提供该信息。
类二十烷酸
类二十烷酸是由20碳脂肪酸氧化产生的信号分子，所述20碳脂肪酸例如花生四烯酸或其他的多不饱和脂肪酸(PUFA)。它们对许多机体***施加复杂的控制，主要在身体活动的过程中或之后的生长方面、摄入毒性物质和病原体后的炎症或免疫方面，并且在中枢神经***中作为信使。类二十烷酸包括***素、环***素、凝血烷、白三烯和其它的由氧通过酶促或非酶促加成到PUFA上而形成的代谢物。
类二十烷酸源自于omega-3(ω-3)或omega-6(ω-6)脂肪酸。一般而言，ω-6类二十烷酸是促炎性的，而ω-3促炎性较弱，甚或可能是抗炎性的。这些脂肪在人的饮食中的含量和平衡将影响人体的类二十烷酸控制的功能，对心血管疾病、甘油三脂、血压和关节炎产生影响。抗炎性药物例如阿司匹林和其他NSAID通过下调类二十烷酸的合成来发挥作用。
类二十烷酸有很多个亚家族，包括***素如环***素、凝血烷、脂氧素和白三烯。每一种还有2或3个另外的系列，其源自于ω-3或ω-6EFA。这些系列的不同活性基本解释了ω-3和ω-6脂肪酸的健康效应。
多不饱和脂肪酸
多不饱和脂肪酸(PUFA)是其骨架中含有多于一个双键的脂肪酸。这个类别包括许多重要的化合物，例如必需脂肪酸。多不饱和脂肪酸可根据其化学结构划分为不同组：亚甲基间隔的多烯、缀合的脂肪酸和其他PUFA。PUFA包括除含20个碳(二十碳)的脂肪酸以外的其他脂肪酸，例如，含18个碳的亚油酸和亚麻酸、含22个碳的二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，还包括花生四烯酸和其他20碳脂肪酸的代谢物，例如二十碳三烯酸(ETA)和二十碳五烯酸(EPA)，这些代谢物源自于环氧合酶、脂肪氧合酶、细胞色素P450和非酶促氧化。作用于花生四烯酸和其他PUFA以产生PUFA的酶的例子包括已知的COX、5-LOX、12/15-LOX和CYP。PUFA还可进行非酶促氧化。
游离类二十烷酸和PUFA代谢物的例子包括但不限于PGE2(***素E2)、dhk PGD2(13,14-二氢-15-酮***素D2)、四降12-HETE(2,3,4,5-四降12(R)-HETE)、15-HETE(15-羟基Y-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸)、11,12-diHETrE(11,12-二羟基-二十碳三烯酸)、14,15-diHETrE(14,15-二羟基-5,8,11-二十碳三烯酸)、20-COOH AA(20-羧基-花生四烯酸)、9-oxoODE(9-氧代-十八碳二烯酸)、12,13EpOME(12(13)-异白细胞毒素)、TxB2(凝血烷B2)、12-HHTrE(12-羟基-十七碳三烯酸)、11-HETE(11-羟基-5Z,8Z,12E,14Z-二十碳四烯酸)、5-HETE(5-羟基-6E-8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸)、5,6-diHETrE(5,6-二羟基-8Z,11Z,14Z-二十碳三烯酸)、14,15-diHETrE(14,15-二羟基-5,8,11-二十碳三烯酸)、13-HODE(13-羟基-十八碳二烯酸)、9-HODE(9-羟基-十八碳二烯酸)、9,10EpOMe、9,10diHOME(来自于可溶性的环氧化物水解酶对(±)12,13-EpOME的开环的二醇)、12,13diHOME、9-HOTrE、15-HETrE(15S-羟基-8Z,11Z,13E-二十碳三烯酸)、12-HEPE(12-羟基-5,8,10,14,17-二十碳五烯酸)、14HDoHE(14-羟基-二十二碳六烯酸)、16HDoHE(16-羟基-二十二碳六烯酸)和19,20DiHDPA(19,20-二羟基-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z二十二碳五烯酸)、血浆游离的亚油酸(LA)、α-亚麻酸(ALA)、二十碳三烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及它们源自于5-LOX、12/15-LOX和CYP的代谢物。
本发明还提供一种预测或评估被诊断患有肝病的患者的肝病进展风险的方法，所述方法包括测量该患者血浆中一种或多种游离类二十烷酸和/或多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物的水平，其中，游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物升高或者由于转化(可以包括氧化)成不同的类二十烷酸或PUFA而导致其中一种或多种特定物质降低表示所述肝病进展风险提高。一个方面，所述非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是非酒精性脂肪肝(NAFL)。在另一个方面，所述NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在一个特别有用的方面，本文证明分析血浆类二十烷酸可以区分NAFL和NASH。正如下面的实施例中所阐述的那样，若干类二十烷酸部分被鉴定出在正常与NAFL与NASH之间明显不同，与NAFL、正常对照相比，11,12-diHETrE、dkPGD2和20-COOH AA在NASH患者中以剂量依赖的方式大幅升高。该数据证明了11,12-diHETrE、dkPGD2和20-COOH AA是用于非侵入性诊断NASH的主要类二十烷酸候选生物标记物。
这些结果与以前报道的结果的不同之处在于其仅测量以游离形式存在且未经KOH处理的代谢物。尽管游离类二十烷酸的水平比酯化为脂质的类二十烷酸低得多，但本方法捕捉到多得多的代谢物，并允许了广得多的分析策略。其还避免了某些类二十烷酸和PUFA由于碱处理或酸处理而遭到破坏，而碱处理或酸处理是分析酯化为脂质的类二十烷酸中的必需步骤。在NAFLD中，正常的脂代谢被打乱，导致升高水平的游离脂肪酸和甘油三酯合成。已经表明游离脂肪酸引起肝毒性，并且可以经由许多机制刺激NAFL进展为NASH。它们可以具有直接的细胞毒性，刺激肝细胞中产生炎性途径。这些脂肪酸也充当炎性类二十烷酸的前体。与该结果相一致，NAFL和NASH中许多游离PUFA的血浆水平一直比健康对照高(图1和2)。
然而，在NAFL和NASH之间没有区别，表明血浆游离脂肪酸是区分各阶段NAFLD差的标记物。与此相对，它们转化成类二十烷酸可能构成疾病进展中的关键性机制，分析类二十烷酸水平而不是脂肪酸水平可能是区分NAFL和NASH的有用的临床工具。
所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物可以选自于由PGE2、dhk PGD2、四降12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-oxoODE和12,13EpOME组成的组，或为其任意组合。在一个具体方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为11,12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-COOH AA，或为其任意组合。在一个优选方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为dhk PGD2和20-COOH AA。在另一个方面，所述一种或多种游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物为20-COOH AA。
本方法通过测量患者血浆样品中一种或多种游离类二十烷酸和/或多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物的水平予以实施。正如在此处所使用的那样，术语“样品”是指来自于患者的任何生物样品。例子包括但不限定于唾液、毛发、皮肤、组织、痰液、血液、血浆、血清、玻璃体、脑脊液、尿、***和细胞。
正如进一步在实施例中详细阐述的那样，脂质提取于血浆样品。首先测定提取的脂质中的类二十烷酸和/或PUFA代谢物的特性和数量，然后与适当的对照相比较。所述测定可以通过任何适当的脂质分析技术来进行，优选高通量的脂质分析技术，例如光谱分析(例如Cheng,et al.,Lipid,46(1):95-103(2011)中记载的sulfo-phospho-vanillin(SPV)色谱分析方法)。适于测量和定量脂质含量的其他分析方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于ELISA、NMR、UV-Vis或气相-液相色谱、HPLC、UPLC和/或MS或RIA方法、基于酶的发色方法。提取脂质也可以根据本领域已知的各种方法进行，包括Bligh and Dyer,Can JBiochem Physiol.,37,911(1959)中记载的用于液体样品的常规方法。
对于肝病进展的一般性测定，获得的值可与正常对照相比较。用于在被诊断患有非酒精性肝病(NAFLD)的患者中区分非酒精性脂肪性肝炎(NASH)与非酒精性脂肪肝(NAFL)，例如，用于测定NASH或肝硬化，和/或用于区分NASH和NAFL。对照可以包括正常对照。相对于对照，游离类二十烷酸和/或PUFA代谢物升高表示肝病进展风险提高和/或对NASH的期望区分，据此可以相应地实施疗法。在某些情况下，如果正常的代谢物被氧化或转化为另一种代谢物，则一种或多种类二十烷酸和/或PUFA可能降低。
游离类二十烷酸和PUFA代谢物的水平表示为AUROC(Area under ReceiverOperating Characteristic Curve，受试者工作特征曲线下面积)。通过用稳定的同位素稀释法测量游离类二十烷酸和PUFA代谢物的水平来测定AUROC。简而言之，将相同量的氘化内标加到每个样品中和用于制作标准曲线的所有基准标准中。通过确定内源性代谢物与匹配的氘化内标之间的比率来计算类二十烷酸和PUFA代谢物的水平。通过线性回归，将比率转换为绝对量。使用包括卡方检验、t-检验和AUROC在内的统计分析来评估各类二十烷酸代谢物的诊断测试性能和区分NAFL与NASH的能力。
肝病进展风险提高用AUROC值测定，所述AUROC值约至少0.8，约至少0.9，约至少0.95，约至少0.96，约至少0.97，约至少0.98，约至少0.99或1.0。
本发明的各方面将在下面的实施例中进一步阐释。但本发明的范围不受这些实施例的限定，而是由所附的权利要求书定义。
实施例1
队列人口统计学
本研究中包括19名患NAFLD的患者(10个NAFL病例和9个NASH病例)和10名非-NAFLD的正常对照。详细的基础特征记载在表1中，包括人口统计学、身高体重指数、生化测试、脂质谱分析、针对对照的MRI-PDFF和针对患NAFLD的患者的肝活组织检查数据。非-NAFLD对照更为年轻，BMI较低，血清ALT、AST、GGT、葡萄糖和胰岛素水平均较低，如所期望的那样。除了血浆甘油三酯在患NASH的患者中稍高以外，例行的肝脏相关的代谢测试不能显著区分NAFL和NASH(表1)。与患NAFL的患者相比，患NASH的患者具有更严重的肝脏组织学，且具有更大程度的脂肪变性、气球样变性、小叶炎症和纤维变性。
实施例2
PUFA和代谢物脂质组学谱分析
目前，还没有以充分的特异性将NASH与其他脂肪肝状态区分开的非侵入性生物标记物。肝活组织检查仍是用于可靠鉴别NAFL和NASH的基准，但该过程是侵入性的，并带有一定的风险。因此，临床界非常需要开发出非侵入性的能够准确表征和分级NAFLD的方案，因为这为治疗可选项和预后提供有价值的信息。炎症和氧化应激促进疾病从具有相对良性结局的脂肪变性进展为有肝硬化和肝细胞癌风险的NASH。在此，液相色谱和质谱用于分析和定量循环中的生物活性脂质和脂质过氧化产物，所述生物活性脂质和脂质过氧化产物是NASH患者肝脏发炎的特征。
在清楚表征的疑似患有NAFL或NASH并根据其肝活组织检查评分进行分级的患者队列中建立了完整的类二十烷酸谱，并估计了源自于花生四烯酸(20:4ω6)和相关的多不饱和脂肪酸(PUFA)的游离类二十烷酸的血浆水平(表1)，所述多不饱和脂肪酸(PUFA)包括亚油酸(18:2ω6)、α-亚麻酸(18:3ω3)、二高-γ-亚麻酸(20:3ω6)、二十碳五烯酸(20:5ω3)和二十二碳六烯酸(22:6ω3)。最初的类二十烷酸谱由我们的分析平台可以可靠测量的158个单独的代谢物组成。其中，26个类二十烷酸以可测水平存在于对照、NAFL或NASH血浆样品中(表2)。这些介质(mediator)通过复杂的生物合成机制和多个修饰和降解途径产生(27)。如图1和2所示，源自于所有3个主要酶促途径的类二十烷酸以不同水平存在于对照、NAFL和NASH样品中，所述3个主要酶促途径是环氧合酶途径(COX-1和COX-2)、脂肪氧合酶途径(5-LOX、12-LOX和15-LOX)和细胞色素P450(CYP)途径。源自于COX的凝血烷B2(TXB2)和12-羟基-庚三烯酸(12HHTrE)——人血小板中的凝血烷合成酶产生的主要AA代谢物之一——在对照样品中检测到低水平，但在NAFL和NASH样品中均明显更高；然而，在NAFL和NASH之间没有看到显著性差异。与此相对，***素E2(PGE2)仅在NASH样品中升高，而在对照和NAFL之间没有看到差异(图1)。在任何样品中都没有测到***素D2(PGD2)，但降解产物13,14-二氢-15-酮PGD2(dhk PGD2)在NASH中明显高于在NAFL(p值<0.0011)或对照(p值<0.0002)中(图1)。
源自于LOX的代谢物在NAFLD中也升高。值得注意的是，尽管5-LOX、12/15LOX途径的源自于AA的产物似乎在NAFL中最高(图1)，但源自于包括亚油酸、α-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、EPA和DHA在内的相关PUFAS的代谢物通常在NASH中较高(图2)。相似地，相对于健康对照，CPY途径的源自于AA的代谢物在NASH中显著升高，但在NAFL中却没发生变化(图1和2)。特别是，相对于NAFL或对照，11,12-二羟基-二十碳三烯酸(11,12-diHETrE)和14,15-二羟基-二十碳三烯酸(14,15-diHETrE)在NASH中显著升高。这些代谢物是由水溶性的环氧化物水解酶(sEH)作用于环氧二十碳三烯酸产生的，所述环氧二十碳三烯酸是CYP环氧化酶(epoxygenase)途径作用于初始底物AA产生的主要产物。许多生物作用均归因于环氧二十碳三烯酸，包括心肌保护性血管舒张、白细胞抗迁移性和抗炎作用。通过sEH将环氧化物转化为其对应的二醇降低了其功能水平，因此降低了相关的健康作用。相似地，据报道，20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)具有重要的血管活性，所述20-羟基二十碳四烯酸是通过CYP羟化酶途径合成的AA代谢物。在血浆中没有测到20-HETE，但在NASH样品中发现了20-羧基花生四烯酸(20-COOH AA)持续升高，但当比较NAFL和NASH时，它在这一具体样品系列中并没有达到统计学显著性(表2)。20-HETE转化为20-COOH AA是由CYP酶催化的，这导致其生物活性降低。
实施例3
鉴定作为检测NASH的诊断工具的一组类二十烷酸
基于表2，发现9种生物标记物在评价NAFLD中是有意义的。用AUROC评价其各自的诊断测试性能，并记载在表3中。作为用于将NAFL与NASH区分开的单一生物标记物的最好候选者是11,12s diHETrE，其AUROC是1。此外，发现包括dkPGD2和20-COOH AA在内的一个系列的AUROC为1。
实施例4
方法
研究设计和参与者本研究是源自于前瞻性巢式病例对照(nested case-control)研究的横向分析法，该研究中包括3组患有经活组织检查确诊为NAFLD(包括NASH和NAFL)的独特表型的患者和正常的非-NAFLD对照。所有的参与者来自于UCSD NAFLD研究诊所并在2011年1月至2012年11月之间看过病(18-20)。所有的参与者均提供了书面知情同意书并经历了详细的标准化临床研究采访，包括药物史、饮酒和饮酒量化史(使用Audit-skinner问卷调查)、体检、身体测量、人体测量、空腹生化测试，并作了其他肝病病因的详细排除(请参见下面的选入和排除标准)。在临床研究采访的早晨收集空腹血浆样品并贮存在-80℃的冷冻机中，该冷冻机装在UCSD NAFLD转化研究单元内。
队列描述本研究中包括的所有NAFLD病例均患有经肝活组织检查确诊的NAFLD。活组织检查由并不知晓临床数据、脂质组学和成像数据的有经验的肝病医生来评分。NASHCRN组织学评分***用于对活组织检查进行评分。记录所有患者的NAFLD活性评分(NAS)以及纤维变性评分。NAS评分在0-8的范围，是脂肪变性(0-3)、小叶炎症(0-3)和肝细胞气球样变性(0-2)的程度的总和。肝脏纤维变性在0到4的范围，其中0是没有纤维变性，4是肝硬化。
NASH定义下述患者被划分为患有NASH：患有经活组织检查确诊的NAFLD，具有显著的3区(zone-3)大泡状脂肪变性和小叶炎症以及存在典型的气球样变性。
NAFLD的选入和排除标准选入标准包括：在知情同意过程中年龄至少18岁、有能力并愿意提供书面的知情同意书、最小的或没有与NAFLD相一致的饮酒史(见排除标准)和在肝活组织检查90天内收集血浆。排除标准包括临床或组织学的酒精性肝病证据：访谈之前的2年内的常规和过量饮酒被定义为男性每周饮酒超过14个饮酒单位或女性每周饮酒超过7个饮酒单位。大约10g酒精相当于一个“饮酒”单位。一个单位相当于1盎司蒸馏酒、一罐12盎司的啤酒或一瓶4盎司的葡萄酒，肝脏脂肪变性的次要病因包括以前的手术、减肥手术、全肠道外营养、短肠综合征、产生脂肪的药物治疗、特征在于血清中存在HBsAg的慢性乙肝证据、特征在于血清中存在抗HCV或HCV RNA的慢性丙肝证据、其他肝病病因证据，例如alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏、Wilson病、糖原贮积病、β脂蛋白异常症、已知的表型血色病、自体免疫肝病、或药物引起的肝脏损伤、或研究者认为可能干扰研究的伴随的严重的潜在的全身疾病。
正常对照的定义本研究的新颖之处在于包含了独特且清楚表征的非-NAFLD正常对照组。通过采用MRI-PDFF的准确肝脏脂肪定量所得到的小于5％的脂肪含量，将参与者划分为正常的非-NAFLD(18,20)。肝活组织检查对正常个体而言是不道德的。其他的非侵入性测量例如超声和计算机断层成像不准确，且缺少灵敏度，尤其在肝脂肪含量在1-10％之间时。因此，MRI-PDFF应用在本研究中，用于不存在肝脏脂肪变性的准确诊断(Noureddin etal.Hepatology(2013),58:1930)。MRI-PDFF准确性高、灵敏、重现性好且精确。
正常(非-NAFLD)对照队列的选入和排除标准健康(非-NAFLD)对照组的选入标准包括：(1)年龄大于18岁；(2)肝MRI-PDFF<5％；和(3)无已知的肝病史。排除标准包括：(1)年龄小于18岁；(2)明显的全身疾病；(3)不能进行MRI；和(4)可能患有肝病的证据，包括任何以前的肝活组织检查、阳性乙肝表面抗原、丙肝病毒RNA、或自体免疫血清、alpha-1抗胰蛋白酶缺乏、血色病遗传检测、或低的血浆铜蓝蛋白。
脂质提取在分别针对病例和对照的肝活组织检查和MRI-PDFF 90天内获得用于脂质组学谱分析的血浆样品。所有的血浆样品均储存在-80℃，一旦解冻，立即用于如前所述的游离脂肪酸和类二十烷酸分离。简而言之，在50μl血浆中掺入26种氘化内标(分别购于Cayman化学公司,Ann Arbor,MI)的混合物，并用10％甲醇使体积达到1ml。接着，通过在Strata-X柱(Phenomenex,Torrance,CA)上的固相提取来纯化样品，使用由以下步骤组成的活化过程：用3ml 100％甲醇再用3ml水连续洗涤。接着，类二十烷酸用1ml 100％甲醇洗脱，将洗脱物真空干燥并溶解在由60/40/0.02水/乙腈/乙酸＝60/40/0.02(v/v/v)组成的50μl缓冲液A中，立即用于分析，分析过程如下：对于游离脂肪酸分析，在50μl血浆中掺入氘化脂肪酸标准品，并通过采用甲醇和异辛烷的选择性提取来分离游离脂肪酸。如(Dumlao etal.(2011),1811:724)所述那样，对提取的脂肪酸进行衍生化并用气相色谱和质谱进行分析。
反相液相色谱和质谱通过液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)来分析和定量血浆中的类二十烷酸。简而言之，用反相色谱分离类二十烷酸，反相色谱使用1.7uM 2.1x100mmBEH Shield色谱柱(Waters,Milford,MA)和Acquity UPLC***(Waters,Milford,MA)。色谱柱用缓冲液A平衡，5μl样品用自动取样器注入。用以100％缓冲液A起始的步进梯度洗脱样品1分钟，接着用50％缓冲液B(由50％乙腈、50异丙醇和0.02％乙酸组成)洗脱3分钟，接下来用100％缓冲液B洗脱1分钟。液相色谱与lonDrive Turbo V离子源相连，用三级四极ABSCIEX 6500QTrap质谱仪(AB SCIEX,Framingham,MA)进行质谱分析。使用阴离子模式和使用最丰富和最特定的前体离子/产物离子转换的多反应监测(MRM)的电喷射离子化测量类二十烷酸，以建立能够检测158个分析物和26个内标的获得方法。离子喷雾电压在温度550℃下设为以氮气作为碰撞气体实现了类二十烷酸前体离子的碰撞活化，且对各个代谢物优化了去簇电压、入口电压和碰撞能。通过将类二十烷酸的MRM信号和色谱保留时间与纯的标准品匹配来鉴定所述类二十烷酸。
脂质定量类二十烷酸和游离脂肪酸通过稳定的同位素稀释法进行定量。简而言之，将相同量的氘化内标加到每个样品中和用于制作标准曲线的所有基准标准中。为了计算样品中类二十烷酸和游离脂肪酸的量，计算内源性代谢物与匹配的氘化内标之间的峰面积的比率。通过对相同条件下获得的标准曲线进行线性回归分析，将比率转换为绝对量。
统计分析卡方(x2)检验用于类别变量之间的比较，t-检验用于连续变量之间的比较。我们检测了正常对照、经活组织检查确诊为轻度NAFL的患者和经活组织检查确诊为NASH的患者之间的血浆类二十烷酸谱的差别。最后，我们检测了产生显著性差异的9个生物标记物作为将NAFL与NASH区分开的生物标记物的诊断准确性。认为双尾检验的p值0.05有统计学意义。使用SAS统计软件包版本9.4(Cary，NC,SAS Inc.)进行统计分析。

Claims (8)

1.从血液、血浆或血清样品测定的dhk PGD2、20-COOH Aa或11,12-diHETrE的水平或其任意组合在制备用于体外诊断非酒精性脂肪性肝炎区分于非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病的诊断工具中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述dhk PGD2、20-COOH Aa或11,12-diHETrE的水平或其任意组合与其他的类二十烷酸和相关化合物的水平相组合。
3.根据权利要求1所述的用途，其中dhk PGD2、20-COOH AA或11,12-diHETrE的水平或其任意组合是由从血浆样品提取的脂质测定的。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合是dhk PGD2和20-COOH AA。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述诊断工具被表示为受试者工作特征曲线下面积AUROC的值。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述AUROC的值为约至少0.8。
7.根据权利要求5所述的用途，其中所述AUROC的值为约至少0.9。
8.根据权利要求5所述的用途，其中所述AUROC的值为约至少0.99。
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