CN1283693A - 具有造血刺激和免疫调节作用的细胞因子cklf－h1a及其变异体cklf－h1b - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个新的细胞因子CKLF－H1A及其变异体CKLF－H1B。本发明公开了CKLF－H1A、B的核酸序列与氨基酸序列,本发明涉及携带CKLF－H1A、B核酸序列的载体,表达CKLF－H1A、B的宿主细胞,用基因工程技术生产CKLF－H1A、B多肽的方法。本发明还涉及含有CKLF－H1A、B的药物组合物,CKLF－H1A、B的抗体、拮抗剂及激活剂。由于CKLF－H1A、B具有造血刺激活性和免疫调节作用,因而细胞因子CKLF－H1A、B治疗造血***和免疫***疾病方面具有重要意义。

Description

具有造血刺激和免疫调节作用的细胞因子CKLF-H1A及其变异体CKLF-H1B

本发明涉及生物工程领域，具体地说是一个新的细胞因子CKLF-H1A及其变异体CKLF-H1B的核酸编码序列与氨基酸序列，携带CKLF-H1A、B核酸序列的载体，表达CKLF-H1A、B的宿主细胞，含有CKLF-H1A、B的药物组合物，CKLF-H1A、B的抗体及拮抗剂，以及细胞因子CKLF-H1A、B在制备治疗造血***疾病和免疫***疾病的药物组合物中的用途。

细胞因子是由机体内细胞合成并分泌的、参与多种细胞的增殖分化，在机体的生理和病理过程中发挥重要作用的小分子多肽的总称。细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。细胞因子具有等多种生理功能：它们可以调节机体的免疫功能，参与刺激造血干细胞的增殖与分化，促进血管内皮细胞增殖和新生血管生成、在抗肿瘤和抗微生物感染方面也具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，人们对细胞因子及其受体的结构功能，细胞因子的信号传导和表达调控有了更深入的了解，利用基因工程技术生产重组的细胞因子或其拮抗剂已经作为药物用于临床，并取得良好疗效。例如髓样造血祖细胞抑制因子(MPIF-1)作为造血保护剂被用于肿瘤的大剂量放、化疗中，有望成为新一代的生物工程药物(Marshall A，HGS Launches“first”genomics product in clinic.NatBiotechnol 1998，16：129)。这提示细胞因子在肿瘤、造血功能障碍性疾病、自身免疫性疾病等疑难病症的治疗中具有广阔的应用前景。

细胞因子CKLF-H1A、B(Chemokine Like Factor Homologue 1A、B，简称CKLF-H1A、B)的基因是本发明人通过分析表达序列标签(EST)发现的，该基因与已知基因的核苷酸序列无明显的同源性。本发明人在原核和真核细胞中成功地表达了该多核苷酸编码的的CKLF-H1A、B多肽。

本发明的第一个目的是提供编码细胞因子CKLF-H1A、B的多核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供带有CKLF-H1A、B核酸序列的载体。

本发明的第三个目的是提供经携带CKLF-H1A、B核酸序列的载体转染、转化或转导过的宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供用基因工程手段生产CKLF-H1A、B成熟多肽的方法。

本发明的第五个目的是提供细胞因子CKLF-H1A、B的氨基酸序列。

本发明的第六个目的是提供含有CKLF-H1A、B的药物组合物。

本发明的第七个目的是提供CKLF-H1A、B的单克隆或多克隆抗体。

本发明的第八个目的是提供CKLF-H1A、B的拮抗剂。

本发明的第九个目的是提供CKLF-H1A、B的激活剂

本发明的第十个目的是提供CKLF-H1A、B在制备具有造血刺激活性和免疫调节作用的药物组合物中的用途。

本发明是通过如下的技术方案实现的。本发明人通过抑制性递减杂交技术(SSH)发现了趋化素样因子(CKLF-1)的基因(详见中国专利99107284.7)。发明人进而以CKLF-1的核苷酸序列为基础，通过EST Assembly machine(网址为http：//www.tigenm.it)进行表达序列标签(Expression Sequence Tag，简称EST)分析，得到了全长700bp的cDNA序列，通过设计特异性上游引物P1(5’-GCG ATC CAA AGA GCG CGT -3’)和下游引物P2(5’-TCT CGA TAA AAGCAG CAG CCC-3’)从正常人的cDNA文库中扩增，分离并克隆出细胞因子CKLF-H1A、B的基因(Chemokine Like Factor Homologue 1A、B，以下简称CKLF-H1A、B)。经检索，CKLF-H1的核苷酸序列是新序列。

根据本发明的第一个方面，本发明公开了CKLF-H1A的和CKLF-H1B的核酸序列。CKLF-H1A与CKLF-H1B分别编码具有149个氨基酸(Aa)和94个氨基酸(Aa)的成熟多肽，分别如SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：4所示。SEQ ID NO：1编码的成熟多肽具有菌种保藏号CGMCC NO.0456.1中的DNA所表达的氨基酸序列；SEQ ID NO：3编码的成熟多肽具有菌种保藏号CGMCC NO.0456.2中的DNA所表达的氨基酸序列。

CKLF-H1A的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，它全长603个核苷酸，编码序列为第1-450位核苷酸。CKLF-H1B的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，全长587个核苷酸，编码序列为第1-285位核苷酸。除缺失16个核苷酸外，CKLF-H1B的其它序列(SEQ ID NO：3)与CKLF-H1A的序列(SEQ ID NO：1)完全相同，缺失的16个核苷酸相当于SEQ ID NO：1的第280-295位，缺失的出现导致SEQ ID NO：3中提前出现终止密码子，二者编码的蛋白产物相应产生差异。因此，SEQ ID NO：3是SEQ ID NO：1的特殊形式，差别的产生可能是同一组织中不同的剪切过程造成的。

本发明所述的核酸序列可以是DNA或是RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。

所述细胞因子CKLF-H1A、B的核酸序列最好是以分离形式提供的，分离的核酸序列可以只包括成熟多肽的编码序列，也可以包括成熟多肽的编码序列和附加编码序列，还可以包括成熟多肽的编码序列和非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。CKLF-H1A、B的编码序列可以完全相同于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的编码序列，或相同于保藏号为CGMCCNO：0456.1的菌株(菌种保藏证明中的菌株称号为CKLF-H1(12)，对应于CKLF-H1A)或保藏号为CGMCC NO：0456.2的菌株(菌种保藏证明中的菌株称号为CKLF-H1(18)，对应于CKLF-H1B)中重组体携带的编码序列。此外由于遗传密码的简并性，它可以不同于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的序列，或者保藏物所携带的编码序列。

本发明进一步涉及编码与SEQ ID NO：2所示之多肽、或者与保藏菌株CGMCCNO.0456.1携带的重组体编码之多肽具有相同氨基酸序列的核酸片段、类似物及衍生物、及上述多核苷酸的变异体。多核苷酸的变异体可以是天然存在的等位基因变异体、mRNA不同剪切变异体或非天然存在的变异体。变异体也可以是编码与SEQ ID NO：2所示多肽有相同或相似生物学活性的多肽的缺失变异体、取代变异体及加入(***)变异体。所说的等位变异体可以带有核苷酸取代、***或加入，但实质上没有改变所编码之多肽的功能的多核苷酸的可替代形式。本发明的CKLF-H1B(SEQ ID NO：3)即属于此类变异体。由这些变异的核苷酸编码的CKLF-H1A变异体可以在功能上与本发明的CKLF-H1A相同、相似或不同。

可以使用本发明全长基因的小片段做为cDNA文库的杂交探针，以从cDNA文库分离全长度基因及其与本发明的CKLF-H1A、B基因有高度序列同源性的核苷酸序列。这些探针一般至少有30个碱基，也可含有多达50个以上的碱基。可以用这些探针鉴定相当于全长度转导物和含有完整基因之基因组克隆的cDNA克隆。方法包括根据已知DNA序列合成寡核苷酸探针，并在杂交条件下使用含有与本发明的基因互补之DNA序列的标记的寡核苷酸与人cDNA基因组DNA或RNA库杂交，从中分离出文库中与探针杂交所需要的核苷酸序列。

本发明还涉及与CKLF-H1A、B的基因序列至少有70％，较好90％，最好95％同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与上述CKLF-H1A、B基因杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”意指发生杂交的前提是序列间至少具备95％的同源性。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括CKLF-H1A、B核酸序列的等位基因变异体、也可以包括CKLFH1核酸序列中碱基的缺失、***及置换。这样的序列编码的多肽可以在功能上与本发明的CKLF-H1A、B相同、相似、或不同，但最好是编码与CKLF-H1A、B生物学活性基本相同的多肽。

根据本发明的第二个方面，本发明公开了携带上述多核苷酸的载体，可将所说的多核苷酸***到各种用于表达该多肽的适当表达载体中。这样的载体包括染色体、非染色体来源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、噬菌体(由质粒和噬菌体DNA组合体衍生的载体)、以及病毒(如杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)DNA，条件是这些载体能够在所选择的宿主细胞中复制并存活。

可用各种已知的方法将适当的DNA序列***到载体的适当限制性核酸内切酶位点中。***到表达载体中的DNA序列被可操作地连接到适当的表达控制序列即启动子，以指导mRNA合成。这样的启动子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40启动子，大肠杆菌1ac或trp启动子、噬菌体λPL启动子及在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。

此外，表达载体可含有启动翻译的核糖体结合位点及转录终止子，并含有一个或多个选择标志基因，以提供被转化之宿主细胞的可选择表型特征，如适用于真核细胞的新霉素抗性或二氢叶酸还原酶基因，或适用于大肠杆菌中的氨苄青霉素或四环素抗性基因。

必要时，为了提高编码本发明多肽的DNA在高等真核细胞中的转录效率，可在载体中***增强子序列。增强子一般是约含10-300个碱基对并作用于启动子以增强DNA转录的顺式作用元件。另外，必要时也可在启动子和下游结构序列之间***一个能指导翻译产物向周质或细胞外培养基中分泌的前导序列(分泌信号)。或者，可根据需要导入编码融合蛋白质的异源DNA序列，所说的融合蛋白可包括一个赋予所需特征，如用于稳定被表达之产物的或简化其纯化步骤的N未端识别肽。

具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。

总之，本发明涉及包括CKLF-HIA和CKLF-HIB核酸序列的重组体，重组体包括正向或反向***了本发明所述核酸序列的各种载体，如质粒、病毒颗粒或噬菌体，并且在所说的多核苷酸序列的上游可操作地连接了适当的调节序列如启动子序列和增强子序列。哺乳动物表达载体可含有复制原点、转录终止序列，及5’侧翼非编码序列。可使用衍生于SV40的剪切和聚腺苷酸化位点的DNA序列来提供必要的遗传元件。

根据本发明的第三个方面，本发明提供了经携带本发明多核苷酸的克隆载体或表达载体转导、转化或转染适当的宿主细胞，本领域已知的方法包括氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的CKLF-H1A、B基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。

可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的多核苷酸，可提到的适当宿主的例子有：细菌细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；低等真核细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；高等真核细胞如哺乳动物细胞如CHO、COS细胞。哺乳动物表达***的例子包括人细胞系，如Hela、293和U937细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。

本发明第四个方面公开了用DNA重组技术生产本发明具有免疫调节活性和造血细胞刺激活性的多肽的方法。在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养之。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CKLF-H1A、B及其变异体多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生多肽产物。也可使用常规的肽合成仪化学合成本发明的多肽。或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译***中产生所需的蛋白质。

根据本发明的第五个方面，本发明提供了CKLF-H1A、B成熟多肽的氨基酸序列，CKLF-H1A、B具有不同形式的成熟多肽，如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4分别具有149个Aa和94个Aa。

利用RT-PCR技术检测CKLF-H1A、B在不同组织的表达，发现CKLF-H1A、B有特殊的表达谱，在多种细胞中均有低丰度表达，但在人睾丸文库中特异高表达，并有不同的变异体形式，如CKLF-H1B。对变异体基因的克隆和序列分析证明它编码94个氨基酸，命名为CKLF-HB，这种变异体很可能是CKLF-H1A基因的不同剪切形式。

氨基酸序列分析表明CKLF-H1A、B与其它已知细胞因子没有同源性。用Prosite计算机软件分析推测的氨基酸序列，没有发现明显的穿膜区序列，没有DNA结合位点及N-糖基化位点。SignalP V2.0软件分析证明CKLF-H1A的N端的22-23位氨基酸含天然信号肽切割位点。真核细胞表达上清液的活性分析证明CKLF-H1A、B蛋白可以分泌到细胞外，属于分泌性蛋白。SEQ ID NO：2的氨基酸结构中含Cys-Cys(简称CC结构)的结构特征，而SEQ ID NO：4则不具备CC结构。

本发明还涉及与CKLF-H1A、B具有相同或相似的生物学活性多肽片段。本发明的多肽可以是天然产生、化学合成、或用DNA重组技术由原核或真核细胞产生的。优选重组产生的多肽。

根据本发明的第六个方面，本发明的CKLF-H1A、B及其活性成分可以与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂相混合以制备药物组合物。可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成多种剂型，例如溶液剂、脂质体包裹剂、微胶囊剂及其他缓释制剂。载体或赋形剂的例子包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合。可根据需要在组合物中添加辅助成：例如与本发明CKLF-H1A、B有协同作用的化合物；又如人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸(如甘氨酸或赖氨酸)和金属阳离子(如Zn²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺和Ca²⁺)等蛋白保护剂；聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽等稳定剂；蛋白酶抑制剂及自由基清除剂；以及在粘膜或皮肤局部给药的情况下，添加二甲基亚砜或月桂氮卓酮等皮肤渗透剂。

为了使用上的方便和便于维持组合物各成分特别基本活性成分的生物学活性，可将本发明的药物组合特制作成药盒的包装形式，这样的药盒可包括一个或多个装有本发明药物组合物之一种或多种成分的容器，并在每个容器上按政府制药管理机构指定的形式注明有关药物的使用或销售的批号及相关信息。

可通过常规途径，特别是胃肠道外途径使用本发明给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几微克到几毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量应根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状况给药方式等因素由临床医生来确定。

也可以根据本发明在体内表达本发明的多肽，即以所谓的“基因治疗”方法使用这些多肽。例如，可以用编码本发明多肽的多核苷酸于体外基因工程化处理病人的细胞，然后再将工程化改造的细胞导入欲用所说的多肽治疗的病人体内。例如可使用含有编码本发明多肽的RNA反转录病毒颗粒来转染并工程化改造所说的在体内表达本发明多肽的细胞。可按已知方法将产生含有编码本发明多肽之反转录病毒颗粒的生产细胞投用于病人体内，以在体内对细胞进行基因工程化改造并在体内表达所说的多肽。

上述这些方法以及用于这些方法的反转录病毒、包含在载体内的适当的启动子、包括启动子和处于适当启动子控制下之多核苷酸编码序列的载体、用于转染包装细胞系以形成生产细胞系的逆转录病毒质粒载体，以及适当的可被转染的包装细胞都是基因治疗领域中已知的。

可借助各种已知的方法用携带本发明多肽之核酸编码序列的载体体外或体内转染包装细胞或靶细胞。这些方法包括但不只限于电穿孔、微粒轰击(例如使用Biolistic装置)、脂质体转染法，以及确磷酸钙沉淀法或这些方法的联合使用。另外，也可以将反转录病毒载体包裹在脂质体中，或者偶联到脂质体上，然后再运送到宿主体的适当靶细胞内。

总之，可由生产细胞系产生包含本发明多肽之核酸编码序列的感染性反转录病毒载体颗粒，然后使用这样的载体颗粒于体外或体内转导宿主真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码所说多肽的核酸序列。可被转的真核细胞包括但不只限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞和成人癌细胞，以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、***、上皮细胞及表皮细胞。

本发明还涉及使用本发明的多核苷酸作为诊断试剂，检测突变形式的基因以诊断因体内CKLF-H1A、B表达不足或表达过量所导致的疾病或病理状态。

可用各种技术在DNA水平上检测携带CKLF-H1A、B基因突变的个体。可从病人的体液中，如血液、尿液、唾液或活体或尸检材料中得到用于诊断试验的核酸。可以使用基因DNA或RNA直接进行检测，也可以使用PCR方法(Saiki etal.，Nature 324：163-166，1986)扩增DNA后再进行检测。例如，可使用与编码本发明多肽的核酸互补的PCR引物鉴定和分析待检材料中相应基因的突变，如可与正常基因型相比较并根据扩增产物的大小改变来确定待检基因的缺失或***。可将扩增的DNA与放射标记的CKLF-H1A、B及其变异体RNA或反义DNA序列杂交，以鉴定点突变。

可用直接DNA测序法分析参考基因和突变基因之间的序列差异。另外，也可利用克隆的DNA片段作为探针并结合PCR方法，以高敏感性和特异性来检测特定的DNA片段，例如可联合使用测序引物和由扩增的PCR产物产生的单链PCR产物或单链模板分子。

可以在含有或不含变性剂的凝胶，特别是高分辨率凝胶中检测DNA的电泳迁移率来完成基于DNA序列差异的遗传学试验。可在变性甲酰胺梯度凝胶上区分不同序列的DNA片段(如参见Myers et al.，Science 230：1242，1985)。另外，也可用核酸酶保护检测法或化学裂解法(如参见Cotton et al.，PNAS，USA，85：4397-4401，1985)揭示特定部位的序列改变。

本发明还涉及检测各种组织中CKLF-H1A、B及其变异体蛋白质水平改变的诊断试验法。用于检测得自宿主体内之样品中的CKLF-H1A、B及其变异体蛋白质水平的检测法是本领域技术人员已知的，并包括放射免疫法、竞争性结合法、Western印迹分析法及酶联免疫吸附法(ELISA)。其中优选的方法是ELISA法。

本发明的多核苷酸序列对于染色体鉴定也是有价值的。该序列可特异地定位于个别人染色体的特定位置并可与之杂交。按照本发明，对本明的DNA进行染色体作图将这些序列与疾病相关基因联系起来的第一个重要步骤。

可从cDNA制备PCR引物以进行序列的染色体作图。对基因的3’翻译区进行计算机分析，以迅速选择出跨越基因组DNA中一个以上外显子并从而加入扩增过程中的引物。然后使用这些引物以PCR法筛选含有个别人染色体的体细胞杂种。只有那些含有对应于引物之人类基因的杂种才产生扩增的片段。对体细胞杂种进行PCR作图是一种指定特定DNA在特定染色体上的位置的便利方法。在按照本发明使用同样的寡核苷酸引物的情况下，可用一组得自特定染色体的片段或大的基因组克隆群体按相似方法完成亚定位。然后再用萤光原位杂交法(FISH)对cDNA克隆进行精确的染色体定位(参见Verma et al.，Humanchromosomes：A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NY(1988))。

一旦完成了序列的精确染色体定位作图，即可将该序列的物理位置与遗传图数据联系起来。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)来鉴定作图定位于同一染色体区域上的基因与疾病之间的关系。然后，可确定受损或未受损个体间的cDNA或基因组DNA的差异。如果在某些或全部受损个体中观察到突变，而正常个体中没有观察到这种突变，则该突变便很可能是致病因素。

根据本发明的第七个方面，可以用本发明的CKLF-H1A、B多肽及其片段、类似物或衍生物作为免疫原制备相应的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体，可以是嵌合的、单链的或人源化抗体及其Fab片段。可以用杂交瘤技术生产人单克隆抗体，可以用转基因小鼠制备人源化抗体。

根据本发明的第八个方面，本发明涉及可以阻断或封闭细胞因子CKLF-H1A、B活性的CKLF-H1A、B拮抗剂。拮抗剂可以与一或多种药学上可接受的载体、赋形剂或辅料结合形成药物组合物。

根据本发明的第九个方面，本发明涉及可以活化细胞因子CKLF-H1A、B活性的CKLF-H1A、B激活剂。激活剂可以与一或多种药学上可接受的载体、赋形剂或辅料结合形成药物组合物。

根据本发明的第十个方面，本发明公开了细胞因子CKLF-H1A、B在制备治疗造血***和免疫***疾病的药物组合物中的用途。生物学活性实验表明本发明的CKLF-H1A、B多肽作为一种分泌性小分子物质，对人和小鼠骨髓细胞有明显促增殖作用，对小鼠胸腺和脾细胞也有明显刺激作用，详见实施例六。

检索表明，细胞因子CKLF-H1A、B的核苷酸编码序列是一段新序列。CKLF-H1A、B在氨基酸水平与已知的细胞因子没有同源性，与CKLF1有20％的同源性。实验证明细胞因子CKLF-H1A、B可以促进小鼠骨髓、胸腺和脾细胞及人骨髓细胞的增殖，CKLF-H1A、B的真核细胞表达蛋白没有表现出趋化作用，而具有类似功能的趋化素样因子CKLF1具有广谱的趋化活性。由于趋化作用往往引发炎症反应，因而CKLF-H1A、B更具临床实用价值，有望在造血***和免疫***疾病的治疗中发挥重大作用。

为了更清楚地理解本发明的实质，现参照下列附图和实施例对其进行解释，附图和实施例的目的只是为了解释而不以任何方式限制本发明。

附图简述

图1是原核表达载体pMTY4-CKLF-H1A、B的构建示意图。

图2是CKLF-H1A在原核细胞中表达的结果。

图3是真核表达载体pcDI-CKLF-H1A、B的构建示意图。

图4显示了CKLF-H1A原核表达蛋白对小鼠骨髓细胞的增殖作用。

图5显示了CKLF-H1A、B的转染上清对胎儿骨髓细胞的增殖作用。

图6显示了CKLF-H1A、B转染上清对小鼠胸腺细胞的促增殖作用。

图7显示了CKLF-H1A、B的转染上清对小鼠脾细胞的增殖作用。

图8显示了CKLF-H1A、B在成人正常组织中的表达。

实施例

实施例一、CKLF-H1A、B全长cDNA克隆化

1．生物信息分析：利用CKLF-1序列对人的表达序列标签(ExpressionSequence Tag，简称EST)进行数据检索和同源性比较，发现了19个有低同源性的人EST序列，通过EST Assembly machine(网址为http：//www.tigenm.it)进行EST拼接，形成重叠群(contig)再次进行BLAST拼接，找到完整的编码框架。

CKLF-H1A、B全长cDNA克隆化：引物设计：根据EST拼接得到的CKLF-H1A、B全长cDNA序列，设计特异的引物如下：上游引物P1：5’-GCG ATC CAA AGA GCGCGT-3’，下游引物P2：5’-TCT CGA TAA AAG CAG CAG CCC-3’PCR扩增：用人的睾丸单链cDNA文库为模板进行PCR扩增。PCR产物经TAE配制的琼脂糖凝胶电泳分离后，切下PCR条带，加3倍体积的NaI(6M)45℃-55℃洗脱，加玻璃珠混悬溶液10μl，短暂离心沉淀玻璃珠-DNA复合物，用洗液洗3次，加H2O 45℃2-50℃洗脱DNA。

PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体：PGEM-Teasy载体，购于Promega公司。将纯化的PCR产物连接到pGEM-Teasy载体，连接产物转化XL-1 Blue菌，用蓝白斑颜色反应筛选阳性克隆。

质粒的提取和纯化：测序质粒用Qiagen公司的Tip-20 Mini-preparation试剂盒进行纯化，测序试剂盒购自Pharmacia公司，依照公司提供的说明书(详见Standard Annealing of Primer to Double-Strand Template)利用ALFExpress II DNA序列分析仪进行序列测定。

结果：利用CKLF-1序列对人EST数据库检索拼接得到CKLF-H1A、B全长700bp的人cDNA序列。经RT-PCR扩增其编码区和序列分析，发现其编码部分为新序列，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。SEQ ID NO：3(全长587个核苷酸)比SEQ ID NO：1(全长603个核苷酸)少16个核苷酸，它是SEQ ID NO：1的特殊形式。经检索CKLF-H1A、B的起始子ATG周边序列基本符合Kozak规律(GCGATGG)，除16个核苷酸的差异外，SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1的序列完全相同。这种差别可能是同一组织中不同的剪切过程形成的。

SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：3分别编码具有149个氨基酸(Aa)和94个氨基酸(Aa)的成熟多肽，分别如SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：4所示。氨基酸序列进行分析表明CKLF-H1A、B与其它已知细胞因子没有同源性。用Prosite计算机软件分析推测的氨基酸序列，没有发现明显的穿膜区序列，没有DNA结合位点及N-糖基化位点。SignalP V2.0软件分析证明CKLF-H1A的N端22-23位氨基酸含天然信号肽切割位点。SEQ ID NO：2的氨基酸结构中含Cys-Cys(简称C(结构)的结构特征，而SEQ ID NO：4则不具备CC结构。

实施例二、原核表达载体的构建

如图1所示，挑选正向***的pGEM-T-CKLF-H1A、B质粒，用CKLF-H1A、B的上、下游引物扩增CKLF-H1A、B片段，扩增条件同前。用于扩增SEQ ID NO：1。先用K1enow片段去除PCR产物3’端多余的腺嘌呤“A”，再用NotI酶切，回收纯化后克隆入经StuI-NotI酶切的pMTY4载体(由本室构建)中，构建的质粒pMTY4-CKLF-H1A、B能够在大肠杆菌中诱导表达MS2与CKLF-H1A、B的融合蛋白，两者间由带凝血酶切点的多肽连接。pMTY4-CKLF-H1A、B经EcoR I酶切释放出CKLF-H1A、B片段，同上所述进行序列测定，测序结果完全正确。

实施例三、CKLF-H1A在原核细胞中的表达

大肠杆菌pop2136(C1857 endA，thi，hsdR)为C600衍生菌，编码温度敏感的λ阻遏蛋白，购自德国宝灵曼公司。pMTY4-CKLF-H1A在pop2136菌株中30℃正常培养，42℃诱导表达。离心收获诱导菌，用约1/10原体积的超声缓冲液重悬细菌，超声裂解细菌，融合蛋白MS2-CKLF-H1A以包涵体形式表达，离心收获包涵体。包涵体在8M尿素，14mM β-ME，50M Tris-HCl(pH8.0)中37℃变性30分钟。按1∶10稀释复性，4℃过夜，复性同时进行凝血酶切。利用肝素亲和层析柱进行蛋白质纯化。

如图2所示，融合蛋白表达载体pMTY4-CKLF-H1A的融合蛋白MS2-CKLF-H1A在大肠杆菌中得到高效表达，表达量占菌体蛋白的20％，蛋白经变性复性凝血酶切肝素亲和层析柱纯化，纯度可达90％以上(图2)。

实施例四、真核表达质粒的构建

质粒pCI购自Promega公司，pcDNA3购自Invitrogen公司，质粒pcDI为本室构建，是将pcDNA3的BglI-KpnI片段与pCI的Be1I-KpnI片段置换后得到的一个真核表达载体。如图3所示，用EcoR I酶切释放出CKLF-H1A、B片段，将之连接至经EcoR I酶切后并用CIP处理后的pCDI载体中，构建了pCDI-CKLF-H1A、B载体(图3)。

实施例五、CKLF-H1A、B转入真核细胞

293是人胚肾细胞，COS-7是SV40转化的绿猴肾细胞，细胞培养于含10％胎牛血清的RPM1 1640培养基中。

转染实验：利用SuperFect(Qiagen公司)高效转染试剂，将纯化的pCDI，pCDI-CKLF-H1A、B质粒转染COS-7细胞，在六孔板中以1×10⁵/1．5ml培养基种植细胞。37℃ CO₂培养箱中培养18-24小时，取2.0μg质粒加至100μl 1640培养基中，取10μl SuperFect转染试剂，加入DNA混合液中，混匀。取600μl完全1640，加入转染反应混合物中。将上述混合物加到细胞中，培养2-3小时。吸出转染反应混合物。加入完全1640 1.5ml，37℃，5％CO₂培养48-72小时。

稳定表达克隆的获得：稳定表达克隆是在质粒转染293细胞后72小时，在培养基中加入G418，G418含量从低浓度逐渐升至高浓度，至500μg/ml，两周后长出细胞克隆。

六、CKLF-H1A、B对细胞的增殖作用

1．CKLF-H1A、B对小鼠骨髓细胞的促增殖作用

将溶解红细胞后的小鼠骨髓细胞铺到96孔细胞培养板中，阴性对照组加10μl正常培养72小时的COS-7细胞上清，实验组各加CKLF-H1A、B和pCDI相应量的原浓度转染上清，每组各做6个复孔，37℃，5％CO₂培养2周后，在培养孔中加入10μl 10mg/ml的MTT，细胞继续培养6小时后加入裂解液后过夜。第二天用酶标仪测定570nm波长的光吸收值。结果发现(图4)CKLF-H1A、B转染上清能明显促进小鼠骨髓细胞的增殖，pCDI对照无明显作用。

2．CKLF-H1A、B对人低密度骨髓细胞的促增殖作用

将分离纯化后的低密度骨髓细胞调整为2×10⁶/ml，取90μl铺到96孔细胞培养板，阴性对照组加10μl正常培养的293细胞上清，实验组加10μl 293细胞转染上清，37℃5％CO₂培养2周在培养孔中加入10μl 10mg/ml的MTT，6小时后加入裂解液过夜，第二天测570nm波长的光吸收值。结果发现CKLF-H1A、B能明显促进人胎儿骨髓细胞的增殖(图5)

3．CKLF-H1A、B对小鼠胸腺细胞及脾细胞的作用检测

取正常BALB/C小鼠20g，分别取脾、胸腺，得到小鼠胸腺和脾细胞，调整浓度为2×10⁶/ml，取90μl铺到96孔细胞培养板，阴性对照组加10μl正常培养的293细胞培养上清或10μl Tris-HCl(50mM pH8.0)；阳性组各加相应量的转染上清，pCDI空载体，pCDI-CKLF-H1A，pCDI-CKLF-H1B及纯化的原核表达蛋白pMTY-CKLF-H1A，37℃5％CO₂培养2周，在培养液中加10μl 10mg/mlMTT，细胞继续培养6小时后加入裂解液后过夜，第二天用酶标仪测定570波长的光吸收值。结果发现，CKLF-H1A、B能促进小鼠胸腺细胞及脾细胞的增殖。(图6-7)

实施例七、CKLF-H1A、B在成人正常组织中的表达水平和剪切形式：

以Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels试剂盒提供的单链cDNA文库作模板，利用CKLF-H1A、B编码区特异性引物，进行PCR扩增，扩增条件如下，94℃2分钟，94℃，15秒，58℃15秒，72℃30秒，30个循环，72℃7分钟。结果发现，(图8)CKLF-H1A、B在多种组织中均有表达，但在睾丸中高表达。电泳结果显示CKLF-H1A、B有三种不同的剪切形式。

                     序列表一般信息

(ⅰ)申请人：***医学免疫学重点实验室、

            北京北医联合生物工程公司

(ⅱ)发明名称：具有造血刺激和免疫调节作用的细胞因子CKLF-H1A及其变异体CKLF-H1B

(ⅲ)序列数：4

(ⅳ)通讯地址：

  (A)联系人：马大龙

  (B)街道：海淀区学院路38号

  (C)城市：北京

  (D)国家：中华人民共和国

  (E)邮编：100083

(ⅴ)计算机可读形式：

  (A)介体类型：3.5英寸软盘

  (B)计算机：奔腾166MMX

  (C)操作***：WINDOWS 95

  (D)软件：WORD 97

  (ⅵ)电讯信息：

  (A)电话：86-10-62091149

  (B)电传：86-10-62091149

SEQ ID NO：1的信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：603个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO：1

      3         9        15        21        27        33        39        45｜        ｜        ｜        ｜        ｜        ｜        ｜        ｜1     ATG  TTG  AAG  ATC  CTG  AGA  CTG  AGT  CTT  ATC  TTA  GGA  GCA  TTA  GCT46     TGT  TTC  ATC  ATC  ACC  CAA  GCC  AAT  GAG  TCA  TTT  ATA  ACA  ATC  ACA91     AGT  CTG  GAA  ATC  TGC  ATT  GTC  GTT  TTT  TTT  ATT  CTA  ATA  TAT  GTG136     CTA  ACC  CTT  CAC  CAC  TTG  CTG  ACC  TAT  TTA  CAT  TGG  CCC  TTA  CTT181     GAT  CTT  ACC  AAC  AGT  ATC  ATT  ACA  GCT  GTG  TTC  CTT  TCA  GTA  GTT226     GCC  ATC  TTG  GCC  ATG  CAA  GAA  AAG  AAA  AGA  AGG  CAT  TTA  CTC  TAT271     GTC  GGG  GGG  TCC  CTG  TGT  CTC  ACA  GCG  GTA  ATC  GTG  TGT  TGC  ATC316     GAT  GCG  TTT  GTG  GTC  ACC  ACG  AAG  ATG  AGG  ACC  AAC  TTG  AAA  AGA361     TTC  CTG  GGA  GTC  GAA  GTT  GAA  AGG  AAG  CTT  TCC  CCC  GCC  AAG  GAC406     GCC  TAC  CCC  GAA  ACC  GGC  CCC  GAC  GCC  CCG  CAG  AGG  CCC  GCC  TGA451     AGC  CAG  CCC  GGC  GCC  CTA  GCA  GAT  GCA  CGT  GTC  TGT  CGA  ATC  GCT496     GCC  TCC  GAG  CCC  ACC  CCC  GAG  CTC  GCA  TGC  TGT  CAC  CCA  TTC  CAG541     CCT  AAA  TGT  GAC  CAT  AAA  ATT  AGG  GCT  GCT  GCT  TTT  ATC  GAG  AAA586     AAA  AAA  AAA  AAA  AAA  AAA

SEQ ID NO：2的信息

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：149个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO：2

              5                  10                  15|                   |                   |1 Met Leu Lys Ile Leu Arg Leu Ser Leu Ile Leu Gly Ala Leu Ala16 Cys Phe Ile Ile Thr Gln Ala Asn Glu Ser Phe Ile Thr Ile Thr31 Ser Leu Glu Ile Cys Ile Val Val Phe Phe Ile Leu Ile Tyr Val46 Leu Thr Leu His His Leu Leu Thr Tyr Leu His Trp Pro Leu Leu61 Asp Leu Thr Asn Ser Ile Ile Thr Ala Val Phe Leu Ser Val Val76 Ala Ile Leu Ala Met Gln Glu Lys Lys Arg Arg His Leu Leu Tyr91 Val Gly Gly Ser Leu Cys Leu Thr Ala Val Ile Val Cys Cys Ile106 Asp Ala Phe Val Val Thr Thr Lys Met Arg Thr Asn Leu Lys Arg121 Phe Leu Gly Val Glu Val Glu Arg Lys Leu Ser Pro Ala Lys Asp136 Ala Tyr Pro Glu Thr Gly Pro Asp Ala Pro Gln Arg Pro Ala ---

SEQ ID NO：3    的信息

(ⅰ)序列特征：

(E)  长度：587个碱基对

(F)  类型：核酸

(G)  链型：单链

(H)  拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO：3

      3         9        15        21        27        33        39        45｜        ｜        ｜        ｜        ｜        ｜        ｜        ｜1     ATG  TTG  AAG  ATC  CTG  AGA  CTG  AGT  CTT  ATC  TTA  GGA  GCA  TTA  GCT46     TGT  TTC  ATC  ATC  ACC  CAA  GCC  AAT  GAG  TCA  TTT  ATA  ACA  ATC  ACA91     AGT  CTG  GAA  ATC  TGC  ATT  GTC  GTT  TTT  TTT  ATT  CTA  ATA  TAT  GTG136     CTA  ACC  CTT  CAC  CAC  TTG  CTG  ACC  TAT  TTA  CAT  TGG  CCC  TTA  CTT181     GAT  CTT  ACC  AAC  AGT  ATC  ATT  ACA  GCT  GTG  TTC  CTT  TCA  GTA  GTT226     GCC  ATC  TTG  GCC  ATG  CAA  GAA  AAG  AAA  AGA  AGG  CAT  TTA  CTC  TAT271     GTC  GGG  GGG  CGG  TAA  TCG  TGT  GTT  GCA  TCG  ATG  CGT  TTG  TGG  TCA316     CCA  CGA  AGA  TGA  GGA  CCA  ACT  TGA  AAA  GAT  TCC  TGG  GAG  TCG  AAG361     TTG  AAA  GGA  AGC  TTT  CCC  CCG  CCA  AGG  ACG  CCT  ACC  CCG  AAA  CCG406     GCC  CCG  ACG  CCC  CGC  AGA  GGC  CCG  CCT  GAA  GCC  AGC  CCG  GCG  CCC451     TAG  CAG  ATG  CAC  GTG  TCT  GTC  GAA  TCG  CTG  CCT  CCG  AGC  CCA  CCC496     CCG  AGC  TCG  CAT  GCT  GTC  ACC  CAT  TCC  AGC  CTA  AAT  GTG  ACC  ATA541     AAA  TTA  GGG  CTG  CTG  CTT  TTA  TCG  AGA  AAA  AAA  AAA  AAA  AAA  AAA586     AA

SEQ ID NO：4的信息

(ⅰ)序列特征：

(I)  长度：94个氨基酸

(J)  类型：氨基酸

(K)  链型：单链

(L)  拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)序列描述：SEQ ID NO：4

                 5                  10                  15|                   |                   |1 Met Leu Lys Ile Leu Arg Leu Ser Leu Ile Leu Gly Ala Leu Ala16 Cys Phe Ile Ile Thr Gln Ala Asn Glu Ser Phe Ile Thr Ile Thr31 Ser Leu Glu Ile Cys Ile Val Val Phe Phe Ile Leu Ile Tyr Val46 Leu Thr Leu His His Leu Leu Thr Tyr Leu His Trp Pro Leu Leu61 Asp Leu Thr Asn Ser Ile Ile Thr Ala Val Phe Leu Ser Val Val76 Ala Ile Leu Ala Met Gln Glu Lys Lys Arg Arg His Leu Leu Tyr91 Val Gly Gly Arg

Claims (19)

1、一段分离的多核苷酸序列，所述核酸序列包含选自由以下序列组成的组的成员：

(1)一段能够编码如SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸序列；

(2)一段能够编码如SEQ ID NO：4所示多肽的多核苷酸序列；

(3)一段能够与(1)或(2)杂交，并且与它们具有至少70％同源性的多核苷酸序列；

(4)一段多核苷酸序列，该序列是(1)、(2)或(3)的核酸片段。

2、一段分离的多核苷酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下序列组成的组的成员：

(1)一段多核苷酸序列，该序列能够编码菌种保藏号CGMCC NO.0456.1中重组体表达的成熟多肽所具有的氨基酸序列；

(2)一段多核苷酸序列，该序列能够编码菌种保藏号CGMCC NO.0456.2中重组体表达的成熟多肽所具有的氨基酸序列；

(3)一段能够与(1)或(2)杂交，并且与它们具有至少70％同源性的多核苷酸序列；

(4)一段多核苷酸序列，该序列是(1)、(2)或(3)的核酸片段。

3、根据权利要求1所述的核酸序列，其中的多核苷酸是DNA。

4、根据权利要求1所述的核酸序列，其中的多核苷酸是RNA。

5、根据权利要求1所述的核酸序列，其中的多核苷酸是基因组DNA。

6、根据权利要求3的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下序列组成的组的成员：

(1)一段如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；

(2)一段如SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列；

(3)一段能够与(1)或(2)杂交，并且与它们具有至少70％的同源性的多核苷酸序列；

(4)一段多核苷酸序列，该序列是(1)、(2)或(3)的核酸片段。

7、根据权利要求6的核酸序列，其中所述核酸序列如SEQ ID NO：1中第1-450位核苷酸所示。

8、根据权利要求6的核酸序列，其中所述核酸序列如SEQ ID NO：3中第1-285位核苷酸所示。

9、一种载体，该载体包含权利要求6的核酸序列。

10、一种宿主细胞，该宿主细胞经权利要求9的载体转化、转染或转导过。

11、一种用基因工程手段生产多肽的方法，这种方法包括在权利要求10的宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽。

12、一种多肽，这种多肽包含选自由以下序列组成的组的成员：

(1)一种具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；

(2)一种具有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽；

(3)一种具有与菌种保藏号CGMCC NO.0456.1中重组体表达的成熟多肽具有相同氨基酸序列的多肽；

(4)一种具有与菌种保藏号CGMCC NO.0456.2中重组体表达的成熟多肽具有相同氨基酸序列的多肽；

(5)一种(1)、(2)、(3)或(4)所述多肽的多肽片段。

13、一种药物组合物，所述药物组合物包括有效剂量的权利要求12所述的多肽或其活性成分，以及一或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

14、一种单克隆或多克隆抗体，所述抗体能够特异性地与权利要求12所述的多肽结合。

15、一种拮抗剂，所述拮抗剂可以抑制或封闭权利要求12所述多肽的生物活性。

16、一种激活剂，所述激活剂可以激活权利要求12所述多肽的生物活性。

17、权利要求12所述的多肽在制备治疗造血***和免疫***疾病的药物组合物中的用途。

18、根据权利要求17的用途，所述用途为权利要求12的多肽在制备治疗造血***的药物组合物中的用途。

19、根据权利要求17的用途，所述用途为权利要求12的多肽在制备治疗免疫***的药物组合物中的用途。

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