CN1279174C - 固定化脂肪酶催化合成脂肪酸低碳醇酯 - Google Patents

Abstract

本发明采用固定化微生物脂肪酶在非水相体系催化合成脂肪酸低碳醇酯。将脂肪酶固定化在惰性载体膜或纺织物上，固定化载体可与金属丝网复合，形成新型反应器，在20～60℃范围内与有机相中催化脂肪酸和醇的酯化反应，14-24hr酯化率可达90-97%。与目前工业中使用化学催化剂在高温高压下酯化的工艺方法相比，此方法具有反应条件温和、能耗低，反应专一性强、副产物少的优点。与同类的酶法合成工艺相比较，该方法具有产物易与固定化酶分离，有利于连续化生产以及固定化酶易回收和重复使用的特点。同时在反应过程中加入吸水剂可缩短反应时间并提高酯化率。由该方法转化得到的产品色泽浅、品质高，在能源、农业及纺织、塑料、食品、化妆品行业等领域中均有重要的应用。

Description

固定化脂肪酶催化合成脂肪酸低碳醇酯

(一)技术领域

本发明涉及生物化工，具体地说是一种用固定化微生物脂肪酶在非水相体系催化脂肪酸和9醇反应合成酯的方法。

(二)背景技术

脂肪酸酯是日用化工许多行业如食品、纺织、塑料、化妆品等常用的化学物质。脂肪酸低碳醇酯是是其中一类重要的工业添加剂和表面活性剂。短链脂肪酸芳香酯是合成香料的重要组成部分和白酒调香的主要原料。而棕榈酸异辛酯、异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯以及硬脂酸辛酯等长链脂肪酸的低碳醇酯则是高档化妆品的重要油性原料。此类长链脂肪酸酯与皮肤相容性好，具有良好的滋润与软化作用，广泛用于浴用制品，发用制品，美容品，剃须品，护肤品，抑汗祛臭剂，防晒制品等个人护理用品中。其中棕榈酸异辛酯还可用作塑料行业中的增塑剂、润滑剂等。脂肪酸甲酯，脂肪酸乙酯则是可生物降解、空气污染物排放低的可再生的“生物柴油”等等。但长期以来，工业上脂肪酸酯均是通过化学法来生产。即用无机催化剂如浓硫酸、苯磺酸等在高温高压下催化酸醇的酯化反应来完成。虽然产率较高，但也存在许多难以克服的缺点。如：高温高压反应能耗高、副反应多，产物色泽深、分离和精制困难等，而且酸对设备腐蚀严重，不利于生产。随着生物技术的发展，特别是酶工程的研究，为生物催化剂合成脂肪酸酯提供了新的方法。与传统的化学法相比，酶法合成具有反应条件温和，特异性强，副反应少，产物品质高等特点。特别是非水相中脂肪酶促反应，拓宽了酶的应用范围和领域，成为年来酶学研究的热点。

众多的研究报道和综合评述都展示了非水相中的酶优于水中的酶。有机溶剂能保持一个较低的水分活度，可以降低酯化和水解反应的热动力学和动力学障碍。而且有机底物在有机溶剂中较高的溶解度可以提高反应速度。因此，在非水体系中的酯化反应可实现高转化率，从而简化分离工艺。

根据国内外脂肪酶催化脂肪酸酯合成的技术报道，“微生物脂肪酶催化酯的合成”CN 1223300A(1999)报道了以脂肪醇、脂肪酸为底物，游离的的脂肪酶为催化剂，在15℃～40℃条件下，于有机溶剂中催化脂肪酸脂的合成。该方法所用脂肪酶是用华根霉生产，反应为分批操作，在搅拌罐中进行。10～36hr底物转化率可达95％。反应结束后，过滤分离脂肪酶和反应液，减压蒸馏得到产物酯。与使用固定化酶相比较，游离酶在有机溶剂中易聚集结块，重复利用率低，酶活损失大的缺点。同时该方法使用庚烷作有机溶剂提高了生产成本。另外，CN 1308129报道了在无溶剂体系中，用固定化根霉脂肪酶、假丝酵母脂肪酶催化失水山梨醇单油酸酯的合成，但无溶剂体系对于不溶性底物如互不相溶的酸和醇，则会影响传质而降低反应的效率。

EP 0383405A1(1990)，报道了用商品化脂肪酶如用颗粒状树脂固定化的假丝酵母脂肪酶NOVO CP382，固定化米黑毛霉脂肪酶NOVO SP392，催化脂肪酸酯合成的方法。该方法的特点是在无溶剂条件进行，利用酯化反应中生成的水与反应底物之一的醇形成共沸物的性质，在5000～50000Pa压力、温度低于80℃条件下，将反应中生成的水移出，24hr底物转化率可达97％以上。但是也存在不足之处，如由于反应过程中醇也不断被移出，导致反应体系中底物减少，必须向反应体系中补加醇。而且对于形成较高共沸点的醇-水共沸物，温度的升高会导致酶活性和稳定性的降低，该方法将酶反应柱与蒸馏设备分离，在不同的温度下操作，增加了能耗和设备及操作的复杂性。

刘俊康等人(2000)研究了以AOT(二(2-乙基己基))/琥珀酸酯磺酸钠/正庚烷/水/明胶组成的反胶团体系固定化脂肪酶，将固定化酶填充在内径1.8cm的层析柱中催化长链脂肪酸酯的合成，所用有机溶剂为庚烷。25℃下，反应酯化率可达90％。反胶团固定化酶活性保持时间长，但对于亲水性较强乙醇、丙醇等能和水混溶，并进入凝胶的微乳液滴中，对酶分子的结构和活性产生影响，导致反应速度慢，转化率低。而且管式反应器也存在底物流速低，处理量小的不足。

Leite等人(1998)研究了固定化米黑毛霉脂肪酶催化的酯化反应。以异辛烷为溶剂通过渗透蒸发膜移走反应中生成的水。Bufeiend等人(1999)研究了中空纤维膜反应器，以辛烷为溶剂，通过将底物循环反应合成长链脂肪酸酯。膜反应器催化效率高，能选择性移走反应中生成的水，但膜反应器也存在造价高，操作复杂、膜易堵塞等问题。

(三)发明内容

本发明的目的是提供了一种利用固定化脂肪酶合成脂肪酸低碳醇酯的方法。

本发明的技术方案包括将脂肪酶和共固定剂共同固定在惰性载体膜或纺织品膜上制成固定化酶，再将固定化酶固定于不锈钢丝网中并置于酶反应器内催化脂肪酸酯的合成。

本发明的效果是：(1)固定化膜载体的存在防止了酶分子在有机溶剂中的聚集作用，提高了酶分子的扩散效果，增大了催化面积。(2)共固定剂有效地改善了固定化载体的亲水和疏水特性，为酶和底物之间的作用提供了良好的微环境，从了大大提高了酶的催化活性。(3)通过将固定化酶固定在金属丝网中，金属丝网卷曲成螺旋板状增大了酶反应器中的催化面积，在反应过程中可及时加入吸水剂除去反应生成的水。(4)反应结束后，固定化酶也易于与反应液和吸水剂分离，有利于回收复用和连续化生产。(5)对于固体底物本发明采用价廉的石油馏份作溶剂，降低了生产成本。

由本发明得到的产品色泽浅，品质高，低成本，从而为脂肪酸酯的工业化生产提供了一种新方法。

主要技术内容如下：

1.脂肪酶的固定化：固定化载体先用共固定剂活化。将固定化载体和共固定剂按质量体积比1∶1～1∶3的比例混合(W∶V)，室温晾干。脂肪酶溶液按1000～30000单位/克载体的比例与活化后的固定化载体混合，晾干待用。

2.脂肪酸脂的合成：将底物脂肪酸和醇按摩尔比1∶1～1∶3的比例加入含有有机溶剂的酶反应器中。加入固定化酶开始反应。在20-60℃的条件下，振荡或搅拌反应14-24小时，转化率可达90-97％，在反应4-10hr时加入分子筛或变色硅胶除去反应中生成的水，可加快反应到达平衡的时间。反应结束后，固定化酶可以直接与反应液分离，用少量的有机溶剂洗涤后可再次使用。反应液经5％NaCO₃稀溶液洗涤、过滤后在真空度0.05-0.08MPa条件下减压蒸馏，蒸发出反应媒体有机溶剂，得到产物酯。蒸发出的溶剂经过冷凝后可回收复用。

3.载体活化时所用的共固定物包括高分子化合物、油脂、表面活性剂、蛋白质和无机离子等物质。其组成包括：聚乙二醇、Tween和span系列、明胶、卵磷脂等。

4.本发明所用的脂肪酶为固定化假丝酵母脂肪酶、固定化青霉脂肪酶、和酯酶。选用的固定化载体为纺织品，如膜等。固定化酶膜具有表面积大、吸附性强、价格便宜、稳定性好以及以重复利用的特点。

5.在酶反应器中，固定化膜载体被固定在不绣钢丝网中。不锈钢丝网置于反应器内或卷曲成螺旋板状置于反应器中，反应结束后可直接与反应液分离，经有机溶剂洗涤后，可再次用于催化反应。

本发明在有机溶剂中完成的酯化反应方程式为：

脂肪酸  醇              脂肪酸酯

酶活的定义为：40℃条件下，pH8.0的磷酸缓冲溶液中水解橄榄油，每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。

与传统的化学合成法相比，本发明反应条件温和、能耗低，大大降低了生产成本。同时本发明使用生物催化剂，反应特异性强、副产物少。产品具有色泽浅、品质高的特点。

与同类的生物合成方法相比，本发明的先进性在于(见表1)：

1.选用了新型的固定化载体，如固定化酶膜，增大了酶的作用面积从而减少了酶用量。通过高分子化合物、蛋白、表面活性剂及油脂和无机离子等物质与酶共固定，共固定剂能很好的改善载体的亲水和疏水特性，增强了底物与酶的接触和扩散效果，为酶提供良好的与底物作用的微环境，从而大大提高了酶的催化活性和热力学稳定性。以上因素度降低了酶的使用成本。

2.固定化酶固定于不锈钢丝网中，增大了催化面积。与游离酶或颗粒状的固定化酶相比，更易于与反应液分离，并且有利于连续化生产和酶的回收复用。其相应的酶反应器与其他反应器如管式、膜反应器相比，结构和操作简单，设备通用性强。而且在反应器中，酶催化面积大、催化效率高。

3.对于固态底物使用廉价的石油馏出物为反应溶剂，降低了生产成本。

由本发明得到的产品各项指标均达到企业标准，优于市售化学产品。可应用于能源、农业、以及食品、化妆品、纺织行业等领域中。

表1.本发明与同类方法的比较

	同类方法	本发明
			酶	游离酶：易聚集固定化酶：颗粒状树脂、反胶团固定化，操作复杂、成本高	固定化后酶催化活性高，用量少，载体为纺织品，催化面积大、来源丰富、价廉
反应器	设备复杂，操作费用高	简单、催化效率高、酶易分离
			溶剂	己烷、庚烷、异辛烷	无溶剂或石油馏出物，成本低

(四)实施实例

实施例1：

0.12g固定化酶(9000U/g)加入到含1g棕榈酸(0.54mol/L)和0.5g2-乙基己醇(0.7mol/L)的5mL有机溶剂中。40℃条件下，振荡反应(190r/min)24hr，反应转化率达91％。

实施例2：

0.12g固定化酶(9000U/g)加入到含1g棕榈酸(0.54mol/L)和0.67g2-乙基己醇(0.7mol/L)的5mL有机溶剂中。40℃条件下，振荡反应(190r/min)，22hr反应转化率达96.7％。半衰期达150hr。

实施例3：

0.12g固定化酶(9000U/g)加入到含1g硬脂酸(mol/L)和0.62g2-乙基己醇(0.65mol/L)的5mL有机溶剂中。37℃条件下，振荡反应(190r/min)，24hr反应转化率达95％。

实施例4：

20g固定化酶(9000U/g)加入含138g棕榈酸(0.54mol)和92g异辛醇(0.706mol)的690mL的有机溶剂中，40℃条件下搅拌反应。固定化酶固定在不锈钢丝网上置于反应器内，反应24hr转化率可达95％。反应液经5％碳酸钠溶液洗涤、过滤后在0.05～0.08的Mpa真空度下蒸发出有机溶剂，得到产品棕榈酸异辛脂。产品色泽浅，酸值为0.251mgKOH/g。

实施例5：

0.085g脂肪酶(16000u/g)加入含有0.85mol/L浓度油酸和甲醇的5ml的有机溶剂中，40℃条件下，反应24hr后，反应的转化率达95％。经过在-0.05Mpa压力下减压蒸馏得到产物油酸甲酯。

实施例6：

0.048g脂肪酶(16000u/g)加入含有0.75mol/L浓度棕榈酸和甲醇的5ml的有机溶剂中，40℃条件下，反应24hr后，反应的转化率达92％。经过在-0.05Mpa压力下减压蒸馏得到产物棕榈酸甲酯。

实施例7：

0.05g脂肪酶(16000u/g)加入含有0.7mol/L浓度硬脂酸和丁醇的5ml的有机溶剂中，40℃条件下，反应24hr后，反应的转化率达96％。经过在-0.05Mpa压力下减压蒸馏得到产物硬脂酸丁酯。

实施例8：

0.085g脂肪酶(16000u/g)加入含有0.85mol/L浓度油酸和乙醇的5ml的有机溶剂中，40℃条件下，反应24hr后，反应的转化率达95％。经过在-0.05Mpa压力下减压蒸馏得到产物油酸乙酯。

实施例9：

0.05g脂肪酶(16000u/g)加入含有0.7mol/L浓度硬脂酸和甲醇的5ml的有机溶剂中，40℃条件下，反应24hr后，反应的转化率达96％。经过在-0.05Mpa压力下减压蒸馏得到产物硬脂酸甲酯。

Claims (6)

1.固定化脂肪酶催化合成脂肪酸低碳醇酯的方法：

(1)脂肪酶的固定化：固定化载体先用共固定剂活化，将固定化载体和共固定剂按质量体积比1∶1～1∶3的比例混合(W∶V)，室温晾干，脂肪酶溶液按1000～30000单位/克载体的比例与活化后的固定化载体混合，晾干待用，

(2)脂肪酸酯的合成：将底物脂肪酸和醇按摩尔比1∶1～1∶5的比例加入含有有机溶剂的酶反应器中，加入固定化酶开始反应，在20～60℃的条件下，振荡或搅拌反应14～24小时，反应过程中加入吸水剂，转化率达90～97％，反应结束后，固定化酶直接与反应液分离，用少量的有机溶剂洗涤后再次使用，反应液经碱液洗涤、过滤后减压蒸馏，蒸发出有机溶剂，得到产物酯，蒸发出的溶剂经过冷凝后回收复用，所用的脂肪酸选自棕榈酸、硬脂酸和油酸中的其中一种，所用的醇选自甲醇、乙醇、丁醇和2-乙基己醇中的其中一种。

2.根据权利要求1所述方法，所用固定化载体为膜状的纺织物。

3.根据权利要求1所述方法，其特征是在搅拌反应器中，固定化载体被固定在不绣钢丝网中，不锈钢丝网置于反应器中卷曲成螺旋板状，反应结束后直接与反应液分离。

4.根据权利要求1所述方法，其特征是反应所用的有机溶剂为石油馏出物，沸程为40℃～150℃，对于液态的底物直接采用无溶剂体系。

5.根据权利要求1所述方法，其特征是所用的吸水剂为硅胶或分子筛。

6.根据权利要求1所述方法，其特征是所用的洗涤碱液为NaCO₃或NaOH溶液，浓度为5～10％。