CN1277551A - 用于经皮施用免疫原的双相脂小泡组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种用于经皮经皮施用免疫原的组合物。该免疫原包埋于在中央核心区室具有水包油乳剂的脂小泡中。该小泡经皮施用以引发受试者的免疫应答。
Description
发明领域
本发明涉及为免疫或接种目的施用免疫原的方法。免疫原包埋于在中央核心区室具有水包油乳剂的脂小泡中。该小泡经皮施用以施用包埋的免疫原。
参考文献
Benson,M.L.等,加拿大药用组合物杂志,42:368-369(1978)。
Berggren,K.A.等,美国兽医研究杂志42:1383-1388(1981)。
Chanock,R.M.,Lerner,R.A.,Brown,F.和Ginsberg,H.“免疫新探索,疫苗”86,纽约冷泉港,(1987)。
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Czerkinsky,C.等,免疫学方法杂志,110:29-36(1988)。
Harland,R.J.等,Can.Vet.J.33:734-741(1992)。
Santus,G.C和R.W.Baker,受控释放杂志25:1-20(1993)。
本发明的背景
可诱导针对几乎无限物质种类的免疫应答。有2类免疫应答,即体液和细胞应答。在体液应答中,抗原或外源物质被淋巴细胞表面的特异性受体识别,并刺激某些B-淋巴细胞增殖。这些细胞产生大量能结合抗原的抗体。结合后,去掉或破坏被结合的抗原。在细胞或细胞介导的免疫应答中,T-淋巴细胞,特别是辅助和杀伤T-淋巴细胞在识别和破坏外源物质中起作用。
作为抗传染病的预防措施的诱导免疫过程称为免疫接种。免疫接种可以是被动的,其中给动物施用抗体以提供短期免疫,免疫接种也可是主动的,主动免疫更常见,称为种痘,其中将灭活的或减毒的抗原或其片段导入动物。该抗原致敏免疫***,导致如果该抗原后来进入体内,则迅速产生抗体以除去和/或破坏侵入的抗原。
大多数疫苗是含有所寻求针对其进行保护的生物体或生物体部分的制品。该生物体被杀死或减毒,以便足以不引起疾病但可诱导免疫。有些疫苗含化学修饰的细菌毒素。可获得针对各种传染病的疫苗,例如,提供活的减毒疫苗以预防麻疹,流行性腮腺炎,风疹,黄热病和脊髓灰质炎。白喉和破伤风疫苗含有灭活的细菌毒素。霍乱,伤寒,百日咳,狂犬病,病毒性乙型肝炎和流感疫苗含有灭活的生物体,或者在乙型肝炎疫苗中仅含有病毒的一部分。
疫苗通常经过注射入上臂给药,或者,对于脊髓灰质炎疫苗,经过口服用药。经注射用药通常不是很方便,尤其在第三世界国家,对于野外的士兵或对于非人类个体,包括马,奶牛和狗不是很方便。
本发明概述
因此,本发明的一个目的是提供一种简便,有效的施用疫苗的方式。
本发明的另一个目的是提供一种双相脂小泡组合物用于经皮经皮施用包埋于脂小泡中的抗原。
在一个方面,本发明包括一种组合物,用于在受试者中诱导针对免疫原的免疫应答。该组合物包括具有中央核心区室的双相脂小泡的悬液,该核心区室中含有水包油乳剂、且在双相脂小泡中包埋一种免疫原。
在一个实施方案中,免疫原是来自细菌、病毒、寄生虫、植物或真菌来源的抗原。
免疫原有效诱导体液免疫应答,或者,有效诱导细胞介导的免疫应答。
在另一实施方案中,组合物进一步包括包埋于脂小泡中的佐剂。
在另一实施方案中,脂小泡悬液进一步包括皮肤穿透增强剂。
优选的穿透增强剂包括脂酰氨基酸和不饱和脂肪酸。
另一方面,本发明包括在受试者中诱发针对免疫原的免疫应答的方法,该方法包括给受试者经皮经皮施用一剂免疫原。如上所述,免疫原包埋在具有中央核心区室的双相脂小泡中,该区室含有水包油乳剂。
在另一方面,本发明包括应用针对受试者皮肤的装置给受试者经皮经皮施用免疫原的方法。该装置包括(i)经过混合水包油乳剂与形成小泡的脂类形成的脂小泡悬液,该小泡由下列成份组成:(a)由该形成小泡的脂类组成的脂双层外膜,(b)含该水包油乳剂的中央核心区室和(c)包埋于小泡中的对诱发免疫应答有效的一定剂量的免疫原;(ii)适于保持脂小泡悬液和适于从其中释放脂小泡的贮药器(reservoir);和(iii)用于将该装置附着到受试者上以经皮经皮施用免疫原的工具。
在另一方面,本发明包括一种用于经皮施用免疫原的装置,它含有经过混合水包油乳剂与形成小泡的脂类而形成的脂小泡悬液。该小泡由下列成份组成:(i),由该形成小泡的脂类组成的脂双层外膜,(ii),含有该水包油乳剂的中央核心区室,(iii),包埋于小泡中的,诱发免疫应答有效剂量的免疫原。该装置还包括一种保持脂小泡悬液和适于从其中释放脂小泡的贮药器,以及用于将该装置附着在受试者上以经皮施用免疫原的工具。
在一个实施方案中,该装置中的贮药器由不通透的背衬件与用于使脂小泡从该贮药器有效传递的膜所组成。
在另一实施方案中,脂小泡的悬液包括通透增强剂。例如,通透剂可以是脂酰氨基酸或不饱和的脂肪酸。
包埋于小泡中的免疫原优选具有大约100-100,000,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中,免疫原是用于接种动物或人的免疫原。
在一个实施方案中,用于将装置附着于受试者上的工具是一种相邻于膜的粘合层。
小泡悬液可包括一种佐剂,它包埋于脂小泡中或包含在悬液中。
本发明的这些和其它目的和特征在结合附图阅读下面的本发明详细描述后将更加显而易见。
附图的简要描述:
图1显示了根据本发明制备的双相脂小泡。
图2显示了制备用于本发明装置中的在中央核心具有水包油乳剂的双相脂小泡的一般程序。
图3A-3C是适用于本发明的经经皮装置的横切面图;
图4是显示血清抗体反应的布点图,表示为从本发明的装置经皮经皮施用包埋白细胞毒素的双相脂小泡后在405nm下的光密度;
图5是显示从对照小鼠(实心方块)和从用含50μg(实心三角)或100μg(倒三角)包埋于双相脂小泡中的白细胞毒素的经皮药贴施用白细胞毒素免疫的小鼠分离的大量脾细胞的增生反应的布点图;
图6是对于对照小鼠和用含50μg或100μg包埋于双相脂小泡中的白细胞毒素的经皮药贴施用白细胞毒素免疫的小鼠经斑点酶联免疫吸附试验(ELISPOT)测量的大量脾细胞分泌白细胞介素-4的布点图;
图7是显示经皮经皮施用鸡蛋溶菌酶与各种双相脂小泡配制品I-V免疫的小鼠中血清IgG反应的柱形图;
图8A-8D是显示以ELISPOT试验测量的,用各种双相脂小泡配制品I-V中的50μg鸡蛋溶菌酶免疫后脾细胞(图8A-8B)和引流的***细胞(图8C-8D)分泌白细胞介素-4和干扰素-γ的柱形图;
图9是显示用包埋于双相脂小泡中的鸡蛋溶菌酶经皮下和经皮经皮免疫后小鼠血清中的IgG反应的柱形图。
本发明的详细描述:
I.定义:
本文使用的下面术语具有下述含义。
“抗原”指被抗体特异性识别和/或与抗体结合的物质或材料。
“佐剂”指与抗原结合用药时增效免疫反应的物质或材料。佐剂也可用于诱发更迅速的免疫反应。
“双相脂小泡”指由形成小泡的脂类形成的且在中央核心区室具有水包油乳剂的脂颗粒。术语脂小泡,小泡和双相脂小泡在本文中可互换使用。
“免疫原”指能诱导免疫反应的物质或材料包括抗原。免疫原可单独或与佐剂结合诱发免疫反应。免疫原可以是合成的或是天然的,例如,可以是无机或有机化合物,如,半抗原,蛋白质,肽,多糖,核蛋白,核酸或脂蛋白。免疫原可以来自细菌,病毒或原生动物,植物,或真菌生物或其部分。
“剂量”指诱发免疫反应所需的免疫原的量。该量可随动物,免疫原和下文所述的佐剂的存在而变化。免疫剂量用本领域的技术人员已知的方法可较容易地测定,如通过宿主动物免疫和攻击研究(Chanock等,(1987))来测定。
“贮药器”指可保持并在其中分布一种介质的贮存结构。
II.双相脂小泡悬液
A.双相脂小泡
如上所述,本发明包括用于经皮施用免疫原的脂小泡组合物。根据本发明的脂小泡在图1中以示意图描述。
在该附图中,本发明的双相脂小泡是多层脂小泡,如在该图中所示的小泡10,它由一系列脂双层组成,其中的两个双层显示为双层12,14。各脂双层由下面讨论的形成小泡的脂类的两层组成,其中各脂分子,如分子16由其极性头部基团16a定向与亲水区室18接触,其疏水尾部16b与相邻脂分子并排。
小泡最里面的双层限定了一个中央区室20。根据本发明的一个重要特征,脂小泡的核心区室含水包油乳剂,在图中由滴状的22,24,26代表。如下文所述,经过制备表面活性剂稳定的水包油乳剂将水包油乳剂包埋于脂小泡中,在图中表示为被表面活性剂分子22b包围的亲脂滴22a。该乳剂与形成小泡的脂类混合以形成包围乳剂的脂双层。
根据免疫原的药物化学特征可用各种方式将免疫原包埋进脂小泡中。例如,亲水免疫原可以是中央核心区室中水包油乳剂的水相或是脂双层间区室18中的水相。较疏水的免疫原可包含在水包油乳剂的油相中或在脂双层中,如图中30所示。制备包埋免疫原的双相脂小泡的方法如下所述。
B.双相脂小泡包埋的免疫原
如上所述,本发明的组合物包括含有被包埋的免疫原的双相脂小泡悬液,该免疫原能有效诱发免疫应答,以便达到例如,免疫或接种的目的。
一般来说,本发明适用于各种类型的免疫原。下列抗原以说明的方式提供,而不打算用于排除其它抗原:流感病毒抗原(如血细胞凝集素和神经氨酸酶抗原),百日咳杆菌抗原(如百日咳毒素,丝状血细胞凝集素,pertactin),人***状瘤病毒(HPV)抗原,幽门螺杆菌抗原,狂犬病抗原,森林脑炎(TBE)抗原,脑膜炎球菌抗原(如血清型A,B,C,Y和W-135的荚膜多糖),破伤风抗原(如破伤风类毒素),白喉抗原(如白喉类毒素),肺类球菌抗原(如肺炎链球菌3型荚膜多糖),结核病抗原,人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(如GP-120,GP-160),霍乱抗原(如霍乱毒素B亚基),葡萄球菌抗原(如葡萄球菌肠毒素B),志贺菌属抗原(如志贺菌属多糖),水泡性口炎病毒抗原(如水泡性口炎病毒糖蛋白),巨细胞病毒(CMV)抗原,肝炎抗原(如甲肝(HAV),乙肝(HBV),丙肝(HCV),丁肝(HDV)和庚肝(HGV)病毒抗原),呼吸道合胞病毒(RSV)抗原,单纯疱疹病毒抗原,或其组合(例如,白喉,百日喉和破伤风的组合(DPT))。合适的抗原还包括那些被传递以诱导耐受力的抗原,如网膜抗原。还包含用于针对炭疽和鼠疫耶尔森氏菌的免疫/接种的抗原。
优选的抗原包括百日咳杆菌抗原,脑膜炎球菌抗原,破伤风抗原,白喉抗原,肺炎球菌抗原,结核病抗原和RSV抗原。在另一优选的实施方案中,包埋的免疫原具有大约100-100,000,000道尔顿的分子量,更优选100-500,000道尔顿,最优选100-100,000道尔顿。
在为支持本发明进行的研究中,由溶血性巴斯德氏菌产生的外毒素白细胞毒素和鸡蛋溶菌酶被包埋于双相脂小泡中且经皮经皮传递,如下文所述。
III.双相脂小泡的制备
如上所述,本发明的双相脂小泡在脂小泡的中央核心区室以及在分开脂双层的含水空隙中包括水包油乳剂。一般来说,该脂小泡由混合水包油乳剂和形成小泡的脂类来制备。重要的是,在与形成小泡的脂类混合前用表面活性剂稳定水包油乳剂。即,乳剂中的油滴被表面活性剂包裹,优选被表面活性剂单层包裹。在优选的实施方案中,稳定的表面活性剂不是形成双相脂小泡双层的小泡形成脂成份。
更具体地说,根据本发明的双相脂小泡根据图2列出的一般方法来制备。选择的脂成份溶于合适的溶剂中,在优选的实施方案中,溶剂是药用上可接受的亲水溶剂,如多元醇,例如,丙二醇,乙二醇,甘油或醇类,如乙醇,或这些溶剂的混合物。根据脂成份的药物化学特性和选择的溶剂,可能需要加温混合物,例如,加温到40-80℃之间。
脂成份必需包括形成小泡的脂类,这意味着它是可在水中自发形成双层小泡的具有疏水尾部和头部基团的两亲性脂类。形成小泡的脂类优选是具有2个烃链,典型的是酰基链的脂类,且其中头部基团是极性的或非极性的。有各种合成的小泡形成脂类和天然存在的小泡形成脂类是适用的,如磷脂,它包括磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰肌醇,磷脂酸和鞘磷脂,其中2条烃链典型地长度为大约14-22个碳原子,且具有不同程度的不饱和性。这些脂类可经商业途径获得或根据公开的方法制备。
除了形成小泡的脂成份外,本发明的脂小泡可包括其它的脂成份,它能稳定掺入脂双层中,其疏水部分与双层膜的内面,即疏水区域接触,而其极性头部基团指向外面,即膜的极性表面。例如,糖脂,神经酰胺和固醇,如胆固醇,粪甾醇,胆甾烷醇和胆甾烷,长链脂肪酸(C16至C22),如硬脂酸可被掺入脂双层中。可使用的其它脂成份包括脂肪胺,脂酰化蛋白质,脂酰化肽,油,脂肪醇,甘油酯,矿脂和蜡。也可预料在脂小泡的脂类成份中包括皮肤穿透增强剂,这将在下文进行讨论。
在图2中,根据表面活性剂的亲水—亲脂平衡,经过将表面活性剂溶于水或油中制备水包油乳剂。在优选的实施方案中,将表面活性剂与蒸馏水混和并加入到油相中以形成乳剂。可使用搅拌,如匀质化或乳化,或者可经过不包含搅拌的微乳化技术形成乳剂。所得的乳剂优选具有作为连续相的水和作为分散相的油。
根据本发明的重要特征,由于分散相中的油滴被表面活性剂包围,所以水包油乳剂是稳定的。这就是说,各表面活性剂分子的亲水部分延伸进乳剂的水相中,疏水部分与亲脂滴接触。如下所述,经过将水包油乳剂与小泡形成脂类混合而形成脂小泡。如果在与小泡形成脂类接触前乳剂不是表面活性剂稳定过的,那么小泡形成脂类可用于首先稳定乳剂而不是在水包油乳剂周围形成脂双层。
适用于形成水包油乳剂的表面活性剂有许多,包括阳离子,阴离子和非离子或两性表面活性剂。在一个实施方案中,优选的表面活性剂是阳离子表面活性剂,如亚油酰氨基丙基丙二醇—氯化二monium磷酸盐,可可酰氨基丙基丙二醇—氯化二monium磷酸盐和硬脂酰氨基丙二醇—氯化二monium磷酸盐。这些合成的磷脂复合物可从Mona Industries,Inc(Patterson,NJ)分别以商标PhospholipidEFA TM,Phospholipid SVTM和Phospholipid SVCTM买到。用作双相脂小泡双层的主要脂类成份的另一优选的小泡形成脂类是氢化磷脂酰胆碱。
举例性的阴离子表面活性剂包括酰基谷氨酸,如三乙醇胺可可酰谷氨酸,月桂酰谷氨酸钠,氢化牛脂谷氨酸钠和可可酰谷氨酸钠。
举例性的非离子表面活性剂包括天然产生的乳化剂,如聚乙二醇-60杏仁油甘油酯,鳄梨油二乙醇胺,乙氧基化西蒙得木油(聚乙二醇-40西蒙得木酸和聚乙二醇-40西蒙得木醇);聚氧乙烯衍生物,如聚氧乙烯-20脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯-20脱水山梨糖醇单硬脂酸酯,羊毛脂衍生物,如polychol 20(LANETH 20)和polychol 40(LANETH 40);和中性磷酸酯,如聚丙二醇—鲸蜡醚磷酸酯和二乙醇胺oleth-3磷酸酯。
在分散的油相中的油滴优选具有小于约1μm的大小,更优选直径不超过大约0.5μm。当然,油滴大小可经过诸如剪切力和混合时间等的混合条件很容易地进行调节。
可预料到可向水包油乳剂中加入其它成份,即,水包油乳剂不必是单独的油,表面活性剂和水。例如,乳剂可包括抗微生物试剂,如羟苯甲酸甲酯,对羟苯甲酸丙酯,和增强剂成份,如蜡,脂肪醇,脂肪酸酯,甘油硬脂酸酯,矿脂,植物油和提取物,以及其组合。特别优选的例子包括蜂蜡,橄榄油,甘油硬脂酸酯,鲸蜡醇,硬脂醇,豆蔻酸豆蔻酯和棕榈酸鲸蜡酯,庚酸硬脂酸酯,和棕榈酸硬脂酸酯。适用于本发明的举例性的配制品在下文描述,且在共同拥有的美国专利申请流水号08/507,923中公开,本文作为参考文献引用。
在图2中,稳定的水包油乳剂与溶解的小泡形成脂类混合,且如添加,则还有其它的脂成份,如胆甾醇。在有效形成在中央区室含有水包油乳剂的多层小泡的条件下混合乳剂与脂成份。
小泡大小典型地为大约0.1-100μm。为用于本发明,优选脂小泡大小为大约0.5-25μm之间,经过调节混合条件可极容易地达到这点。
根据本发明形成的脂小泡组合物不需进一步添加增稠剂或胶化剂就具有与奶油相似的粘稠度,因此,容易直接施用到受试者皮肤上用于经皮经皮施用包埋的免疫原。另外,该脂小泡组合物可容易地掺入经皮经皮用药的装置的容器中。
图2所列的制备方法产生具有均匀大小分布和均匀组成的小泡群体,如共同未决的申请系列号08/507,923中所讨论和显示,该申请以其全文在本文中作为参考文献引用。该小泡物理上稳定,即,贮存4年期间很少有明显的小泡聚集或融合。
A.其它脂小泡成份
免疫原根据其理化特性可被包埋在脂双层间的小泡中央核心区室内,或在脂双层的内部,如下所述。
水溶性免疫原经过在制备水包油乳剂期间将免疫原加入水相中而将其包埋在中央核心区室和在脂双层间的外周区室内。溶解或悬浮于水相中的免疫原在加入小泡形成脂类后在脂小泡形成期间作为乳剂部分被包埋。
在制备水包油乳剂期间将亲脂免疫原加入油相中以便在中央区室和外周区室中包埋。另外或者作为选择,经过将免疫原加入小泡形成脂类和/或其它脂成份,如胆甾醇中可将亲脂免疫原包埋进脂双层中。
在本发明的另一实施方案中,双相脂小泡包括穿透增强剂以增强被包埋抗原的穿透。在皮肤用药领域中已广泛研究了这些增强剂的应用(Santus等,1993)且可预料到这类增强剂适用于本发明。在优选的实施方案中,穿透增强剂是脂酰化氨基酸,如单月桂酰赖氨酸或双棕榈酰赖氨酸,不饱和脂肪酸,如油酸,短链脂肪酸,如月桂酸或水杨酸甲酯。穿透增强剂可以按上述包含包埋免疫原相同的方式包含进水包油乳剂或脂双层中。
在有些实施方案中,如上所述,制备用于本发明的双相脂小泡包括抗微生物剂,如羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯。当制备水包油乳剂时,该试剂可加入水相中并作为水相部分被包埋在脂小泡中。
在本发明的另一实施方案中,在双相脂小泡组合物中包含佐剂。举例性的佐剂包括完全Freund氏佐剂(CFA),不完全Freund’s佐剂(IFA),氢氧化铝,细菌,病毒或合成佐剂。佐剂在用药位点经过帮助和延缓免疫原的释放而起作用。例如,油基佐剂诱导形成肉芽瘤,它主要是由巨噬细胞和其它的抗原呈递细胞聚集形成。佐剂也帮助将免疫原传递给淋巴***,使免疫原邻近抗原呈递细胞和免疫效应细胞。
尽管已知CFA是有力的佐剂激活剂,但由于存在热灭活的分枝杆菌或类似抗原性的表位,其应用局限于动物。另外,可使用其它佐剂激活剂,如热灭活的棒状杆菌属或博德特氏杆菌属种类的成员,细菌细胞肽聚糖或胞壁酰二肽,它们将抗原定位在T-细胞依赖区域以便抗原呈递细胞和免疫细胞活化。
用于本发明的另一类佐剂激活剂包括两亲性和表面活化的试剂,如皂苷,溶血卵磷脂,视黄醛,Quil A和pluronic聚合物配制品。当膜成份用作免疫原时表面活性佐剂的效率特别显著。其它类型的佐剂包括惰性载体,如皂土和丙烯酰载体;多克隆T-细胞活化剂,如纯化的蛋白质衍生物(PPD)和polyU:polyA。
IV.经皮装置:
如上所述,本发明的双相脂载体组合物用于经皮经皮用药。该组合物可直接施用到皮肤上,例如,用作洗剂,乳剂或凝胶,或者可掺入经皮装置中。现在对该装置进行描述。
在最基本的实施方案中,本发明的经皮装置包括适合于在贮存期间保持及在用药中释放含有包埋的免疫原的脂小泡的一种贮药器。举例性的装置在图3A-3C中显示,然而,可预料到在本领域中已描述了各种各样的经皮装置且它们均适用于本发明。
在图3A中显示的举例性的经皮装置40包括由不通透的背衬层44和膜46限定的贮药器42。背衬层和膜在该装置的外周附近连接在一起。如48所示。这些层经过粘连,热密封等连接起来。装置40还包括粘合层50,作为将该装置附着到受试者皮肤上的工具。该装置在使用前去掉可剥离离型纸52以暴露粘合层50。
背衬层44限定了药贴的远侧,即使用时离皮肤最远的侧面。背衬层是该装置的主要结构元件,使该装置具有机械特性,例如,柔韧性。背衬层用作保护性的不通透的覆盖物以防止贮药器42内的内容物损失。合适的背衬材料包括商业上可获得的医用膜,如由3M公司,Dow Chemical或Fasson Medical Industries提供的那些医用膜。典型的背衬材料可由聚酯等制成且可被染色或硬化。
膜46是高度多孔的元件,它保持贮药器42内的配制品,即,阻止大量配制品流出贮药器,但允许配制品从贮药器传递进皮肤。适用作膜46的材料包括非织造织物,如非织造聚酯,聚乙烯,聚丙烯和其它合成聚合物。该材料优选经加热或者其它方式密封到背衬层上以挡住贮药器内容物的横向流动。
由背衬和膜之间的空间或空隙限定的贮药器42提供了一种贮存结构,其中保持待施用的脂小泡悬液。脂小泡悬液将在下面进行详细描述。
粘合层50是将装置附着在皮肤上的装置。该层由药用上可接受的压敏粘合剂,如聚二甲基硅氧烷,聚异丁烯,聚丙烯酸酯,聚氨基甲酸乙酯等制备。如图3A所示,粘合层50是线内粘合剂。可预料到粘合层也可以是外周或边缘的粘合层,如图3B所示。
装置40包括揭片条或可剥离离型纸以覆盖粘合层的表面并且在贮存期间防止贮药器内容物损失。使用前,从该装置中去掉可剥离离型纸。可剥离离型纸一般是对贮药器内容物不通透的材料,例如聚对苯二甲酸乙二醇酯,通常经过用聚硅氧烷或碳氟化合物处理而可剥离。
在图3B中,显示了第二个举例性的经皮装置,包括背衬层62,膜64和外周粘合层66。在该实施方案中,背衬层62和膜64在该装置的外周被加热密封,如68所示。由背衬层和膜之间的空间限定的贮药器70提供待经皮经皮用药的脂小泡悬液的贮存点。外周粘合层66直接加至背衬层62。可剥离离型纸72在贮存期间保护该装置。适用于背衬层,膜,粘合剂和可剥离离型纸的材料如对图3A中所述。
第3种举例性的经皮装置80在图3C中显示。在该装置中,贮药器82中的内容物当装置附着到受试者上时直接与皮肤接触。该装置中的贮药器由吸附性海绵或多孔的高通透性的聚合物组成。适用于贮药器的材料包括聚氨基甲酸乙酯,聚乙烯或聚丙烯材料。不通透的背衬层84防止贮药器内容物通过该装置的远端顶侧流失。背衬层在其远侧用粘合性上衬86覆盖。它受到背衬层或聚合物层88的保护。使用前,经过从该装置的近皮肤侧揭去可剥离离型纸90和不通透的保护条92暴露粘合性上衬的外周边缘。
在上述实施方案中,该装置粘附到使用者的皮肤上,当然,将该装置附着到皮肤上的其它工具是可想象的,且是适用的,如弹性臂箍或可调腰带。
经皮装置中的膜优选多孔的,高通透性膜,相对于皮肤具有对贮药器内容物扩散的最小阻力。同时,膜具有防止贮药器内容物大量流出该装置的功能。如下所述,贮药器中含有悬液形式的脂小泡,脂小泡穿过该膜与皮肤接触且穿透皮肤用于施用包埋的免疫原。适用作膜的材料包括亲水和疏水织物,布料和适合于传递脂小泡的具有多孔性的聚合物膜。该材料可以是非织造织物或者可以是具有限定孔经的织物材料。一种优选的材料是PecapTM聚酯HC7-51,它具有51μm的孔经(Tetco,Inc.,Briarcliff Manor,NY)。其它优选的材料是Saatifil聚酯PES47126(Saati Corp,Stamford,CT)和具有10μm筛径的9-COP-105 Fluortex(Tetco,Inc.,Briarcliff Manor,NY)。
可预料到,可选择膜以提供所需更大或更小的扩散阻力。例如,为了设计经膜速率而不是经皮肤速率受到控制的装置,可选择具有更紧密织物或更小孔径的膜。
B.经皮装置的制备
经皮经皮用药的含免疫原的双相脂小泡悬液包含在经皮装置的贮药器内,如图3A-3C所示。该装置的制备是本领域的技术人员已知的。且本发明的经皮装置的具体例子的制备在下文实施例2中描述。
可预料到,经皮装置中膜的选择部分依赖于双相脂小泡的大小。典型的是,膜的孔径略大于脂小泡的直径。在优选的实施方案中,膜孔径为0.1-500μm,更优选0.1-200μm。膜孔径与脂小泡直径间大小的差异影响双相脂小泡从该装置的释放速率。差异越小,脂小泡转移的速率越慢。
在本发明的一个实施方案中,具有不均匀大小分布的双相脂小泡包含在该装置的贮药器中。较小的小泡含有第一免疫原和/或佐剂,较大的小泡含有第二免疫原和/或佐剂。对于给定的膜,较小的小泡从该装置中的释放比较大的小泡速率快,产生第一次用药和第二次用药的组合物。
V.使用方法
在另一方面,本发明包含在受试者中诱导针对免疫原的免疫应答的方法。该方法包括给受试者经皮施用本文所述的包埋于双相脂小泡中的免疫原。在一个实施方案中,双相脂小泡以如上文所述的参考图3A-3C的经皮传递的装置中用药。
为支持本发明进行的研究中,制备的双相脂小泡包括白细胞毒素,它是溶血性巴斯德氏菌产生的一种外毒素。溶血性巴斯德氏菌是一种革兰氏阴性细菌,通常是从带有巴斯德氏菌肺病的家畜肺中分离出来的(Collier等,1962)。白细胞毒素被鉴定为潜在的毒性因子(Benson等,1978;Berggren等,(1981)),在大肠杆菌中产生的重组蛋白用于免疫家畜以预防纤维性肺炎(Harland,等,1992)。为达到本发明的目的,白细胞毒素被用作样板抗原以证实经皮传递疫苗抗原可在小鼠中诱发免疫应答,例如,抗体反应。
如实施例1所述,根据上述方法制备的双相脂小泡包含白细胞毒素。将小泡形成脂类、即氢化磷脂酰胆碱和胆甾醇溶于丙二醇中(见成份含量实施例的表1)。经过制备含有抗微生物剂羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯的水溶液制备水包油乳剂。将亲脂组合物,橄榄油,甘油单硬脂酸酯,鲸蜡醇,合成蜂蜡混合在一起并在表面活性剂磷脂EFA存在的条件下与水相匀质化以形成表面活性剂稳定的水包油乳剂。
在有效形成双相多层脂小泡的条件下同时向脂类成份中加入乳剂和100mg/ml白细胞毒素的水溶液。该制品维持在40-50℃,用涡旋混合混合5分钟。获得大约0.5-10μm的双相脂小泡。
按实施例2所述制备经皮药贴。用60mg双相脂小泡的悬液填充每块药贴的贮药器,其中脂小泡含有50μg或100μg白细胞毒素。按实施例3所述将药贴贴在小鼠上,使其固定3天。3周后,经过将一块新药贴贴在各试验小鼠上并使药贴固定3天来进行重复免疫。在第21天的第二次免疫10天后,给小鼠放血并分析血清中白细胞毒素特异性抗体,如实施例3所述。
结果在图4中显示,其中显示了含安慰剂的双相脂小泡的对照药贴和含有包埋于双相脂小泡中的50μg或100μg白细胞毒素的药贴在405nm下的光密度。结果表明用来自双相脂小泡的50μg或100μg白细胞毒素经皮用药免疫后可获得明显的抗体水平。
图5显示了从对照和使用本发明以白细胞毒素免疫的小鼠分离的大量脾细胞的增生反应。从免疫的和对照的小鼠中分离了大量脾细胞且经过在25μg/ml白细胞毒素存在下培养细胞测量增生。结果表示为3个独立实验的平均刺激指数,如实施例4所示。
图6显示了以斑点酶联免疫吸附试验(ELISA)测量的大量脾细胞分泌的白细胞介素-4。测量了从对照和白细胞毒素免疫的小鼠分离的脾细胞分泌的IL-4。按下文所述,在免疫程序后,分离了脾细胞并与白细胞毒素接触。如实施例5所述,经过计数分泌IL-4的集落数鉴定产IL-4的细胞。
在为支持本发明进行的其它研究中,制备了含鸡蛋溶菌酶的双相脂小泡且经皮传递给动物。如实施例6所述,制备了含有包埋了鸡蛋溶菌酶的脂小泡的经皮传递装置。如I-V号所示,制备了5种不同的双相脂小泡配制品。各配制品含有形成脂小泡的脂类,氢化磷脂酰胆碱和胆甾醇,且在水包油乳剂的成份上有区别。各配制品含有20mg/ml鸡蛋溶菌酶。
如实施例7所述,经过将该装置附着在小鼠上并测量诱发的免疫反应体内试验5种不同的经皮配制品。经过在两个免疫时间点的每一次粘附一块新的药贴进行3天的给药以3周的间隔免疫试验动物。第二次免疫后10天,处死小鼠以评价对鸡蛋溶菌酶的免疫反应。
图7是显示试验动物血清中鸡蛋溶菌酶特异性IgG反应的柱形图,按实施例7所述以在405nm下的光密度进行测量。该数据显示从试验动物血清中鸡蛋溶菌酶特异性IgG滴度证实所有这些试验配制品均能有效地诱发免疫应答。用V号脂小泡配制品免疫的小鼠在血清中具有最高水平的抗原特异性IgG。对于所有的试验配制品,抗鸡蛋溶菌酶IgG反应被鉴定为主要是IgG1亚类,如表2所示。
表2
配制品 | 鸡蛋溶菌酶特异性IgG同种型(GM)* | |||
IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | |
对照 | <40 | <40 | <40 | <40 |
I | 402000 | 365 | 445 | 749 |
II | 77040 | 1352 | 395 | 1681 |
III | 728900 | 460 | 471 | 5964 |
IV | 260400 | 490 | 1505 | 454 |
V | 1335000 | 2036 | 3450 | 4379 |
*滴度表示为5个小鼠的几何平均值。
图8A-8D是显示体外局部免疫来自双相脂小泡配制品I-V号每一种中的50μg鸡蛋溶菌酶后大量脾细胞(图8A-8B)和引流的淋巴节细胞(图8C-8D)分泌白细胞介素-4和干扰素-γ的布点图。按实施例8所述在20μg鸡蛋溶菌酶存在下培养细胞,以ELISAPOT评价***和脾中分泌白细胞介素-4和干扰素-γ的细胞频率。可见体外抗原刺激来自这些组织的细胞显示相对于干扰素-γ而言白细胞介素-4反应占主导地位。
通过经皮和皮下施用包埋于双相脂小泡中的50μg鸡蛋溶菌酶检查了用药途径的效力。免疫后,使用ELISA分析小鼠血清的抗鸡蛋溶菌酶的水平。在图9中可见,经皮途径诱发的鸡蛋溶菌酶特异性抗体反应与经皮下用药获得的反应相当。
根据已知的免疫活化机制技术人员可确定免疫的时间和剂量。用免疫原免疫后,免疫反应遵循特征的方式。开始,在免疫受试者的免疫时间和抗体水平对数增加之间出现延迟期。开始接触免疫原导致抗体水平增加,且主要是针对免疫原抗原性表位的IgM抗体,在免疫大约3周后逐渐减少。在第一次接触3至4周后的随后免疫攻击导致强烈的免疫应答,其中主要的抗体类型是IgG类。这种次级免疫应答强度更大,持续时间更长。
一般来说,确定针对抗原的合适反应的免疫方案落在本领域已知的参数中。具体免疫原的剂量取决于其抗原性潜力,抗原决定簇的大小和多样性,以及免疫原剂刺激抗原呈递细胞的能力。不同类型免疫原的剂量范围的例子参见下面表3。
表3
免疫原 | 初次剂量 | 最终加强剂量 |
可溶性及膜蛋白 | 10-100μg | 达到500μg |
核酸 | 200μg | 200μg |
真核细胞 | 2-20×106 | 2-20×106 |
细菌细胞 | 50μg | 50μg蛋白质 |
病毒 | 50μg;107个颗粒(每周3次剂量) | |
真菌抗原 | 20-100μg | 10-100μg |
在包括细菌或病毒的免疫方案中,使用免疫原的减毒形式以防止感染疾病。经过将它们暴露在例如,高温、化学变性剂中或经过将它们在厌氧条件下生长可减毒或灭活细菌和病毒。免疫原的化学修饰可包括免疫原的甲酰化、甲基化,乙酰化或自身交联或与其它修饰剂交联。
免疫原不必以纯的形式才有效。为了保证特定表位或多个表位的最佳机会以及免疫应答具体类型(体液与细胞)的最佳机会,可进一步纯化或合成免疫原。例如,共价附着于蛋白质上的小的化合物可用于刺激对选定表位特异性的体液应答。另一方面,可寻求分别经过呈递到第I类或第II类主要组织相容性复合物上刺激特定T细胞类型,例如细胞毒性细胞或辅助细胞的肽,这对于抗原加工和呈递领域的技术人员而言是已知的。
VI.实施例
下面实施例说明了本发明装置的制备和使用。这些实施例并不打算限制本发明的范围。
实施例1
含白细胞毒素的双相脂小泡的制备
A、脂类成份的制备
将脂成份,氢化磷脂酰胆碱(Phospholipon 90HTM,NattermanGmbH,德国)和胆甾醇以表1所示的量与丙二醇混合且混合时加热到大约65-75℃之间。
B、水包油乳剂的制备
经过将表面活性剂亚油酰氨基丙基丙二醇—氯化二monium磷酸盐(Phospholipid EFATM,Mona Industries Inc.,Patterson,NJ)羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯以表1所示量在蒸馏水中混合制备水包油乳剂。
在一个分离的容器中,将亲脂成份橄榄油,甘油单硬脂酸酯,鲸蜡醇和合成蜂蜡混合在一起。
将水相和油相在高压匀浆机(H-5000 Laboratories HomogenizerMicrofluidic Corp.)中以40psi混合20分钟。肉眼可见,乳剂是具有水稠度的乳状溶液。
C、双相脂小泡形成
将脂成份和水包油乳剂以50-300rpm经涡旋或螺旋浆混合在一起。
表1
成份 | %(W/W) |
氢化磷脂酰胆碱 | 7 |
胆甾醇 | 2 |
丙二醇 | 7 |
10mg/ml溶于水中的白细胞毒素 | 20 |
磷脂EFAJ | 4 |
羟苯甲酸甲酯 | 0.15 |
对羟苯甲酸丙酯 | 0.05 |
橄榄油 | 4 |
甘油单硬脂酸酯 | 1 |
鲸蜡醇 | 0.6 |
合成蜂蜡 | 0.28 |
蒸馏水 | 53.92 |
实施例2
经皮装置的制备
按如下所述用如下材料制备经皮装置。
背衬层从热密封的聚酯膜ScotchpakTM1009(3M公司,St Paul,MN)上剪下使直径为18mm。
将具有外径为18mm,内径为10mm的药用级转移粘合剂(3M公司,#9871)圆环片贴到背衬层上。
从转移粘合剂上取下可剥离离型纸并用外径为18mm,内径为10mm的泡沫环(ARCare 7298 Medical Foam,Adhesives Research,Inc.,Clen Rock,PA)固定在粘合剂覆盖的背衬层。不与背衬层接触的环边缘用医用级粘合剂覆盖。
用60mg双相脂小泡悬液填充药贴,其中该小泡含50μg或100μg白细胞毒素且按实施例1所述制备。
填充后,将PeCapTM膜(3M公司的聚酯HCT-51)剪成具有12mm外径的盘片,并贴到泡沫环的边缘。
将18mm可剥离离型纸圆片(3M公司#1022)贴到药贴的皮肤侧。
该装置具有18mm外径,活性传递区域为7.8mm2。
实施例3
经皮施用来自双相脂小泡的白细胞毒素
在6-8周龄的雌性Balb/c小鼠上试验按实施例2所述制备的装置(动物资源中心(Saskatchewan大学))。经过吸入卤烷(MTCPharmaceuticals,Cambridge,Ontario)麻醉小鼠,用电动剃须刀去掉背部区域毛发。剃毛24小时后将含疫苗配制品的药贴贴到去毛的皮肤上并用塑料绷带固定药贴,药贴固定3天。在第21天重复免疫,10天后给动物放血,按如下所述分析血清中白细胞毒素特异性的抗体滴度。
经ELISA测定白细胞毒素特异性的抗体滴度。用溶于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中的纯化的白细胞毒素(0.05μg/孔)覆盖96-孔平板(Immulon2;Dynatech Laboratories,Alexandria,VA)。平板在4℃培养过夜,然后在含0.5%明胶的PBS-T中洗涤4次。在PBS-T中制备4倍稀释的小鼠血清并分配成200μl体积。培养平板1小时并洗涤。1/5,000稀释的亲和纯化的马抗小鼠IgG(H&L)-生物素缀合物(Vector Laboratories Inc.,Toronto,Ontario)用作检测抗体。培养2小时及随后洗涤4次后,在室温下加入在PBS-T(含0.5%明胶)中的1/10,000稀释的链霉抗生物素蛋白—碱性磷酸酶(BIO/CAN)1小时。Di(Tris)对硝基苯基磷酸盐(PNPP,Sigma化学公司,St,Louis,MO)用作生色底物。10分钟后在405nm(Bio-Rad,Richmond,CA)下阅读吸光率。
结果在图4中显示,其中显示了用对照药贴(药贴贮药器中含安慰剂双相脂小泡)处理的动物和用含有包埋于双相脂小泡中的50μg或100μg白细胞毒素的药贴处理的动物在405nm下的光密度。
实施例4
脾细胞对白细胞毒素的增生反应
从未免疫的和免疫的小鼠中无菌取出脾脏并撕破通过尼龙筛。使用TRIS缓冲的氯化铵(0.75%)在1分钟裂解步骤中去掉大多数的红细胞。具核的脾细胞洗涤2次并随后重悬于培养基中。
培养基由补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma化学公司),2mM L-谷氨酰胺(Gibco-Life Technologies),100μm非必需氨基酸(Gibco-Life Technologies),1mM HEPES(Gibco-LifeTechnologies)和5×10-5M 2-巯基乙醇(Sigma化学公司)的AIM-V(Gibco-Life Technologies,Burlington,Canada)组成。
A.增生
2×10-5个脾细胞以100μl体积分配进微滴板的孔中。将各种浓度的白细胞毒素抗原以100μl体积一式三份加入各孔中。培养3天后,用0.4μCi/孔浓度的[3H]胸苷(Amersham,Oakville,Canada)标记细胞。18小时后收获细胞,经液闪计数评价胸苷的掺入。表示为刺激指数(有抗原时每分钟的计数/无抗原时每分钟的计数)的增生反应在图5中显示。
实施例5
分泌白细胞介素-4(IL-4)的脾细胞的定量
按以前所述(Czerkinsky等,1988)使用白细胞介素-4特异性的ELISPOT试验。简单地说,在37℃下5%CO2中,在有或无白细胞毒素(0.5μg/ml)的培养基中培养脾细胞。洗涤细胞2次并以合适的浓度重悬于培养基中。在环境温度下用在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中稀释的2μg/ml纯化的抗小鼠白细胞介素-4(IL-4)(11B11,Pharmingen,San Diego,CA)包被硝酸纤维素平板(Miuipore Multiscreen-HA;Miuipore,Bedford MA)2小时。经过在含0.05%Tween 20(Sigma Chemical Co.)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(PBS-T)中洗涤一次并用PBS洗涤3次去掉未结合的抗体。随后在培养基中封闭2小时。倾去培养基并以一式三份向孔中加入100μl的各细胞悬液。培养过夜后,在冷的PBC-T中洗平板以去掉所有细胞。
使用在0.1%BSA/PBS中稀释到3μg/ml浓度的生物素标记的对小鼠IL-4特异性的抗体(BVD5-24G2,Pharmingen)完成对IL-4的夹心ELISA。向各孔中加入100μl各悬液并在环境温度下培养2-4小时。在PBS-T中洗涤平板3次。制备在0.1%BSA/PBS中1/1000稀释的链霉抗生物素蛋白—碱性磷酸酶(BIO/CANScientific,Mississauga,Ontario,Canada)并分配成100μl体积。在环境温度下培养2小时,随后在PBS中连续洗涤8次。按如下制备底物:将5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)(Sigma Chemical Co.)溶于二甲基甲酰胺(Sigma化学公司)得到14mg/ml至15mg/ml的浓度,将1.5mg加入到10ml含3mg氮蓝四唑(NBT)(sigma化学公司)的15mM硼酸盐缓冲液(pH9.8)中。加入氯化镁至5mM浓度。过滤底物且向每孔中加入100μl体积,在室温培养10-60分钟,在蒸馏水中洗涤平板,并随后空气干燥。使用解剖显微镜计数代表过夜培养期间脾细胞分泌IL-4的位置的斑点。结果在图6中作布点图,其中数值表示为每5×105个细胞中染色斑阳性的数目。
结果表示为从4只小鼠合并的脾细胞的平均标准偏差,且反映了分泌白细胞介素-4的细胞的活化。白细胞介素-4也称为B-细胞生长因子-1,它是T-细胞产生的细胞因子,触发抗原引发的B-细胞增生。IL-4不仅刺激B-细胞的增生,而且增强MHC-II型在抗原呈递细胞表面的表达以及T-细胞的细胞毒性活力的激活。
实施例6
制备含有包埋于双相脂小泡中的鸡蛋溶菌酶的经皮装置
根据实施例1的方法将鸡蛋溶菌酶(Sigma,St.Louis,Mo)配制在双相脂小泡中。制备5种不同的双相脂小泡,本文称为配制品I-V号,在脂小泡脂双层中包含氢化磷脂酰胆碱(PhospholiponTM 90H)和胆甾醇。配制品的区别主要在于水包油乳剂的组成,各配制品包含20mg/ml鸡蛋溶菌酶。
经皮用药贴按实施例2所述制备,且用60mg的一种配制品填充以获得每片药贴100μg剂量的鸡蛋溶菌酶。
实施例7
鸡蛋溶菌酶的经皮用药
雌性Balb/c小鼠为6-8周龄,且由动物资源中心(Saskatchewan大学)提供。经过吸入卤烷(MTC Pharmaceuticals,Cambridge,Ontarto)麻醉小鼠,用电动剃须刀在背部去毛。将含不同双相脂小泡疫苗配制品I-V号的药贴(实施例6)贴到去毛的皮肤上,用塑料绷带固定和保护住,以3周的间隙免疫动物2次并在最后一次免疫10天后将动物安乐处死以评价对鸡蛋溶菌酶的免疫应答。对于每次免疫,使用新鲜制备的药贴并贴3天。
经ELISA测定对鸡蛋溶菌酶特异性的抗体滴度。用在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中的纯化的鸡蛋溶菌酶(0.05mg/孔)包被96孔平板(Immulon2;Dynatech Laboratories Inc.,Alexandria,VA)。平板在4℃培养过夜然后在含0.5%明胶的PBS-T中洗涤4次。在PBS-T中制备4倍稀释的小鼠血清并分配成200μl体积。将平板培养1小时并洗涤。使用1/5000稀释的亲和纯化的马抗小鼠IgG(H&L)-生物素缀合物(Vector Laboratories Inc.,Toronto,Ont)作为检测抗体。培养2小时并随后进行4次洗涤后,在室温下加入在PBS-T(含0.5%明胶)中1/10,000稀释的链霉抗生物素蛋白—碱性磷酸酶(BIO/CAN)1小时。Di(Tris)对硝基苯基磷酸酯(PNPP,Sigma)用作生色底物。10分钟后在405nm下读吸光率(BIO-RAO,Richmond,CA)。结果在图7中显示。
实施例8
定量分泌IL-4和INF-γ的脾和淋巴细胞
从未处理过的和免疫过的小鼠中无菌摘取脾脏并撕破使通过尼龙筛,使用TRIS缓冲的氯化铵(0.75%)在1分钟的裂解步骤中去掉大多红细胞。洗涤细胞2次并随后重悬于培养基中。
培养基由补充了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma化学公司,St Louis,Missouri),2mM L-谷氨酰胺(Gibco,LifeTechnologies),100μM非必需氨基酸(Gibco,Life Technologies),和5×10-5M 2-巯基乙醇(Sigma化学公司)的AIM-V(Gibco,LifeTechnologies,Burlington,Canada)组成。
ELISPOT试验用于定量分泌白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)的细胞的频率。简单地说,脾细胞在37℃下5%CO2中在有或无鸡蛋溶菌酶(2μg/ml)的培养基中培养。洗涤细胞2次并以适当浓度重悬于培养基中。用在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中稀释的2μg/ml纯化的抗-小鼠IL-4(11B11)或抗小鼠IFN-γ(R4-6A2)(Pharmingen,San Diego,CA)在环境温度下包被硝酸纤维素平板(Millipore Multiscreen-HA;Millipore,Bedfood,MA)2小时。经过在含0.05%Tween20(Sigma公司)的磷酸盐缓冲液(PBS)(PBS-T)中洗涤1次并用PBS洗涤3次去掉未结合的抗体。随后在培养基中封闭2小时。倾去培养基并以一式三份向孔中加入100μl各细胞悬液。培养过夜后,在冷的PBS-T中洗涤平板以去掉所有的细胞。在0.1%BSA/PBS中将对小鼠IL-4(BVD6-24G2)或IFN-γ(XMG1.2)特异性的生物素标记的抗体(Pharmingen)稀释成3μg/ml的浓度。向各孔中加入100μl各悬液并在环境温度下培养2-4小时。平板在PBS-T中洗涤3次,制备在0.1%BSA/PBS中1/1000稀释的链霉抗生物素蛋白—碱性磷酸酶(BIO/CAN Scientific,Mississawga,Ont,Candda)并分配成100μl体积。在环境温度下培养2小时,随后在PBS中连续洗涤8次。按下述制备底物:将5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)(Sigma化学公司)溶于二甲基甲酰胺(Sigma化学公司)以达到15mg/ml浓度,将1.5mg加入含3mg氮蓝四唑(NBT)(Sigma化学公司)的10ml 15mM硼酸盐缓冲液(pH9.8)中。加入氯化镁至5mM浓度。过滤底物且向孔中加入100μl体积在室温下培养10-60分钟。在蒸馏水中洗涤平板并随后空气干燥。使用解剖显微镜计数斑点。数值表示为每5×105个细胞染色斑点阳性的数目且在图8A-8D中显示。
尽管本发明针对具体实施方案进行了描述,但在不偏离本发明的前提下做出各种改变和修饰对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
Claims (28)
1、一种用于经皮施用免疫原以在个体中诱发针对免疫原的免疫应答的组合物,包含
一种具有含水包油乳剂的中央核心区室的双相脂小泡悬液,和
包埋于双相脂小泡中的一种免疫原。
2、权利要求1的组合物,其中免疫原选自来自细菌、病毒、寄生虫、植物和真菌来源的抗原。
3、权利要求1的组合物,其中免疫原可有效引发体液免疫应答。
4、权利要求1的组合物,其中免疫原可有效引发细胞介导的免疫应答。
5、权利要求1的组合物,它进一步包括包埋于脂小泡中的佐剂。
6、权利要求1的组合物,其中脂小泡悬液进一步包括皮肤穿透增强剂。
7、权利要求6的组合物,其中的穿透增强剂选自脂酰化氨基酸和不饱和的脂肪酸。
8、一种用于在个体中诱发针对免疫原的免疫应答的方法,包括:
经皮给所说的个体施用一定剂量的所述免疫原,所说的免疫原包埋于具有含水包油乳剂的中央核心区室的双相脂小泡中。
9、权利要求8的方法,其中的免疫原是细菌,病毒或真菌来源的抗原。
10、权利要求8的方法,其中的免疫原可有效诱发体液免疫应答。
11、权利要求8的方法,其中的免疫原可有效诱发细胞介导的免疫应答。
12、权利要求8的方法,它进一步包括包埋于脂小泡中的一种佐剂。
13、权利要求8的方法,其中所说的脂小泡悬液包含于适于其保存的贮药器中。
14、权利要求13的方法,其中所说的贮药器由不通透的背衬件和有效用于使所说的脂小泡从所说的贮药器传递的膜所限定。
15、权利要求8的方法,其中所说的脂小泡悬液进一步包括穿透增强剂。
16、权利要求15的方法,其中所说的穿透增强剂选自脂酰化氨基酸和不饱和的脂肪酸。
17、用于给个体经皮施用免疫原的方法,包括,
给个体皮肤贴上一种装置,所说装置包括:
(i)经过将水包油乳剂与形成小泡的脂类混合形成的脂小泡悬液,所说的小泡由下述部分组成:(a)由所述的小泡形成脂组成的脂双层外膜,(b)含所述水包油乳剂的中央核心区室和(c)包埋于所述小泡中的有效诱发免疫反应剂量的免疫原;
(ii)适于保持所说的脂小泡悬液且适于从其中释放脂小泡的贮药器;和
(iii)将该装置附着到个体上以经皮施用所述免疫原的工具。
18、权利要求书17的方法,其中所述的贮药器由不通透的背衬件和有效用于使所述脂小泡从所述贮药器传递的膜限定。
19、权利要求书17的方法,其中所述的脂小泡悬液包括通透增强剂。
20、权利要求书19的方法,其中所述的穿透增强剂选自脂酰化氨基酸和不饱和脂肪酸。
21、权利要求书17的方法,其中所述的用于附着的工具是邻近所述膜的粘合层。
22、权利要求书17的方法,它还包括包埋于所述脂小泡中的佐剂。
23、一种用于经皮施用免疫原的装置,包括:
由水包油乳剂与小泡形成脂类混合形成的脂小泡悬液,所述的小泡由下述成份组成:(i)由该小泡形成脂组成的脂双层外膜,(ii)含该水包油乳剂的中央核心区室和(iii)包埋于所述小泡中的有效诱发免疫反应剂量的免疫原;
适于保持所述悬液且适于从其中释放脂小泡的贮药器;
和用于将该装置附着在个体上以经皮施用所述免疫原的工具。
24、权利要求书23的装置,其中所述的贮药器由不通透的背衬件和有效用于使所说的脂小泡从所述贮药器中传递的膜限定。
25、权利要求书23的装置,其中所述的的脂小泡悬液包含一种穿透增强剂。
26、权利要求书23的装置,其中所述的穿透增强剂选自脂酰化氨基酸和不饱和的脂肪酸。
27、权利要求书23的装置,其中所述的用于附着的装置是邻近所述膜的粘合层。
28、权利要求书23的装置,还进一步包括包埋于所述脂小泡中的一种佐剂。
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