CN100336904C - 一种来自水稻的病原和化学诱导型启动子及用途 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种从水稻中分离到的能被稻瘟菌侵染和水杨酸、茉莉酸诱导，可以作为病原和化学诱导型启动子使用的DNA序列片段，该DNA序列片段是水稻过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶基因(POG)的转录调控区，其特征是它具有SEQ ID NO：1所示的第1位到第2789位的启动子区核苷酸序列。对该核苷酸序列进行一个或多个核苷酸序列的***、替换和/或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的的。本发明可以作为病原和化学诱导型启动子使用，作分子标记探针，水稻中再分离调控序列，或用于其它转基因植物的相关调控序列，培育抗病植物中的应用。

Description

一种来自水稻的病原和化学诱导型启动子及用途

发明领域

本发明属于植物基因工程领域，本发明提供了一种能被病原物以及水扬酸(SA)、茉莉酸(JA)诱导激活而启动与其相关联的DNA转录的诱导型基因启动子，本发明涉及包含该可诱导型基因启动子或其衍生变体的载体，宿主和细胞，本发明提供的该启动子可作为病原体诱导型启动子应用于驱动赋予植物宿主以病原体抗性的基因表达，或因水扬酸和茉莉酸等化学物质处理而诱导目的基因表达中使用。

技术背景

植物在生长过程中会受到成百上千种微生物的影响，在与这些微生物长期作用过程中，植物逐渐进化出多种抵御周围潜在病原物侵袭的防御机制，以使其自身在与多种微生物的竞争中获胜。总体看来，植物对病原物的抵御机制分组成性的被动防御和诱导性的主动防御两类，诱导性的主动防御在植物抵御病原菌中起主导作用(Agrios，Plant PathologyFourth edition 1999)。伴随对病原菌的抗性表达，寄主植物在病原菌侵染位点周围常常迅速发生局部的细胞死亡，即过敏性反应(hypersensitive response，简称HR)。从寄主植物与病原菌之间R/Avr的识别，到植物抗病相关基因的表达，其中涉及了一系列复杂的信号识别、转导及级联放大的过程。在某些情况下植物对病原物的防御并不成功，导致植物感病，但是在这种情况下植物也发生对病原侵入的应答反应，只是应答反应的速度太慢或程度太轻，使植物来不及将信号传递给防御***，而对病原作出有效抵抗。

研究表明脂氧合酶(LOX)途径与植物对病原物的防卫反应密切相关。植物体内的亚麻酸(Linolenic acid)和亚油酸(Linoleic acid)等多不饱和脂肪酸在有氧条件下经脂氧合酶催化加氧，生成过氧羟基脂肪酸(fatty acid hydroperoxide)，再经一系列不同酶的作用最终生成具有一定生理功能的代谢产物。由于这一代谢途径的关键酶是脂氧合酶，它所催化的反应控制着该途径的反应速度，是这一代谢途径的限速步骤，因此被称为脂氧合酶途径(Gardner，Hort.Science 30：197-205，1995)。脂氧合酶途径与植物的防卫反应主要表现在以下三个反面：1.参与植物过敏性反应，在植物受病原物侵染是LOX及其相关酶活性增加与HR反应过程一致(Berkman，Ingram，Physiol.Mol.Plant.Pathol.，45：229-246，1994；Barker，Orlandi，Aunu.Rev.Phytopathol.，33：299-325，1995；Shewfelt，Purvis，Hort.Science，32：213-218，1995)；2.合成诱导植物防卫基因表达的信号分子，由LOX途径合成的茉莉酸类化合物能激活植物防卫基因的表达，使植物产生对病原物的抗性(Dixon，Lamb，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，41：339-3671990；Choi，Bostock，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：2329-2333，1994)。3.参与抗菌物质的合成，在植物LOX途径中，过氧羟基脂肪酸通过氢过氧化物裂解酶催化的分支代谢途径产生大量如醛类、二乙烯乙醛类等具有较高抗菌活性的中间产物或终产物(Stumpe等FEBS Letters，507：372-376，2001；Itoh等，J.Bio.Chem.276：3620-3627，2001)。

过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(POG)是参与LOX途径的末端酶，能催化依赖于过氧羟基化合物和过氧化氢的羟基化反应(Ishimaru等J.Biol.Chem.252：199-204，1977)以及环氧化反应(Gardner等，J.Biol.Chem.268：6971-6977，1993)。POG在过氧羟基脂肪酸化合物的代谢中具有重要作用，其催化活性已经在许多种植物如豌豆、大豆、水稻、玉米和马铃薯块茎中被发现(Blee等，J.Biol.Chem.，265：12887-12894，1990)。并且已有报道(Ohta等Plant Cell Physiol.31：1117-1122，1990和Plant Physiol.97：94-98，1991)表明在水稻在受稻瘟病侵染时能强烈诱导POG活性的迅速增加，催化LOX产物形成羟基或环氧羟基脂肪酸等抗菌化合物，并引起氧化脂肪酸类植保素的合成。

启动子是调控基因转录的DNA序列，通常位于所调控表达基因的的上游，具有应答于发育或环境刺激或以组织特异性方式来改变基因的表达。利用能感受病原菌诱导的基因启动子的调控作用就可使防卫基因在植物体内有选择地表达，有效地防治病害。达到这一目的有两个手段可供选择，一是分离和利用合适的受病原物诱导的植物基因启动子来与防卫基因相连形成嵌合基因转化植物，曾有报道将伤害诱导的启动子与马铃薯蛋白酶抑制剂基因相连转化水稻，成功获得了抗螟虫的转基因水稻(Duan等，Nature Biotech.14：494-498，1996)。另外就是分离调控防卫基因诱导表达的反式作用因子，然后用调控该因子的表达来调控目标基因的表达。确定基因启动子区域中对该基因诱导表达重要的顺式作用元件是分离与其特异互作的反式作用因子的基础，将启动子区域部分缺失并与报告基因融合转化植物，通过检测报告基因的表达情况可以确定对诱导表达重要的顺式调控元件。目前运用这种方法已经从防卫基因启动子区域发现了一些与病原菌侵染诱导表达有关的特异顺式调控元件(Dixon等，Annu.Rev.Phytopathol，32：479-501，1994；Grary等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：9230-9234 1992)。

水稻POG基因及其转录调控区核苷酸序列至今还未见报道，由于已知其能被稻瘟菌强烈诱导表达，并且推测其参与了抗病信号传导。因此其转录调控区就包含了能迅速应答病原物刺激的启动子元件，使用POG基因启动子与赋予植物宿主以病原体抗性的基因相连，转入感病植物，就可在病原体侵入的情况下启动相关联的目的基因在植物宿主中表达，赋予植物有效抗击病害的能力。

同时大量研究表明水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)作为关键的内源信号分子参与许多植物防御基因的转录调控和HR反应(Durner等，TrendsPlant Sci.，2：266-274，1997；Penninckx等，Plant Cell，8：2309-2323，1996)，据推测在植物和病原互作时，针对不同的病原物，植物可能采取JA介导的和/或SA介导的独立的防卫信号转导途径来调控相应的防卫反应(Thomma等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：15107-1511，1998)。但具体机制仍不清楚，作为调控抗病信号传导的参与者，POG基因启动子还能提供定性鉴定细胞对SA和JA的应答中涉及的顺式元件、转录因子和上游信号成分的机会。为理解植物抗病信号传导提供依据。

发明内容

本发明的目在于提供一种POG基因的转录调控区核苷酸序列或其具有相同功能的类似物衍变体核苷酸序列片段，是一种能被病原物如稻瘟菌侵染以及化学的刺激如水扬酸(SA)、茉莉酸(JA)诱导激活而启动与其相关联的DNA转录的诱导型启动子。可驱使在病原体或化学物质诱导情况下与其相关联的目的基因在植物宿主中表达，赋予植物有效抗击病害、虫的能力。具体地讲，是从水稻中分离到的诱导表达的启动、转录的调控区DNA片段，其特征是它具有与SEQ ID NO：1所示的的第1位到第2789位的启动子区核苷酸序列，而且还应当指出的是，对本发明的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸序列的***、替换和/或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的的。因而本发明也包括与SEQID NO：1所示的核苷酸序列具有至少50％的同源性，优选至少90％的同源性，并同时具有相同功能的类似物。

本发明的另外一个目的还包括提供含有上述诱导型启动子序列及其具有相同功能的类似物衍生变体的表达载体和其重组宿主细胞。重组宿主细胞有重组微生物和重组植物细胞，重组微生物包括重组细菌或/和重组酵母，重组微生物其中有重组农杆菌，尤其是重组农杆菌EHA105，重组植物细胞优选水稻重组植物细胞。根据本发明提供的诱导型启动子，可以构建包含该启动子的双元表达载体，其启动子下游可以嵌合使用者所感兴趣的将要表达的基因。这些基因根据来源可以是水稻中既存的，也可以是水稻之外的可表达的异源基因(如无毒基因等)；可以是抑制病原菌扩展的基因(如防卫基因等)。一般实验者均可以从相关的科技文献、数据库或手册中选取这些感兴趣的基因。构建本发明中的表达载体技术是本领域的普通技术人员掌握的，可依据Sambrook等(分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室1989)等文献的相关内容进行操作。同样道理，用上述的表达载体转化微生物细胞可以得到重组的微生物，利用重组农杆菌转化植物细胞可以得到重组植物细胞。这种技术也是本技术领域的一般技术人员可以实现的。

本发明还包括至少含有一个这样重组植物细胞或始于这样细胞发育的植物或植物部分组织。

本发明还涉及提供一种培育抗病植株的方法，其特征是使用本发明如上所述的DNA序列及其具有相同功能的类似物衍变体与直接或间接抑制、破坏病原菌扩展和生存的基因，植保素合成基因或其产生过程中关键的酶类基因，以及能在水稻中表达的可有效抑制病菌扩展的异源基因(如无毒基因，反义RNA等)相嵌合，形成融合DNA序列，并直接或用含该融合序列的载体转化植物，获得抗病或耐病植株，本发明的表达载体转化植物可以通过多种途径进行转化，本发明的实施例优选农杆菌介导法转化植物。

本发明还包括一种在植物中表达蛋白质的方法，其特征是将本发明启动子与编码目的基因的DNA片段进行可操作连接以作为调控区使用，具体地说，其中所述启动子可由水杨酸、茉莉酸或其类似物诱导激活，而启动目的基因表达。

为了对上述发明内容和涉及的各种词语的含义的进一步的理解，再做如下说明：

本发明采用由蛋白纯化到基因克隆的方法。从稻瘟菌诱导的水稻cDNA文库中克隆到了过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(POG)基因，其序列显示于SEQID NO：2，以其为探针筛选水稻基因组文库，获得了包含该基因的基因组片段，从中了克隆基因5’端调控序列，该序列具有SEQ ID：1所示的碱基序列，其启动子活性优选的由稻瘟菌侵染诱导，同时也能被水扬酸和茉莉酸诱导，所调控的基因转录产物的积累随处理时间的延长而增加，通过分析推测该序列的调控作用是水稻抗病信号传导的一部分。

本说明书中涉及5’端调控序列主要是指从转录起始位点(对应于SEQID：1第2290位核苷酸)开始的5’端上游序列，对应于这段序列包含控制下游基因表达的重要顺式调控元件。同时包括从转录起始位点到下游翻译起始位点ATG(对应SEQ ID：1第2786至2788位核苷酸)之间的序列。根据序列特征将该序列的重要启动子元件定位如下：转录起始位点定位为1位，TATA盒(对应于SEQ ID：1第2265至2270位核苷酸)位于-25至-20位，CAAT盒(对应于SEQ ID：1第2209至2212位核苷酸)位于-79至-76位。

本发明中调控序列片段的“克隆”是指从自然界天然水稻基因组中分离出的，可以不经任何改变直接单独利用的一段启动子序列。按照本发明的序列，可以设计上下游一对引物，用PCR技术再次获得，也可以利用设计其标记探针从水稻基因组文库中筛选获得，甚至可以用经典的酶法或化学方法合成获得，这些途径都是本领域一般技术人员可以做到的。

本发明中的基因5’端调控序列的“衍生变体”指在SEQ ID NO：1序列中1到2789位核苷酸之间序列的基础上，经片段缺失、碱基改变、碱基添加或再次分离的一部分、几部分或其组合。

本发明中的基因5’端调控序列及其衍生变体的启动子活性可以通过在启动子下游嵌合报告基因，诸如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，以GUS的表达情况得以确认。一个较佳的实施例是利用Jerfferson等(EMBO J.，6：3901～3907，1987)建立的成熟的方法。根据本发明的实施例，得到了基本上由基因组中掺入了一个或多个拷贝的上述嵌合DNA片段的细胞组成，且能够将一个或多个拷贝传递给后代的植物，该DNA片段能特异驱动报告基因在宿主植物细胞中以预期的方式表达。

本发明还提供了启动子顺式元件所在的大致区段，为此构建了从其5’端逐级缺失的衍生变体，并嵌合到去掉35S的双元载体pCAMBIA1301(Jerfferson教授提供)的GUS基因之前，以上操作都是本领域技术人员常用的基本方法，优选的方案是设计携带合适的方便连接的酶切位点的引物，用PCR技术从原始序列中扩增获得。

本发明的优选实施方案是通过该诱导型启动子与目的基因可操作连接，将目的基因置于其控制之下，可以有目的的开关基因的表达***，这种表达***能够使植物在有利的时间或时机(如病原侵染)表达基因，使植物有效抵抗病原物的侵染。

本发明的另一个用途是将目的基因与上述诱导启动子连接，应用外源化学物(如JA、SA)诱导实现目的蛋白质在植物体内的受控表达，在这方面，SA或JA的应用可以采用任何形式，例如对植物进行叶面喷洒或灌溉。

本发明中使用包含目的基因并与上述诱导启动子连接的DNA片段导入水稻的方法在本领域是显而易见的，也是本领域一般技术人员可达到的。上述启动子或其衍生变体的活性检测以及利用该启动子进行有针对性的分子操作，都不可避免的要在植物***中进行，一个优选的实施方案是采用农杆菌介导的方法(Hiei等，Plant J.，6：271～282，1994；Hiei等，Plant Mol.Biol.，35：205～218，1997)将其导入水稻中；实验者也可根据自己的熟练程度灵活的选用以下转化方法：原生质体融合法、基因枪法、电击法、PEG法、花粉管导入法等(Horsch等，Science，234：496，1984；Barton，Cell32：1033，1983；Liu等Acta Phytophysiol.Sin，21：195～205；Horsch等Science，227：1229，1985)

根据本发明的启动子有活性的其它衍生变体，在转基因完成后，从抗性愈伤到生根后移入自然环境(如田间)的组织培养期间，转化组织或个体有类似组成型表达的活性，这是由于组织培养基中激发活性成分或组培期间其同自然植株的差异(如类似损伤)所致，在移入田间恢复后即基本失去。

本发明提供的各种序列可以用作分子标记探针，可以用作在水稻中再分离该序列，也可以用于其它植物的相关调控序列，这些都是本发明所涉及的内容。

通过以下附图说明便于更进一步理解本发明

附图说明

附图1.水稻POG基因的诱导表达动态Northern分析，图中从左至右各泳道分别是处理0、8、16、24、36、60和72小时后POG基因mRNA的转录积累，每种处理以17SrDNA为上样对照。其中A为清水模拟接种对照，B为接种稻瘟菌亲合性小种007，C为接种稻瘟菌非亲和性小种131，D为SA处理，E为JA处理，F为脱落酸(ABA)处理，G为机械损伤，H为紫外线照射。

附图2.POG基因启动子5’端不同程度缺失的各变体驱动的GUS基因表达的转基因水稻叶片的GUS诱导表达活性柱状示意图，设转入无启动子驱动的GUS报告基因的转基因水稻(WP)为阴性对照，设转入以CaMV35S启动子驱动的GUS基因的转基因水稻(35S)为阳性对照。图示说明：从左至右各种处理为SA、JA，稻瘟菌小种131、稻瘟菌小种007、机械损伤和水对照。GUS活性单位为pmol 4-MU/mg蛋白质/分钟。

具体实施方案

为了更好的理解本发明，以下通过实施例予以进一步地说明，但并非对本发明的限制。

实施例1稻瘟菌侵染诱导基因POG启动子的克隆

1.水稻过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(POG)的纯化

准备水稻品种爱知旭(Oryza sativa cv Aichiasahi)，待4-5叶抽出时，以非亲和性稻瘟病菌接种的稻叶为实验材料，通过选择性抽提膜蛋白、20％饱和度的硫酸铵沉淀去杂和45％饱和度硫酸铵盐析、DEAE-Toyopearl阴离子交换、DEAE-Sepharose阴离子交换、CM-Toyopearl(pH5.1)阳离子交换、CM-Toyopearl(pH4.5)阳离子交换和超滤浓缩等步骤，纯化了稻瘟菌侵染诱导性POG，并获得了电泳纯的酶蛋白。采用赖氨酸特异性的Lysyl endopeptidase酶解的方法，对POG的N-末端氨基酸序列进行测定，获得部分氨基酸序列。

2.POG基因的克隆

非亲和性稻瘟病菌接种的稻叶，取48h后的稻叶，异硫氰酸胍(GT)法抽取总RNA，用poly A快速mRNA纯化试剂盒(Stratagene，USA)纯化mRNA，以该mRNA为模板用ZAP Express cDNA Gigapack II Gold cloning试剂盒构建水稻抗病cDNA噬菌体文库。

根据获得的部分POG蛋白的氨基酸序列设计简并引物，从所构建的水稻抗病文库中特异扩增出一个105bp的片段，以该片段为探针筛选水稻抗病文库，经第二、三轮筛选，分离纯化候选阳性克隆，再经确认。选择包含较大***片段的噬菌体进行体外切割，释放出含有***片段的环化噬菌粒，进行序列测定。有关噬菌体文库筛选的铺板、转膜、固定、杂交切割等具体操作步骤按cDNA Gigapack II Gold cloning试剂盒说明书进行。水稻POG全基因cDNA序列如SEQ ID：2所示。

3.POG基因启动子的克隆

以水稻POG基因cDNA片段为探针筛选水稻基因组文库(由华南农业大学刘耀光教授提供，构建及筛选方法见Liu等Gene，282：247-255，2002)获得包含POG的水稻基因组DNA片段，以POG基因cDNA的5’端为探针对阳性克隆进行Southren杂交，亚克隆带有POG5’侧端序列的片段，包含该片段的质粒定名为POGH，测定序列，软件推定序列中的启动子元件。有关的Southren转膜、杂交，亚克隆等具体操作按照Sambrook等(分子克隆实验指南，1989)等文献的相关内容进行，水稻POG基因的5’调控区序列如SEQ ID：1所示的第1位到第2789位的核苷酸序列，其中第1到第2290位核苷酸为启动子区，第2291到第2789位核苷酸为5’非翻译区(5’UTR)。

实施例2 POG基因的诱导表达特性

以爱知旭(Oryza sativa cv Aichiasahi)为供试水稻品种。以对该品种为非亲和性的稻瘟菌(Magnaporthe grisea)131#生理小种和亲和性的稻瘟菌007#生理小种为接种体。稻瘟菌孢子制备方法同Peng等(Can.J.Biol.，66：730-735，1988)。在稻苗第5叶将近完全展开时，用稻瘟菌孢子悬液(106个/ml)喷雾接种水稻，然后在100％相对湿度、28℃避光培养36h后再光照培养，以0.02％ Tween-20喷雾的模拟接种为对照。分别在接种后0h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、72h时取样，取样时剪取第5叶中部。其它物理、化学处理如下：JA处理：将100μM JA的喷洒于水稻叶面，然后密封于接种箱中；机械伤害：用粗砂纸夹住稻叶后，沿叶脉方向刮擦叶面至叶面出现明显的伤痕；紫外线照射：将整株水稻叶面朝上，在紫外灯下照射15min；SA和ABA处理：分别将浓度为10mM SA或600μM ABA喷洒于水稻叶面。机械伤害、紫外线照射、SA及脱落酸(ABA)处理后，适当保湿。上述处理后0h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、72h分别取样，液氮快速冷冻后于-80℃保存备用。GT法提取总RNA，以POG基因cDNA为探针进行Northern杂交。

结果显示，接种稻瘟菌16小时后POG基因转录产物开始有积累，时间延长基因转录产物的积累也随之增加，但接种非亲合小种的材料中基因转录产物的积累要高于同期接种亲合小种的材料，表明POG基因受稻瘟菌诱导侵染诱导，诱导没有小种特异性，但非亲合性小种可强烈诱导该基因表达，推测该基因参与水稻对稻瘟菌侵染的防卫反应。SA和JA也能诱导POG基因，紫外线照射需要72小时后才能观察到基因转录产物的积累，而ABA、机械损伤几乎不能诱导POG基因表达(附图1)。

实施例3 POG启动子5’端渐变缺失衍生变体的获得

POG基因5端上游调控片段放入数据库进行检索，并用软件分析，推测其可能的顺式元件位置，然后根据这些位置，用酶切结合PCR的方法获得了6个POG启动子5′端渐变缺失片段，分别是命名为GPF(对应于SEQID.1第163至2789位核苷酸)，G200(对应于SEQ ID：1第807至2789位核苷酸)，G150(对应于SEQ ID.1第1286至2789位核苷酸)，G100(对应于SEQ ID.1第1635至2789位核苷酸)，G75(对应于SEQ ID.1第2038至2789位核苷酸)，G42(对应于SEQ ID.1第2363至2789位核苷酸)。其中GPF由人工合成的寡核苷酸引物5′tcttggcgtc gaggagc 3′和5′tcgacatcag gcgccgacga g 3′对质粒POGH进行PCR扩增得到，G200由NcoI+SpeI双酶切POGH质粒得到，G150由人工合成的寡核苷酸引物SEQ5′tcttggcgtc gaggagc 3′和5′cataagtcat ctttagtcat acc 3′对质粒POGH进行PCR扩增得到，G100由NcoI+BamHI双酶切POGH质粒得到，G75由NcoI+ScaI双酶切POGH质粒得到，G42由人工合成的寡核苷酸引物5′tcttggcgtc gaggagc 3′和5′ttagcctgct attgtacctg c3′对质粒POGH进行PCR扩增得到。

实施例4 5端上游调控片段及其一系列衍生变体的与GUS基因嵌合的双元载体构建

上述启动子5’端渐变缺失片段中，由PCR得到的克隆到T-easy载体中，分别对双元载体pCAMBIA1301和克隆到T-easy上的衍生变体用相同的限制性内切酶进行双酶切，限制性内切酶的选择T-easy上的片段用SalI+NcoI。两组双酶切后的产物分别用回收试剂盒(北京鼎国)回收：(1)双元载体pCAMBIA1301是切去原来35S的剩余部分，(2)T-easy载体是回收切下的是带启动子和其衍生变体部分。最后按一定比例分别将回收的(1)(2)两部分混合并用T4连接酶连接，实施例2中所述的用双酶切方式获得的衍生变体片段，直接与经相同双酶切的pCAMBIA1301载体相连，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，并经酶切鉴定和测序确认。

实施例5 POG启动子驱动GUS表达的融合基因转化水稻

1.双元载体转化根癌农杆菌

分别将上述双元载体质粒DNA用冻融法导入根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞，28℃培养到形成单菌落。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCR鉴定。

2.根癌农杆菌介导的水稻转化

准备水稻品种爱知旭未成熟种子，经表面消毒后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB)上，暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基(NB)上，在相同条件下继代培养5天左右；或者准备水稻成熟胚愈伤组织，挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。挑选状态较好的愈伤组织与适量农杆菌悬浮液(OD 0.3-0.5)共培养15-20分钟，转入固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天至长出抗性愈伤组织。从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过15-25天左右，有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右，即可在温室内移栽入土。

实施例6 5端上游调控片段及其一系列衍生变体启动子活性的鉴定

稻瘟菌接种：以对水稻品种爱知旭为非亲和性的稻瘟菌(Magnaporthegrisea)131#生理小种和亲和性的稻瘟菌007#生理小种为接种体。用稻瘟菌孢子悬液(106个/ml)喷雾接种水稻，然后在100％相对湿度、28℃避光培养36h后再光照培养，以0.02％ Tween-20喷雾的模拟接种(CK)为对照。在接种后48h取样，化学处理如下：JA处理：将100μM MeJA的喷洒于水稻叶面，然后密封于接种箱中；SA处理：将浓度为10mM SA喷洒于水稻叶面。上述处理经适当保湿48h后分别取样，取样时剪取第5叶中部。上述处理均设转入无启动子驱动的GUS报告基因的转基因水稻(WP)为阴性对照，设转以CaMV35S启动子启动的GUS基因的转基因水稻(35S)为阳性对照。

GUS活性的检测采用1.组织染色法：将选取的经上述处理的转基因材料进行无菌水表面清洗，用无菌吸水纸吸干后浸入GUS染色液(1mM X-Gluc，100mM磷酸缓冲液PH7.5，10mM EDTA，5mM铁***，5mM亚铁***)，抽气5分钟后放置与摇床上37℃，200rpm反应过夜，然后在95％的乙醇内脱色漂洗直至显色。2.将选取的经上述处理的转基因材料0.1克在液氮中研磨充分，加入200μl提取液(50mM磷酸缓冲液PH7.5，10mM巯基乙醇，0.1％ Triton X-100，1mM EDTA)，混合均匀，8000rpm离心10分钟，取20μl上清加入180μl用提取缓冲液配制的2mM MUG反应液，37℃保温1小时，加入20μl 0.2M Na2CO3溶液终止反应。取200μl终止后的反应液在激发波长365nm和发射波长455nm下测定荧光。通过测定反应产物4-MU的一系列稀释溶液的荧光，建立标准曲线，结合每个样品的蛋白含量，计算出酶活性，单位是4-MU pmol/mg/蛋白质/min。结果显示，转入POG启动子各缺失结构驱动GUS基因的转基因水稻在稻瘟菌和化学诱导下都能检测到GUS基因的表达，其诱导特征与POG基因一致。与阳性对照相比稻瘟菌和化学物质诱导下POG启动子各结构均表现出了比植物表达***中常用的CaMV35S启动子高得多的活性。各结构相比，G200有最高的启动子活性，G100的活性较低，而比其稍长或稍短的G150和G75都保持了较高的启动子活性。因此可以推测在SEQ ID：1第1635至2038位核苷酸存在抑制启动子活性的顺式元件，最短结构G42仍保持了很高活性，表明其中包含了启动子的核心元件(附图2)。

                          序列表

<110>中国农业大学

<120>一种来自水稻的病原和化学诱导型启动子及用途

<130>彭友良2003-2

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2789

<212>DNA

<213>Oryza sativa cv Aichiasahi

<400>1

ataaactaaa actaaacttc caatgtgtac gtatctgcgg caggattctg ctgcttgtcc       60

cccattaaat tgtaatggtt ccatcttctg cttcgccata tgatggtgct tgctactact      120

caccggcgac gacacgccta cggccgccac cgacttctgc tgctcgacat caggcgccga      180

cgagcctccg cctactcgcg ccgcggaagg cgacgcaaca gacctcgccg acgacattct      240

gccctttcca ccggagagtt tctgctccat caaaaacctg cagaacaaaa tcttcttcct      300

cacaaatccg aaagataatt gtggtcctca ttttctgtcc tccatcaccg tcaacttaaa      360

tagagtatca atacagcaac ctccacacta actactctcc tggtcgctcg gtcgtgcatg      420

cgtgcgggta acaaaccatg catgcagaac attcaaaatg actcaccatg cagaacatag      480

cgcagtgatc cgaattttca aaaaaaaaag aatattcaag tttctgcatc actggtttaa      540

tggatctttt ctcacaatcc gttagtgagt tgaagcccga aaccctgatg tgagttggac      600

aggtgtccga tggttacaat aggagtagct actcctggga gtagaatata ggcttcatat      660

atatatatat atatatatat atatagtaaa tttgtttggt gctccatggt gcccgggcac      720

cattgttgaa attgagtata tacccaattc aaatgagtat gaaacttttt gcaattactt     780

aggtattaac attaactact ttactaacta gttcaaagca tgtttgtact gaatttgaac     840

ttgtttttgt tagattttga ttctaggtat atagcatcca tacatataat tagttaggta     900

tgtaatcatg gattgtgaaa taaagttaaa tttgagttgt tttgttgata ggtatagata     960

tgaatcgaat tattataact aggtatatac tcacaatttg aaaattttga aaaatttgag    1020

tgattttgta cattagatac catggtgccc catatgagtg tcctatatag taaatttgtc    1080

ctatatatat atatatatat atgtttgttt tgtgttgaaa atatttctaa ttttttctat    1140

aaacttgttt ggacttaaaa aaaatattga ctagaaaaaa attcaaaaca acgtaaagaa    1200

aggaagtaga atttagaagt tgccctattt tggccatgtt tctttccata agtcttaggg    1260

ctaaaaatta gttctagggc taaaacataa gtcatcttta gtcataccct gtttgtttgg    1320

agggactaaa agggactaaa acctcattaa atgacctatc ttttagcact tcatccaaca    1380

cctacatgct tcatccattc aatagtaggt gcgctatagg cctttagtct aaattagcac    1440

ctcccctaga gatttatgga cctaggtaat tttagcctct tttagtccct cctgtttagt    1500

attttagggg ctaaaataga ctaaagtgaa gggacttatg attagcccct ccaaacaaac    1560

aacccgaagg gagtactgtt acatagtgat tgacacatga actgttgaca gatggaactg    1620

tcagtacacg ttggatccat gctttagacg tctcgacaat aactttggat ttgggatata    1680

ctagggaaac aacgagggaa tacaatcttc gaattctagc cttcgaccaa gtcacccgcg    1740

cgcatgtacc ttggacgacg atgttgtcca cttgccgtgc gaacgtgtgg aggtaaagcg    1800

aaaaaagact aggtaaaacc atgcaagcag cacacgcgtg cttatttact gtttagttac    1860

atggacggat gcaccaaata atttcagcta gacagcaatc attccacacg ttctcctctc    1920

ctgctccagc tccccatccc agatgaggtg gcaacaacac tgcttaaaca cgccaccatc    1980

tcggccgccg tccggccggc cgtcttcgcg agtgacgcag ctcccatcag cagcaacgag    2040

ctctgctagc tttcgtctca gcgctccgtc ctgcggtctt ttgggtctcg aatcgcctca    2100

tgtggacccc acaatcacgt tggcaaatag cagctgccct ggtgctgctt ctcacgtttt    2160

agagcaagtt taatagtggc cactgctagc tccaattcat caatagccaa taaaataatt    2220

ggcttactat actattaata tatggtctca tctgtcatac atatattatg tcttagagtc    2280

cgcgctgcag ctggctacag atctatagcc tgctgctctt ctctctcatc ttttatctca    2340

ttaaaaatat gtttacaggc tattagcctg ctattgtacc tgctcttaga gagagtgtgt    2400

cgtgggtgac tattcagtct cccntctcat ttctctgcca cctcatcact tttgccatcg    2460

tggacacact atcaccaggc tccagctaat ttttttcaat tgtacgtgct cttagtcgac    2520

gtacgtccaa tttctttctc caagaaagaa cgccgaacaa gcgccgacga aaaacggttc    2580

ctcgttattt ctctccaacg cgcgcgcacg ggctatttct acccccgccg ccgagtagtt    2640

aggcgtccaa agtttcggga gttcatcgtg aacggtgatc gatccaaaga acaacaactc    2700

ggagcaaagc tagctaacga agttagttcc aaacaaagct agcttatcgc gattagctag    2760

ctagaagaga gttagctagg cgccatgga                                      2789

<400>2

gttcatcgtg aacggtgatc gatccaaaga acaacaactc ggagcaaagc tagctaacga      60

agttagttcc aaacaaagct agcttatcgc gattagctag ctagaagaga gttagctagg     120

cgccatggag ctaggcgtgc cactgccacg acggcccgtg cccggtagct acggcgtgcc     180

gttcgtctcg gcggtgcgcg accgcctcga tttctactac ttgcaggggc aggacaagta     240

cttcgagtcg cgcgccgaga ggtacggctc caccgtcgtc cgcatcaacg tcccgcctgg     300

cccattcatg gcgcgcgacc cccgcgtggt ggcgctcctc gacgccaaga gcttccccgt     360

cctcttcgac gtcgccaagg tcgagaagcg ggacgtgttc accggcacgt tcatgccgtc     420

cacctccctc accggcggct accgcgtctg cgcctacctc gacccgtccg agcccaacca     480

cgccaagatc aagcagctgc tcctctccct cctggtctct cgcaaggacg ccttcgtccc     540

ggtcttccgc tccaatttcg gcgcgctcct cgacaccgtc gagtcgcagc tcgcgagcgg     600

cggcggcaag tccgacttca ccgccctcaa cgatgccacc tccttcgagt tcatcggcga     660

ggcgtacttc ggcgtgcgtc cctccgcgtc gagctccctc ggcaccggcg ggccgaccaa     720

ggccgccctg tggctcctat ggcagctcgc cccgctcacc acgctcggcc tgcccatgat     780

catcgaggat ccgctcctcc acacgctgcc gctgccaccc ttcctcatca gctccgacta     840

caaggcgctg tacgcgtact tcgccgccgc ggcgtcgcag gcgctcgacg ccgccgaggg     900

ccttggcctg tcgcgggagg aggcctgcca caacctgctg ttcgcgacgg tgttcaacag     960

ctacggcggc ttcaagctgc tgctcccgca gatcctgtcg cgcgtcgcgc aggccggcga     1020

gaagctccac gagaggctcg ccgcggagat acggagcgcg gtggccgacg ccggcggcaa     1080

cgtgacgctg gccgctctgg agaagatgga gctgaccagg tcggtggtgt gggaggcgct     1140

gcggctggac ccgccggtca ggttccagta cgggcgcgcc aaggccgacc tggagatcga     1200

gagccacgac gcgtcgttcg cgatcaagaa gggggagatg ctgttcggct accagccgtg     1260

cgccaccagg gacccgcggg tgttcggcgc cacggcgagg gagttcgtcg gcgaccggtt     1320

cgtcggcgag gaggggagga agctgctgca atacgtgtac tggtcgaatg ggcgagagac     1380

ggagaaccct agcgttgaca acaagcagtg ccccggcaag aacctggtgg tgctcgtcgg     1440

aaggctgttg ctcgtcgagc tcttcctccg gtacgacacc ttcaccgccg aggccggcaa     1500

aaaggtggtc atcaccgggg tcaccaaagc ttcaacctcc gccgtcaatc gtactgctta     1560

agccggccat cacttcaggc gtgggtcgtc gatcatccac tcaaccagct ccgtcctacg     1620

catatgcaat aagaaatact cgtacctgaa ttcttgcatg gctaaacact actaataagt     1680

gtatgtattc tgtttatttg ttcgattcca tatttgtaat tttgttgtta ttgtttgctg     1740

ttgaattacg attgtgtatt ttccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                1790

Claims (14)

1.一种来源于水稻的转录调控区DNA序列片段，其是一种水稻过氧羟基脂肪羟化环氧化酶基因的转录调控区的核苷酸序列片段，其核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的第1位至第2789位的核苷酸序列。

2.一种含有权利要求1的DNA序列片段的表达载体。

3.根据权利要求2的表达载体，在将其重新导入植物后，能够启动相关基因的转录、表达，所述相关基因是指植物中分离的抗病基因、防卫基因，或者防卫过程中的关键酶类或蛋白的基因，或者具有直接或间接杀菌作用的植保素合成基因或关键酶类基因，或者从病原中分离的无毒基因或与病原寄生密切相关的基因的反义RNA，或者是动物或微生物中分离的具有抗病性的活性物质的基因或合成它们酶类的基因。

4.含有权利要求2的表达载体的重组根癌农杆菌。

5.一种培育抗病植株的方法，该方法包括利用权利要求2的表达载体进行植物细胞转化，将权利要求1的DNA序列片段整合到植物细胞的染色体中，再将转化的植物细胞培育成植株。

6.根据权利要求5的方法，其中所述的植物细胞转化方法是通过重组根癌农杆菌介导、原生质体融合、基因枪、电激、PEG介导、或花粉管导入方法进行的。

7.权利要求1的DNA序列片段作为分子标记探针在从水稻中再分离调控序列中的应用。

8.权利要求1的DNA序列片段的功能类似物，所述功能类似物是选自下列各项的任何一种：GPF，对应于SEQ ID NO：1第163位至2789位核苷酸；G200，对应于SEQ ID NO：1第807位至2789位核苷酸；G150，对应于SEQ ID NO：1第1286位至2789位核苷酸；G75，对应于SEQ IDNO：1第2038位至2789位核苷酸；G42，对应于SEQ ID NO：1第2363位至2789位核苷酸。

9.一种含有权利要求8的功能类似物的表达载体。

10.根据权利要求9的表达载体，在将其重新导入植物后，能够启动相关基因的转录、表达，所述相关基因是指植物中分离的抗病基因、防卫基因，或者防卫过程中的关键酶类或蛋白的基因，或者具有直接或间接杀菌作用的植保素合成基因或关键酶类基因，或者从病原中分离的无毒基因或与病原寄生密切相关的基因的反义RNA，或者是动物或微生物中分离的具有抗病性的活性物质的基因或合成它们酶类的基因。

11.含有权利要求9的表达载体的重组根癌农杆菌。

12.一种培育抗病植株的方法，该方法包括利用权利要求9的表达载体进行植物细胞转化，将权利要求8的功能类似物整合到植物细胞的染色体中，再将转化的植物细胞培育成植株。

13.权利要求12的方法，其中所述的植物细胞转化方法是通过重组根癌农杆菌介导、原生质体融合、基因枪、电激、PEG介导、或花粉管导入方法进行的。

14.权利要求8的功能类似物作为分子标记探针在从水稻中再分离调控序列中的应用。

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