CN1269840C - 长效的人干扰素类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及长效的人干扰素类似物及其制备方法和医疗用途。人干扰素类似物是干扰素和人血清白蛋白(HSA)通过基因工程方法重组形成的一种融合蛋白。动物实验证明这种新型的干扰素除具有干扰素的抗病毒作用外，其在体内的半衰期是干扰素的3至10倍，从而延长了其在体内的作用时间。长效干扰素能用于治疗病毒性感染疾病，如SARS、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎以及甲型肝炎，并且还可用于治疗白血病和恶性黑素瘤。人干扰素类似物的贮存期是干扰素的3至5倍。
Description
技术领域
本发明是美国申请号60/392,948(美国公开号：20040063635)的继续申请。本发明涉及用血清白蛋白重组技术制造人干扰素类似物。生物实验证明这种新型的干扰素类似物与干扰素有相同的体内及体外生物活性。干扰素类似物是酵母表达的由白蛋白和干扰素形成的融合蛋白，可用于组成长效重组蛋白药物，旨在提高重组蛋白药物的疗效。
背景技术
1.白蛋白
人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区。经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR，“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon，纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP330 451和EP361991中公开。
白蛋白具有多种多态体及30种不同的遗传杂分子(Weikamp，CR等，人类遗传年报，37：219-226，1973)。血清白蛋白分子的三维结构已经由X-光衍射法测定(Carter，科学，244，1195-1198，1989)。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，半衰期寿命为14-20天。综上所述，白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，并可使治疗性蛋白质以较高剂量使用。
利用基因工程技术，将人血清白蛋白与人生长激素在酵母菌中表达为融合蛋白，该融合蛋白增加了人生长激素在血清中和储存时的稳定性。该项技术已在中国的专利申请CN1207131中公开。同理，人血清白蛋白与CD4蛋白受体形成融合蛋白后融合蛋白对HIV-1病毒的亲和性与CD4受体蛋白质单体相比有相同或更高的结合度(美国专利6,165,470)。上述文献均在此引为参考文献。
2.干扰素
干扰素是多功能细胞因子异源家族成员之一，其首先被发现的生物活性是抵抗病毒感染。多年以来，干扰素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今，发现干扰素有许多其它生物功能，如作用于细胞的生长、分化和免疫调节等活性可能具有更大的生物学意义。
干扰素有两个完全不同的家族，超级家族干扰素-α/β(也称I型干扰素)包括一组结构相关基因和蛋白，可进一步分为IFN-αIIFN-αII，和IFN-β(表1)亚族。另一亚族包括单一基因和其编码的蛋白IFN-γ(也称II型干扰素或免疫干扰素)。应该清楚IFN-γ在结构上与IFN-α/β超级家族无相关性，由于历史的原因，才把它们放在一起讨论。Isaacs和Lindenmann于1957年首先发现干扰素是被病毒感染的细胞的产物，并能诱导细胞抵抗同类或不同类的病毒的侵染。功能相关的病毒抑制蛋白(现称干扰素-γ)是Wheelock于1965年发现并描述为“干扰素类似物”，它是有丝***原激活的T淋巴细胞产生的物质。多年来，区分干扰素-γ和其它类型的干扰素的唯一特性是干扰素-γ缺乏Ph 2稳定性(Wheelcok 1965)和不同的抗原特异性(Youngner andSalvin 1973)。直到20世纪80年代初期，各主要类型干扰素的基因和蛋白序列被揭示，才弄清楚不同类型干扰素之间的关系。人们才认识到干扰素-γ是一种免疫调节细胞因子，干扰素-α/β的潜在作用可以是更广义的细胞和组织。
干扰素-α/β超级家族代表典型的干扰素。第一个清楚被阐述的是I类干扰素，研究表明它来源于人白细胞和纤维原细胞，具有不同的抗原性(Havell等，1975)。以后，源于白细胞和纤维原细胞的干扰素被分别命名为干扰素-α和干扰素-β(COMMITTEE ON INTERFERON NOMENCLATURE 1980)。基因克隆研究揭示了大多数干扰素的结构，已确定至少24个非等位人干扰素-α基因和假基因。可将这些基因分为二个不同的亚类IFN-αI和-αII(Weissmann and Weber 1986)。IFN-αI亚类包含一些有潜在功能的基因和数个假基因。IFN-αII亚类仅有一个功能基因和5至6个非等位假基因。干扰素-αI基因编码的成熟蛋白包括165-166个氨基酸，干扰素-αII基因编码的成熟蛋白有172个氨基酸。编码N末端分泌信号肽序列，通常为23个氨基酸残基，成熟干扰素在从细胞中释放出来前，其信号肽序列被酶水解。已经发现所有类型的人干扰素-αI基因和蛋白序列存在高度同源性，而干扰素-αII的序列则与干扰素-αI有很大的不同。据此，人们将它们分成不同的亚族(Capon等，1985)。实际上，干扰素-αII已经被命名为干扰素-ω(Adolf 1987)。
干扰素-α由单核细胞或巨噬细胞、淋巴母细胞或成纤维细胞产生，其它类型细胞如被病毒、核酸、糖皮质激素以及其它低分子量物质诱导也能产生的干扰素-α，其分子量在19道尔顿至26道尔顿之间。干扰素的作用广泛，最主要的是抗病毒和抗寄生虫。此外，干扰素-α还有抗某些肿瘤细胞的增殖作用。人干扰素-α缺乏潜在的N-糖基化位点，大多数天然形式的α亚族成员没有糖基化(Pestka 1983)。有些天然的人干扰素-α已被纯化到均一，分子量在16000～21000之间(Rubinstein et al.1981)。分子量存在明显差别的原因还未完全弄清楚。
人干扰素-β的单一基因编码166个氨基酸长的蛋白质。干扰素-β和干扰素-α亚族成员之间氨基酸的同源性约为25％～30％，核酸序列的同源性约为45％(Taniguchiet al.1980)。另外，在其转录启动子和增强子序列的5’端区域有高度同源性，表明干扰素-α和干扰素-β的基因常常是协同诱导的(Degrave等，1981)。
干扰素是一类重要的生物药物，已被用于治疗多种疾病，包括免疫性疾病、癌症以及提高机体抗感染的免疫力。至今，已有5种人干扰素即α、β、γ、ω以及一种新的人类和鼠的干扰素ε已经用于临床诊断和治疗。目前临床使用干扰素治疗乙型肝炎和丙型肝炎以及多种癌症如慢性骨髓性白血病。
干扰素用于治疗乙型肝炎和丙型肝炎以及多种癌症如慢性骨髓性白血病。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染引起的肝脏炎症。丙型肝炎病毒是最常见的与血液相关的慢性疾病，在中国有近八千万携带者，在美国有四百万携带者，导致全世界每年有一百万人死亡。慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的肝脏炎症，乙型肝炎病毒能发展成肝癌和肝硬化。全世界有近五亿人感染乙型肝炎病毒。
病毒感染过程中产生的干扰素-α/β能够阻止病毒的扩散并促进机体恢复(Gresser等，1976)。近年来，有几类干扰素制剂已被批准临床使用。在美国，大肠杆菌表达的重组人干扰素-α2(IFN-α-2a)和干扰素-αA(IFN-α-2b)已被批准用于毛细胞白血病的治疗。干扰素-α2和干扰素-αA都是干扰素-α1亚族成员，两者的区别仅在23位点的一个氨基酸差别(干扰素-α2是精氨酸，干扰素-αA是赖氨酸)。一种制剂被批准用于治疗***，另一种制剂被一些国家批准用于临床，例如人淋巴细胞的Namalwa系产生的几种IFN-α亚型的天然的混合物或培养的成纤维细胞产生的天然的人IFN-β。在某些国家，这些被批准的干扰素制剂用于慢性活动性乙型肝炎，急性病毒性脑炎以及鼻咽癌。在德国，大肠杆菌表达的重组人干扰素-γ已被批准用于治疗风湿性关节炎。批准和试验的干扰素的治疗应用广泛地涉及这一主题(Finter andOldham 1985)。低剂量的干扰素-β正用于刺激因红细胞成熟障碍的红细胞生成(Michalevicz，US5,104,653)。
利用人干扰素-α基因转化的大肠杆菌产生的新的多肽经过分离和鉴定，证明这些多肽具有干扰素活性，如抗病毒、细胞生长调节以及细胞物质产生的调节。这些新干扰素被Innis在美国专利5,098,703中称为干扰素-α-67，在美国专利4,975,276中称为干扰素-α-54，在美国专利4,973,479中称为干扰素-α-61。
纯化的干扰素-γ和白介素-2的混合制剂可用于***。优选地，干扰素-γ和白介素-2是由重组细胞合成得到(Palladino US5,082,658)。
Johnson等在美国专利6,174,996提到，由干扰素-τ多肽的N末端区域和另一类干扰素多肽的C末端区域如干扰素-α或干扰素-β的融合蛋白与相应的未经修饰的干扰素I型相比，具有减低对细胞的毒性。这是仅有的提到如何制备干扰素融合蛋白的专利。
Glue等在美国专利5,908,621中公开了一种将PEG12000与α干扰素共价结合来制备干扰素-α使之用于慢性丙型肝炎病人的治疗。这里提到如何制备长效和缓释形式的干扰素。Shechter等报道(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001 January 30；98(3)：1212-1217)通过共价连接FMS(2-硫代-9-氟芴基甲氧羰基(fluorenylmethoxycarbonyl)在干扰素-α2的氨基酸基团上能延长人干扰素-α2的半衰期。
Leibowitz等在美国专利US4,892,743报道了一个发明，其特征是构建一个新的干扰素杂合子，它由161和/或162个氨基酸组成。这个杂合子的新颖性不仅在于其结构，还在于该杂合子是剪切缩短过的干扰素-α。因此，该干扰素杂合子并不存在于自然界中。
Chang等在美国专利US5,723,125中报道了融合重组蛋白，由人干扰素，优选的是干扰素-α和人免疫球蛋白Fc片断，优选的是γ4链，通过由一个连接肽Gly GlySer Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser连接而组成的融合蛋白。
有些研究论文报道多种干扰素的联合使用可对病人较有利。如Trotta在美国专利US5,190,751中提到人干扰素-α和干扰素-γ联合使用，或是同时或是先后使用，能抑制白血病T细胞和B细胞的增殖，干扰素-α优先的是干扰素-α-2b。
然而，这些使用方式的一般特征是存在于各种组织体液中的干扰素-α快速失活(O′Kelly等，1985.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.178，407-411)，导致细胞因子在注射后的数小时内从血浆中消失(Rostaing等，1998，J.Am.Soc.Nephrol.9，2344-2348)。与其它类型的蛋白药物使用方法不同的是，在体内，干扰素-α是通过在循环***中的血清蛋白酶的蛋白质水解进行消除。因此，在临床上用于治疗病毒感染和癌症，非常需要具有长效性干扰素。
发明内容
本发明涉及体外制备干扰素类似物的方法，特别是这种干扰素类似物能增强机体对抗病毒侵染，刺激机体的免疫应答，提高疾病治疗的水平。
本发明涉及干扰素类似物，即人干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，目的是解决使用传统干扰素在治疗上的不足。总之，与干扰素比较，本发明涉及的干扰素类似物具有下列优点：1)能刺激机体对病毒感染的免疫应答；2)干扰素类似物在体内的存留时间长；3)起最大的治疗作用以及减小传统干扰素的潜在的副作用或毒性。
本发明还提供一种干扰素类似物的治疗方法。这些方法包括由干扰素类似物组成的药物制剂以及治疗的有效剂量。药物制剂可以是任何药学可接受的能够使干扰素类似物稳定的任何赋形剂制剂形式。药物制剂可以进一步是天然的或重组的人白蛋白，和/或不同的干扰素类似物。
另外，本发明还涉及一种利用酵母生产干扰素类似物的高效低成本的方法.特别是用毕氏酵母生产人白蛋白分别与干扰素-α-1b，干扰素-α-2b，干扰素-ω、干扰素-β和干扰素-γ组成的融合蛋白，这种融合蛋白在血浆中的稳定性非常高并且血浆半衰期长，其体内、体外的生物保护功能与传统的干扰素相同。
1.血清白蛋白-干扰素融合蛋白
本发明描述了编码人血清白蛋白和一种干扰素所形成的融合基因，例如血清白蛋白-干扰素融合基因。还应该提出的是其它类型的白蛋白也能用于制备本发明所提到的干扰素类似物。
干扰素可以包括干扰素家族的任何成员。在一具体实例中，干扰素是被病毒感染的细胞产生的天然细胞因子。这样的干扰素在“肽生长因子及其受体II”(Sporn andRoberts，Spring-Verlag Heidelberg，New York Inc.，USA.pp3-38)中被Vilcek(1991，)称为“干扰素”，这一名称一直沿用至今。
干扰素的特别实例包括，但不限于，干扰素-α-1(IFNA-1)、干扰素-α-2(IFNA-2)、干扰素-α-4(IFNA-4)、干扰素-α-5(IFNA-5)、干扰素-α-6(IFNA-6)、干扰素-α-7(IFNA-7)、干扰素-α-8(IFNA-8)、干扰素-α-10(IFNA-10)、干扰素-α-12(IFNA-12)、干扰素-α-13(IFNA-13)、干扰素-α-14(IFNA-14)、干扰素-α-16(IFNA-16)、干扰素-α-17(IFNA-17)、干扰素-α-21(IFNA21)、干扰素-β-1(IFNB-1)、干扰素-β-2(IFNB-2，也称白介素-6)、干扰素-λ-1(白介素-29)、干扰素-λ-2(白介素-28A)、干扰素-ω、干扰素-γ或干扰素-ε。
在本发明中重点描述三种不同的干扰素类似物的制备。白蛋白-干扰素-α(包括-1b、-2a、-2b和-ω)，白蛋白-干扰素-β，以及白蛋白-干扰素-γ。其他种类的干扰素家族成员能用同样的方法制备新的干扰素类似物。
干扰素可直接连接在白蛋白的N末端或C末端形成干扰素类似物。也可以，通过一个连接肽来连接白蛋白和干扰素以形成融合蛋白，血清白蛋白-连接肽-干扰素或干扰素-连接肽-血清白蛋白。连接肽长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为14-30个氨基酸。连接肽长度可短至白蛋白大分子对干扰素形成的位阻保持最小，例如(G4S)3-4。连接肽有利于干扰素与其受体结合。但连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，最优选的是没有连接肽。
融合蛋白可以是分泌型蛋白，可与人的特异性血清白蛋白抗体相结合，优选地，其与干扰素的特异性抗体相结合。
本发明提供体外制备人干扰素类似物的方法，用于疾病的治疗以提高健康水平。特别是人血清白蛋白(HSA)和干扰素的重组融合蛋白能：1)保持干扰素原有的在体内、体外的生物学功能；2)在体内缓慢释放来维持最大的抗病毒效果；3)减少潜在的干扰素使用时伴随的副作用或毒性。此外，利用酵母菌生产重组蛋白成本低、效率高。
本发明同时提供一种独立的核苷酸编码血清白蛋白和干扰素融合蛋白，本发明还包括所有在体内体外具有干扰素生物功能的蛋白。特别是，包括，但不局限于，干扰素-α(1b、2a和/或2b)、干扰素-β、干扰素-ω和/或干扰素-γ以及其它的人干扰素。
优选地，干扰素可与血清白蛋白的N端或C端直接连接。连接肽L可应用于连接白蛋白和干扰素以形成融合蛋白。即白蛋白-连接肽-干扰素或干扰素-连接肽-白蛋白。连接肽的长度优选的是2至100个氨基酸，较优选的是5至50个氨基酸，更优选的是14至30个氨基酸。连接肽的长度应以使白蛋白大分子与干扰素分子之间的空间阻隔最小，如(G4S)3-4。连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，最优选的是没有连接肽。
在实施例中，DNA核苷酸序列编码干扰素类似物-α-1b(HSA-IFN-α-1b)，其核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO.1同源(图1)。优选地，多核苷酸序列至少有95％与序列SEQ ID NO.1同源。由该核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2[干扰素类似物-α-1b]。
在实施例中，核苷酸序列编码干扰素类似物-α-2b(HSA-IFN-α-2b)，其核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO.3同源。优选地，核苷酸序列至少有95％与SEQ ID NO.3同源。由该核苷酸编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4[干扰素类似物-α-2b]。
在另一实施例中，核苷酸序列编码干扰素类似物-β(HSA-IFN-β)，其核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO.5同源。优选地，该核苷酸序列至少有95％与SEQ ID NO.5同源。由该核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.6[干扰素类似物-β]。
在另一实施例中，核苷酸序列编码的干扰素类似物-ω(HSA-IFN-ω)，其核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO.7同源。优选地，该核苷酸序列至少有95％与SEQ IDNO.7同源。由该核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.8[干扰素类似物-ω]。
在另一实施例中，核苷酸序列编码干扰素类似物-γ(HSA-IFN-γ)，其核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO.9同源。优选地，该核苷酸序列至少有95％与SEQ IDNO.9同源。由该核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.10[干扰素类似物-γ]。
在另一实施例中，核苷酸序列编码人血清白蛋白(HSA)，其核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO.11同源。优选地，该核苷酸序列至少有95％与SEQ ID NO.11同源。由该核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.12[人血清白蛋白]。
优选地，干扰素的核苷酸序列进一步至少有95％与SEQ ID NO.13、15、17、19或21同源。由这些核苷酸序列编码的干扰素氨基酸序列为SEQ ID NO.14、16、18、20或22。
依据实施例，干扰素可以是，但不限于干扰素α-1(IFNA-1)、α-2(IFNA-2)、α-4(IFNA-4)、α-5(IFNA-5)、α-6(IFNA-6)、α-7(IFNA-7)、α-8(IFNA-8)、α-10(IFNA-10)、α-12(IFNA-12)、α-13(IFNA-13)、α-14(IFNA-14)、α-16(IFNA-16)、α-17(IFNA-17)、αa-21(IFNA21)；干扰素-β-1(IFNB-1)、干扰素-β-2(IFNB-2，也称白介素-6，IL-6)，干扰素-λ-1(白介素-29)，干扰素-λ-2(白介素-28A)、干扰素-ω、干扰素-γ或干扰素-ε。
与上述的核苷酸有一定程度的序列相似性的核苷酸是指：例如，能编码一种干扰素类似物，并在相似的核苷酸序列之间具有至少95％的序列同源性的核苷酸。其包括核苷酸链上每百个核苷酸有5个点突变，并也是编码干扰素类似物的核苷酸序列。换句话讲，任何核苷酸链与上述编码干扰素类似物的核苷酸链具有95％的序列同源性，即，即便有多达5％的核苷酸个体可以被替换、删减或***等，均与本发明所指的核苷酸序列相同。无论是在5’或3’端，或在两端之间的任何位点发生的突变，还是以单体或多体发生的突变均在本发明的范围内。
实践上，任何特指的核酸分子，只要具有90％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性，就在本发明的保护范围内。而且由核苷酸序列编码的干扰素类似物也可由常规已知的计算机软件，如Bestfit软件(Wisconsin)序列分析软件包来获得。Bestfit应用区域同源性比较方法(文献：Smith和Waterman，应用数学进展，2：482-489(1981)来寻找两个序列之间最佳的同源序列。当应用该软件或其它任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有95％以上的序列同源性，均视为与本发明所述的序列相同源。
在室温或低温条件下，干扰素类似物贮藏期比传统干扰素在同样条件下，具有2倍以上，优选达4倍或6倍或更优选达10倍以上的贮存期。
本发明还涉及用人血清白蛋白作为载体，携带治疗性的蛋白质药物，如干扰素来处理和治疗各种疾病或异常，或那些病毒性感染患者。在本发明中，干扰素类似物可以用于脊椎动物，优选地是人类，并通过不同途径，包括但不局限于口服、非经肠胃、腹腔膜内、静脉内、动脉内、皮下、舌下、肌内、肠内、唾液腺、鼻内、脂质法，通过吸入、注射、***、眼内方法给药。干扰素类似物也可通过局部性释放(如导管或支架管)，包括皮下、脂肪下、关节下及膜内，并可以做成缓释剂。具体地，干扰素类似物主要通过注射法和喷，滴法给药。
当在动物体内使用时，干扰素类似物的血浆半衰期与传统干扰素相比可延长2倍、优选的是4倍、更优选的是6倍、最优选的是10倍。
本发明所述的干扰素类似物可以与天然或重组的白蛋白联合使用，优选的是以治疗的有效剂量和比例联合使用。
由血清白蛋白与干扰素融合后形成的干扰素类似物将有更长的贮藏期和在血浆中更长的半衰期，这便于运输，节省贮藏费用以及减少药物的使用量或使用次数。
相信其它的具有抗病毒功能的多肽或能够阻止病毒进入细胞的多肽与血清白蛋白形成融合蛋白时，在维持同样生物学功能和治疗功能的同时，使得多肽具有较长的贮藏期及血浆半衰期，例如阻止HIV病毒侵入目标细胞的T20多肽就可与血清白蛋白形成融合蛋白，而获得具有长效功能的多肽药物。
2.用于表达干扰素类似物的宿主***
本发明中的干扰素类似物核苷酸序列可利用重组克隆技术引入宿主细胞，以使干扰素类似物得以表达。
一般来说，宿主细胞经遗传工程(转导或转化或转染)方法将携带有本发明中所提到的各种可能组合的干扰素类似物核苷酸序列的载体质粒以侵入方式、病毒感染“噬菌体”等形式转入宿主***中。工程宿主细胞可以在含常规营养物的培养基中培养，并经过适当修改以利于启动子。以适当的操作方式控制选择转化子或扩增编码干扰素类似物的核苷酸链的培养条件，如温度、pH和选择表达细胞。
按本发明所述，重组载体携带有包含编码干扰素类似物的核苷酸。重组载体可以是一个表达载体，可在宿主细胞内由携带的核苷酸编码来表达融合蛋白。形式可为，但不局限于，HSA/IFN、IFN/HSA、HSA/L/IFN或IFN/L/HSA(L＝连接肽)。宿主生物体及体细胞包括，但不局限于，脊椎动物(如人、猴、鼠、兔等)鱼、鸡、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等。
编码干扰素类似物的核苷酸是在适当的启动子作用下表达干扰素类似物蛋白质。可利用的适合启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要的后期启动子；或异源启动子，如CMV启动子和RSV启动子；诱导型启动子可有MMT启动子、热刺激启动子、白蛋白启动子、ApoAI启动子和人球蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶脱氧核苷酶启动子则有疱疹病毒胸腺激酶启动子；反转录病毒LTR启动子包括经修饰后的LTR启动子；β-肌动蛋白启动子；人生长激素启动子。也可用天然启动子来控制核苷酸编码表达干扰素类似物蛋白质。
按本发明所述，重组载体携带有包含编码HSA/IFN融合蛋白的核苷酸序列。重组载体可以是一个表达载体，可在宿主生物内表达由其携带的核苷酸编码的干扰素类似物，HSA融合蛋白，HSA-IFN，HSA-L-IFN，或IFN-L-HSA。形式可为，但不局限于，HSA/IFN、IFN/HSA、HSA/L/IFN或IFN/L/HSA(L＝连接肽)。宿主生物包括，但不局限于，哺乳动物(例如人、猴、鼠、兔等)，鱼、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等。
优选的宿主生物为酵母属，包括但不局限于，酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕氏酵母属(Phichia)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、孢园酵母属(Tarulaspora)和裂殖酵母属等。更优选地，宿主***可为毕氏酵母属巴斯德菌种。具体地讲重组载体质粒可为pPICZ-A，B或C。
根据选用不同的宿主用来表达融合蛋白，本发明中表达的蛋白可以是糖基化或非糖基化。优选地，当在一种宿主***中得到表达时，HSA和干扰素的融合蛋白可以是糖基化的，其糖基化程度可以和在哺乳动物细胞如中国仓鼠(CHO)中表达的一致，或与在毕氏酵母菌中表达的一致。
如上所述，在本发明中提到的干扰素类似物，优选的使用基因工程技术构建来表达。获得干扰素类似物蛋白的优选方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达干扰素类似物蛋白。特别是利用可转化酵母的表达载体，来转化毕氏酵母，并使干扰素类似物蛋白分泌到培养液中。
利用酵母菌表达干扰素类似物的优势为，酵母菌***允许产生高质量成熟的干扰素类似物蛋白，并分泌到培养液中便于纯化。
酵母菌遗传工程的发展使外源基因可以在酵母菌中得到表达并分泌蛋白产品到细胞外。利用酵母菌表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量，蛋白质为可溶性，正确的折叠和易于大规模生产和纯化。
干扰素类似物，既HSA/IFN融合蛋白，可经由白蛋白天然信号肽分泌到酵母菌培养液中。含有血清白蛋白融合蛋白的多肽可由信号肽主导并通过分泌途径而得到加工。在一首选实例中，血清白蛋白的前导肽序列使干扰素类似物蛋白分泌到酵母菌外的培养基中。其它分泌肽，如天然的酿酒酵母的α-因子分泌信号肽，也可用于分泌本发明中的融合蛋白。
酵母表达的白蛋白是可溶性的并且显示出与血浆中分离的白蛋白有相同的二硫健结构。当作为药物使用时，白蛋白的用量为克级，因而重组白蛋白须与天然的白蛋白结构一致。由酵母分泌到培养液中的HSA/IFN是通过与白蛋白表达一致的途径来加工的，并避免了由酵母细胞抽提物中分离纯化蛋白的难题，因为酵母细胞是难于裂解的。另外，分泌出的蛋白质纯度也易于提高，因为由酵母分泌出的蛋白仅占全部酵母蛋白的0.5-1％，而且酵母无毒性蛋白伴随。
优选实例为，应用巴斯德酵母菌***来表达本发明中提及的HSA/IFN融合蛋白。巴斯德酵母菌是由SALK生物技术工业研究所与菲力蒲石油工业研究所协作发展出的一个高效重组蛋白表达***。有关毕氏酵母菌的应用技术已在有关美国专利中详细阐述了(4,683,293；4,808,537；4,857,467)。
利用毕氏酵母菌来表达HSA、HSA融合蛋白或干扰素类似物优于利用其它表达***。毕氏酵母菌具有许多高等真核细胞表达***所具有的优点，例如蛋白质的加工和折叠，转录后的修饰以及如同培养细菌或酿酒酵母一样的易于大规模培养。其与其它***如杆状病毒、哺乳动物细胞培养相比更具有简捷、快速表达和产量更高的优点。毕氏酵母还有另外一个优势是可以10-100倍高的异源蛋白表达。这些特性使得毕氏酵母变成十分有力的蛋白表达***。
由于毕氏酵母与酿酒酵母的相关性，许多由酿酒酵母研究发展出的方法和技术均可用于毕氏酵母，包括转化、基因***、基因取代。更进一步的在酿酒酵母上发展出的遗传专用术语，也可用于毕氏酵母菌。如，组氨酸脱氢酶、在酿酒酵母和毕氏酵母中均是由HIS4基因编码的。毕氏酵母作为甲醇利用酵母能够以甲醇为单一碳源进行代谢。其过程为：首先甲醇的代谢是用乙醇氧化酶将分子氧加到甲醇分子上使甲醇氧化，变为甲醛。这一反应形成过氧化氢。为了避免过氧化氢的毒性。甲醇代谢发生在一个特殊的细胞组织中，叫做过氧质体。其可将过氧化氢的毒性与细胞其它部分隔绝。乙醇氧化酶与氧的亲和性极差，使得毕氏酵母菌为了代谢的进行而大量生产乙醇氧化酶(AOX)，调控乙醇氧化酶生产的启动子被用来驱动外源蛋白(如HSA、HSA融合蛋白或干扰素类似物)在毕氏酵母菌中的表达。
毕氏酵母菌与酿酒酵母菌相比，毕氏酵母菌在对分泌的蛋白质进行糖基化的程度上有着更大的优点。即：毕氏酵母不会有过度糖基化现象。酿酒酵母和毕氏酵母均有N-连接的糖基甘露糖修饰。然而寡糖化物链加在表达的蛋白上，在毕氏酵母菌中只有8-14个糖基，而远短于在酿酒酵母中的50-150甘露糖链。在毕氏酵母菌中连接糖基化较少发生。酿酒酵母的核心糖化带有α-1，3连接末端物。而在毕氏酵母菌则没有。研究表明由酿酒酵母产生的糖基化蛋白具有较强的抗原反应，而使得这些蛋白不适于用在特别是治疗目的上的使用。当然也表明这又减少了一个对毕氏酵母菌用来表达蛋白在糖基化上的担忧。
Watanabe等(Pharm Res.Dec：18(12)：1775，2001)描述了一种省时的纯化方法获得的由毕氏酵母表达的人血清白蛋白在生物体内外的特性。Kobayashi等(Ther Apher，Nov：2(4)：257-62.1998)讨论了重组人血清白蛋白的研究进展。
利用毕氏酵母做为表达***有许多试剂盒可以使用。如Invitrogen的易选EasySelectTM毕氏酵母表达试盒。表达载体上有一个AOX1启动子可以使外源基因在毕氏酵母中利用甲醇来诱导表达。同时还有一个抗生素卓霉素(Zeocin)抗性基因，可做为选择重组子的标记。在本发明中，表达干扰素类似物的启动子是非常重要的因素。
在毕氏酵母***中，AOX1基因启动子是十分强劲的启动子，特别是在毕氏酵母菌中。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶，AOX1和AOX2。AOX1负责在细胞中产生合成巨量的乙醇氧化酶(AOX1)活性。AOX1基因的表达受到紧密控制并由甲醇诱导而达到极高的水平。典型地当用甲醇作为唯一碳源时，在所有的可溶性蛋白中AOX1基因的产物就达30％。AOX1基因已分离得到。AOX1基因启动子也用于本发明的载体质粒中用以驱动编码有目的基因的外源蛋白的表达(Ellis等，1985；Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而AOX2和AOX1基因有97％的同源性。在甲醇中的生长速度比AOX1基因为慢。这种缓慢生长状态，可以分离到Mut+(AOX1)株。除了AOX1基因启动子外，在酵母菌中其它启动子也可用于起动HSA融合蛋白的表达。这些启动子包括，但不局限于PGK1、GAPDH、Gal1、Gal10、CYC1、PH05、TRP1、ADH1或ADH2基因启动子。在本发明中，特别阐述了一种制备在二个不同的位点***双表达盒的重组酵母的新方法。
表达质粒也可以是细菌宿主如大肠肝菌DH5α(Gibcol/BRL)和酵母之间的穿梭质粒。抗生素卓霉素作为选择标记已应用在本发明的各实施例中。
表达载体含有编码干扰素类似物蛋白的核苷酸。按Invitrogen试剂盒所描述的方法转化酵母菌。经过抗性选择出转化的酵母菌菌落，将这些表达目标干扰素类似物蛋白的细胞接种于适当的选择性培养基中，然后分析这些酵母菌表达分泌干扰素类似物蛋白于培养基中的能力。蛋白质的收获可在细胞连续培养中进行，或在批量培养结束后一并收获。本发明所述的干扰素类似物蛋白经培养的酵母菌表达后，以能维持蛋白活性，药物活性的蛋白提纯方法来加以分离纯化。
在此还需提及的是，其它表达***也可用于本发明中所提到重组蛋白和干扰素类似物蛋白的表达；包括，但不局限于细菌、枯草杆菌(B.Subtitis)、酿酒酵母(S.Cerevisiae)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)，汉逊酵母属(Hansenula)、孢圆酵母属(Tourlaspora)、裂殖酵母属(Schizosaromyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、Pachysoler，德巴利酵母属(Debaromyces)、梅奇酵母属(Metschumikowia)、红冬孢属(Rhodosporidium)、无色担子孢子属(Leucosporiduum)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolcus)、拟内孢霉属(Endomyucopsis)、动物、植物和昆虫细胞等。
3.干扰素类似物的组合治疗
本发明还提供了不同干扰素类似物的组合应用。这些干扰素类似物或传统干扰素的特异组合给患者使用，可刺激机体的多种保护反应以抵御病毒或具协同增效的保护细胞的抗病毒功能。研究表明特别是人白蛋白与有造血活性的细胞因子的融合蛋白的组合可有效地刺激多种血细胞和血小板的增生。仅一次注射，白蛋白-干扰素融合蛋白可作用于不同类型血细胞的信号传导途径，促进血小板、红血球、巨噬细胞等血液功能细胞的增殖(YU and FU US20040063635，于在林，中国专利公开号CN1467224A)。
在本发明中，白蛋白的血浆转运功能和干扰素的治疗功能因蛋白发生融合而得到整合。当在血液中循环时，由于与白蛋白融合而赋予干扰素一个抵抗蛋白酶降解的超级稳定性，结果大大延长了干扰素在血液中的半衰期。由于大量白蛋白的存在，不同的干扰素与白蛋白形成融合蛋白，经组合可以减少并形成较小的生物学功能上的相互干扰现象。这种干扰现象常出现在“干扰素单体”之间的组合。进一步来说，一个与白蛋白融合的干扰素可以在血液***中停留相当长的一段时间而得到缓慢释放，因而减低了在常规方法下，单独使用大剂量单一干扰素时，带来的急性反应，毒性及副作用。这种干扰素类似物的缓慢释放作用形式，以本发明中的使用剂量，注射次数减少，而更进一步降低传统干扰素的副作用。特别是对乙肝病人实施大剂量，长周期治疗，这种组合式使用，在抑制病毒的复制和刺激肝细胞恢复上是十分有用的。乙肝病人常需忍受多次高剂量的干扰素注射，给病人带来极大的损害。根据本发明，血清白蛋白与干扰素形成融合蛋白后，可在进入体内后因缓慢释放而减少上述局限性。另外，这样的融合蛋白可以与相对大量的白蛋白组合，可进一步减轻直接注射干扰素进入体内导致的中枢神经***强烈不良反应。
已知，贮存“裸露”的细胞因子(例如细胞因子不与另一种蛋白如白蛋白融合)是相当不稳定的，在血液中的血浆半衰期较短。十分清楚地是，治疗性蛋白质的弱稳定性是它的一大缺陷。事实上，重复注射蛋白产品或由灌注点滴法给药来达到药物的有效强度对病人来讲是十分昂贵和不便的。由于血浆半衰期和稳定性的提高，本发明的干扰素类似物和它们的组合，例如HSA和干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω以及干扰素-γ能用于刺激人血浆产生多种抗病毒多肽。
在本发明中，干扰素类似物-α可与干扰素类似物-γ组合用于病毒感染的患者可即刻刺激抗病毒多肽的分泌。例如，癌症患者可在病毒感染前或感染后注射干扰素类似物-α和干扰素类似物-γ的组合以避免细胞和器官的损害。IFN-α能抵抗病毒而IFN-γ能抑制癌细胞的增殖。
另一方面，干扰素类似物蛋白也能与不同的干扰素类似物蛋白先后顺序或同时使用于患者，这种组合治疗方式有协同效应。在一实例提供的方法是：给予患者含有第一种干扰素类似物的药物可接受的制剂有效剂量，再给予患者含有第二种干扰素类似物的药物可接受的制剂有效剂量，这样的组合治疗方式具有协同效应。
例如可先给予患者干扰素类似物-α-2b，然后给予有效治疗剂量和比例的干扰素类似物-γ、干扰素类似物-ω和/或干扰素类似物-β可抑制不同癌细胞的增生并诱导抗病毒多肽的分泌。
本发明提供了成套的组合治疗。成套组合包括第一个干扰素类似物与第二个干扰素类似物。例如，第一个干扰素类似物是干扰素类似物-α-2b和第二个干扰素类似物是干扰素类似物-γ；第一个干扰素类似物是干扰素类似物-ω和第二个干扰素类似物是干扰素类似物-γ；或第一个干扰素类似物是干扰素类似物-β和第二个干扰素类似物是干扰素类似物-γ等。
干扰素类似物和它们的组合可用于治疗各种疾病，包括但不局限于病毒感染，如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、人***状瘤病毒、SARS以及或爱滋病毒感染、肿瘤、肾衰竭、组织或器官移植。这些干扰素类似物优选地不含有能引起人类免疫反应的蛋白质序列(连接肽)。干扰素类似物包括但不限于干扰素-α-1(IFNA-1)、干扰素-α-2(IFNA-2)、干扰素-α-4(IFNA-4)、干扰素-α-5(IFNA-5)、干扰素-α-6(IFNA-6)、干扰素-α-7(IFNA-7)、干扰素-α-8(IFNA-8)、干扰素-α-10(IFNA-10)、干扰素-α-12(IFNA-12)、干扰素-α-13(IFNA-13)、干扰素-α-14(IFNA-14)、干扰素-α-16(IFNA-16)、干扰素-α-17(IFNA-17)、干扰素-α-21(IFNA21)；干扰素-β-1(IFNB-1)、干扰素-β-2(IFNB-2，也称白介素-6，IL-6)；干扰素-λ-1(白介素-29)，、干扰素-λ-2(白介素-28A)、干扰素-ω、干扰素-γ或干扰素-ε。
附图说明
图1.实施例人干扰素类似物，白蛋白和各种人干扰素的核苷酸序列以及氨基酸序列。
图2.含有人血清白蛋白序列的质粒DNA，作为制备干扰素类似物，白蛋白-干扰素融合蛋白的骨架载体
图3.蛋白印迹检测实验。用鼠-抗人白蛋白单克隆抗体(Sigma Cat# A6684)每一泳道上样量是10μl表达三天后的酵母上清液；A)，白蛋白(65Kd)；B)，干扰素-α-2a类似物(84Kd)；C)，干扰素-β类似物(84kd)；D)，干扰素-ω类似物(84kd)；E)，对照(酵母菌株培养液)。
图4.蛋白印迹检测实验。用兔多克隆抗人干扰素-α-2a抗体(ChemiconInternational Inc.，Cat# Ab-218-NA)进行检测，每一泳道包含100ng蛋白。A)大肠杆菌表达的人干扰素-2b(19kd)；B)干扰素-α类似物(84Kd)，(酵母菌表达的白蛋白-干扰素-α-2b融合蛋白)。
图5.人干扰素-α和干扰素-α类似物的抗病毒感染实验，利用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为检测***。
图6.不同温度条件下干扰素类似物蛋白稳定性和细胞抗病毒活性结果A)37℃；B)50℃。
图7.干扰素与干扰素类似物在动物体内的血液中存留时间比较。A)0-24小时；B)1-12天。
具体实施例
实施例1 分子克隆技术简述
常规分子克隆技术包括DNA、RNA的提取，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNA片段的连接，限制性内切酶酶切反应均参照文献(Maniatis等，“分子克隆实验手册”冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，1982)。DNA聚合酶链反应(PCR)(参照文献Saikiet等，科学，230：1350，1985)所用的酶及反应所需PCR仪均为PerkinElmer产品。并参照厂家操作程序。DNA测序和DNA扩增所需用的寡聚核苷酸引物由专门机构完成。转受态大肠杆菌由GIBCO/BRL公司购得。质粒DNA的纯化，DNA片段的回收等均采用商品Qiagen纯化柱制备。本发明所使用的酵母菌菌种均购自Invitrogen公司的EasySelectTM Pichia Expression Kit。所有的酵母菌是Pichia成员，特别是毕氏酵母菌(Invitrogen公司产品)。
实施例2 人血清白蛋白(HSA)基因表达及载体质粒的构建
以人胎肝中提取的总RNA为模板，利用反转录多聚酶链聚合反映来合成、扩增HSA基因。5微克总RNA在反转录酶(购自GIBCO/BRL公司)的作用下，合成相对应的DNA链，寡聚核苷酸引物为18个T+1N(N为随机核苷酸)。反应条件为45℃20分钟，而后升温至55℃，继续保温40分钟。
其寡聚核苷酸引物序列为：
Seq.ID NO.23：5’-
GAATTCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3’，和
Seq.ID NO.24：5’-
GAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT GC-3’
用于扩增HSA的寡聚核苷酸引物是按GenBank中V00494的DNA序列所设计。
两个EcoR I识别位点分别加在HSA基因的两端亚克隆入一表达载体。PCR反应条件为94℃ 4分钟以灭活反转录酶，编码HAS的DNA进一步用Taq DNA PCR(Perkin Elmer)扩增35个循环反应：94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃扩增2分30秒。循环反应结束时，再给予72℃ 10分钟的延长反应。凝胶电泳显示PCR扩增产物长约1842碱基对。PCR产物利用TA克隆的方法***PCRII载体(Invitrogen公司)。所得质粒命名为PCR-HSA。DNA测序结果表明其与发表的人血清白蛋白DNA序列相同。附图1 Seq ID NO.11为HSA基因DNA序列，Seq ID NO.12为HSA人白蛋白氨基酸序列。
用EcoR I酶限制性消化PCR产物，经电泳分离纯化HSA DNA片断***Invitrogen提供的pPICZ-A或pGAPZ-A载体或经于在林修饰的新载体pYH。以编码HSA的这个载体转染DH5α感受态细菌，在含有抗生素卓霉素(25μg/ml)的低盐LB-琼脂平板上选择出的细菌克隆，其基因***方向经Xho I/Nde I酶切决定。其经检定对HSA基因***的质粒命名为pYZ-HSA(Y：酵母载体，Z：含卓霉素抗生素抗性)，AOX1或GAP启动子或pYH-HSA(Y：酵母载体，组氨酸抗性)，AOX1或GAP(GAPDH)启动子。pYZ-HSA载体质粒的物理图谱列于附图2。
质粒具有如下优点：1)带有卓霉素抗性基因可使受其转化的细菌或酵母菌在含有卓霉素抗性素的培养基上生长。卓霉素抗性素是一种新型广谱抗生素。在结构上属于博来霉素/腐草霉素家族，对于细菌、真菌(包括酵母菌)、植物、哺乳动物细胞均具较强的毒性。但卓霉素对真菌的毒性小于博来霉素。携带有卓霉素抗性基因的质粒即可在细菌中，又可在真菌的转化中做为选择标记。在HSA基因***的下游，载体带有多个酶切位点。这些酶切位点便于以基因工程方法直接***功能蛋白基因，与HSA形成融合蛋白；2)一个myc抗原序列和多聚组氨酸标签序列可融入表达的融合蛋白的C-末端，便于检测和/或用商品化的抗myc抗原和多聚组氨酸标签抗体进行纯化；3)AOX1启动子或GAPDH启动子有更多的选择方便表达干扰素类似物。GAP启动子不被甲醇诱导，应用GAPDH启动子比应用AOX启动子的工业发酵规模更大(1,000公斤以上)，更安全，因为不添加甲醇诱导表达；4)来自二个载体的双表达盒(启动子，被表达的基因，抗性基因)能直接***同一酵母株制备高表达重组酵母。
应用两个载体质粒，可分别含有相同或不同的启动子，相同或不同的待表达的基因，同时或先后转导同一酵母菌以获得高效表达外源蛋白的酵母菌株。例如pYZ-HSA质粒线性化后可以直接***在酵母菌染色体的AOX1基因启动子位点，这一酵母菌就带有卓霉素抗生素抗性。应用同一启动子可将线性化的pYH-HSA载体质粒直接***在酵母菌染色体的HIS基因位点处，使用不添加组氨酸的培养基进行重组酵母菌的筛选。载体质粒pYH和pYZ作为主要载体质粒用于AOX1启动子以及pWZ和pWHKA作为主要载体质粒用于GAPGH启动子的使用。本发明中干扰素类似物在酵母菌中的表达均使用这些载体质粒。
实施例3.人干扰素分子克隆
3.1.人干扰素-α-1b分子克隆
人干扰素-α-1b的分子克隆应用相似于实施例2中所表述的RT-PCR方法，从人白细胞(单核细胞/巨嗜细胞/B淋巴细胞)的总RNA制备物中扩增，寡聚核苷酸引物分别为：
SEQ ID NO.25：5’-
CATATGTGTGATCTCCCTGAGACCC-3’
SEQ ID NO.26：5’-
GGATCCTTACTTCCTCCTTAATCTTTC-3’
多聚核苷酸有579碱基对，经RT-PCR扩增，亚克隆入Invitrogen公司的pCR IITA载体中，DNA测序分析证实人干扰素-α-1b的阅读框。Nde I限制性酶切位点形成5’末端，Bam HI限制性酶切位点形成3’末端(化线部分)。干扰素-α-1b的人工起始密码子也包括在这个位点中(SEQ ID NO.25的化线部分)。图1表示人干扰素α-1b的DNA序列(SEQ ID NO.13)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.14)。
3.2.人干扰素-α-2b分子克隆
人干扰素-α-2b与人干扰素-α-2a的基因仅有一个核苷酸差别，这导致在#23位的一个氨基酸不同(干扰素-α-2b是精氨酸，而干扰素-α-2b是赖氨酸)。干扰素-α-2a是通过SEQ ID NO.27：5’-
CATATGGCCTTGA CCTTTGCTTTAC-3’和SEQ ID NO.28：5’-
GGATCCTCATTCCTTACTTC TTAAAC-3’克隆而来。干扰素-a-2b的基因是通过用Stratagene公司的一种试剂盒进行点突变得到。一对突变引物用于序列中的一个核苷酸改变。它们是
SEQ ID NO.29：5’-TGGCACAGATGAGGA
AAATCTCTCTTTTCT CCTGC-3’，和
SEQ ID NO.30：5’-CAGGAGAAAAGAGAGATT
TTCCTCATCTGTGCCAGC-3’.
化线部分的核苷酸是点突变位点，即干扰素-α-2a的AGA(精氨酸)变为干扰素-α-2b的AAA(赖氨酸)。实验是按照制造商提供的操作手册进行。pCR II载体的突变产物通过序列分析得到证实，图1表示人干扰素α-2b的DNA序列(SEQ ID NO.15)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.16)。
3.3.人干扰素-β分子克隆
下列引物用于克隆来自人白细胞cDNA文库的干扰素-β基因：
SEQ ID NO.31：5’-
CATATGACCAACAAGTGTCTCC-3’，和
SEQ ID NO.32：5’-
GAATTCTCAGTTTCGGAGGTAACC-3’
Nde I限制性酶切位点形成干扰素-β的5’末端，EcoR I限制性酶切位点形成3’末端。PCR产物经凝胶电泳纯化克隆至pCR2.1 TA载体，并进行DNA序列确证。图1表示人干扰素-β的DNA序列(SEQ ID NO.17)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.18)。
3.4.人干扰素-ω分子克隆
人干扰素-ω克隆自人白细胞cDNA文库的总RNA，引物是：
SEQ ID NO.33：5’-
CATATGGCCCTCCTGTTCCCTCTAC-3’，和
SEQ ID NO.34：5’-
GAATTCTCAAGATGAGCCCAGGTCTC-3’
PCR产物经凝胶电泳纯化克隆至pCR2.1 TA载体，并进行DNA序列确证。图1表示人干扰素-ω的DNA序列(SEQ ID NO.19)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.20)。
3.5.人干扰素-γ分子克隆
人干扰素-γ克隆自有丝***原激活的T淋巴细胞cDNA文库的总RNA，引物是：
SEQ ID NO.35：5’-
CATATGAAATATACAAGTTATATC-3’
SEQ ID NO.36：5’-
GAATTCTTACTGGGATGCTCTTCG-3’
PCR产物经凝胶电泳纯化克隆至pCR2.1 TA载体，并进行DNA序列确证。图1表示人干扰素-γ的DNA序列(SEQ ID NO.21)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.22)。
实施例4.人血清白蛋白与人干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-β、干扰素-γ及干扰素-ω的融合和干扰素类似物的表达载体质粒的构建
白蛋白基因与干扰素基因的融合来制备干扰素类似物。在白蛋白的C末端有Bsu36 I位点，实例中涉及的所有干扰素都是在这一位点与这种白蛋白直接融合，通过PCR引物延伸在干扰素DNA的N末端形成Bsu36 I限制性酶切点。干扰素DNA片段经PCR扩增克隆到经线性化的pYZ-HSA载体或pYH-HSA载体的Bsu36 I和XhoI位点。
4.1.干扰素类似物α-1b载体的构建
设计下列引物用于制备干扰素-α-1b和白蛋白的基因融合。
SEQ ID NO.37：5’CTGCCTTAGGCTTA
TGTGATCTCCCTGAGA CCC-3’和
SEQ ID NO.38：5’-T
CTCGAGTTACTTCCTCCTTAATC TTTC-3’。(划线部分是人干扰素-α-1b成熟蛋白序列)。在干扰素-α-1b基因的3’末端构建一Xho I位点(SEQ ID NO.38划线部分)。PCR产物经Bsu36I和Xho I消化，所得片段经凝胶电泳纯化***pYZ-HSA或pYH-HSA载体的Bsu36I和Xho I位点之间形成一新质粒pYZ-HSA/IFN-α-1b。图1表示干扰素类似物-α-1b杂合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和干扰素类似物-α-1b氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。
4.2.干扰素类似物-α-2b载体的构建
干扰素-α-2a或干扰素-α-2b的基因通过下列PCR引物融合到白蛋白的C末端：
SEQ ID NO.39：5’-CTGCCTTAGGCTTA
TGTGATCTGCCT CAAACCC-3’(划线部分是人干扰素-α-2a和干扰素-α-2b成熟蛋白序列)和
SEQ ID NO.40：5’-T
CTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3’。
在干扰素-α基因的3’末端构建一Xho I位点(SEQ ID NO.40划线部分)。PCR产物经Bsu36I和Xho I消化，所得片段经凝胶电泳纯化***pYZ-HSA或pYH-HSA载体的Bsu36 I和Xho I位点之间形成一新质粒pYZ-HSA/IFN-aα-2b。干扰素类似物-α-2b杂合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)和干扰素类似物-α-2b氨基酸序列(SEQ IDNO.4)。
4.3.干扰素类似物-β载体的构建
设计下列引物用于制备干扰素-β和白蛋白的基因融合。SEQ ID NO.41：5’-CTGCCTTAGGCTTA
TACAACTTGCTTGGATTCC-3’(划线部分是人干扰素-β成熟蛋白序列)和SEQ ID NO.42：5’-CA
CTCGAG TCAGTTTCGGAGGTAACC-3’(划线部分是Xho I位点)。PCR产物***pYZ-HSA或pYH-HSA载体的Bsu36 I和XhoI位点之间形成一新质粒pYZ-HSA/IFN-β或pYH-HSA/IFN-β。图1表示干扰素类似物-β杂合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。
4.4.干扰素类似物-ω，载体的构建
用下列二个引物将人干扰素-ω基因融合到白蛋白的DNA序列中：
SEQ ID NO：43：5’-CTGCCTTAGGCTTA
TGTGATCTGCCTCAGAA CCATGG-3’(划线部分是人干扰素-ω成熟蛋白序列)和
SEQ ID NO.44：5’-
CTCGAGTCAAGATGAGCCCAGGTCTC-3’(划线部分是干扰素-ω 3’末端)
PCR产物经凝胶电泳纯化克隆到pYZ-HSA或pYH-HSA载体的Bsu36 I和XhoI位点之间形成一新质粒pYZ-HSA/IFN-ω或pYZ-HSA/IFN-ω。图1表示干扰素类似物-ω、HSA-INF-ω杂合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)。
4.5.含有干扰素类似物-γ载体的构建
下列引物用于构建干扰素类似物-γDNA序列，并克隆至pYZ-HSA载体中，
SEQ ID NO.45：5’-ACTCCTTAGGCTTA
CAGGACCCATATG TACAAGAAGC-3’(划线部分是人干扰素-γ成熟蛋白序列)和
SEQ ID NO.46：5’-
CTCGAGTTACTGGGATGCTCTTCG-3’(划线部分是XhoI位点)。
PCR产物经凝胶电泳纯化并在Bsu36 I和Xho I位点酶切，***到pYZ-HSA或pYH-HSA载体的Bsu36 I和Xho I位点之间，形成一新质粒pYZ-HSA/IFN-g或pYH-HSA/IFN-γ。图1表示干扰素类似物-γ、HSA-INF-γ杂合子的核苷酸序列(SEQ IDNO.9)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。
实施例5 酵母菌的转化
表达盒包括一个启动子、干扰素类似物、一个终止子和一个选择性标记(卓霉素抗生素或组氨酸缺陷型)。酵母株GS115，SMD1168或ZY101是组氨酸合成缺陷型。当用线性转移穿梭载体转化酵母时，表达盒将直接***同源重组区。多数情况下，一个表达盒将***一个酵母中。本发明阐明一种用有二种选择性标记的二个载体同时***同一染色体的不同区域的新方法。
5.1.表达载体质粒在酵母菌染色体上的单***
将毕氏酵母菌菌株GS115菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml培养基中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时之细胞密度达到OD600＝1.3-1.5。离心收集酵母菌，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1M山梨醇的溶液洗涤一次。实例2中构建的质粒pYZ-HSA和实施例4中构建的质粒pYZ-HSA/IFN-α-1b、pYZ-HSA/IFN-α-2b、pYZ-HSA/IFN-β、pYZ-HSA/IFN-ω和pYZ-HSA/IFN-γ均经Pme I限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。
取5μg线性质粒DNA与80ul新鲜制备的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于点脉冲仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10(ms)。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含卓霉素抗生素的YPD平板培养基上。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的***。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测。不同的毕氏酵母菌菌株，如X-33，KM71以及蛋白酶缺陷型酵母菌株SMD1168和ZY101均可用来表达和分泌重组的融合蛋白。
5.2.表达载体质粒在酵母菌染色体上的双***
为了获得对干扰素类似物具有高表达的酵母菌株，可以采用Invitrogen公司的多拷贝***方法。但在实际上选择并不是十分有效。本发明采用了一种二次转导的方法，使同一酵母菌能携带有多个表达组件，它们分别被***在染色体的不同部位。例如，首先使用在实施例5.1中所述方法，用线性化的pYZ-HSA/IFN-β转导酵母菌后干扰素类似物-β表达组件***在染色体AOX1基因启动子的位点。酵母菌就带有卓霉素抗生素的抗性。然后同一重组酵母菌再用线性化的pYHKA-HSA/IFN-β质粒转导，使用不含有组氨酸的基本培养基来筛选重组酵母菌。干扰素类似物基因就在新的重组酵母菌染色体上坐落在两个不同的区域内，AOX1启动子和HIS基因区域。新的重组酵母菌也就同时具有卓霉素抗生素基因和生长在无组氨酸存在的培养基中。同时使用G418抗生素作为压力选择，可以获得***在HIS基因区域内的多拷贝表达组件的重组酵母菌。
使用这种方法，不同的表达组件也可以***在同一酵母菌染色体内。例如，第一个表达组件可以是干扰素类似物-a，第二个表达组件可以是干扰素类似物-b。即第一个表达组件是蛋白质-X，第二个表达组件是蛋白质-X或蛋白质-Y。启动子可以是相同也可以是不同的。
实施例6 酵母菌分泌干扰素类似物蛋白质的方法及定性
经含有干扰素类似物的载体转化的重组酵母菌落分别培养在含有甘油的基本缓冲培养液中，以300转/分的速度培养至菌体密度达到OD600＝2-6。1500转/分离心5分钟收集菌体，菌体再重悬于不含甘油而含0.5％甲醇同种基本培养液中继续培养至细胞密度达到OD600＝1.0。每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％，诱导蛋白表达。在不同的时间点分别收集培养上清液，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或蛋白质免疫印迹法检测融合蛋白的表达，检测结果证明人白蛋白和白蛋白-干扰素融合蛋白(干扰素类似物)都得到表达并分泌到培养液中。使用GAPDH启动子时，则使用含有葡萄糖的基本缓冲培养液。
鼠抗人血清白蛋白的单克隆抗体(Sigma)用于蛋白质免疫印迹实验确定表达的蛋白质为与人血清白蛋白形成的融合蛋白。典型的蛋白质免疫印迹实验是将SDS-PAG凝胶电泳分离的蛋白质电泳转移到尼龙或硝酸纤维膜上，与特异抗体(第一抗体)温育，然后加抗第一抗体的抗体(第二抗体)与第一抗体结合。因为第二抗体是经荧光标记的，整个特异性结合的复合物经X光胶片曝光后会留下印记。标准蛋白分子量用于决定未知蛋白的分子量。图3表示酵母菌表达重组蛋白、白蛋白及干扰素类似物α(HSA-IFN-α-2a)融合蛋白，其分子量与预计相符，并且与来源于人血清白蛋白(Sigma)的抗原相同。
以抗人干扰素-α的单克隆抗体为第一抗体所做的蛋白质免疫印迹实验表明，干扰素类似物-α蛋白和人干扰素-α(Chemicon International Inc.US)具有相同的抗原性，并显示白蛋白和干扰素-α在融合蛋白中的摩尔比率与预期相同(YU and FU美国专利20040063635)。同理，以抗干扰素-β的单克隆抗体为第一抗体(CII，US)，干扰素类似物-β蛋白和人干扰素-β(CII，US)具有相同的抗原性，并显示白蛋白和干扰素-β在融合蛋白中的摩尔比率与预期相同(图4)。
实施例7.干扰素类似物的纯化和分子特性
在上清液中含有重组的毕氏酵母菌细胞分泌出的血清白蛋白或血清白蛋白的融合蛋白-干扰素类似物。培养液经收集、浓缩并降低盐浓度后，调整pH至7.5左右，浓缩液通过Bio-Rad公司制造的Affi-Gel Blue-Gel层析柱。HSA或融合蛋白则与层析柱上的功能集团结合而挂在柱体上。经过洗涤，HSA或干扰素类似物则可经由1-5MNaCl梯度洗脱，得到具有75-85％纯的蛋白制剂。如有需要则进一步通过分子筛层析柱，可得纯度提高至95-99％或更纯。用于动物试验的样品则将可能的热源如内毒素，借助Affi-Prep polymyxin Support层析柱(Bio-Rad)来去除，以符合体内试验需要。利用常规方法来决定蛋白质的浓度，如Bio-Rad生产的蛋白质浓度测定试剂盒。最后纯化的蛋白质通过0.2uM滤膜以达无菌要求。
实施例8.干扰素类似物-α-2a的对病毒攻击细胞的保护试验
干扰素-α-2a及其衍生物的抗病毒活性由细胞因子保护人胎儿羊膜WISH细胞抵抗疱疹性口炎病毒(VSV)诱导引起的细胞病变程度来确定(Rubinstein等，1981，J.Virol.37，755-758)。WISH细胞(4.5×105细胞/ml)预先置于96孔板中(100μl/孔)，与二倍梯度稀释的干扰素-α-2a或干扰素类似物α-2a一起在37℃下温育18小时。在ELISA板内测定结晶紫染色的细胞的吸收值可确定WISH细胞的活性。本分析方法中，天然干扰素-α-2a在半数有效剂量(ED50)0.45±0.04pM浓度时，其保护VSV诱导引起的WISH细胞病变的能力为50％；而干扰素类似物-α-2a则在半数有效剂量(ED50)1.13±0.3pM浓度时，具有天然干扰素抗病毒的25％(图5)。由于白蛋白的分子量(65kd)约是干扰素(19kd)的4倍。可推测如果按分子量比例计，干扰素类似物-α-2a与干扰素-α-2a具有相同的生物活性。
实施例9.应用酶联免疫分析干扰素类似物
应用酶联免疫分析(ELISA)测定未知样品中干扰素或干扰素类似物的活性并与已知生物活性的干扰素标准品进行比较测定是一种常规方法。Chemicon公司出品的干扰素-αELISA试剂盒是双抗体夹心方法。ChemiKineTM分析***是用预先包埋的山羊抗兔抗体板捕获特异的干扰素-α复合体，复合体中含有的干扰素-α抗体与干扰素-α结合。生物偶联的干扰素-α(竞争性配体)、样品或标准品竞争干扰素-α特异抗体结合位点。因此当样品中干扰素α浓度增加时，被抗体捕获的偶联的干扰素α量降低。用streptavidin碱性磷酸酶偶联的底物反应分析可定量分析，样品中干扰素-α的含量与使与标准品曲线相比较，可以计算出未知样品中的干扰素-α生物活性及含量。计算方法参照“第二版国际标准制备(WHO，67/343)。并以由尿液中分离的人干扰素-α、CHO细胞表达的人重组干扰素-α作为对照确定重组HSA/IFN-α融合蛋白的生物活性。
结果表明，干扰素类似物蛋白与天然的干扰素-α有相同的生物活性。当样品中干扰素类似物蛋白的浓度较高时可能是干扰素类似物蛋白分子太大，阻止干扰素-α抗体有效地与融合蛋白中的干扰素-α结合，因此使分析的灵敏度降低。在HSA-EPO的ELISA实验中也存在同样现象(YU and FU，美国专利20040063635)
实施例10 测定干扰素类似物在体外生物活性的稳定性
以干扰素类似物-α-2a为例，对干扰素类似物蛋白在37℃和50℃条件下，在不同时间点进行稳定性测定。取50U(0.5ng)由细菌表达的人干扰素-α-2a或50U(19.6ng)重组HSA/IFN-α-2a融合蛋白，置于含有200微升，不含血清及其它组分的RPM1培养液于200微升薄壁试管中，试管封好置于水浴中。在不同时间点取出样品，立即置于-80℃保存。待全部样品收集后，按标准操作规程以病毒感染Wish细胞系进行生物活性测定，并设立对照实验。结果表明，“裸露”干扰素-α在37℃下10小时(图6A)丧失全部生物活性；但在37℃下24小时后，干扰素类似物的生物活性没有任何变化，甚至其抗病毒活性在10天后仍保持原有的生物活性的一半。在50℃下(图6B)，“裸露”干扰素-α在一天内完全失去了生物活性；而干扰素类似物蛋白的生物活性在5天后保持原有的生物活性的90％。结果显示干扰素类似物储存时间延长，对环境如温度有更强的抗性。
实施例11.干扰素类似物在血浆中的存留时间
测定了在动物血浆中干扰素类似物-α-2b(HSA/IFN-α-2b)和干扰素-α-2b的存留时间。15ng(约1×103U)人干扰素-α-2b加45ng来自重组酵母表达的白蛋白或60g(约1×103U)人干扰素类似物-α-2b分别稀释成100μl溶液注射入小鼠体内，然后在不同时间分别采集血液样品(0.05ml)。实验的最后一天，所有受试的小鼠都采集血液样品0.5ml，在微型离心管中加EDTA一起离心，上清液置-80℃贮存。用Chemicon公司的ChemiKineTM人干扰素EIA试剂盒测试所有采自注射过干扰素-α-2b(对照)、干扰素类似物动物的血清样品。结果显示干扰素类似物比“裸露”的干扰素-α-2b在血浆中保持更长的未被降解的时间(图7)。在注射后12天仍能检测出干扰素类似物-α-2b的存在，这个结果与血清白蛋白有14-20天的血浆半衰期是一致的(Waldmann T.A.，in“Albumin Structure，Function and Uses”，Rosenoer V.M等(eds)，Pergamon Press，Oxford，255-275，1977)。注射干扰素类似物的动物血浆样品在第12天时仍能测出保护WISH细胞的抗病毒活性。结果显示对照样品没有保护细胞免受病毒攻击的功能，这种长效的生物学功能赋予干扰素类似物新的临床用途。
实施例12 应用发酵技术大规模表达制备干扰素类似物
实验中表明应用毕氏酵母表达和规模化生产重组干扰素类似物蛋白质比起其他任何***都要容易的多。重组株分离到后，重组蛋白表达株可有Mut+和Muts两种形式。从小规模培养开始，甲醇诱导或不需诱导，在不同培养时间点取样测试蛋白的表达。分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用SDS-PAGE方法进行分析，表达产物的生物活性，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。
序列表
<110>美国福源集团
<120>长效的人干扰素类似物
<130>I04US053570
<150>US60/483,984
<151>2003-06-30
<160>22
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2325
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60
gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120
gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180
gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240
gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300
gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360
gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420
agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480
aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540
tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600
tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660
agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720
gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780
gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840
agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900
gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960
gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020
aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080
aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140
ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200
tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260
cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320
caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380
tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440
ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500
tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560
tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620
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<213>智人
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<213>智人
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<213>智人
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Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
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<213>智人
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85 90 95
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100 105 110
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cttacaggtt acctccgaaa ctga 564
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<213>智人
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Gly Arg Arg Ala Ser Gln
165
Claims (22)
1.一种蛋白质，该蛋白质为人血清白蛋白和干扰素的融合蛋白，其中干扰素以N-末端或C-末端与人血清白蛋白蛋白质的C-末端或N-末端直接相连以构成融合蛋白。
2.如权利要求1所述的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列为Seq ID No.2、4、6、8或10所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述干扰素选自IFN-α-1、IFN-α-2、IFN-α-4、IFN-α-5、IFN-α-6、IFN-α-7、IFN-α-8、IFN-α-10、IFN-α-12、IFN-α-13、IFN-α-14、IFN-α-16、IFN-α-17、IFN-α-21、INF-β-1、INF-β-2、INF-λ-1、INF-λ-2、INF-ω、INF-γ和/或INF-ε。
4.如权利要求3所述的蛋白质，其中所述干扰素选自IFN-α-1b、IFN-α-2a或IFN-α-2b。
5.如权利要求1所述的蛋白质，该蛋白质是分泌型的。
6.一种多核苷酸，该核苷酸编码权利要求1所述的蛋白质。
7.如权利要求6所述的多核苷酸，该核苷酸为Seq ID NO.1、3、5、7或9所示的核苷酸序列。
8.一种载体，其携带有如权利要求6所述的多核苷酸。
9.一种宿主***，其经权利要求8所述的载体转化、转染或转导得到。
10.根据权利要求9所述的宿主***，其包括脊椎动物、昆虫、植物的细胞、酵母菌、细菌或病毒。
11.根据权利要求10所述的宿主***，其中所述的酵母菌是酿酒酵母、毕氏酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母。
12.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，该方法包括在权利要求9所述的宿主***中表达如权利要求6所述的多核苷酸。
13.权利要求1-5任一项所述的蛋白质在制备用于治疗病毒感染或癌症的药物中的用途。
14.权利要求6或7所述的多核苷酸在制备用于治疗病毒感染或癌症的药物中的用途。
15.一种药物组合物，该组合物包含至少一种权利要求1-5任一项所述的蛋白质。
16.如权利要求15所述的组合物，该组合物包含人血清白蛋白与干扰素-α的融合蛋白和人血清白蛋白与干扰素-γ的融合蛋白。
17.如权利要求15所述的组合物，该组合物包含人血清白蛋白与干扰素-α的融合蛋白和人血清白蛋白与干扰素-β的融合蛋白。
18.如权利要求15所述的组合物，该组合物包含人血清白蛋白与干扰素-α的融合蛋白和人血清白蛋白与干扰素-ω的融合蛋白。
19.如权利要求15所述的组合物，该组合物包含人血清白蛋白与干扰素-ω的融合蛋白和人血清白蛋白与干扰素-γ的融合蛋白。
20.如权利要求15所述的组合物，该组合物包含人血清白蛋白与干扰素-β的融合蛋白和人血清白蛋白与干扰素-ω的融合蛋白。
21.一种药物组合物，该药物组合物含有至少一种权利要求6或7所述的多核苷酸。
22.一种试剂盒，该试剂盒含有至少一种权利要求1-5任一项所述的蛋白质或至少一种权利要求6或7所述的多核苷酸。
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