CN1257918A

CN1257918A - 重组抗真菌蛋白基因序列、工程菌及其产物制备方法

Info

Publication number: CN1257918A
Application number: CN98125610A
Authority: CN
Inventors: 吴光耀; 赵进东; 刘迎芳; 王春霞
Original assignee: 吴光耀
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2000-06-28

Abstract

一种重组抗真菌蛋白基因序列、工程菌及其产物制备方法。制备方法包括:自美洲商陆的种子中分离总mRNA,人工合成有限制内切酶切点的引物,PCR基因扩增,将获得Pa－AFP前体蛋白基因片段克隆在pGEX－4T1上,转化进入大肠杆菌,将工程菌扩增培养、经IPTG诱导后,融合基因被大量表达,表达产物经谷胱甘肽Sepharore4B亲和柱层析,融合蛋白被纯化。采用本发明提供的引物,准确获得了含有65个氨基酸的蛋白前体基因序列,并获得成熟的蛋白序列。该产物抑菌能力强,在农业或医药上有潜在应用前景,本方法可使菌体产量高,且表达量高达41%,破包含体后占55%。

Description

重组抗真菌蛋白基因序列、工程菌及其产物制备方法

本发明涉及一种重组抗真菌蛋白基因序列以及工程菌的制备和产物的纯化方法。

自美洲商陆成熟的种子中发现的Pa-AFP蛋白是一种抗植物真菌的蛋白。实验表明，它对西洋参致病真菌立枯丝合菌(Rhigoctonia solani)有抗菌活性。西洋参四年成熟，但第二年必须转移栽培，否则将被真菌感染而死亡，立枯丝合菌即从西洋参分离出的致病菌。由于真菌结构的相似性，可望它对人的致病真菌也有抑制作用。因此，这一蛋白将在农业上和临床应用上有潜在的应用前景。

本发明目的是提供一种新的抗真菌蛋白，及生产这种蛋白的工程菌和产物的制备方法，该方法获得的多肽产物活性高、表达量大。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：重组抗真菌蛋白基因序列、工程菌和产物制备方法，它包括以下几个步骤：

①美洲商陆成熟种子中的总mRNA分离；

②人工合成有限制内切酶切点的引物，引物包括获得成熟Pa-AFP蛋白基因引物，全长Pa-AFP蛋白cDNA引物，和克隆到pGEX-4T1的引物，引物的序列分别为：成熟Pa-AFP蛋白基因引物：

Hind III

5′AAGCTTG(TC)AT(TCA)AA(AG)AA(TC)GG

SalI

3′GTCGAC TACATC TTTTTTTTTTTT

全长Pa-AFP蛋白cDNA引物[由mRNA反转离成cDNA后，用末端核苷酸转移酶(TdT)加尾Oligo(dC)]：

XbaI

5′TCTAGA TCT GGGGGGGGGGGG

BamHI

3′GGATCC A TTA GCG GTT TTT GCA AAC ACC

克隆所需引物(以Pa-AFP蛋白cDNA为模板)：

BamHI

5′TAC GGATTC GCG GGA TGC ATA AA

EcoRI

3′CG GAATTC TTA GCG GTT TTT GCA AAC

③PCR基因扩增：在含有前体Pa-AFP蛋白基因引物的存在下，以含有Pa-AFP的cDNA(来自总mRNA反转录的cDNA)为模板，通过PCR基因扩增，获得Pa-AFP前体蛋白基因片段，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：

5′ATG GCT AAG GTT TCA TCT GCC TAC CTG AAA TTT GCT CTC GTC ATG ATT CTC TTA

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

M A K V S S A Y L K F A L V M I L L

TGT AAC GCG AGT GCA GGT CCT CCA TAC TGT TGT TCT AGC TAT TGT TTC CAA ATA

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

C N A S A G P P Y C C S S Y C F Q I

GCT GGA CAA TCC TAT GGT GTT TGC AAA AAC CGC TAA 3′

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

A G Q S Y G V C K N R *

用pGEX-4T1克隆时，以Pa-AFP蛋白基因为模板，对其cDNA克隆和大肠杆菌转化。

经BamHI和EcoRI酶切pGEX-4T1和Pa-AFP蛋白cDNA进行连接，并转化到感受态的大肠杆菌中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即Pa-AFP工程菌。

④将工程菌扩增培养、IPTG诱导表达、破壁、破包含体、亲和层析纯化。

以下结合实施例及附图对本发明作详细说明：

图1.获得的Pa-AFP基因序列分析图谱

图2.重组质粒pGEX-4T1-PaAFP构建图谱

图3.pGEX-AFP重组质粒鉴定

图4a.AFP基因的表达和纯化

图4b.图4a中含有pGEX-AFP质粒的大肠杆菌BL21全蛋白电泳扫描

图5.纯化的AFP的立枯丝合菌的抑制作用

实施例1

1.Pa-AFP基因的获得

①美洲商陆种子总mRNA的分离：

按Pharmacia公司微量mRNA纯化试剂盒所述方法进行(也可用其他公司的试剂盒)：

将100毫克即将成熟的美洲商陆种子在提取缓冲液中匀浆，用稀释缓冲液稀释后离心，上清液用Oligo(dT)一纤维素吸附，洗涤后用洗脱缓冲液洗脱，即获得总mRNA。

②RT-PCR基因扩增

在我们获得了抗真菌蛋白后，对其N-末端进行了测序，依其氨基酸序列合成了5′端引物，3′端用PolyA为引物，引物序列为：

Hind III

5′AAGCTT G(TC)AT(TCA)AA(AG)AA(TC)GG

SalI

3′GTCGAC TACATC TTTTTTTTTTTT

进行逆转录一聚合酶链反应扩增后，在琼脂糖电泳凝胶上回收cDNA扩增带，即得到成熟抗真菌蛋白cDNA。测序后，再依3末端序列设计引物，mRNA反转录成cDNA后，用末端核苷酸转移酶(TdT)，加Oligo(dC)尾为5′引物，引物序列为：

xbaI

5′TCTAGA TCT GGGGGGGGGGGG

BamHI

3′GGATCC A TTA GCG GTT TTT GCA AAC ACC

进行聚合酶链反应扩增后，在琼脂糖电泳凝胶上回收cDNA扩增带，即得到抗真菌蛋白前体cDNA序列。

③Pa-AFP成熟蛋白cDNA克隆和大肠杆菌转化

依pGEX-4T1的需要，从新设计了具有BamHI和EcoRI位点引物，引物序列为：

BamHI

5′TAC GGATTC GCG GGA TGC ATA AA

EcoRI

3′CG GAATTC TTA GCG GTT TTT GCA AAC

以成熟Pa-AFP蛋白cDNA为模板，PCR扩增，产物回收后依重组质粒pGEX-4T1构建策略，进行克隆。经BamHI和EcoRI酶切的pGEX-4T1(购于Pharmacia公司)与Pa-AFP cDNA连接，1-7μl连接产物加到100-200μl的大肠杆菌感受态细胞悬液中。转化的阳性大肠杆菌扩大培养，对克隆的准确性进行酶切鉴定，并且进行表达量测定。

④扩大培养的产物鉴定

经筛选后的大肠杆菌经三级培养(发酵罐培养)，其培养基配方为：

硫酸铵5.0克/升，磷酸氢二钾6.0克/升，

磷酸二氢钾3.0/升，柠檬酸钠0.5克/升，

硫酸镁1.5克/升，三氯化铁0.01克/升，

胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物2.0-10.0克/升，

葡萄糖80.0-100.0克/升；

微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)10^-5-10^-4克分子/升。

菌体37℃培养4-5小时，IPTG诱导表达3-4小时后，收集菌体。菌体裂解，破包含体，再进行SDS-PAGE测定表明，产物大量表达。

⑤Pa-AFP纯化

产物为与谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白。纯化方法依Pharmacia公司试剂盒，破包含体后10000rpm离心10分钟，在1XPBS(0.14mol/LNaCl，2.7mmol/LkCl，10mmol/LNa₂HPO₄，1.8mmol/LKH₂PO₄，pH7.3)缓冲液中的上清液通过谷胱甘肽-Sepharose4B柱，柱用含有10mmol/L还原谷胱甘肽的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗脱，收集洗脱液。洗脱液加入适量凝血酶溶液(Thrombin)切断融合蛋白，10000rpm离心10分钟，在Sephadex G-50柱上凝胶过滤，即得纯化的抗真菌蛋白。纯化的Pa-AFP含量在95％以上，蛋白含有38个氨基酸，分子量为4600D。

图3中，1为PCR扩增的AFP基因片段；2，标准DNA(pBR322/BstNI)；pGEX-AFP由BamHI和EcoRI酶切：4pGEX由BamHI和EcoRI酶切。

图4a中，1，标准蛋白分子量；2大肠杆菌BL21全蛋白；3含有空载体pGEX的大肠杆菌BL21全蛋白；4含有pGEX-AFP质粒的大肠杆菌BL21全蛋白；5表达细胞中的包含体；6含有pGEX-AFP质粒由大肠杆菌BL21低速离心后上清；8，7纯化的GST-AFP。

图5中，CK，对照；C1、C2、C3、C4，不同浓度的重组AFP对立枯丝合菌的抑制作用。

本发明优点：

①在我们新发现的抗真菌蛋白(Pa-AFP)测序的基础上，两次设计引物，准确获得了含有65个氨基酸的蛋白前体基因序列，且获得了成熟蛋白序列。

②利用与谷胱甘肽-S-转移酶基因融合，可用亲合层析柱一步纯化，并可大量表达。

③采用高密度培养基，使得经扩大培养后的菌体产量高，从而可使产物高产。

④由于表达量高，有利于工业化生产。

⑤产物抑菌能力强，在农业或医药上有潜在的应用前景。

Claims

1.一种重组抗真菌蛋白基因序列，其特征在于其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：

5′ATG GCT AAG GTT TCA TCT GCC TAC CTG AAA TTT GCT CTC GTC ATG ATT CTC TTA

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

M A K V S S A Y L K F A L V M I L L

TGT AAC GCG AGT GCA GGT CCT CCA TAC TGT TGT TCT AGC TAT TGT TTC CAA ATA

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

C N A S A G P P Y C C S S Y C F Q I

GCT GGA CAA TCC TAT GGT GTT TGC AAA AAC CGC TAA 3′

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

A G Q S Y G V C K N R *

2、一种重组抗真菌蛋白基因序列、工程菌及其产物制备，其特征在于它包括以下几个步骤：

①美洲商陆种子中总mRNA的分离；

②依已知蛋白的N-末端序列，人工合成含有限制性内切酶切点的成熟蛋白cDNA引物；

Hind III

5′AAGCTTG(TC)AT(TCA)AA(AG)AA(TC)GG

SalI

3′GTCGAC TACATC TTTTTTTTTTTT

③RT-PCR基因扩增：在含有合成引物的存在下，以mRNA为模板，通过RT-PCR基因扩增，获得抗真菌蛋白基因片段；

④再依成熟蛋白cDNA 3′末端序列合成引物；

XbaI

5′TCTAGA TCT GGGGGGGGGGGG

BamHI

3′GGATCC A TTA GCG GTT TTT GCA AAC ACC

⑤PCR基因扩增：在含有合成引物的存在下，以总mRNA的逆转录cDNA为模板，获得抗真菌蛋白前体基因片段，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：5′ATG GCT AAG GTT TCA TCT GCC TAC CTG AAA TTT GCT CTC GTC ATG ATT CTC TTA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

M A K V S S A Y L K F A L V M I L LTGT AAC GCG AGT GCA GGT CCT CCA TAC TGT TGT TCT AGC TAT TGT TTC CAA ATA

C N A S A G P P Y C C S S Y C F Q IGCT GGA CAA TCC TAT GGT GTT TGC AAA AAC CGC TAA 3′--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

A G Q S Y G V C K N R *

⑥抗真菌蛋白cDNA克隆和大肠杆菌转化：为使抗真菌蛋白基因与pGEX-4T，载体连接，从新设计了引物，其引物序列为：

BamHI

5’TAC GGATTC GCG GGA TGC ATA AA

EcoRI

3′CG GAATTC TTA GCG GTT TTT GCA AAC

克隆载体转化至感受态的大肠杆菌中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即抗真菌蛋白工程菌；

⑦将工程菌扩增培养，化学诱导表达、破壁、破包含体、亲和层析、融合蛋白水解，抗真菌蛋白被纯化。

3、按权利要求2所述的重组抗真菌蛋白序列工程菌及其产物的制备方法，其特征在于所述工程菌扩增培养的培养基配方为：

硫酸铵5.0克/升，磷酸氢二钾6.0克/升，

磷酸二氢钾3.0/升，柠檬酸钠0.5克/升，

硫酸镁1.5克/升，三氯化铁0.01克/升，

胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物2.0-10.0克/升，

葡萄糖80.0-100.0克/升；

微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)各10^-5-10^-4克分子/升。