CN1132844C - 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌及其产物的制备方法，包括人白细胞分离，白细胞总mRNA分离；人工合成含有限制性内切酶切点的引物；RT-PCR基因扩增；IL-18 cDNA克隆；转化进入大肠杆菌；工程菌中产物高效表达；IL-18的纯化。由于采用含有限制性内切酶切点的引物，准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因。使用大肠杆菌偏爱的终止密码子提高表达率、采用高扩增培养基，表达量高，使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。

Description

重组人白细胞介素-18的工程菌直至产物的制备方法

本发明涉及一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌直至产物的制备方法。

白细胞介素-18是人的一种细胞因子(Cytokines)，它可以明显促进T细胞大量产生γ-干扰素，γ-干扰素在抗微生物感染时起着关键作用。IL-18还可增加人体中NK细胞的活性，增加它对靶细胞(如肿瘤细胞)的细胞毒性(裂解能力)，在这方面它的作用强于普遍认为有临床应用价值的人白细胞介素-12(IL-12)。此外，IL-18还可以促进GM-CSF和IL-2的产生，增加它们的活性。因此，IL-18对增强人体免疫功能、抗肿瘤功能和增加造血功能上有重要作用。它在临床应用上有潜在的应用前景。

本发明目的是提供一种人白细胞介素-18工程菌直至产物的制备方法，该方法获得的多肽活性高、表达量大。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：制备方法包括以下几个步骤；

①人外周血中白细胞分离；

②白细胞总mRNA的分离；

③人工合成含有限制性内切酶切点的引物，在合成的上游引物中导入EcoRI位点，在合成的下游引物中导入BamHI位点，并将天然IL-18的终止密码子TAG转换成大肠杆菌偏爱的终止密码子TAA，引物的序列为：

PL 5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′

PR 3′GC GGATCC TTA GTC TTC CTT TTG AAC AG       5′

④RT-PCR基因扩增：在含有合成引物的存在下，以mRNA为模板，通过RT-PCR基因扩增，获得IL-18基因片段，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：

                                    10

ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA

 M   Y   F   G   K   L   E   S   K   L   S   V   I   R

                     20

AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG

 N   L   N   D   Q   V   L   F   I   D   Q   G   N   R

     30                                      40

CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT

 P   L   F   E   D   M   T   D   S   D   C   R   D   N

                             50

GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC

 A   P   R   T   I   F   I   I   S   M   Y   K   D   S

             60                                      70

CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG

 Q   P   R   G   M   A   V   T   I   S   V   K   C   E

                                     80

AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT

 K   I   S   T   L   S   C   E   N   K   I   I   S   F

                     90

AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGT

 K   E   M   N   P   P   D   N   I   K   D   T   K   S

    100                                     110

GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT

 D   I   I   F   F   Q   R   S   V   P   G   H   D   N

                        120

AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA

 K   M   Q   F   E   S   S   S   Y   E   G   Y   F   L

            130                                     140

GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA

 A   C   E   K   E   R   D   L   F   K   L   I   L   K

                                    150

AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT

 K   E   D   E   L   G   D   R   S   I   M   F   T   V

            158

CAA AAC GAA GAC TAA

 Q   N   E   D   *

⑤IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化：

经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接，并转化至感受态的大肠杆菌中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即IL-18工程菌。

⑥将工程菌扩增培养，热激表达，破壁、破包含体、IL-18纯化。

以下结合实施例及附图对本发明作详细说明：

图1、重组质粒pBV220-IL-18构建图谱

图2、获得的IL-18基因序列分析

图3、克隆和转化后的质粒酶切图谱

图4a、IL-18表达量SDS-PAGE图谱

图4b、IL-18表达量SDS-PAGE扫描图谱(破壁后全蛋白)

图4c、IL-18表达量SDS-PAGE扫描图谱(破包含体后)

图5、纯化后IL-18的SDS-PAGE图谱

图6、纯化后IL-18蛋白N末端15个氨基酸序列分析图

实施例1

1.工程菌的获得

①人外周血中白细胞的分离：

取健康人的外周血，以1∶1.5(V/V)的比例加入细胞分离液，在1000rpm下离心15分钟进行梯度分离，收集白细胞部分，每毫升加入0.5μg ConA，细胞培养24小时，使T淋巴细胞增殖。

②白细胞总mRNA的分离：

按Pharmacia公司微量mRNA纯化试剂盒所述方法进行(也可以其他公司的试剂盒)：

将含有10⁷个细胞的白细胞悬液放在1.5ml塑料离心管中，1000rpm下离心，弃上清液，管中加入0.4ml提取缓冲液匀浆，再用0.8ml洗脱液稀释，1000xg下离心1分钟，得含有mRNA的上清液。

另取一支1.5ml塑料离心管，加入1ml Oligo(dT)-纤维素，1000xg下离心1分钟，除去贮存液。将含有mRNA的上清液加入到Oligo(dT)-纤维素离心管中，混合3分钟，使mRNA亲和吸附，再在16000xg下离心10秒钟，弃上清液。

在管中加入1ml高盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCL，1mmoI/LEDTA，0.5mol/L NaCl pH7.4进行洗涤，将Oligo(dT)-纤维素悬浮，离心10秒钟，弃上清液。重复上述步骤4次。

在管中再加入1ml低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA，0.1mol/L NaCl，pH7.4)进行洗涤，重复洗涤3次。洗涤后的Oligo(dT)-纤维素加入0.3ml低盐缓冲液悬浮，放入微型柱中，在柱中的Oligo(dT)-纤维素再用0.5ml低盐缓冲液洗涤三次，离心除去洗涤液。加入0.2ml洗脱缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)离心，洗脱下来的400ml mRNA溶液中加入1oμl糖原溶液，40μl乙酸钾溶液，再加入1ml-20℃冷乙醇(95％)，-20℃静量至少30分钟，在4℃离心5分钟得mRNA沉淀，沉淀在-80℃贮存，洗脱液在260nm的最大吸收量0.05，相当于RNA浓度为2μg/ml。

③RT-PCR基因扩增：

以上述mRNA为模板，加入引物，(引物序列为：

PL5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′

PR3′GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′

进行RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)扩增，在95℃变性35秒后，50℃退火一分钟，再于70℃延伸1分钟，反应进行35次循环，扩增样品在琼脂糖凝胶电泳后回收IL-18cDNA扩增带。

④IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化。

经EcoRI+BamHI酶切的pBV220载体(来自中国预防医学科学院)和IL-18cDNA进行连接，连接在0.5ml塑料离心管中进行，管中加入4.5μl重蒸水，1.5μl连接反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/LMgCl₂，20mmol/L DTT，1mmol/L ATP和50μg BSA.pH7.8)，2μl载体DNA，6μl IL-18DNA片段和1μl T4DNA连接酶，样品混匀后，在14-16℃水浴中保温24-72小时。

取5-7μl连接产物(载有IL-18基因的质粒)加到100-200μL的E.coli HB101感受态细胞悬液中，混匀放在冰浴中30分钟，再于42℃热击2分钟，加入1ml LB培养液(不含抗菌素)，37℃保温1小时，涂布于含有LB固体培养基(内含氨苄青霉素)37℃培养过夜，取阳性克隆的大肠杆菌菌落，扩大培养并鉴定表达量。

IL-18产物鉴定

经筛选后的大肠杆菌经三级培养(发酵罐培养)，其配方：

硫酸铵5.0克/升，磷酸氢二钾6.0克/升，

磷酸二氢钾3.0/升，柠檬酸钠0.5克/升，

硫酸镁1.5克/升，三氯化铁0.01克/升，

胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物

2.0-10.0克/升，葡萄糖80.0-100.0克/升，

微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)10^-5-10^-4克分子/升，湿菌体达70-80克/升。

菌体裂解、破包含体，再进行SOS-PAGE测定表明，IL-18蛋白占菌体可溶蛋白的30％以上，占包含体蛋白的60％以上，经SaphadexG-100柱纯化，得含量95％以上的IL-18蛋白，蛋白含有158个氨基酸，分子量为18KD。

图3中，1，质粒PBV220-IL18，2，EcoRI/BamHI双酶切，3，BamHI酶切，4，ECORI酶切，5，标准碱基数。

图4a中，1，未热激全蛋白，2，破壁后全蛋白，3，破包含体后全蛋白，4，标准分子量，

图4b中，IL-18占全蛋白的44.99％，

图4c中，IL-18占蛋白的61.3％，

本发明优点：

①采用含有限制性内切酶切点的引物，准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因，并克隆到热诱导载体上。②使用大肠杆菌偏爱的终止密码子，提高表达效率。③由于采用高扩增培养基，使得经扩大培养后的菌体产量高。④由于表达量高，使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。

Claims (2)

1.一种重组人白细胞介素-18(IL-18)工程菌直至产物的制备方法，其特征在于它包括以下几个步骤：

①人外周血中白细胞的分离；

②白细胞中总mRNA的分离；

③人工合成含有限制性内切酶切点的引物，在合成的上游引物中导入EcoRI位点，在合成的下游引物中导入BamHI位点，其引物的序列为：

PL5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′

PR3′GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG       5′

④RT-PCR基因扩增：在含有合成引物的存在下，以mRNA为模板，通过RT-PCR基因扩增，获得IL-18基因片段，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：

                                     10

ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA

 M   Y   F   G   K   L   E   S   K   L   S   V   I   R

                    20

AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG

 N   L   N   D   Q   V   L   F   I   D   Q   G   N   R

     30                                      40

CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT

 P   L   F   E   D   M   T   D   S   D   C   R   D   N

                             50

GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC

 A   P   R   T   I   F   I   I   S   M   Y   K   D   S

             60                                      70

CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG

 Q   P   R   G   M   A   V   T   I   S   V   K   C   E

                                     80

AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT

 K   I   S   T   L   S   C   E   N   K   I   I   S   F

                     90

AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGT

 K   E   M   N   P   P   D   N   I   K   D   T   K   S

    100                                     110

GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT

 D   I   I   F   F   Q   R   S   V   P   G   H   D   N

                            120

AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA

 K   M   Q   F   E   S   S   S   Y   E   G   Y   F   L

            130                                     140

GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA

 A   C   E   K   E   R   D   L   F   K   L   I   L   K

                                    150

AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT

 K   E   D   E   L   G   D   R   S   I   M   F   T   V

             158

CAA AAC GAA GAC TAA

 Q   N   E   D   *

⑤IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化：

经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接，并转化至感受态的大肠杆菌中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即IL-18工程菌。

⑥将工程菌扩增培养，热激表达、破壁、破包含体；IL-18纯化。

2.按权利要求1所述的重组人白细胞介素-18(IL-18)工程菌直至产物的制备方法，其特征在于所述扩增培养的培养基配方为：

硫酸铵5.0克/升，磷酸氢二钾6.0克/升，

磷酸二氢钾3.0/升，柠檬酸钠0.5克/升；

硫酸镁1.5克/升，三氯化铁0.01克/升；

胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物

2.0-10.0克/升，葡萄糖80.0-100.0克/升；

微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)10^-5-10^-4克分子/升，

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