CN1132844C - 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 - Google Patents
重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1132844C CN1132844C CN 98103307 CN98103307A CN1132844C CN 1132844 C CN1132844 C CN 1132844C CN 98103307 CN98103307 CN 98103307 CN 98103307 A CN98103307 A CN 98103307A CN 1132844 C CN1132844 C CN 1132844C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aaa
- ttt
- gaa
- gat
- atg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌及其产物的制备方法,包括人白细胞分离,白细胞总mRNA分离;人工合成含有限制性内切酶切点的引物;RT-PCR基因扩增;IL-18 cDNA克隆;转化进入大肠杆菌;工程菌中产物高效表达;IL-18的纯化。由于采用含有限制性内切酶切点的引物,准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因。使用大肠杆菌偏爱的终止密码子提高表达率、采用高扩增培养基,表达量高,使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。
Description
本发明涉及一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌直至产物的制备方法。
白细胞介素-18是人的一种细胞因子(Cytokines),它可以明显促进T细胞大量产生γ-干扰素,γ-干扰素在抗微生物感染时起着关键作用。IL-18还可增加人体中NK细胞的活性,增加它对靶细胞(如肿瘤细胞)的细胞毒性(裂解能力),在这方面它的作用强于普遍认为有临床应用价值的人白细胞介素-12(IL-12)。此外,IL-18还可以促进GM-CSF和IL-2的产生,增加它们的活性。因此,IL-18对增强人体免疫功能、抗肿瘤功能和增加造血功能上有重要作用。它在临床应用上有潜在的应用前景。
本发明目的是提供一种人白细胞介素-18工程菌直至产物的制备方法,该方法获得的多肽活性高、表达量大。
为达到上述目的,本发明采用以下技术方案:制备方法包括以下几个步骤;
①人外周血中白细胞分离;
②白细胞总mRNA的分离;
③人工合成含有限制性内切酶切点的引物,在合成的上游引物中导入EcoRI位点,在合成的下游引物中导入BamHI位点,并将天然IL-18的终止密码子TAG转换成大肠杆菌偏爱的终止密码子TAA,引物的序列为:
PL 5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′
PR 3′GC GGATCC TTA GTC TTC CTT TTG AAC AG 5′
④RT-PCR基因扩增:在含有合成引物的存在下,以mRNA为模板,通过RT-PCR基因扩增,获得IL-18基因片段,其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为:
10
ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA
M Y F G K L E S K L S V I R
20
AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG
N L N D Q V L F I D Q G N R
30 40
CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT
P L F E D M T D S D C R D N
50
GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC
A P R T I F I I S M Y K D S
60 70
CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG
Q P R G M A V T I S V K C E
80
AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT
K I S T L S C E N K I I S F
90
AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGT
K E M N P P D N I K D T K S
100 110
GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT
D I I F F Q R S V P G H D N
120
AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA
K M Q F E S S S Y E G Y F L
130 140
GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA
A C E K E R D L F K L I L K
150
AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT
K E D E L G D R S I M F T V
158
CAA AAC GAA GAC TAA
Q N E D *
⑤IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化:
经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接,并转化至感受态的大肠杆菌中,经抗性培养基筛选,得阳性克隆的大肠杆菌,即IL-18工程菌。
⑥将工程菌扩增培养,热激表达,破壁、破包含体、IL-18纯化。
以下结合实施例及附图对本发明作详细说明:
图1、重组质粒pBV220-IL-18构建图谱
图2、获得的IL-18基因序列分析
图3、克隆和转化后的质粒酶切图谱
图4a、IL-18表达量SDS-PAGE图谱
图4b、IL-18表达量SDS-PAGE扫描图谱(破壁后全蛋白)
图4c、IL-18表达量SDS-PAGE扫描图谱(破包含体后)
图5、纯化后IL-18的SDS-PAGE图谱
图6、纯化后IL-18蛋白N末端15个氨基酸序列分析图
实施例1
1.工程菌的获得
①人外周血中白细胞的分离:
取健康人的外周血,以1∶1.5(V/V)的比例加入细胞分离液,在1000rpm下离心15分钟进行梯度分离,收集白细胞部分,每毫升加入0.5μg ConA,细胞培养24小时,使T淋巴细胞增殖。
②白细胞总mRNA的分离:
按Pharmacia公司微量mRNA纯化试剂盒所述方法进行(也可以其他公司的试剂盒):
将含有107个细胞的白细胞悬液放在1.5ml塑料离心管中,1000rpm下离心,弃上清液,管中加入0.4ml提取缓冲液匀浆,再用0.8ml洗脱液稀释,1000xg下离心1分钟,得含有mRNA的上清液。
另取一支1.5ml塑料离心管,加入1ml Oligo(dT)-纤维素,1000xg下离心1分钟,除去贮存液。将含有mRNA的上清液加入到Oligo(dT)-纤维素离心管中,混合3分钟,使mRNA亲和吸附,再在16000xg下离心10秒钟,弃上清液。
在管中加入1ml高盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCL,1mmoI/LEDTA,0.5mol/L NaCl pH7.4进行洗涤,将Oligo(dT)-纤维素悬浮,离心10秒钟,弃上清液。重复上述步骤4次。
在管中再加入1ml低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/LEDTA,0.1mol/L NaCl,pH7.4)进行洗涤,重复洗涤3次。洗涤后的Oligo(dT)-纤维素加入0.3ml低盐缓冲液悬浮,放入微型柱中,在柱中的Oligo(dT)-纤维素再用0.5ml低盐缓冲液洗涤三次,离心除去洗涤液。加入0.2ml洗脱缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH7.4)离心,洗脱下来的400ml mRNA溶液中加入1oμl糖原溶液,40μl乙酸钾溶液,再加入1ml-20℃冷乙醇(95%),-20℃静量至少30分钟,在4℃离心5分钟得mRNA沉淀,沉淀在-80℃贮存,洗脱液在260nm的最大吸收量0.05,相当于RNA浓度为2μg/ml。
③RT-PCR基因扩增:
以上述mRNA为模板,加入引物,(引物序列为:
PL5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′
PR3′GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′
进行RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)扩增,在95℃变性35秒后,50℃退火一分钟,再于70℃延伸1分钟,反应进行35次循环,扩增样品在琼脂糖凝胶电泳后回收IL-18cDNA扩增带。
④IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化。
经EcoRI+BamHI酶切的pBV220载体(来自中国预防医学科学院)和IL-18cDNA进行连接,连接在0.5ml塑料离心管中进行,管中加入4.5μl重蒸水,1.5μl连接反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,10mmol/LMgCl2,20mmol/L DTT,1mmol/L ATP和50μg BSA.pH7.8),2μl载体DNA,6μl IL-18DNA片段和1μl T4DNA连接酶,样品混匀后,在14-16℃水浴中保温24-72小时。
取5-7μl连接产物(载有IL-18基因的质粒)加到100-200μL的E.coli HB101感受态细胞悬液中,混匀放在冰浴中30分钟,再于42℃热击2分钟,加入1ml LB培养液(不含抗菌素),37℃保温1小时,涂布于含有LB固体培养基(内含氨苄青霉素)37℃培养过夜,取阳性克隆的大肠杆菌菌落,扩大培养并鉴定表达量。
IL-18产物鉴定
经筛选后的大肠杆菌经三级培养(发酵罐培养),其配方:
硫酸铵5.0克/升,磷酸氢二钾6.0克/升,
磷酸二氢钾3.0/升,柠檬酸钠0.5克/升,
硫酸镁1.5克/升,三氯化铁0.01克/升,
胰蛋白胨10.0-20.0克/升,酵母提取物
2.0-10.0克/升,葡萄糖80.0-100.0克/升,
微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)10-5-10-4克分子/升,湿菌体达70-80克/升。
菌体裂解、破包含体,再进行SOS-PAGE测定表明,IL-18蛋白占菌体可溶蛋白的30%以上,占包含体蛋白的60%以上,经SaphadexG-100柱纯化,得含量95%以上的IL-18蛋白,蛋白含有158个氨基酸,分子量为18KD。
图3中,1,质粒PBV220-IL18,2,EcoRI/BamHI双酶切,3,BamHI酶切,4,ECORI酶切,5,标准碱基数。
图4a中,1,未热激全蛋白,2,破壁后全蛋白,3,破包含体后全蛋白,4,标准分子量,
图4b中,IL-18占全蛋白的44.99%,
图4c中,IL-18占蛋白的61.3%,
本发明优点:
①采用含有限制性内切酶切点的引物,准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因,并克隆到热诱导载体上。②使用大肠杆菌偏爱的终止密码子,提高表达效率。③由于采用高扩增培养基,使得经扩大培养后的菌体产量高。④由于表达量高,使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。
Claims (2)
1.一种重组人白细胞介素-18(IL-18)工程菌直至产物的制备方法,其特征在于它包括以下几个步骤:
①人外周血中白细胞的分离;
②白细胞中总mRNA的分离;
③人工合成含有限制性内切酶切点的引物,在合成的上游引物中导入EcoRI位点,在合成的下游引物中导入BamHI位点,其引物的序列为:
PL5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′
PR3′GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′
④RT-PCR基因扩增:在含有合成引物的存在下,以mRNA为模板,通过RT-PCR基因扩增,获得IL-18基因片段,其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为:
10
ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA
M Y F G K L E S K L S V I R
20
AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG
N L N D Q V L F I D Q G N R
30 40
CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT
P L F E D M T D S D C R D N
50
GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC
A P R T I F I I S M Y K D S
60 70
CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG
Q P R G M A V T I S V K C E
80
AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT
K I S T L S C E N K I I S F
90
AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGT
K E M N P P D N I K D T K S
100 110
GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT
D I I F F Q R S V P G H D N
120
AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA
K M Q F E S S S Y E G Y F L
130 140
GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA
A C E K E R D L F K L I L K
150
AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT
K E D E L G D R S I M F T V
158
CAA AAC GAA GAC TAA
Q N E D *
⑤IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化:
经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接,并转化至感受态的大肠杆菌中,经抗性培养基筛选,得阳性克隆的大肠杆菌,即IL-18工程菌。
⑥将工程菌扩增培养,热激表达、破壁、破包含体;IL-18纯化。
2.按权利要求1所述的重组人白细胞介素-18(IL-18)工程菌直至产物的制备方法,其特征在于所述扩增培养的培养基配方为:
硫酸铵5.0克/升,磷酸氢二钾6.0克/升,
磷酸二氢钾3.0/升,柠檬酸钠0.5克/升;
硫酸镁1.5克/升,三氯化铁0.01克/升;
胰蛋白胨10.0-20.0克/升,酵母提取物
2.0-10.0克/升,葡萄糖80.0-100.0克/升;
微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)10-5-10-4克分子/升,
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 98103307 CN1132844C (zh) | 1998-07-24 | 1998-07-24 | 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 98103307 CN1132844C (zh) | 1998-07-24 | 1998-07-24 | 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1243130A CN1243130A (zh) | 2000-02-02 |
CN1132844C true CN1132844C (zh) | 2003-12-31 |
Family
ID=5217851
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 98103307 Expired - Fee Related CN1132844C (zh) | 1998-07-24 | 1998-07-24 | 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1132844C (zh) |
-
1998
- 1998-07-24 CN CN 98103307 patent/CN1132844C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1243130A (zh) | 2000-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1132844C (zh) | 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 | |
CN1611604A (zh) | 猪α-干扰素的基因合成、表达载体构建及产物的制法 | |
CN1305902C (zh) | 一种人白细胞介素29的生产方法及重组il-29工程菌 | |
CN1125081C (zh) | 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法 | |
CN1294258C (zh) | 一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽 | |
CN1057564C (zh) | 能生产活性重组藻胆蛋白的微生物及其制备方法 | |
CN1818068A (zh) | 重组人白细胞介素-2(125ser)表达载体的构建 | |
CN1752210A (zh) | 鸡干扰素γ及其制备方法和用途 | |
CN1185261C (zh) | 白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子融合蛋白 | |
CN1381587A (zh) | 中国对虾抗菌肽基因与克隆技术 | |
CN1534097A (zh) | 中国对虾热休克蛋白70基因及其克隆方法 | |
CN1168831C (zh) | 一种重组人b淋巴细胞刺激因子表达载体的构建、dna免疫制备单克隆抗体及其应用 | |
CN1055312C (zh) | 人白细胞介素-6的制备方法及其产物 | |
CN1141319C (zh) | 一种在真核细胞中高效表达重组人白细胞介素12的方法 | |
CN1920029A (zh) | 人类组织因子途径抑制因子突变基因mTFPI、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 | |
CN1150327C (zh) | 用基因工程方法生产红细胞刺激因子/粒细胞集落刺激因子融合蛋白 | |
CN1373221A (zh) | 具有生物活性的重组中国人白细胞介素-12及其制备方法 | |
CN1487083A (zh) | 一种石斑鱼***ⅱ基因、含有该基因的载体、重组株及其应用 | |
CN117304344B (zh) | 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 | |
CN1157477C (zh) | 含有大鳞大马哈鱼生长因子的大肠杆菌 | |
CN1143895C (zh) | 用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白 | |
CN1182240C (zh) | 纤溶酶原的酵母表达***及其纯化工艺 | |
CN1313611C (zh) | 新型肿瘤凋亡素2配体基因、其表达的肿瘤凋亡素及其制法 | |
CN1693458A (zh) | 一种人白细胞介素28a的生产方法及重组il-28a工程菌 | |
CN1147588C (zh) | 一种高效表达生产肽抗生素的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |