CN1255552C - 体外检测crygs基因及其编码产物是否存在突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊断白内障等晶状体病变的方法，它包括检测个体的CRYGS基因、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患白内障等晶状体病变的可能性大于正常人群。本发明还公开了治疗白内障等晶状体病变的方法和药物组合物。

Description

体外检测CRYGS基因及其编码 产物是否存在突变的方法

本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及利用CRYGS基因及其编码产物诊断和治疗晶状体病变的方法，以及含有CRYGS基因和/或蛋白的药物组合物。

白内障是一种常见的眼科疾病，是人类致盲的主要因素之一，是严重影响人民生活质量的重要疾病。在白内障中，其主要原因是填充于晶状体中的晶体蛋白变性、沉积所致。晶体蛋白主要分为三类：α-晶体蛋白，β-晶体蛋白，γ-晶体蛋白，γ-晶体蛋白又分为七类：A，B，C，D，E，F，S-晶体蛋白。已有文献报道，一些晶体蛋白的改变可导致晶状体的病变、白内障。然而，迄今为止，尚没有充分揭示白内障的确切原因，也没有人揭示出白内障与每种蛋白存在直接的相关性。

此外，本领域还缺乏早期诊断白内障疾病的有效方法以及非手术治疗白内障的有效手段。

因此，本领域迫切需要开发新的诊断和治疗白内障的有效方法，以及相关的治疗药物，诊断技术和试剂。

本发明的一个目的就是提供一种新的诊断(尤其是早期诊断)白内障等晶状体病变的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗白内障等晶状体病变的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗白内障等晶状体病变的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的白内障易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的CRYGS基因、转录本和/或蛋白，并与正常的CRYGS基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患白内障的可能性高于正常人群。

较佳地，被检测的是CRYGS的基因或转录本，并与正常CRYGS核苷酸序列比较差异。更佳地，所述的差异选自下组：内含子1，第76位的G76→C76；内含子2，第11位的A11→G11；内含子2，第24位的ATGT被重复；外显子3，mRNA编码序列中第489位G489→A489。

在本发明的第二方面，提供了一种治疗晶状体病变的方法，它包括步骤：给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常CRYGS蛋白。较佳地，CRYGS蛋白被局部施用于眼部。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的CRYGS蛋白以及药学上可接受的载体。较佳地，它是眼药水或眼药膏。

在本发明的第四方面，提供了一种检测晶状体病变的试剂盒，它包括特异性扩增CRYGS基因或转录本的引物。较佳地，它还含有与突变部位结合的探针。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

在附图中，

图1A-C显示了白内障模型小鼠的眼部病变过程。

图2A-2F显示了晶状体病理性改变情况。

图3A-C显示了CRYGS基因中的序列变化。图3A显示了内含子1，第76位的G76→C76。图3B显示了内含子2，第11位的A11→G11；内含子2，第24位的ATGT被重复；图3C显示了外显子3，mRNA编码序列中第489位G489→A489。

γS-晶体蛋白(简称为“CRYGS”)是晶体蛋白的一种，人们对其功能了解甚少，不知道与白内障是否相关。本发明的发明人经过多年研究，首次发现和证明了γS-晶体蛋白(CRYGS)与白内障密切相关，而且发现了它的新功能，γS-晶体蛋白的改变将直接导致晶状体的病变、白内障。在此基础上完成了本发明。

本发明人建立了一种常染色体隐性白内障小鼠模型。γS-晶体蛋白(Crygs)的突变导致了小鼠表现为晶状体的病变、白内障。通过AFLP，RH Panel，STR Marker等方法在小鼠全基因组中进行探查，定位到mcat小鼠在第16号染色体上与白内障表型相连锁的基因位点。利用单链构象多态性分析的方法查找到位于遗传距离位16cM的Crygs基因的突变与白内障相关。我们的研究表明，小鼠Crygs蛋白不但与白内障密切相关，而且具有调控晶状体上皮细胞发育、分化、增殖和稳定其他晶状体蛋白的作用，它的稳定存在是维持晶状体正常生理状态的关键。γS-晶体蛋白的变异是导致白内障等晶状体病变的直接原因之一。

根据蛋白同源性比较，人类的γS-晶体蛋白(CRYGS)与小鼠的(Crygs)高度同源(相同性＝160/178，89％；相似性＝172/178，95％)。可以说明小鼠该基因的任何变化及其导致的相应生理变化，均可在人类中找到相应的变化。因此人类的γS-晶体蛋白(CRYGS)的突变同样导致人类的晶状体的病变，可根据CRYGS基因及其表达产物设计的药物和诊断治疗技术，可用于诊断和治疗人类的晶状体的病变。

CRYGS蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗CRYGS蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进CRYGS蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人CRYGS蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人CRYGS蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人CRYGS DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CRYGS基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CRYGS基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CRYGS蛋白的分子，也包括那些并不影响人CRYGS蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CRYGS基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CRYGS蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人CRYGS蛋白功能的抗体以及不影响人CRYGS蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CRYGS基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CRYGS基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人CRYGS蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CRYGS蛋白。

多克隆抗体的生产可用人CRYGS蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CRYGS蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、或局部给药(包括眼球旁注射、眼球后注射、眼球内注射)。较佳地是在眼部局部给药。

正常的CRYGS多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于白内障等晶状体病变方面的治疗。在使用本发明CRYGS蛋白时，还可同时使用其他治疗白内障的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CRYGS蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如眼药水或眼药膏、片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如眼药水、眼药膏、针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的CRYGS蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人CRYGS蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于CRYGS蛋白的无表达或异常/无活性的CRYGS蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带CRYGS基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人CRYGS基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还涉及定量和定位检测人CRYGS蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人CRYGS蛋白水平，可以用作解释人CRYGS蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断CRYGS蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在CRYGS蛋白的方法是利用CRYGS蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CRYGS蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CRYGS蛋白。

CRYGS蛋白的多聚核苷酸可用于CRYGS蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，CRYGS蛋白的多聚核苷酸可用于检测CRYGS蛋白的表达与否或在疾病状态下CRYGS蛋白的异常表达。如CRYGS DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CRYGS蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CRYGS蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CRYGS蛋白的转录产物。

检测CRYGS基因的突变也可用于诊断CRYGS蛋白相关的疾病。CRYGS蛋白突变的形式包括与正常野生型CRYGS DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本发明中，关于CRYGS序列及其他一些有用信息，可在如下电子数据库信息中找到：

小鼠基因组信息(Mouse genome Informatics，MGI).http：//www.informatics.jax.org/(小鼠标记序列和遗传位置).

Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research.http：//www-genome.wi.mit.edu/(对应RH定位).

GenBank Overview，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/GenbankOverview.html(对于小鼠Crygs[登录号AF032995，AF055702和AF055703]和人CRYGS[登录号AF161703])

实施例1

模型动物建立和DNA标本：

常染色体隐性遗传的白内障突变自发地产生于昆明小鼠中。我们通过近亲交配繁殖方式，经过近交20多代，十年时间已将这一突变稳定保持，并育成一独立的品系--常染色体隐性白内障模型小鼠(rncat)。白内障模型小鼠(rncat)是一种常染色体隐性白内障模型。它自发地发生于动物生产过程中，经过近交20多代，十年时间，已培养成一独立的品系。

rncat小鼠的白内障发生为一种进行过程(图1A-C)：0-10天，晶体清澈；10-15天，云雾状白色隐约可见(图1A)；15-30天，白内障逐渐成熟，发育成一核型白内障(图1B，C)。

为了进行遗传性分析，将此白内障小鼠与近交系小鼠B10SN杂交产生出F1代杂合子小鼠，F1代杂合子小鼠再回交于白内障小鼠产生出F2代。这样F2代小鼠有两种晶状体表型：正常和白内障。

进行遗传性分析的DNA标本来自于40天的F2代小鼠的肝脏组织。

定位rncat位点：

首先，利用扩增片断长度多态性分析(AFLP)的方法进行定位：

来自于F2代小鼠的基因组DNA经两种限制性内切酶Eco RI和Mse I或EcoRI和Taq I酶解，并将酶解产物分别与相应接头(adapter)连接。

Eco RI接头  5′-CTCGTAGACTGCGTACC

                CATCTGACGCATGGTTAA-3′

Mse I接头   5′-GACGATGAGTCCTGAG

                TACTCAGGACTCAT-5′

Taq I接头   5′-GACGATGAGTCCTGAG

                TACTCAGGACTCGC-3′

经过16℃连接过夜，将连接产物稀释十倍后，分别用Eco RI和Mse I组合的预扩增引物或Eco RI和Taq I组合的预扩增引物进行预扩增。

Eco RI预扩增引物(Eco RI-C)5′-GACTGCGTACCAATTCC-3′

Mse I预扩增引物(Mse I-C)5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′

Taq I预扩增引物(Taq I-A)5′-GATGAGTCCTGAGCGAA-3′

经过标准预扩增后，将PCR产物稀释四十倍，再分别用Eco RI和Mse I组合的选择性扩增引物或Eco RI和Taq I组合的选择性扩增引物进行选择扩增。其中Eco RI选择性扩增引物5′末端加有M13操纵子序列，用于LI-COR公司的全自动荧光测序仪检测。选择性扩增后，将PCR产物上样于变性的丙稀酰胺凝胶，在全自动荧光测序仪上进行电泳检测。

Eco RI选择性扩增引物(Eco RI-CAN)

5′-CACGACGTTGTAAAACGACTGCGTACCAATTCCAN-3′

Mse I 选择性扩增引物(Mse I-CNN)5′-GATGAGTCCTGAGTAACNN-3′

Taq I选择性扩增引物(Taq I-ANN)5′-GATGAGTCCTGAGCGAANN-3′

(其中N可以是A、T、C、G任何碱基)

我们发现其中Eco RI-CAC、Taq I-ACT这对选择性扩增引物所扩增的片断中有与白内障连锁的多态片断。该片段经同位素标记和再次扩增，从变性的丙稀酰胺凝胶中回收后，进行了测序。根据测序结果设计出以下一对引物：

Forword：5′-CATTTTCATGTCTAAGCCAG-3′

Reverse：5′-AGAGTGAAATGGATCAGATG-3′

利用此对引物经过以PCR为基础的Mouse Radiation Hybrid Panel(ReserarchGenetics Inc.Huntsville，AL，USA)方法，将此片段定位于小鼠的第16号染色体上，靠近微卫星Marker D16Mit39(LOD＞3)。

根据以上结果，进一步通过六对微卫星Marker：D16Mit129，D16Mit9，D16Mit60，D16Mit59，D16Mit158和D16Mit6精细对白内障基因进行了定位。我们将导致小鼠白内障基因定位于D16Mit9和D16Mit60这两对微卫星Marker之间。

候选基因的筛选及突变检测：

在这一范围中，晶状体蛋白(Crygs)基因是一个重要的候选基因，它特异地表达在眼睛中，并在晶状体处高表达。我们设计了七对引物覆盖该基因所有外显子，内含子与外显子的边际，部分操作子的序列：

Crygs-1正向，5′-TAGGGCTGGGCGAGCATTAC-3′；

Crygs-1反向；5′-CAAAGGTTGATTCCCGCACT-3′；

Crygs-2正向，5′-GTCCCTCTGCCTGTAGTCCT-3′；

Crygs-2反向；5′-ACAAGCCTTTTCCATCTTCTC-3′；

Crygs-3正向，5′-CCAGCTCCTCAGCTCACTCA-3′；

Crygs-3反向；5′-CCATCCAACGCTGGTATTCA-3′；

Crygs-4正向，5′-CCGCTCGTACCTAAGTCGCT-3′；

Crygs-4反向；5′-AGGAAAGATGCGGGGTCGTG-3′；

Crygs-5正向，5′-CCGAGTTCCTGACATGCTAA-3′；

Crygs-5反向；5′-ATACTGTCTGCCACGGTAGTT-3′；

Crygs-6正向，5′-GAGATTCATTCCTGTAAGGTGGTA-3′；

Crygs-6反向；5′-CCTCAGGGAGAACTCTATGGTC-3′；

Crygs-7正向，5′-TCTGGATAAGAAGGAGTACCG-3′；

Crygs-7反向；5′-GGTCCTAAAAGCAATTAAGAAG-3′.

利用这七对引物和单链构象多态性分析(SSCP)的方法，对我们白内障模型小鼠的晶状体蛋白(Crygs)基因进行突变检测。其中Crygs-2，Crygs-4，Crygs-6，Crygs-7四对引物检测到白内障模型小鼠的晶状体蛋白(Crygs)基因与正常不同。测序结果显示Crygs-6，Crygs-7同一位置的变化，Crygs-2对应于内含子1(Intron1)，Crygs-4对应于内含子2(Intron2)，Crygs-6和Crygs-7对应于外显子3。全自动测序仪检测突变如下(图3)：

内含子1，第76位的G76→C76；(图3A)

内含子2，第11位的A11→G11；第24位的ATGT被重复；(图3B)

外显子3，mRNA编码序列中第489位G489→A489。(图3C)

在白内障小鼠(rncat)的Crygs基因的转录本测序中。G489→A489被再次确定，这一改变将使序列由CC_GTCGATTGG改变为CC_GTCGATTGA，导致了限制性内切酶BslI(识别CCN7GG)识别序列的改变，在酶解检测中，突变体由于突变的存在而不会被BslI所识别，无法被酶解。

G489→A489的突变使得Crygs蛋白在163位由Trp变为终止密码子。本由178氨基酸组成的Crygs蛋白变为突变体162个氨基酸。它直接导致了小鼠表现为白内障，并引起晶状体病理性改变(图2A-F)：

晶体上皮细胞过度增殖，分化，并且产生空泡变性；

后囊膜下变性；皮层走向紊乱，有钙化，蓝色斑点；

晶体中央嗜伊红染色深染等特点；

病理表现与人的白内障相同。

结果与讨论：

突变小鼠临床特点

在小鼠出生后11天，可看到明显的晶状体混浊，并随着年龄的增加而加重(Fig.1A，B，C)。裂隙灯检查发现在纯合突变的小鼠晶状体混浊集中在核区，而杂合小鼠晶状体始终保持透明。组织学检查发现晶状体上皮细胞有明显的变性和正常连接的丧失。赤道部的晶状体上皮细胞过度增殖，可看出晶状体上皮细胞分化潜能的降低。增殖的细胞向前极和后极过度迁移。虽然Crygs在视网膜上有表达，但视网膜细胞形态正常。在晶状体后囊下皮质区可看到空泡和类马氏小体的结构。在核区中，可看到一些蓝色球形小体，排列形成Y样结构。晶状体中央核区与周边皮质区相比，伊红染色较深红。晶状体纤维失去了正常的走向。除了晶状体的改变，未发现其他形态和行为的异常。

白内障小鼠(rncat)基因定位

为了找到受损基因，我们使用扩增片断长度多态性分析(AFLP)，在6个F2代突变小鼠和5个野生性小鼠中进行全基因组探查。在11个受测小鼠中发现了与白内障相连锁的多态条带。为了证实该结果，另选了20个F2代小鼠进行基因型分析，得到了一致的结果。我们直接对该多态片断PCR产物进行测序，根据测序结果设计出通过Mouse Radiation Hybrid Panel定位染色体上位置的引物。进一步确定白内障位点，我们使用从3.3cM到45.9cM的6个微卫星标记对191个F2代小鼠进行基因型测定。结果我们将rncat定位于16号染色体4.4cM到25.1cM的区域。候选基因Crygs位于该区域。

Crygs基因突变分析

小鼠Crygs序列可从Genbank数据中获得。为了进行突变分析，我们进行了单链构象多态性分析(SSCP)。根据测序结果，令人惊喜的是，在突变小鼠中发现了1号内含子中76位G-＞C的替换，2号内含子中11位有A-＞G的替换，在2号内含子中24位有ATGT的***。出乎意料的是，在10个远交野生型小鼠中，我们发现了G489A的替换，但未发现另外两个内含子的突变。如果在突变小鼠中G489A的替换发生在相同区域，内含子的突变必定发生在G489A替换之后。

讨论

Crygs蛋白折叠成四个希腊钥匙基序组成两个结构域。G489A突变可能影响C-末端结构域的形成。排列序列显示在小鼠和其他物种中，163Trp在γ晶状体蛋白家族中有高度保守性，提示163Trp是维持Crygs蛋白功能的基础。在离体试验中，Crygs蛋白在抑制γ晶状体蛋白的聚集和与α晶状体蛋白的相互作用中有重要作用。突变后缩短的Crygs蛋白可能失去与其他分子正常的相互作用或导致本身的不溶解性。

在突变小鼠中核区的深染提示核区pH值较周边皮质更低。这可能是酸性分子的聚集。因为Crygs主要在继发晶状体纤维细胞中表达，绝大部分位于核区中，我们推测主要聚集的分子不是Crygs基因产物，可能是其他算酸性蛋白。组织切片提示缩短的Crygs直接或间接的促进了晶状体上皮细胞的增殖。在突变小鼠中晶状体纤维结构的紊乱是很明显的。这提示Crygs影响晶状体上皮细胞的生长迁移和晶状体纤维的排列。另外，上皮细胞的变性和去连接可能是缩短的Crygs蛋白的细胞毒性作用的结果。

Crygs的表达不局限于晶状体，在视网膜、角膜和肿瘤组织中也有表达，这提示其在发育和致病机理上有多重作用。目前尚未知晓G489突变是否对视网膜和角膜的功能有影响。组织学检查未发现突变小鼠视网膜细胞有明显的形态上的异常。在小鼠Crygs的高度表达持续到死亡后7天才消失。从我们的原始资料可见在突变小鼠中Crygs的表达更早、且持续高表达。由于晶状体蛋白Crygs可完全吸收紫外光和短波长的蓝色射线保护视网膜免受光损伤，Crygs在视网膜中的作用可能与晶状体中相似。

总之，本发明的研究为探明白内障发病的分子学机制和晶状体的发育起到了重要推进作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

文献

Berry V，Francis P，Kaushal S，Moore A，Bhattacharya S(2000)Missensemutations in MIP underlie autosomal dominant′polymorphic′and lamellar cataractslinked to 12q.Nat Genet 25：15-17.

Bours J(1996)Calf lens alpha-crystallin，a molecular chaperone，builds stablecomplexes with beta s-and gamma-crystallins.Ophthalmic Res 28 Suppl 1：23-31.

Everett CA，Glenister PH，Taylor DM，Lyon MF，Kratochvilova-Loester J，FavorJ(1994)Mapping of six dominant cataract genes in the mouse.Genomics 20：429-434.

Francis PJ，Berry V，Moore AT，Bhattacharya S(1999)Lens biology：development and human cataractogenesis.Trends Genet 15：19l-196.

Harding，J.J.，Crabbe，M.J.C(1984)The lens：development，proteins，metabolismand cataract.In：Davson H，editor.The eye，vol 1b.New York：Academic Press；1984.P.207-492.

Hejtmancik JF(1998)The genetics of cataract：our vision becomes clearer.AmJ Hum Genet 62：520-525

Jaworski C，Wistow G(1996)LP2，a differentiation-associated lipid-bindingprotein expressed in bovine lens.Biochem J 320(Pt 1)：49-54.

Jones SE，Jomary C，Grist J，Makwana J，Neal MJ(1999)Retinal expression ofgamma-crystallins in the mouse.Invest.Ophthalmol Vis Sci 40：3017-3020.

Kerscher S，Glenister PH，Favor J，Lyon MF(1996)Two new cataract loci，Ccwand To3，and further mapping of the Npp and Opj cataracts in the mouse.Genomics.36：17-21.

Knorr C，Cheng H H，Dodgson J B(1999)Application fo AFLP markers togenome mapping in poultry.Anim Genet 30：28-35.

Lambert SR，Drack AV(1996)Infantile cataracts.Surv Ophthalmol.40：427-458.

Liu C，Pande J，Lomakin A，Ogun O，Benedek GB(1998)Aggregation inaqueous solutions of bovine lens gamma-crystallins：special role of gamma(s).InvestOphthalmol Vis Sci 39(9)：1609-1619.

Mackay D，Ionides A，Kibar Z，Rouleau G，Berry V，Moore A，Shiels A et al.(1999)Connexin46 mutations in autosomal dominant congenital cataract.Am J HumGenet 64：1357-1364

Quax-Jeuken Y，Driessen H，Leunissen J，Quax W，de Jong W，Bloemendal H(1985)beta s-Crystallin：structure and evolution of a distinct member of the betagamma-superfamily.EMBO J 4：2597-2602.

Roll B(2000)Carotenoid and retinoid--tWo pigments in a gecko eye lens.CompBiochem Physiol A Mol Integr Physiol 125：105-112.

Semina EV，Ferrell RE，Mintz-Hittner HA，Bitoun P，Alward WL，Reiter RS，Funkhauser C et al.(1998)A novel homeobox gene PITX3 is mutated in families withautosomal-dominant cataracts and ASMD.Nat Genet 19：167-170.

Shiels A，Bassnett S.(1996)Mutations in the founder of the MIP gene familyunderlie cataract development in the mouse.Nat Genet 12：212-215.

Shiels A，Mackay D，Ionides A，Berry V，Moore A，Bhattacharya S(1998)Amissense mutation in the human connexin50 gene(GJA8)underlies autosomaldominant″zonular pulverulent″cataract，on chromosome 1q.Am J Hum Genet62：526-532.

Sinha D，Esumi N，Jaworski C，Kozak CA，Pierce E，Wistow G(1998)Cloningand mapping the mouse Crygs gene and non-lens expression of[gamma]S-crystallin.Mol Vis 4：8.

Straatsma BR，Horwitz J，Takemoto LJ，Lightfoot DO，Ding LL(1984)Clinicobiochemical correlations in aging-related human cataract.The Pan AmericanAssociation and American Journal of Ophthalmology lecture.Am J Ophthalmol97：457-469.

van Rens GL，Raats JM，Driessen HP，Oldenburg M，Wijnen JT，Khan PM，deJong WW，Bloemendal H(1989)Structure of the bovine eye lens gamma s-crystallingene(formerly beta s).Gene 78：225-233.

Voorter CE，De Haard-Hoekman WA，Hermans MM，Bloemendal H，De JongWW(1990)Differential synthesis of crystallins in the developing rat eye lens.ExpEye Res 50：429-437.

Vos P，Hogers R，Bleeker M，Reijans M，van de Lee T，Hornes M，Frijters A et al.(1995)AFLP：a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res 23：4407-4414.

Wistow G，Sardarian L，Gan W，Wyatt MK(2000)The human gene forgammaS-crystallin：alternative transcripts and expressed sequences from the firstintron.Mol Vis 6：79-84.

Zarina S，Abbasi A，Zaidi ZH(1992)Primary structure of beta s-crystallin fromhuman lens.Biochem J 287(Pt 2)：375-381.

Claims (10)

1.一种体外检测CRYGS基因或转录本是否存在核酸突变的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测所述的CRYGS基因或转录本，并与正常的CRYGS基因或转录本相比较，其中存在选自下组的差异就表明CRYGS基因或转录本存在核苷酸突变：

内含子1，第76位的G76→C76；

内含子2，第11位的A11→G11；

内含子2，第24位的ATGT被重复；或

外显子3，mRNA编码序列中第489位G489→A489。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的是CRYGS的基因，并与正常CRYGS基因的核苷酸序列比较差异。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差异选自下组：

外显子3，mRNA编码序列中第489位G489→A489。

4.一种体外检测CRYGS蛋白是否存在氨基酸突变的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测所述的CRYGS蛋白，并与正常的CRYGS蛋白相比较，其中存在以下差异就表明CRYGS蛋白存在氨基酸突变：

CRYGS蛋白第163位由Trp变为终止密码子。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的检测是检测CRYGS蛋白的长度，其中CRYGS蛋白的长度为162个氨基酸就表明第163位由Trp变为终止密码子。

6.一种CRYGS基因或蛋白的用途，其特征在于，用于制备(a)检测晶状体病变的试剂盒；(b)检测晶状体病变的试剂；或(c)治疗因缺乏正常CRYGS蛋白所导致的晶体状病变的药物组合物。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的检测晶状体病变的试剂是引物、探针或抗体。

8.一种检测晶状体病变的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增CRYGS基因或转录本的引物，并且用所述引物扩增出的扩增产物含有选自下组的突变部位：

内含子1，第76位的G76→C76；

内含子2，第11位的A11→G11；

内含子2，第24位的ATGT被重复；或

外显子3，mRNA编码序列中第489位G489→A489。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，它还含有与所述突变部位结合的探针。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变选自下组：

外显子3，mRNA编码序列中第489位G489→A489。

Images