CN1252271C - D-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 - Google Patents
D-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1252271C CN1252271C CN 200310107150 CN200310107150A CN1252271C CN 1252271 C CN1252271 C CN 1252271C CN 200310107150 CN200310107150 CN 200310107150 CN 200310107150 A CN200310107150 A CN 200310107150A CN 1252271 C CN1252271 C CN 1252271C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactate dehydrogenase
- gene
- dehydrogenase gene
- lactic acid
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及D-型乳酸脱氢酶基因、含有该基因的重组载体及用该载体转化的宿主细胞,特别是涉及构建生产L-乳酸的基因工程技术。自然界中存在L和D两种乳酸脱氢酶,如果D-乳酸脱氢酶缺失,就可以得到纯度为100%的L-乳酸。D-乳酸脱氢酶广泛存在于微生物中,但目前只有少数乳杆菌属的D-乳酸脱氢酶基因被克隆和测序。本发明的技术方案:从乳杆菌MD-1中提取基因组DNA,构建有D-乳酸脱氢酶基因的重组载体、D-乳酸脱氢酶克隆载体;克隆载体转化到大肠杆菌中,得到重组微生物。在本发明完成的基础上,可以进一步研究D-乳酸脱氢酶基因的缺失,那么,缺失D-乳酸脱氢酶基因的乳杆菌MD-1将可以发酵生产高光学纯度的L-乳酸,从而可以大大降低L-乳酸的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体地说涉及D-型乳酸脱氢酶基因、含有该基因的重组载体,及用该载体转化的宿主细胞。
背景技术
乳酸广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸依其旋光性不同可分为D-乳酸、L-乳酸、D,L-乳酸三种。其中,L-乳酸及其衍生物,广泛应用于食品、医药、饲料和化工等领域。在医药领域,L-乳酸、L-乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等配制成的复合制剂,可以缓解酸中毒患者及治疗高血钾症。另外,L-乳酸铁、L-乳酸钠、L-乳酸钙是补充体内所缺乏的金属元素的药品。在化工领域,L-乳酸是可降解塑料聚L-乳酸(简称聚乳酸)的原料,它的应用可极大地缓解难降解的废弃塑料制品对环境造成的污染,因此,随着世界各国对降解塑料研究开发的重视,使完全可降解塑料聚L-乳酸成为大工业生产的主流。
在动物或微生物体中,乳酸脱氢酶(简称“LDH”)是以NADH为辅酶,将丙酮酸经过生化反应生成乳酸,因此乳酸脱氢酶是乳酸菌乳酸发酵的关键酶。自然界中存在L和D两种依赖NADH的乳酸脱氢酶,分别催化丙酮酸生成L-乳酸和D-乳酸。在同时具有D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶的乳酸菌中,如果将D-乳酸脱氢酶缺失,就可以得到理论上光学纯度为100%的L-乳酸。目前已经有相关方面的报道(Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillusplantarum 1dhL Gene:Overexpression and Deletion.J.Bacteriol.176(3):596-601和KARI KYL-NIKKIL et al.2000.Metabolic Engineering of Lactobacillus hilveticusCNRZ32 for Production of Pure L(+)-Lactic Acid.Appl.Environ.Microbiol.66(9):3835-3841)。D-乳酸脱氢酶广泛存在于微生物中,但目前只有少数乳杆菌属的D-乳酸脱氢酶基因被克隆和测序(Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillus plantarum ldhL Gene:Overexpression and Deletion.J.Bacteriol.176(3)596-601;Nathalie Bernard et al.1991.Cloning of a Lactate Dehydrogenase Gene from Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus by complementation in Escherichia coli.FEBS Letters.61-64)。
乳杆菌MD-1具有以下特性:①最佳生长和发酵生产乳酸的温度为48℃;②在其基因组中具有D和L两种乳酸脱氢酶基因,在生长过程中合成D和L两种乳酸脱氢酶;③乳酸类型为DL-乳酸;④可以在发酵培养基中含200g/L葡萄糖条件下快速生长和生产乳酸;⑤72小时可以产酸140g/L以上;⑥营养要求简单,可以用大米或玉米糖化液作为发酵培养基进行发酵生产乳酸。
如果缺失D-乳酸脱氢酶基因,乳杆菌MD-1可以发酵生产高光学纯度的L-乳酸,理论上光学纯度可达到100%,72小时发酵液中可积累140g/L以上的L-乳酸,从而可以大大降低L-乳酸的生产成本,具有很大的应用潜力。
明确乳酸菌-D乳酸脱氢酶基因的多核苷酸序列,是研究-D乳酸脱氢酶基因缺失的前题,它对构建生产L-乳酸的工程菌具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足,提供一种D-乳酸脱氢酶基因。
本发明的第二个目的是提供一种由D-乳酸脱氢酶基因编码的多肽。
本发明的第三个目的是提供一种包括有D-乳酸脱氢酶基因的重组载体。
本发明的最后一个目的是提供一种利用D-乳酸脱氢酶基因的重组载体转化的重组微生物。
本发明的技术方案概述如下:
一种D-乳酸脱氢酶基因,它是SEQ ID No.5所述的核苷酸序列。
一种D-乳酸脱氢酶基因编码的多肽,它是SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
一种包括SEQ ID No.5所述的核苷酸序列基因的重组载体,它是以SEQ ID No.3、SEQID No.4为PCR引物扩增出的D-乳酸脱氢酶的开放阅读框架,回收得到DNA片段,与pGEM-TEasy加入T4连接酶,进行连接反应,制成pLZD3082,或用HindIII和NdeI双酶切pET-28a(+)和pLZD3082,分别得到DNA片段,再用T4连接酶,进行连接反应,制成pLOD3081。
一种含有D-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞,将含有SEQ ID No.5核苷酸序列的重组载体pLZD3082转入大肠杆菌DH5α而获得。
一种含有D-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞,将含有SEQ ID No.5核苷酸序列的重组载体pLOD3081转入大肠杆菌DE3而获得。
本发明中乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶的特点在于和其他已经报道的乳杆菌D-乳酸脱氢酶的多核苷酸序列相似性较低,最高达到49.33%;其编码的氨基酸序列的相同性最高为39%。
在本发明完成的基础上,可以进一步研究D-乳酸脱氢酶基因的缺失,那么,缺失D-乳酸脱氢酶基因的乳杆菌MD-1将可以发酵生产高光学纯度的L-乳酸,从而可以大大降低L-乳酸的生产成本。
附图说明
图1显示了1409bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.1);
图2是根据核苷酸序列(SEQ ID No.1)推测的D-乳酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNo.2);
图3显示了35bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.3);
图4显示了29bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.4);
图5显示了996bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.5);
图6为一种含有D-乳酸脱氢酶基因的重组(克隆)载体的构建策略图;
图7由乳杆菌MD-1基因组DNA的随机基因文库筛选到的一种含有D-乳酸脱氢酶基因的重组(克隆)载体的构建策略图;
图8为阳性克隆的乳酸脱氢酶比活力
图9为pLZD3081的酶切分析
图10为一种含有D-乳酸脱氢酶基因的重组表达载体的构建策略图;
图11为全细胞蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱;
图12为高效液相色谱法测定乳酸浓度图。
具体实施方式
制备本发明的一种D-乳酸脱氢酶基因、重组载体及其宿主细胞的方法包括如下步骤:
1.从乳杆菌MD-1中提取基因组DNA,经限制性内切酶部分水解,得到DNA片段,连接到pJDC9载体(南开大学生命科学学院提供)上并转化到大肠杆菌FMJ144(南开大学生命科学学院提供),构建出乳杆菌MD-1的随机基因文库。
2.将有重组质粒的大肠杆菌FMJ144菌株在厌氧条件下培养,获得含D-乳酸脱氢酶基因的重组质粒pLZD3081及重组大肠杆菌FMJ144/pLZD3081。
在可使D-乳酸脱氢酶基因表达的条件下培养该重组菌,用丙酮酸做底物,NADH为辅酶,用紫外分光光度计测定D-乳酸脱氢酶的酶活性,证明该重组质粒具有乳酸脱氢酶活性;用SBA-40C酶膜分析仪分析以上生化反应的乳酸产物的光学特性,没有检测到L-乳酸,表明反应液中只存在D-乳酸,证明含有该重组质粒的大肠杆菌FMJ144产生的乳酸脱氢酶属于D型。
乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶基因核苷酸序列SEQ ID No.1(见图1)。D-乳酸脱氢酶基因全长1409bp;144位点的GTG为起始密码子,以1138位点的TAA为终止密码子。起始密码子上游有推测的典型核糖体结合位点(RBS):GGAGGAA,位于起始密码子上游的第7个碱基;该区域的中心AGGA到翻译起始位点的距离是8个碱基,与E.coli和Bacillus subtilis中已证实的最适距离7-9bp相一致(参见Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillusplantarum 1dhL Gene:Overexpression and Deletion.J.Bacteriol.596-601;NathalieBernard et al.1991.Cloning of a Lactate Dehydrogenase Gene from Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus by complementation in Escherichia coli.FEBS Letters.61-64)。1dhD推测的SD框TATAGTA和Lactobacillus plantarum 16srRNA(EMBL序列号,M58827)3’端的3’-UUCCUC-5’碱基严格互补。从而也可以说明Lactobacillus sp.MD-1和Lactobacillus plantarum在***发育中亲缘关系较近(参见Dominique Garmyn et al.1995.Cloning,Nucleotide Sequence,and Transcriptional Analysis of the Pediococcusacidilactici L-(+)-Lactate Dehydrogenase Gene.266-272)。在5’端非编码区中还有一个推测的-35区
和推测的-10区
相距16nt,共同构成了D-乳酸脱氢酶基因的启动子。在D-乳酸脱氢酶基因的3’端非编码区中存在典型的回文结构形成了D-乳酸脱氢酶基因的典型的终止子。乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶基因与其他已报道的D-乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列相比,相似性小于50%。
根据核苷酸序列SEQ ID No.1,推测乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列见SEQ ID No.2。该D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列由331个氨基酸组成,分子量为36600Da,pI值为5.12。通过对本发明涉及的D-乳酸脱氢酶基因推导的氨基酸序列与其他乳杆菌的D-乳酸脱氢酶氨基酸序列进行比对分析,结果表明D-LDH有两个保守的区域,即R77-E107区:RNVGTDNIDIQAAKANNVKITNVPAY SPESIAE和V147-D176区:VGVMGTGHIGQVAIKLFKGFGAKVIAYD。其中V147-D176是辅酶NADH的结合域,此保守序列中有典型的GXGXXG结构,典型结构后面还有17-20个保守的氨基酸残基。‘D176’天冬氨酸残基决定了辅酶是NADH而不是NADPH(参见Nathalie Bernard et al.1991.Cloning of a Lactate Dehydrogenase Gene fromLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus by compl ementation in Escherichia coli.FEBS Letters.61-64;Nathalie Bernard et al.D175 Discriminates between NADH andNADPH in the Coenzyme Binding Site of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusD-Lactate Dehydrogenase.Biochemical and Biophysical Research Communication.1995,208(3):895-900.)。据报道R77-E107区是酶的催化活性部位(参见NestléResearch Center etal.Envolutionary Relationship of NAD+-Dependent D-Lactate Dehydrogenase:Comparison of Primary Structure of 2-Hydroxy Acid Dehydrogenase.Biochemical andBiophysical Research Communication.1992,184(l):60-66.)。通过分析证明克隆的D-乳酸脱氢酶属于依赖NADH的脱氢酶家族的一员,与其他已报道的D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列相比,其相同性小于50%。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。应该理解的是,所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例1 乳杆菌MD-1基因组DNA的提取
采用高温高产乳酸的乳杆菌MD-1(南开大学生命科学学院提供),接种乳杆菌MD-1在200mLMRS培养基中,48℃培养24小时。离心收集菌体,用TE缓冲液(Tris-HCl 10mmol/L,EDTA 1mmol/L,pH8.0)洗涤2次,然后悬浮在24mLTE缓冲液中加入溶菌酶,使其工作浓度为5mg/mL,混匀后于37℃放置2小时;之后加入2.5mL溶液A(Tris-HCl 50mmol/L,EDTA0.25mmol/L,pH8.0),同时加入1.5mL溶液B(十二烷基磺酸钠(SDS)10%,Tris-HCl50mmol/L,EDTA 20mmol/L)以及150μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K,混匀后于55℃保温1小时;该溶液分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次,然后再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次,取上清液用0.6倍的异丙醇沉淀,收DNA,用70%7醇洗涤2次,沉淀溶于3mLTE缓冲液中;加入10mg/mL Rnase18μL,37℃保温1小时,分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次,上清液加入2倍体积无水乙醇,回收DNA,分别用70%的乙醇和无水乙醇洗涤,干燥,用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/280=1.98,A260/A230=2.18。
实施例2基因文库的构建
取实施例1所提取的基因组DNA10μL(约50μgDNA),用限制性内切酶BamHI不完全消化,经琼脂糖凝胶电泳,用大连宝生物的胶回收试剂盒回收,得到约2-6kb的部分消化片段。用限制性内切酶BamHI酶切pJDC9,经琼脂糖凝胶电泳,用凝胶回收试剂盒(大连宝生物)回收pJDC9;取2μL pJDC9回收产物,与5μL回收的基因组DNA片段,在10μL连接体系进行连接反应,总共做20支10μL连接体系的连接反应,其中含1μL的10倍连接缓冲液,1μLT4DNA连接酶,1μL水。连接体系在16℃条件下过夜反应,取10μL连接产物电转化到E.coli(大肠杆菌)FMJ144中,涂布在M9培养基平板上,得到乳杆菌MD-1基因组DNA的随机基因文库(见图7)。
实施例3 在厌氧条件下进行互补筛选
将电转化的大肠杆菌FMJ144细胞涂布在含有工作浓度为250μg/mL红霉素的M9培养基平板上,厌氧条件下37℃培养144h筛选获得有乳酸脱氢酶活性的含有重组质粒的菌株,即阳性克隆;对阳性克隆菌落用碱法提取重组质粒,采用实施例2中相同的电转化手段,将重组质粒电转化到E.coli(大肠杆菌)FMJ144中进一步进行筛选;在厌氧条件下37℃培养144h筛选验证含有乳酸脱氢酶活性的含有重组质粒的菌株。
实施例4乳酸脱氢酶酶活性分析
将阳性克隆接种到10mLM9液体培养基中,37℃静置培养48小时,离心收集菌体,用0.5M的磷酸缓冲液悬浮菌体,超声波破碎细胞,14,000r/min离心30分钟,取其上清液,即蛋白粗提物;用福林酚法测定蛋白质浓度。用紫外分光光度计测定乳酸脱氢酶活性,具体方法为:在2790μL0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL2.5mg/mL丙酮酸、100μL3.5mg/mL的NADH和10μL酶液,在25℃条件下用紫外分光光度计用340nm波长测定3分钟反应液的吸光值变化量,即ΔA340nm。分析结果表明筛选出的8株含有重组质粒的阳性克隆均存在很高的酶活(见图8),选取酶活性最高的H菌株进行进一步分析。该阳性克隆的重组质粒称为pLZD3081(见图7中的质粒),含有此重组质粒pLZD3081的重组大肠杆菌称为大肠杆菌FMJ144/pLZD3081。
酶活单位(U):在25℃,pH7.0的条件下,1分钟氧化1μmolNADH的酶量为1单位。
实施例5鉴定乳酸脱氢酶类型
在700μL0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL10mg/mL丙酮酸、100μL42mg/mL的NADH和100μL上述酶液,在25℃条件下反应2小时;用SBA-40C酶膜分析仪分析酶反应液中乳酸类型,分析结果表明在反应液中没有L-乳酸,证明了在反应液中只含有D-乳酸,酶液中乳酸脱氢酶属于D-乳酸脱氢酶。
实施例6 pLZD3081酶切分析
挑出阳性克隆接入含有250μg/mL红霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时;用碱法提取质粒,用BamH I酶切分析,琼脂糖凝胶电泳中呈约3kb的带(见图9)。
实施例7 序列测定与分析
DNA序列测定由TaKaRa公司完成。DNA序列分析采用Artemis v5,蛋白质序列分析采用Dnaman4.0和ClustalX1.8以及NCBI相关数据库和软件。分析得到DNA序列:SEQ ID No.1(图1)和SEQ ID No.5。(图5)
实施例8 D-乳酸脱氢酶ORF的PCR扩增和测序
以SEQ ID No.1的核苷酸序列作参照,设计并合成PCR引物:
上游引物为5’-AAA
GCTAGCGTGAAATTAATTGTTTATAATGTTCG-3’
NheI
下游引物为5’-AAA
AAGCTTTTAGTCAACTAGATCGGCTG-3’
HindIII
反应体系:
Taq premix version模板DNA引物1(20pmol/μL)引物2(20pmol/μL)水 | 25μL1μL1μL1μL23μL |
50μL |
扩增条件:
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,用回收试剂盒回收约1kb的DNA片段,对该DNA片段用Sanger链终止法测定其核苷酸序列,以检测PCR片段是否和D-乳酸脱氢酶的ORF一致,测序结果见SEQ ID No.5。结果表明PCR片段与D-乳酸脱氢酶的ORF一致。
实施例9 构建D-乳酸脱氢酶克隆载体
取5μL回收的D-乳酸脱氢酶基因ORF的PCR片段与0.5μLpGEM-T Easy载体(promega出售)在10μL连接体系进行连接反应,其中含1μL的10×连接缓冲液,1μLT4DNA连接酶,2.5μL水。连接体系在16℃条件下过夜反应,连接产物用于转化大肠杆菌。
实施例10 克隆载体转化到大肠杆菌DH5α
加入100μL解冻的用CaCl2法制备的感受态细胞大肠杆菌DH5α(市售)和10μL连接液至Eppendorf管中,冰上30分钟,42℃热激90s,冰上2分钟,加入LB培养基900μL37℃100r/min振荡培养1小时。取100μL涂布在LB培养基平板(100μg/mL氨苄青霉素、1mmol5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)(大连宝生物)、1mmol异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(大连宝生物)上,37℃条件下培养16小时;挑出白色菌落接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时;用碱法提取质粒,用PCR检测,琼脂糖凝胶电泳中呈约1kb的带。含有该DNA片段的重组质粒称为pLZD3082(见图6),含有此重组质粒pLZD3082的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5α/pLZD3082。
实施例11 D-乳酸脱氢酶与表达载体pET-28a(+)(novagen出售)的重组
D-乳酸脱氢酶和表达载体pET-28a(+)分别用HindIII和NheI双酶切。酶切条件如下:
EppendorfAHindIIINheI10×M缓冲液pLZD3082H2O | 1μL1μL5μL30μL13μL |
50μL |
EppendorfAHindIIINheI10×M缓冲液pET-28a(+)H2O | 1μL1μL5μL30μL13μL |
50μL |
37℃酶切2小时,电泳后分别回收两个目的片段,用T4 DNA连接酶连接,连接条件如下:
Eppendorf AT4 DNA连接酶10×连接缓冲液pET-28a(+)酶切片段H2O | 1μL1μL2μL3μL3μL10μL |
20μL |
连接体系在16℃条件下过夜反应,连接产物用于转化大肠杆菌。
实施例12 表达载体转化到大肠杆菌DE3(novagen出售)
加入60μL解冻的用用CaCl法制备的感受态细胞大肠杆菌DE3和10μL连接液至Eppendorf管中,冰上30分钟,42℃热激90s,冰上2分钟,加入LB培养基930μL37℃100r/min振荡培养1小时。取100μL涂布在LB培养基平板(60μg/mL卡拉霉素)上,37℃条件下培养16小时;挑出菌落接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时;用碱法提取质粒,用PCR检测,琼脂糖凝胶电泳中呈约1kb的带。含有该DNA片段的重组质粒称为pLOD3081(见图10),含有此重组质粒pLOD3081的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DE3/pLOD3081。
实施例13 D-乳酸脱氢酶在大肠杆菌DE3中的表达
将带有D-乳酸脱氢酶的pET-28a(+)重组载体pLOD3081的大肠杆菌DE3接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时,取培养物50μL接入5mL含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养,直到OD值为0.3-0.4,加入1mmolIPTG诱导D-乳酸脱氢酶表达,25℃诱导2小时后,离心收集细胞,用0.5MpH7.0的磷酸缓冲液洗涤两次,然后悬浮在1mL相同的磷酸缓冲液中;用超声波细胞破碎仪破碎细胞,12000r/min离心30分钟,得到上清液,即粗酶液。按照实
施例4、实施例5测定D-乳酸脱氢酶活性(见表1)。
表1
菌株 | 大肠杆菌DE3/pET-28a(+) | 大肠杆菌DE3/pLOD3081 |
比活性(U.mg-1.) | 0.0027 | 0.0463 |
实施例14 含有重组表达载体pLOD3081的大肠杆菌DE3全蛋白聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳
将带有D-乳酸脱氢酶的pET-28a(+)重组载体pLOD3081的大肠杆菌DE3接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时,取培养物50μL接入5mL含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养,直到OD值为0.3-0.4,加入1mMIPTG诱导D-乳酸脱氢酶表达,25℃诱导2小时后,取1mL菌液离心收集细胞,加入100μL水和100μL2×SDS-PAGE上样缓冲液,沸水煮5分钟,用浓度为15%的凝胶进行SDS-PAGE凝胶电泳2小时,用考马斯亮蓝染液染色1小时,再用脱色液脱色4小时,得到电泳图谱(见图11)全细胞蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱:图中,A,含有重组质粒pLOD3081的大肠杆菌DE3的全细胞蛋白B,含有载体质粒pET-28(+)的大肠杆菌DE3的全细胞蛋白C,蛋白质标准)。电泳结果证实有蛋白质大量表达,分子量约为36600道尔顿(除去组氨酸标签,其分子量约为3000道尔顿)。
实施例15 实施例1的反应液中乳酸含量的测定
在700μL0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL10mg/mL丙酮酸、100μL42mg/mL的NADH和100μL上述酶液,在25℃条件下反应2小时;反应液用高效液相色谱法测定乳酸浓度(见图11),色谱条件如下:
分析仪器:Waters 600E HPLC 996PDA
色谱柱:Xterra RP18 5m 150×3.9mm
流动相:0.05mol/LKH2PO3,pH2.0
流速:1ml/min
检测波长:210nm
根据色谱分析,证明反应液中存在乳酸,经过SBA-40C酶膜分析仪分析,证明不存在L-乳酸,说明反应液中只存在D-乳酸,因此在大肠杆菌DE3中表达的乳酸脱氢酶是D-乳酸脱氧酶。
Claims (5)
1.一种D-乳酸脱氢酶基因,其特征是它是SEQ ID No.5所述的核苷酸序列。
2.一种D-乳酸脱氢酶基因编码的多肽,其特征是它是SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
3.一种包括权利要求1基因的重组载体,其特征是将以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为PCR引物扩增出的D-乳酸脱氢酶的开放阅读框架,回收得到DNA片段,与pGEM-TEasy加入T4连接酶,进行连接反应,制成pLZD3082,或用HindIII和NdeI双酶切pET-28a(+)和pLZD3082,分别得到DNA片段,再用T4连接酶,进行连接反应,制成pLOD3081。
4.一种含有D-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞,其特征是将含有SEQ ID No.5核苷酸序列的重组载体pLZD3082转入大肠杆菌DH5α而获得。
5.一种含有D-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞,其特征是将含有SEQ ID No.5核苷酸序列的重组载体pLOD3081转入大肠杆菌DE3而获得。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310107150 CN1252271C (zh) | 2003-12-02 | 2003-12-02 | D-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310107150 CN1252271C (zh) | 2003-12-02 | 2003-12-02 | D-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1546667A CN1546667A (zh) | 2004-11-17 |
CN1252271C true CN1252271C (zh) | 2006-04-19 |
Family
ID=34334342
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200310107150 Expired - Fee Related CN1252271C (zh) | 2003-12-02 | 2003-12-02 | D-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1252271C (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102861176B (zh) * | 2011-07-07 | 2014-07-16 | 浙江科技学院 | 一种护眼药袋 |
CN103656425B (zh) * | 2013-12-06 | 2016-08-17 | 山东大学齐鲁医院 | 治疗脚臭的中药组合物及制备方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102517303B (zh) * | 2011-11-24 | 2013-08-07 | 中国科学院微生物研究所 | 一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用 |
CN103014028A (zh) * | 2012-12-25 | 2013-04-03 | 肖飞 | 一种制备乳酸脱氢酶的方法及应用 |
CN104673819A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-06-03 | 华南理工大学 | 一种用于敲除l-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法 |
CN109280652A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-01-29 | 四川自豪时代药业有限公司 | 一种外源高表达乳酸脱氢酶突变体的高密度发酵方法 |
CN109504630B (zh) * | 2018-12-17 | 2022-03-11 | 吉林中粮生化有限公司 | 一种重组d-乳酸生产植物乳杆菌菌株及利用该菌株生产d-乳酸的方法 |
CN113975377B (zh) * | 2020-07-27 | 2023-11-10 | 成都青山利康药业股份有限公司 | 一种心脏停搏液 |
CN112961901A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-15 | 上海市农业科学院 | 一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法 |
-
2003
- 2003-12-02 CN CN 200310107150 patent/CN1252271C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102861176B (zh) * | 2011-07-07 | 2014-07-16 | 浙江科技学院 | 一种护眼药袋 |
CN103656425B (zh) * | 2013-12-06 | 2016-08-17 | 山东大学齐鲁医院 | 治疗脚臭的中药组合物及制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1546667A (zh) | 2004-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Nguyen et al. | Production of L-lactic acid from a green microalga, Hydrodictyon reticulum, by Lactobacillus paracasei LA104 isolated from the traditional Korean food, makgeolli | |
CN101880696B (zh) | 发酵生产l-乳酸的方法及该方法所用的菌株 | |
EP2202316B1 (en) | METHOD FOR PRODUCING POLYHYDROXYALKANOATES (PHAs) USING HALOBACTERIUM AND HALOBACTERIUM | |
CN101473027A (zh) | 溶剂耐受微生物及分离方法 | |
CN102212501B (zh) | 一种重组大肠杆菌及应用其以单一碳源生产phbv的方法 | |
CN1301310A (zh) | 一种通过聚羟基链烷酸酯的自降解生产羟基羧酸的方法 | |
CN102712912A (zh) | 在乳酸菌中改善流向乙酰乳酸来源产物的流量 | |
JP6444419B2 (ja) | スポロラクトバチルス・テラエおよびその使用 | |
CN102365357A (zh) | 通过发酵产生大量乙醇酸的方法 | |
CN107709540A (zh) | 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种ng7及其用途 | |
CN102816729A (zh) | 一株盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用 | |
CN106434483B (zh) | 一种布氏乳杆菌及其应用 | |
CN1252271C (zh) | D-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 | |
Belal et al. | Production of Poly-β-hydroxybutyric acid (PHB) by Bacillus cereus | |
KR101239757B1 (ko) | 알긴산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 페니바실러스 라우투스 gd-a2와 알긴산 분해용 생촉매 및 이를 이용한 알긴산 올리고당의 제조 방법 | |
CN102174557A (zh) | 一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢及其制备方法 | |
CN103397006A (zh) | 来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶(rdh)及其编码基因与应用 | |
CN101597627B (zh) | 一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法 | |
CN1245515C (zh) | L-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 | |
CN101993850B (zh) | 一种生产d-乳酸基因工程菌及构建方法和应用 | |
JP5551354B2 (ja) | 糖アルコールの製造方法 | |
CN109929853B (zh) | 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用 | |
Tolieng | Characterization of lactic acid producing Bacillus coagulans strains with their antibacterial activity and L-lactic acid production | |
CN102268424A (zh) | 一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶及其编码基因与应用 | |
Long et al. | Fermentation Optimization and In-Vitro Antioxidant Activity of Exopolysaccharides Produced by Leuconostoc suionicum LSBM1 Using Sugar Beet Molasses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |