CN101473027A - 溶剂耐受微生物及分离方法 - Google Patents

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Abstract

丁醇耐受性增强的乳杆菌细菌已被分离。所述细菌用于丁醇的发酵制备。还提供了分离丁醇耐受乳杆菌的新方法。

Description

溶剂耐受微生物及分离方法
此申请要求2006年6月15日提交的美国临时申请No60/813779的权益。
发明领域
本发明涉及工业微生物学领域。特别地，微生物已被分离，表现出对醇，尤其是丁醇的高耐受性。
发明背景
丁醇是重要的工业化学品，用作燃料添加剂、塑料行业的化工原料，以及食品和调味品工业的食品级提取剂。每年通过石化方法制备100至120亿磅的丁醇，对此日用化学品的需求可能会增加。
丁醇的化学合成方法是众所周知的。例如1-丁醇可利用巴豆醛的Oxo法、Reppe法，或加氢制备(Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，6th edition，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH andCo.，Weinheim，Germany，Vol.5，pp.716-719)。2-丁醇可使用正-丁烯水合制备(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，6thedition，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，Vol.5，pp.716-719)。或者异丁醇可用一氧化碳的Oxo合成、催化氢化(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，6th edition，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，Vol.5，pp.716-719)，或甲醇和正-丙醇的Guerbet缩合(Carlini等，J.Molec.Catal.A：Chem.220：215-220(2004))制备。这些方法使用的起始原料来自石化产品，通常昂贵且不利于环保。
通过发酵生产丁醇的方法也是已知的，最普遍的方法制备出丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物，被称为ABE法(Blaschek等，U.S.Patent No.6,358,717)。通过丙酮丁醇梭菌(梭状芽孢杆菌acetobutylicum)的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵是最古老的已知工业发酵，制备这些溶剂的途径和基因已有报道(Girbal等，Trends inBiotechnology 16：11-16(1998))。此外，表达1-丁醇生物合成途径(Donaldson等，同时待审并共同拥有的美国专利申请No.11/527995)，2-丁醇生物合成途径(Donaldson等，同时待审并共同拥有的美国专利申请No.60/796,816)，以及异丁醇生物合成途径(Maggio-Hall等，同时待审并共同拥有的U.S专利申请No.11/586315)的重组体微生物制备宿主已有描述。但是人们认为丁醇的生物制备被丁醇对发酵中使用的宿主微生物的毒性所限制。
耐受1-丁醇的梭状芽孢杆菌菌株已通过化学诱变(Jain等，美国专利No.5,192,673；和Blaschek等，美国专利No.6,358,717)，某些类别的基因如表达应激反应蛋白的基因的过度表达(Papoutsakis等，美国专利No.6,960,465；和Tomas等，Appl.Environ.Microbiol.69(8)：4951-4965(2003))，以及连续富集(Quratulain等，Folia Microbiologica(Prague)40(5)：467-471(1995)；和Soucaille等，Current Microbiology 14(5)：295-299(1987))分离。Desmond等(Appl.Environ.Microbiol.70(10)：5929-5936(2004))报道，应激反应蛋白GroESL在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)中的过度表达产生了能在0.5％体积/体积(v/v)[0.4％重量/体积(w/v)]1-丁醇存在下生长的菌株。此外，来自河口沉积物(Sardessai等，Current Science 82(6)：622-623(2002))和活化污泥(Bieszkiewicz等，Acta Microbiologica Polonica 36(3)：259-265(1987))的1-丁醇耐受性菌株的分离已有描述。另外已知一些乳杆菌耐受乙醇(参见例如Couto，Pina and Hogg Biotechnology.Letter19：487-490).Ingram and Burke(1984)Adv.Micribial.Physiol 25：253-300。但是，对本领域描述的大多数微生物而言，37℃下生长在液体培养基时，浓度小于2.0％w/v的1-丁醇使生长完全受到抑制。而且耐受2-丁醇和异丁醇的微生物菌株在本领域不是已知的。因此，对1-丁醇、2-丁醇和异丁醇具有高耐受性的微生物的鉴别将代表着本领域内的进步。
此外，2-丁酮和乙醇都是可用微生物发酵制备的有价值的化合物。2-丁酮也被称为甲乙酮(MEK)，是继丙酮后广泛使用的溶剂和最重要的商业制备的酮。它能用作漆、树脂和粘合剂的溶剂，以及氧化反应的选择性提取剂和活化剂。2-丁酮可以通过省略2-丁醇生物合成途径的最后一步制备(Donaldson等，同时待审并共同拥有的美国专利申请No.60/796816)。乙醇作为替代燃料需求高。大肠杆菌(E.coli)的基因修饰菌株已用作乙醇制备的生物催化剂(Underwood等，(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：6263-6272)。乙醇产出提高的运动酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的基因修饰菌株在US 2003/0162271 A1中有描述。对2-丁酮和乙醇具有提高的耐受性的微生物的鉴别将增加这些化合物的产出。
因此存在着对丁醇耐受性更高的微生物宿主菌株的需求，可用于生物制备高含量(titer)的丁醇。本发明通过丁醇耐受微生物的发现及其分离方法的开发解决了此需求。此外，发现的微生物对2-丁酮和乙醇的耐受性增加。
发明概述
本发明涉及丁醇耐受的微生物，尤其是乳杆菌属的成员及其分离方法。富集并筛选对丁醇耐受的微生物聚生体。分离了37℃下在固体培养基生长时，对至少2.5％w/v浓度的1-丁醇表现出耐受性的乳杆菌的一些种。
因此，本发明提供了分离丁醇耐受微生物的方法，其包括：
a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；
b)使所述微生物聚生体与包含可发酵碳源的生长培养基接触，直至微生物聚生体的成员生长；
c)使步骤(b)的生长中的微生物聚生体与丁醇接触；以及
d)分离步骤(c)的可存活成员，其中丁醇耐受的微生物被分离。
在另一实施方案中，本发明提供通过本发明方法分离的丁醇耐受微生物，优选的微生物是乳杆菌属的。
在另一实施方案中，本发明提供了丁醇耐受乳杆菌的分离方法，其包含：
a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；
b)在含有可发酵碳源的培养基中，富集存在乳杆菌的微生物聚生体(enriching the microbial consortium for the presence ofLactobacillus)，以生成乳杆菌富集的培养物，其中乳杆菌富集培养物的成员正在生长；
c)使步骤(b)的生长中的乳杆菌富集培养物与丁醇接触；以及
d)分离步骤(c)的可存活成员，其中丁醇耐受乳杆菌被分离。
在优选实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法分离的丁醇耐受的乳杆菌，所述具体丁醇耐受乳杆菌被鉴定为ATCCPTA-8318(植物乳杆菌PN0510)，ATCC PTA-8320(植物乳杆菌PN0511)，ATCC PTA-7727(植物乳杆菌PN0512)和ATCC PTA-8319(亚利桑那乳杆菌PN0514)。
在另一实施方案中，本发明提供了制备丁醇的方法，其包含：
a)提供通过本发明的方法分离的乳杆菌，其包含编码丁醇生物合成途径的基因构建物，和
b)使步骤(a)的乳杆菌在可制得丁醇的条件下生长。
在另一实施方案中，本发明提供了制备2-丁酮的方法，其包含：
c)提供通过本发明的方法分离的乳杆菌，其包含编码2-丁酮生物合成途径的基因构建物；以及
d)使步骤(a)的乳杆菌在可制得丁酮的条件下生长。
生物保藏简述及序列说明
本发明的各种实施方案可从作为此发明的一部分的下列详细说明、生物保藏和附随的序列说明得到更完全的理解。
在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款下，申请人进行了下列生物保藏。
Figure A200780022430D00121
下列序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(“含核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利申请的公开所需的要求-序列规则(Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosures-the Sequence Rules)”)，并与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)，以及EPO和PCT的序列列表要求(法条5.2(Rules 5.2)和49.5(a-bis)，以及管理规范(Administrative Instructions)的208节(Section208)和附件C(AnnexC))一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和形式与37 C.F.R.§1.822中所示的规则一致。
表1
1-丁醇生物合成途径的基因和蛋白SEQ ID号的概要
 
说明 SEQ IDNO：核酸  SEQ IDNO：肽   
来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的乙酰-CoA乙酰转移酶thlA                                         1 2
来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的乙酰-CoA乙酰转移酶thlB                                         3 4
来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶                                        5 6
来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的巴豆酸酶 7 8
来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的推定反烯酰CoA还原酶                                         9 10
来自拜季林斯基梭状芽孢杆菌(Clostridiumbeijerinckii)NRRL B594的丁醛脱氢酶     11 12
来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的1-丁醇脱氢酶bdhB 13 14
来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824的1-丁醇脱氢酶bdhA 15 16
表2
2-丁醇生物合成途径的基因和蛋白SEQ ID号的概要
 
说明   SEQ IDNO：核酸  SEQ IDNO：肽   
budA，来自肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC 25955的乙酰乳酸脱羧酶                                 17 18
budB，来自肺炎克雷伯杆菌ATCC 25955的乙酰乳酸合酶                    19 20
budC，来自肺炎克雷伯杆菌IAM1063的丁二醇脱氢酶                      21 22
pddA，来自催产克雷伯杆菌(Klebsiellaoxytoca)ATCC 8724的丁二醇脱水酶α亚基                                 23 24
pddB，，来自催产克雷伯杆菌ATCC 8724的丁二醇脱水酶β亚基               25 26
pddC，来自催产克雷伯杆菌ATCC 8724的丁二醇脱水酶γ亚基             27 28
sadH，来自赤红球菌(Rhodococcusruber)219的2-丁醇脱氢酶        29 30
表3
异丁醇生物合成途径的基因和蛋白SEQ ID号的概要
 
说明 SEQ IDNO：核酸  SEQ IDNO：肽   
肺炎克雷伯杆菌budB(乙酰乳酸合酶) 19 20
大肠杆菌ilvC(乙酰羟酸还原异构酶) 31 32
大肠杆菌ilvD(乙酰羟酸脱水酶) 33 34
乳酸乳球菌kivD(支链α-酮酸脱羧酶)，密码子优化的                                        35 36
大肠杆菌yqhD(支链乙醇脱氢酶) 37 38
如实施例1中所述，SEQ ID NOs：39和40是用于扩增丁醇耐受菌株16S rRNA基因的引物的核苷酸序列。
如实施例1中所述，SEQ ID NOs：41-44是丁醇耐受乳杆菌菌株16S rRNA基因的核苷酸序列。
发明详述
本发明提供了表现出醇高耐受性的微生物，尤其是丁醇，以及2-丁酮和乙醇。本发明的微生物能在存在有2.5％w/v或更高的1-丁醇的固体培养基上生长。此外，本发明提供了分离丁醇耐受微生物的方法。这些丁醇耐受微生物可以是通过基因工程改造成包含丁醇生物合成途径或2-丁酮生物合成途径，并用于生物合成高含量的1-丁醇、2-丁醇、异丁醇或2-丁酮。
下列定义和缩略语用于解释权利要求和说明书。
本文所用的术语“丁醇”指1-丁醇、2-丁醇、异丁醇或其混合物。
当用于描述本发明的微生物时，术语“丁醇耐受微生物”和“耐受”指37℃下在存在2.5％w/v或更高的1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的固体培养基上生长时，或37℃下在存在2.0％w/v或更高的1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的液体培养基中生长时，显示出生长态势的细菌或酵母菌。
术语“微生物聚生体”指不同基因型的异质微生物种群。例如，微生物聚生体可以是环境样品，如废水污泥或土壤或堆肥或受污染的水样；纯菌株的化学诱变微生物种群；含有多拷贝质粒库的微生物菌株；某一特定菌株的转座子标记的突变体群。
术语“环境样品”指从环境获得的样品。尤其地，环境样品可能是从接触丁醇和/或其它溶剂的环境获得的废水污泥或其他样品。环境样品包含微生物聚生体。
施用于微生物培养物，特别是微生物聚生体培养的术语“富集”指向聚生体或微生物培养物的细胞提供过量生长营养物以提高或促进细胞生长的做法。
术语“可发酵碳源”、“碳底物”或“可发酵碳底物”互换使用，指很容易为微生物聚生体利用的碳源。可发酵碳源包括但不限于单糖、寡糖、多糖和一碳底物或其混合物。优选的可发酵碳源的非限制列表包括简单糖，如葡萄糖、果糖和蔗糖；以及羧酸，如脂肪酸、丁酸和戊酸。
术语“需氧条件”指有氧存在的生长条件。
术语“厌氧条件”至无氧存在的生长条件。
术语“微需氧条件”指低水平氧(即低于正常的大气氧水平)的生长条件。
术语“丁醇生物合成途径”指产生1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的酶途径。
术语“1-丁醇生物合成途径”指从乙酰辅酶A(乙酰-CoA)产生1-丁醇的酶途径。
术语“2-丁醇生物合成途径”指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。
术语“异丁醇生物合成途径”指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
术语“2-丁酮生物合成途径”指从丙酮酸产生2-丁酮的酶途径。
术语“乙酰CoA乙酰基转移酶”指催化两分子乙酰CoA转化为乙酰乙酰-CoA和辅酶A(CoA)的酶。虽然具有更宽底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也会有功能，但优选的乙酰CoA乙酰基转移酶是底物优选(在正向上反应)短链酰基CoA和乙酰CoA的乙酰辅酶A酰基转移酶，分类为E.C.2.3.1.9[Enzyme Nomenclature1992，Academic Press，San Diego]。乙酰CoA乙酰基转移酶从一些来源获得，例如大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank Nos；NP_416728，NC_000913；NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)氨基酸序列，NCBI核苷酸序列)，丙酮丁醇梭菌(GenBank Nos：NP_349476.1(SEQ ID NO：2)，NC_003030；NP_149242(SEQ ID NO：4)，NC_001988)，枯草杆菌(Bacillussubtilis)(GenBank Nos：NP_390297，NC_000964)以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank Nos；NP_015297，NC_001148)。
术语“3-羟基丁酰基CoA脱氢酶”指催化乙酰乙酰基-CoA转化成3-羟基丁酰基CoA的酶。3-羟基丁酰基CoA脱氢酶可以是还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖性的，底物优选(S)-3-羟基丁酰基CoA或(R)-3-羟基丁酰基-CoA，分别被分类为E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。此外，3-羟基丁酰基CoA脱氢酶可以是还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性的，底物优选(S)-3-羟基丁酰基-CoA或(R)-3-羟基丁酰基-CoA，分别分类为E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羟基丁酰基CoA脱氢酶从一些来源获得，例如丙酮丁醇梭菌(GenBank NOs：NP_349314(SEQID NO：6)，NC_003030)，枯草杆菌(GenBank NOs：AAB09614，U29084)，营养产碱菌(Ralstonia eutropha)(GenBank NOs：ZP_0017144，NZ_AADY01000001，营养产碱菌(Alcaligeneseutrophus)(GenBank NOs：YP_294481，NC_007347)以及营养产碱菌(A.eutrophus)(GenBank NOs：P14697，J04987)。
术语“巴豆酸酶”指催化3-羟基丁酰基CoA转化为巴豆酰基CoA和H2O的酶。巴豆酸酶底物优选(S)-3-羟基丁酰基CoA或(R)-3-羟基丁酰基CoA，分别分类为E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶从一些来源获得，例如大肠杆菌(E.coli)(GenBank NOs：NP_415911(SEQ ID NO：8)，NC_000913)，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank NOs：NP_349318，NC_003030)，枯草杆菌(GenBank NOs：CAB13705，Z99113)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank NOs：BAA21816，D88825)。
术语“丁酰基CoA脱氢酶”也称作反烯酰CoA还原酶，指催化巴豆酰基CoA转化为丁酰基CoA的酶。丁酰基CoA脱氢酶可以是NADH-依赖性的或NADPH依赖性的，分别分类为E.C.1.3.1.44和E.C.1.3.1.38。丁酰基CoA脱氢酶从一些来源获得，例如丙酮丁醇梭菌(GenBank NOs：NP_347102(SEQ ID NO：10)，NC_003030)，薄肌眼虫(Euglena gracilis)(GenBank NOs：Q5EU90，AY741582)，山地链霉菌(Streptomyces collinus)(GenBank NOs：AAA92890，U37135)以及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank NOs：CAA22721，AL939127)。
术语“丁醛脱氢酶”指催化丁酰CoA转化为丁醛的酶，使用NADH或NADPH为辅助因子。丁醛脱氢酶优选NADH，已知为E.C.1.2.1.57，从例如拜季林斯基梭状芽孢杆菌(Clostridiumbeijerinckii)(GenBank NOs：AAD31841(SEQ ID NO：12)，AF157306)和丙酮丁醇梭菌(GenBank NOs：NP_149325，NC_001988)获得。
术语“1-丁醇脱氢酶”指催化丁醛转化为1-丁醇的酶。1-丁醇脱氢酶是醇脱氢酶广阔家族的亚类。1-丁醇脱氢酶可以是NADH-或NADPH-依赖性的。1-丁醇脱氢酶从例如丙酮丁醇梭菌(GenBank NOs：NP_149325，NC_001988；NP_349891(SEQ IDNO：14)，NC_003030；和NP_349892(SEQ ID NO：16)，NC_003030)以及大肠杆菌(GenBank NOs：NP_417484，NC_000913)获得。
术语“乙酰乳酸合酶”也称为“乙酰羟酸合酶”，指具有催化两分子丙酮酸转化为一分子α-乙酰乳酸的酶活性的多肽。乙酰乳酸合酶已知为EC 2.2.1.6[以前为4.1.3.18](Enzyme Nomenclature1992，Academic Press，San Diego)，其活性可以是辅助因子焦磷酸硫胺素依赖性的。合适的乙酰乳酸合酶从一些来源，例如枯草杆菌(GenBank Nos：AAA22222 NCBI(National Center forBiotechnology Information)氨基酸序列，L04470 NCBI核苷酸序列)，土生克雷伯菌(Klebsiella terrigena)(GenBank Nos：AAA25055，L04507)，以及肺炎克雷伯杆菌(GenBank Nos：AAA25079(SEQ IDNO：20)，M73842(SEQ ID NO：19)获得。
术语“乙酰乳酸脱羧酶”是指具有催化α-乙酰乳酸转化为3-羟基-2-丁酮的酶活性的多肽。乙酰乳酸脱羧酶已知为EC4.1.1.5，从例如枯草杆菌(GenBank Nos：AAA22223，L04470)，土生克雷伯菌(GenBank Nos：AAA25054，L04507)和肺炎克雷伯杆菌(SEQ ID NO：18(氨基酸)SEQ ID NO：17(核苷酸))获得。
术语“丁二醇脱氢酶”也被称为“3-羟基-2-丁酮还原酶”是指具有催化3-羟基-2-丁酮转化为2，3-丁二醇的酶活性的多肽。丁二醇脱氢酶是醇脱氢酶广阔家族的亚类。丁二醇脱氢酶可特异性制备R-或S-立体化学的醇产品。S-特异性丁二醇脱氢酶已知为EC 1.1.1.76，从例如肺炎克雷伯杆菌(GenBank Nos：BBA13085(SEQ ID NO：22)，D86412获得。R-特异性丁二醇脱氢酶已知为EC 1.1.1.4，例如从蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(GenBankNos.NP_830481，NC_004722；AAP07682，AE017000)和乳酸乳球菌(GenBank Nos.AAK04995，AE006323)获得。
术语“丁二醇脱水酶”也称为“二醇脱水酶”或“丙二醇脱水酶”是指具有催化2，3-丁二醇转化为2-丁酮，也称为甲基乙基酮(MEK)的酶活性的多肽。丁二醇脱水酶可利用辅助因子腺苷钴胺。腺苷钴胺依赖性的酶已知为EC 4.2.1.28，例如从催产克雷伯杆菌(GenBank Nos：BAA08099(α亚单位)(SEQ ID NO：24)，BAA08100(β亚单位)(SEQ ID NO：26)，和BBA08101(γ亚单位)(SEQ ID NO：28)，(注意所有三种亚单位对活性都是必需的)，D45071)获得。
术语“2-丁醇脱氢酶”是指具有催化2-丁酮转化为2-丁醇的酶活性的多肽。2-丁醇脱氢酶是醇脱氢酶广阔家族的亚类。2-丁醇脱氢酶可以是NADH或NADPH依赖性的。NADH依赖性的酶被称为EC 1.1.1.1，例如从赤红球菌(GenBank Nos：CAD36475(SEQ ID NO：30)，AJ491307(SEQ ID NO：29))获得。NADPH依赖性的酶已知为EC 1.1.1.2，例如从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)(GenBank Nos：AAC25556，AF013169)获得。
术语“乙酰羟酸异构还原酶”或“乙酰羟酸还原异构酶”指用NADPH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作为电子供体，催化乙酰乳酸转换为2，3-二羟基异戊酸的酶。优选的乙酰羟酸异构还原酶已知为EC号1.1.1.86，序列从各种大批的微生物，包括但不限于大肠杆菌(GenBank Nos：NP_418222(SEQ ID NO：32)，NC_000913(SEQ ID NO：31))，酿酒酵母(GenBank Nos：NP_013459，NC_001144)，海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)(GenBankNos：CAF30210，BX957220)和枯草杆菌(GenBank Nos：CAB14789，Z99118)获得。
术语“乙酰羟酸脱水酶”是指催化2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的酶。优选的乙酰羟酸脱水酶已知为EC号4.2.1.9。这些酶从各种大批的微生物，包括但不限于大肠杆菌(GenBank Nos：YP_026248(SEQ ID NO：34)，NC_000913(SEQ ID NO：33))，酿酒酵母(GenBank Nos：NP_012550，NC_001142)，海沼甲烷球菌(GenBank Nos：CAF29874，BX957219)和枯草杆菌(GenBank Nos：CAB14105，Z99115)获得。
术语“支链α-酮酸脱羧酶”是指催化α-酮异戊酸转化为异丁醛和CO2的酶。优选的支链α-酮酸脱羧酶已知为EC号4.1.1.72，从一些来源包括但不限于乳酸乳球菌(GenBank Nos：AAS49166，AY548760；CAG34226(SEQ ID NO：36)，AJ746364，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(GenBank Nos：NP_461346，NC_003197)和丙酮丁醇梭菌(GenBank Nos：NP_149189，NC_001988)获得。
术语“支链醇脱氢酶”是指催化异丁醛转换为异丁醇的酶。优选的支链醇脱氢酶已知为EC号1.1.1.265，但也可分类归入其他醇脱氢酶(具体指EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。这些酶利用NADH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体，从一些来源包括但不限于酿酒酵母(GenBank Nos：NP_010656，NC_001136；NP_014051，NC_001145)，大肠杆菌(GenBank Nos：NP_417484(SEQ ID NO：38)，NC_000913(SEQ ID NO：37))和丙酮丁醇梭菌(GenBank Nos：NP_349892，NC_003030)获得。
术语“基因”是指能被表达为特定蛋白的核酸片段，任选包括编码序列之前(5′-非编码序列)及之后(3′-非编码序列)的调控序列。“天然基因”是自然界中发现的具有自身调控序列的基因。“嵌合基因”是指非天然的任何基因，包含在自然界中没有一起发现的调控和编码序列。因此嵌合基因可包含不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源的但与自然界中发现的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指有机体基因组中处于其自然位置的天然基因。“外源”基因是指通常不会在宿主有机体中发现，但通过基因转移引入宿主有机体的基因。外源基因可以包含***到非天然有机体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化过程已被引入到基因组的基因。
本文所用的术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“适当的调控序列”指位于编码序列上游(5′-非编码序列)、之中或下游(3′-非编码序列)的核苷酸序列，其影响转录、RNA加工或稳定性，或相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
术语“启动子”是指能控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可全部来源于天然基因，或由来源于自然界中发现的不同启动子的不同因子组成，甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员理解，不同启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或针对不同的环境或生理条件的表达。使基因大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”指核酸序列结合到单个核酸片段上，这样使其中一个的功能受其它的影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时(即编码序列受启动子的转录控制)，启动子可操作地连接到编码序列。编码序列可正义或反义地可操作地连接到调控序列。
本文所用的术语“表达”指来自本发明核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达也可指mRNA翻译成多肽。
本文所用的术语“转化”是指核酸片段转移进入宿主有机体，使基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主有机体被称为“转基因”或“重组的”或“转化的”有机体。
术语“质粒”和“载体”是指通常携带非细胞中心代谢部分的基因的额外染色体元件，通常形式是环状双链DNA片段。这样的元件可以是来自任何来源的自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，线性或环形，单或双链DNA或RNA，其中一些核苷酸序列已加入或重组到了独特的结构中，该结构能将选定基因产物的启动子片段和DNA序列，以及合适的3′端非翻译序列引入细胞。“转化载体”指含有外源基因，并具有除促进特定宿主细胞转化的外源基因之外的元件的特定载体。
本文使用的术语“密码子简并”是指允许核苷酸序列变化，且不影响编码的多肽的氨基酸序列的遗传密码的性质。熟练的技术人员很清楚在使用核苷酸密码子以指明特定氨基酸中，具体的宿主细胞表现出的“密码子偏好”。因此，为改善宿主细胞中的表达而合成基因时，理想的是设计基因使其密码子使用频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。
术语“密码子优化”当指对于不同宿主的转化而言的核酸分子的基因或编码区时，指的是核酸分子的基因或编码区中密码子的变化，从而反映宿主有机体的典型密码子使用，并且不改变所述DNA编码的多肽。
这里使用的标准重组体DNA和分子克隆技术在本领域是众所周知的，在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验指南)，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(以下为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.andEnquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Cold Press Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学实验指南)，出版商Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)有描述。
本文所用的术语“发明”或“本发明”指普遍适用于权利要求中描述的、出现的或之后修正或补充的，或说明书中的本发明所有实施方案。
在一个实施方案中，本发明提供了分离丁醇耐受微生物的方法。如下面详述的，该方法包括在生长条件下富集微生物聚生体，并使富集的聚生体与丁醇接触。还提供了通过本发明的方法鉴别的，表现出对醇，特别是丁醇高耐受性的微生物。这些鉴别出的微生物对2-丁酮和乙醇耐受性也高。这些丁醇耐受微生物可以是基因工程得到，包含丁醇生物合成途径或2-丁酮生物合成途径，并可用于生物制备高含量的1-丁醇、2-丁醇、异丁醇或2-丁酮。
丁醇耐受微生物的分离
丁醇耐受微生物可从环境样品如废水污泥和来自其它接触丁醇或其它溶剂的环境样品分离。例如环境样品可从化工厂的废水处理设施获取。由于长期在存在不同有机溶剂的条件下生长，工业废水生物反应器是特别好的具有理想耐受性表型的微生物环境样品来源(Bramucci等，Trends Biotechnol.18：501-505(2000))。丁醇耐受微生物也可自其他微生物样本分离。例如微生物样本可以是纯菌株的化学突变微生物种群，含有多拷贝质粒库的微生物菌株，或某一特定菌株的转座子标记的突变体群。包括混合种群的任意这些微生物样本据说包括微生物聚生体。
在本发明的一个实施方案中，微生物样本是在含有过量生长营养的生长培养基中培养的，从而富集其中含有的微生物聚生体直至聚生体的成员生长。在一个实施方案中，培养物处于对数生长期。生长培养基包含可发酵碳源，并可以包括适当水平的氮、磷、硫和盐。对于微生物聚生体生长必需的合适水平的这些营养对本领域技术人员是公知的，非限制性的例子如下。可发酵碳源可以是微生物聚生体成员很容易代谢的任何碳源，包括但不限于蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物。可发酵碳源也可以是羧酸，如脂肪酸、丁酸或戊酸。通常情况下，碳源出现的浓度为约0.1％重量/体积w/v至约1.5％w/v。氮源可以是任何合适的氮源，包括但不限于铵盐或酵母提取物。氮源通常在生长培养基中出现的浓度约为10mM。磷在培养基中以磷酸盐形式存在，如钠和钾的磷酸盐，通常在生长培养基中出现的浓度约为50mM。硫在培养基中以硫酸盐的形式出现，如钠或铵的硫酸盐，通常在生长培养基中出现的浓度约为10mM。其它盐包括但不限于氯化镁、氯化钙、氯化锰、氯化铁、氯化亚铁、氯化锌、氯化铜、氯化钴和钼酸钠。这些盐通常在生长培养基中出现的浓度约为1μM到约2mM。生长培养基还可含有维生素，如盐酸硫胺素。
富集的培养物在温度为约25℃至约60℃下生长足够时间，使样本中的微生物聚生体的成员生长，通常约12小时至约24小时。培养物可在厌氧、微需氧或有氧条件，振荡或不振荡下生长。正如熟练技术人员容易理解的，厌氧条件是缺氧的条件，有氧条件是含氧的条件，微需氧条件是存在的氧水平低于空气中水平的条件，即低于21％。培养物的生长可通过测量光密度监测，通常在波长600nm监测。
生长富集的培养物随后与丁醇接触。此接触可通过用含有丁醇的新鲜生长培养基稀释富集培养物进行。如果此时富集的培养物处于对数生长期，则尤其适合。使用的丁醇浓度约为0.8％w/v至约3.0％w/v，优选约0.8％w/v至约2.0％w/v。在一个实施方案中，所述丁醇主要是1-丁醇。在另一实施方案中，所述丁醇主要是2-丁醇。在另一实施方案中，所述丁醇主要是异丁醇。此处使用的主要指以总丁醇重量计的至少约90％。此外可使用包含1-丁醇、2-丁醇和异丁醇的两种或多种的各种组合的混合物。培养物生长了一段时间，直到观察到明显生长。任选地，表现出明显生长的培养物可再一次或多次接触丁醇，以筛选增加的丁醇耐受性。每次接触可逐步提高丁醇浓度进行。
随后分离与丁醇接触的微生物聚生体，以分离单个菌株。细胞分离的多种手段为本领域技术人员所知，涉及液体或固体培养基。例如与丁醇接触的微生物聚生体可置于可能含有或不含有丁醇的固体培养基上，如营养琼脂、Luria Bertani(LB)琼脂、改良LB琼脂(即补充了可发酵碳源和盐的LB培养基)，或最小富集琼脂培养基。如果固体培养基中有丁醇，其浓度一般是约1.2％w/v至约3％w/v。培养物生长直至菌落形成。然后用本领域已知的方法分离菌落，从而提供丁醇耐受的微生物。例如所述固体培养基的菌落可用本领域已知的方法收集并鉴定，如下所述。或者固体培养基的所述菌落可接种到液体或固体的不含丁醇的生长培养基(如最小富集培养基)。生长后可收集并鉴别所述细胞。任选地，菌落的细胞可在有丁醇的液体或固体培养基(如最小富集培养基)中生长。一般来说，培养基中丁醇浓度约1.2％w/v至约3％w/v。收集丁醇存在下生长的细胞。分离的微生物可用本领域已知的方法鉴别，如16S核糖体RNA(rRNA)基因测序，脂肪酸分布型分析或核糖分型。
用本发明的方法分离的所述丁醇耐受微生物于37℃在固体培养基上生长时，耐受至少2.5％丁醇(即1-丁醇、2-丁醇或异丁醇)，或者37℃在液体培养基里生长时，耐受至少2.0％w/v丁醇。应该指出的是，丁醇耐受微生物一般在固体培养基上比在液体培养基内生长得更旺盛。此外，丁醇耐受微生物依赖于生长温度，通常在较低生长温度下生长更旺盛。通过将富集的微生物聚生体与一种丁醇接触而分离的微生物通常也耐受其他丁醇以及2-丁酮和乙醇。例如使用1-丁醇分离的微生物也耐受2-丁醇和异丁醇。
使用本方法分离的菌株的耐受性，可通过测定在含有添加待测化学物质的液体培养基中生长的IC50值评估。IC50值是造成50％生长抑制的化学物质的浓度。如本文实施例1和第2所示，IC50值1-丁醇为1.8％w/v，异丁醇为2.4％w/v，2-丁醇为3.1％w/v，2-丁酮为4.5％w/v，乙醇为5.9％w/v，是在筛选到的菌株中测定的。基于含有1-丁醇的固体培养基上所述菌株的生长，这些IC50值以及对1-丁醇和对每种其它待测化合物耐受性间的相关性，所确定的耐受菌株预计在含有2.7％w/v异丁醇，3.9w/v 2-丁醇，5.0％w/v 2-丁酮或9.0％w/v乙醇的固体培养基上生长。
所述富集的培养物还可在恒化器生物反应器中连续培养生长并与丁醇接触。通过适当调整稀释率，恒化器生物反应器中的细胞可以以不同生长率生长。恒化器培养可精确控制通气和pH值，从而得到更高的细胞密度。此外，可通过调节原料构成，逐步增加丁醇浓度。富集培养物和丁醇在生物反应器中接触后，如上所述丁醇耐受的微生物被分离和鉴别。
意想不到的是，本文实施例中使用本发明的方法鉴别的许多丁醇耐受微生物是属于乳杆菌属的细菌。乳杆菌细菌为兼性厌氧、革兰氏阳性、不能运动的、杆状细胞(Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology，Vol 2，Sneath等，Eds.；Williams & Wilkins，Baltimore，MD，1986，pp.1063-1065)。通过测定16S rRNA基因序列(SEQ ID NOs：41，42，43和44)，本文进一步表征了丁醇耐受的乳杆菌菌株，确定它们为植物乳杆菌和亚利桑那乳杆菌菌株。
可改变分离丁醇耐受微生物的本方法，以选择性分离丁醇耐受乳杆菌。例如可用使用乳酸细菌培养基如细菌乳酸菌(BactoLactobacilli)MRS琼脂培养乳杆菌的标准方法从各种环境富集乳杆菌，然后筛选1-丁醇耐受的。
分离的丁醇耐受乳杆菌菌株可以是基因工程得到的，包含编码丁醇生物合成途径或丁酮生物合成途径的基因构建物，并在合适的条件下生长从而生成丁醇或丁酮。所述丁醇生物合成途径可以是1-丁醇、2-丁醇或异丁醇生物合成途径。
1-丁醇生物合成途径
制备1-丁醇的生物合成途径由Donaldson等在同时待审并共同拥有的美国专利申请No.11/527995中描述，此申请在此引作参考。此生物合成途径包含以下底物向产物的转化：
a)乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化，例如通过作为SEQ IDNO：1或3给出的基因编码的乙酰CoA乙酰转移酶催化；
b)乙酰乙酰CoA转化为3-羟基丁酰CoA，例如通过作为SEQ ID NO：5给出的基因编码的3-羟基丁酰CoA脱氢酶催化；
c)3-羟基丁酰CoA转化为巴豆酰基CoA，例如通过作为SEQID NO：7给出的基因编码的巴豆酸酶催化；
d)巴豆酰基CoA转化为丁酰CoA，例如通过作为SEQ IDNO：9给出的基因编码的丁酰基-CoA脱氢酶催化；
e)丁酰CoA转化为丁醛，例如通过作为SEQ ID NO：11给出的基因编码的丁醛脱氢酶催化；以及
f)丁醛转化为1-丁醇，例如通过作为SEQ ID NO：13或15给出的基因编码的1-丁醇脱氢酶催化。
所述途径不需要ATP，并生成NAD+和/或NADP+，因此与产生乙酰-CoA的中心代谢途径相平衡。
2-丁醇和2-丁酮生物合成途径
生成2-丁醇和2-丁酮的生物合成途径由Donaldson等人，在同时待审并共同拥有的美国专利申请Nos.11/741892和11/741916中描述，所述申请在此引作参考。一个2-丁醇生物合成途径包含以下底物向产物的转化：
a)丙酮酸转化为α-乙酰乳酸，例如通过作为SEQ ID NO：19给出的基因编码的乙酰乳酸合酶催化；
b)α-乙酰乳酸转化为3-羟基-2-丁酮，例如通过作为SEQ IDNO：17给出的基因编码的乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)3-羟基-2-丁酮转化为2，3-丁二醇，例如通过作为SEQ IDNO：21给出的基因编码的丁二醇脱氢酶催化；
d)2，3-丁二醇转化为2-丁酮，例如通过作为SEQ ID NOs：23、25和27给出的基因编码的丁二醇脱水酶催化；以及
e)2-丁酮转化为2-丁醇，例如通过作为SEQ ID NO：29给出的基因编码的2-丁醇脱氢酶催化。
省略上述途径的最后一步(e)提供了制备2-丁酮，也称为甲乙酮(MEK)的生物合成路径。
异丁醇生物合成途径
生成异丁醇的生物合成途径由Maggio-Hall等人，在同时待审并共同拥有的美国专利申请No.11/586315中描述，所述申请在此引作参考。一个异丁醇生物合成途径包含以下底物向产物的转化：
a)丙酮酸转化为乙酰乳酸，例如通过作为SEQ ID NO：19给出的基因编码的乙酰乳酸合酶催化；
b)乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸，例如通过作为SEQ IDNO：31给出的基因编码的乙酰羟酸异构还原酶催化；
c)2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸，例如通过作为SEQID NO：33给出的基因编码的乙酰羟酸脱水酶催化；
d)α-酮异戊酸转化为异丁醛，例如通过作为SEQ ID NO：35给出的基因编码的支链酮酸脱羧酶催化；以及
e)异丁醛转化为异丁醇，例如通过作为SEQ ID NO：37给出的基因编码的支链醇脱氢酶催化。
生成丁醇或丁酮的乳杆菌宿主的构建
含有编码将可发酵碳源底物转化为丁醇或丁酮的酶促途径之一的酶的必需基因的重组体丁醇耐受乳杆菌菌株，可用本领域已知的技术构建。植物乳杆菌(L.plantarum)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、清酒乳杆菌(Lsakei)、约氏乳杆菌(Ljohnsonii)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和德氏乳杆菌(L.delbrueckii)的基因组序列是已知的(National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库)，genbankTM鉴定如下：
·植物乳杆菌WCFS1，全部基因组
gi|28376974|ref|NC_004567.1|[28376974]
·唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.Salivarius)UCC118，全部基因组
gi|90960990|ref|NC_007929.1|[90960990]
·清酒乳杆菌菌株23K全部基因组
gi|78609255|emb|CR936503.1|[78609255]
·约氏乳杆菌NCC533，全部基因组
gi|42518084|ref|NC_005362.1|[42518084]
·嗜酸乳杆菌NCFM，全部基因组
gi|58336354|ref|NC_006814.1|[58336354]
·德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.
Bulgaricus)ATCC11842，全部基因组
gi|104773257|ref|NC_008054.1|[104773257]
这些细菌的G+C含量范围为32％到49％。
在本发明中，编码上述丁醇或丁酮生物合成途径之一的酶的基因可从不同来源分离(见上文)。从细菌基因组得到所需基因的方法在分子生物学领域是常见和熟知的。例如如果所述基因的序列是已知的，可用标准引物引导扩增法如聚合酶链反应(美国专利号No.4,683,202)设计引物并扩增所需序列，以得到适合克隆到转化载体内的量的DNA。如果要分离与已知序列异源的基因，则可通过限制性内切酶消化创建合适的基因组库，并用具有与所需基因序列互补序列的探针进行筛选。一旦序列被分离，所述DNA可用标准引物引导扩增法如聚合酶链式反应(美国专利No.4,683,202)扩增，以获得适合克隆到表达载体的量的DNA，随后所述DNA被转化入适当的宿主细胞中。
此外，考虑到具有理想酶活性的蛋白的氨基酸序列，编码序列可通过所述蛋白序列的反向翻译确定。含有编码序列的DNA片段可合成制备，并克隆到表达载体中，然后转化到所需宿主细胞中。
在制备含有编码序列的合成的DNA片段中，为了在靶宿主细胞中表达，可优化该序列。为在异源宿主中表达所进行的密码子优化工具很容易获得。
一旦有关途径的基因被确认和分离，它们可能会通过本领域众所周知的方法***载体并转化到丁醇耐受乳杆菌宿主中。用于乳杆菌转化的载体是已知的(见下文)。通常载体或盒包含引导***的DNA序列、可选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列的转录和翻译的序列。合适的载体包括含有转录起始控制的***DNA片段的5’区，以及控制转录终止的DNA片段的3’区。虽然可以理解这样的控制区也可来自非源于特定制备宿主的基因，但两种控制区可以来自与被转化的宿主细胞同源的基因。
用于驱动在所需乳杆菌宿主细胞中表达相关途径编码区的起始控制区或启动子，可从其他乳酸菌或其他革兰氏阳性有机体获得。非限制性的例子是来自乳球菌(Lactococcus)的nisA启动子。终止控制区也可来自源于优选宿主或相关细菌的不同基因。任选地，终止位点可以是非必要的，但是如果包括在内，则它是最优的。
乳杆菌属属于乳(酸)杆菌族(Lactobacillales)家族，枯草杆菌和链球菌(Streptococcus)转化中使用的许多质粒和载体可用于乳杆菌。合适载体的非限制性例子包括pAMβ1和其衍生物(Renault等，Gene 183：175-182(1996)；和O’Sullivan等，Gene 137：227-231(1993))；pMBB1和pHW800，pMBB1衍生物(Wyckoff等Appl.Environ.Microbiol.62：1481-1486(1996))；pMG1，接合质粒(Tanimoto等，J.Bacteriol.184：5800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等，Appl.Environ.Microbiol.63：4581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等，Appl.Environ.Microbiol.67：1262-1267(2001))；以及pAT392(Arthur等，Antimicrob.AgentsChemother.38：1899-1903(1994))。来自植物乳杆菌的一些质粒也已有报道(van Kranenburg R，Golic N，Bongers R，Leer RJ，de Vos WM，Siezen RJ，Kleerebezem M.Appl.Environ.Microbiol.2005 Mar；71(3)：1223-1230)，可用于转化。
丁醇或丁酮生物合成路径的各种基因可组装成任何合适的载体，如上述那些。可优化所述密码子，以在从宿主菌株如植物乳杆菌或亚利桑那乳杆菌的基因组序列推导出的密码子索引(index)的基础上进行表达。质粒可用本领域已知的方法引入宿主细胞，如电穿孔，在任何一篇的下列参考文献中有描述：Cruz-Rodz等(Molecular Genetics and Genomics 224：1252-154(1990))，Bringel andHubert(Appl.Microbiol.Biotechnol.33：664-670(1990))，以及TeresaAlegre，Rodriguez and Mesas(FEMS Microbiology letters 241：73-77(2004))。质粒也可以通过接合引入植物乳杆菌(Shrago，Chassyand Dobrogosz Appl.Environ.Micro.52：574-576(1986))。丁醇或丁酮生物合成途径基因也可使用整合载体整合到乳杆菌染色体中(Hols等Appl.Environ.Micro.60：1401-1403(1990)；Jang等Micro.Lett.24：191-195(2003))。
发酵培养基
生产丁醇或丁酮的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可以包括但不限于单糖如葡萄糖和果糖，低聚糖如乳糖或蔗糖，多糖如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物如干酪乳清透析液(cheese whey permeate)、玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽。蔗糖可从如甘蔗、甜菜、木薯以及甜高粱的原料获得。葡萄糖和葡萄糖可以通过包括谷类如玉米、小麦、黑麦、大麦和燕麦的基于淀粉的原料的糖化获得。
此外，发酵糖类可通过预处理和糖化过程从纤维素质和木质纤维生物质获得，如同例如在共同拥有并同时待审的美国专利申请US 20070031918A1中描述的，此专利申请在此引作参考。生物质指任何纤维素质或木质纤维材料，包括包含纤维素，及任选进一步包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的物质。生物质还可包含其他成分如蛋白质和/或脂质。生物质可来自单一来源，或生物质可包含超过一个来源的混合物，例如生物质可包含玉米棒和玉米秸秆的混合物，或青草和树叶的混合物。生物质包括但不限于生物能源作物、农业剩余物、城市固体废物、工业固体废物、造纸的污泥、庭院废物，木材和林业废料。生物质的例子包括但不限于玉米粒、玉米棒、作物剩余物，如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、谷物碾磨得到的成分、树木、树枝、根、叶、木屑、锯末、灌木、蔬菜、水果、花卉和动物粪肥。
尽管设想所有上述碳底物及其混合物在本发明中是合适的，但优选的碳底物为葡萄糖、果糖和蔗糖。
除了适当的碳源，发酵培养基必须含有本领域技术人员已知的合适的矿物质、盐类、辅助因子、缓冲液和其他组分，这些物质适合培养物的生长，并促进制备丁醇或丁酮必需的酶促途径。
培养条件
通常细胞在合适培养基中生长的温度范围约25℃至约40℃。本发明的合适生长培养基是普通的商业制备培养基，如细菌乳酸菌MRS肉汤或琼脂(Difco)，Luria Bertani(LB)肉汤，沙氏葡萄糖(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可使用其他界定的或合成的生长培养基，特定微生物生长的适当培养基对微生物和发酵科学领域的技术人员来说是已知的。使用已知直接或间接调节降解物阻遏的物质，如环腺苷2′：3′-单磷酸，也可纳入发酵培养基中。
发酵的合适pH值范围为pH5.0至pH9.0，pH6.0至pH8.0优选作为初始条件。
发酵可在有氧或无氧条件下进行，优选厌氧或微需氧条件。
工业分批和连续发酵
丁酮或丁醇可使用分批发酵方法制备。典型分批发酵是封闭的***，培养基组成在发酵开始时设定，发酵过程中不受人为变更。标准分批发酵***的变化是补料***。本发明中补料分批发酵过程也是适合的并包含典型分批***，只不过底物是随着发酵的进行递增添加的。当降解物阻遏有抑制细胞代谢的倾向时，补料分批***是有用的，理想的是培养基中有有限量的底物。分批和补料分批发酵在本领域是常见并众所周知的，例子可见Biotechnology中Thomas D.Brock：A Textbook of IndustrialMicrobiology(工业微生物手册)，Second Edition(1989)SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA.，or Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)，其在此引入参考。
丁醇或丁酮也可利用连续发酵法制备。连续发酵是开放的***，向生物反应器中连续加入确定的发酵培养基，加工时同时去除等量条件培养基。连续发酵普遍保持恒定高密度的培养物，细胞主要处于对数生长期。连续发酵允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任何数目的因素。调节营养物和生长因子以进行连续发酵处理的方法，以及最大化产物形成率的技术在工业微生物学领域是众所周知的，各种方法的详见Brock，同上。
设想丁醇或丁酮的制备可以使用分批、补料分批或连续处理进行，任何已知模式的发酵都是合适的。此外，设想细胞可固定在底物上作为整体细胞催化剂，并经受丁醇或丁酮制备的发酵条件。
丁醇和2-丁酮从发酵培养基分离的方法
对于ABE发酵生物制备的丁醇可以用本领域已知的方法从发酵培养基分离(参见例如Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等，Process.Biochem.27：61-75(1992)在此作为参考)。例如固体可通过离心、过滤、倾析等等从发酵培养基除去。然后丁醇可使用例如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、气提、膜蒸发或渗透蒸发的方法从发酵培养基分离。这些相同的方法可适于从发酵培养基分离生物制备的2-丁酮。
实施例
本发明在下列实施例中进一步明确。应该理解的是，这些实施例，同时指出优选实施方案，仅通过例证方式给出。从上述讨论和这些例子，本领域技术人员可确定此发明的基本特征，并且不偏离其精神和范围可作出本发明的各种变化和修改，以适应各种用途和条件。
使用的缩略语意义如下：“min”指分钟，“h”指小时，“sec’指秒，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“nm”指纳米，“mm”指毫米，“cm”指厘米，“μm”指微米，“mM”指微摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“μmole”指微摩尔，“g”指克，“μg”指微克，“mg”指毫克，“rpm”指每分钟转数，“w/v”指重量/体积，“OD”指光密度，“OD600”指600nm处测得的光密度，“OD595”指595nm处测得的光密度；“IC50”指导致50％生长抑制的丁醇浓度，“GCMS”指气相色谱-质谱，以及“HPLC”指高效液相色谱。
通法：
实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，由Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984，以及Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience，N.Y.，1987描述。
适合于细菌培养物的保持和生长的材料和方法也是本领域众所周知的。适用于下列实施例的技术可见Manual of Methods forGeneral Bacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips，eds.，American Societyfor Microbiology，Washington，DC.，1994，或Thomas D.Brock inBiotechnology：A Textbook ofIndustrial Microbiology，Second Edition，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，1989。所有用于细菌细胞生长和保持的物质、限制性内切酶和材料从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，BDDiagnostic Systems(Sparks，MD)，Life Technologies(Rockville，MD)，或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得，除非另有说明。
实施例1
采用连续培养的丁醇耐受菌株的分离
这些实施例的目的是分离丁醇耐受菌株。环境样品取自几个流出液处理场所，1-丁醇存在下在恒化器生物反应器中连续培养。几种1-丁醇耐受菌株被分离，并鉴定为植物乳杆菌或亚利桑那乳杆菌。
Appilikon发酵罐(Fermentor)(Appilikon Inc.，Clinton，NJ)(Appilikon Inc.，Clinton，NJ)作为厌氧恒化器进行操作。该生物反应器***由1-L碟底(dished bottom)反应器，控制器(Controller)ADI 1032 P100，以及带有船推进涡轮搅拌桨的搅拌器单位组成。带有适当传感器的生物控制器(Bio Controller)ADI1030Z510300020监控pH值、溶解氧和温度。Cole Parmer泵和泵头(Cole Parmer Instrument Co.，Vernon Hills，IL)用于添加酸碱，使pH值为维持在7.0。用循环水浴使温度保持在37℃。培养基(S20培养基)由5mM磷酸钾缓冲液，pH值7.0、10mM硫酸铵、0.1％酵母提取物、0.1％酪蛋白水解物、100mM MOPS、2mM MgCl2、0.7mM CaCl2、0.05mM MnCl2、0.001mM ZnCl2、0.002mM盐酸硫胺素、1.72μM CuCl2、2.53μM CoCl2、2.42μMNa2MoO4、25mM葡萄糖、12.5mM蔗糖、12.5mM果糖组成。生物反应器中用体积500毫升的此培养基。该生物反应器操作给料速率范围为0.1至1.0mL/分钟，搅拌速度为50rpm。
生物反应器用从E.I.du Pont de Nemours and Company几处位置的不同废水处理设施获取的一些废水污泥样本混合物接种。短期分批模式操作后，生物反应器操作在连续给料模式下操作，逐渐加入浓度增加的1-丁醇至培养物培养基中。培养基流速范围为0.1至1.0ml/min。
生物反应器中的细胞密度通过测量600nm处的光密度进行监测。原料和流出液中的1-丁醇用带有5973 Mass Detector(AgilentTechnologies，Inc，Wilmington，DE)的HP6890 Gas Chromatograph通过GCMS测定。GC柱为DB-WAX，30m x 0.32mm ID x 0.25μm柱(J&W Scientific，Inc.，Folsom，CA)。或者过滤(Acrodisc CR PTFE0.2μm滤器)样本，用带有
Figure A200780022430D0036171232QIETU
SH-G保护柱的
Figure A200780022430D0036171242QIETU
SH1011柱(8mm ID x 300mm长度；Shoko America Inc.，Colorado Springs，CO)，通过HPLC分析。流动相为0.01N硫酸。柱温50℃，使用的流速0.5mL/min。为检测，所用光度检测器设为210nm，并使用折光率检测器。样品注射体积为10μL。
初始调整阶段后，通过原料进入生物反应器的1-丁醇的量逐渐增加至2.5％w/v。此同一期间内，监测生物反应器流出液中葡萄糖的量。原料中增加1-丁醇的量导致细胞密度降低，并伴随葡萄糖利用减少。适应更高水平的1-丁醇后，连续培育使细胞密度和葡萄糖利用率再次提高。例如1-丁醇增加至1.6％导致细胞密度下降到少于1.5OD600，葡萄糖利用相应降低。然而连续培育使细胞密度增加至2.3OD600，葡萄糖消耗相应增加。
从此生物反应器分离1-丁醇耐受纯菌株如下进行。来自生物反应器废品罐(waster jug)的细胞样品被连续稀释，系列稀释液置于无1-丁醇的胰酶大豆琼脂上(Difco；Bekton Dickinson andCompany；San Jose，CA)。然后菌落从琼脂培养基接种到正方形孔微量滴定板(Beckman Coulter Inc，Fullerton，CA；Catalog No.069681)孔内1.2ml无1-丁醇的S20培养基中。所述正方形微滴定板用粘性覆盖物(adhesive cover)(Beckman Coulter Inc.；Catalog No.538619)密封，37℃振动培育直至72小时。将每个正方形孔的200uL培养物分配到“U形底”微滴定板(VWR ScientificProducts，West Chester，PA；Catalog No.62409-052)的相应孔内，用所述正方形微量滴定板制成主板。用Nunc-TSP可转移固相筛选***(Nunc-TSP transferable solid phase screening system)(Nalgene Nunc International，Napersville，IL；Catalog No.445497)，从主板得到的分离物复制铺板到含有1.2％至3.4％1-丁醇的S20琼脂或TSA琼脂板上。耐受性分离物37℃生长24至72小时后鉴别。在含有3％1-丁醇的琼脂培养基上生长的几种分离物进一步得以表征。
分离菌株的IC50值如下在37℃测定。在没有(对照)和有各种量1-丁醇的条件下，分离物37℃下培养在S30L培养基中(即10mM硫酸铵、pH7.0的5mM磷酸钾缓冲液、pH7.0的50mM MOPS、2mM MgCl2、0.7mM CaCl2、50μM MnCl2、1μMFeCl3、1μM ZnCl2、1.72μM CuCl2、2.53μM CoCl2、2.42μMNa2MoO4、2μM盐酸硫胺、0.01M葡萄糖和0.2％酵母提取物)，每种培养物的倍增时间从生长曲线的对数部分计算(倍增时间＝0.693/生长率)。样品瓶中1-丁醇导致的生长抑制百分比从100％减去生长百分比([对照瓶的倍增时间/样品瓶的倍增时间]X100)而测定。IC50是造成50％生长抑制的丁醇浓度，通过丁醇浓度对抑制百分比作图测定。结果总结于表4。
分离物通过测定从每种分离物提取的DNA中16S rRNA基因的聚合酶链式反应(PCR)得到产物的序列而鉴别。DNA从每种1-丁醇耐受菌株提取。每种分离物用使用商业试剂盒(UltracleanMicrobial Genomic DNA Isolation Kit，来自Mo Bio Laboratories，Inc，Carlsbad，CA，Part No.12224-50)处理。分离物的16S rRNA基因通过使用HotStar Taq(Qiagen，Valencia，CA；Catalog No.203446)和作为SEQIDNO：39给出的引物JCR14(ACGGGCGGTGTGTAC)以及作为SEQ ID NO：40给出的JCR15(GCCAGCAGCCGCGGTA)的PCR进行扩增。PCR条件为95℃ 15分钟；然后30个循环的94℃4 5秒，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟；然后72℃ 10分钟。PCR产物纯化并测序。每个序列用作查询序列，进行GenBank的BLAST搜索，以确定最近似的先前鉴别的16S rRNA基因序列。作为丁醇耐受所选定的三种菌株确定为植物乳杆菌，一种菌株确定为亚利桑那乳杆菌(见表4)。
表4
从环境样品分离的丁醇耐受菌株
 
菌株 种系型 ATCC No. 16S rRNA序列 IC50(％)1-丁醇  
PN0510 植物乳杆菌 PTA-8318 SEQ ID NO：41 1.4
PN0511 植物乳杆菌 PTA-8320 SEQ ID NO：42 1.6
PN0512 植物乳杆菌 PTA-7727 SEQ ID NO：43 1.8
PN0514 亚利桑那乳杆菌 PTA-8319 SEQ ID NO：44 1.7
实施例2
1-丁醇耐受的乳杆菌对其它化合物的耐受性
本实施例的目的是测试基于1-丁醇耐受性分离的乳杆菌菌株对另外的化合物2-丁醇、异丁醇、2-丁酮和乙醇的耐受性。如同实施例1中关于1-丁醇的描述，测量了这些化合物对选定的1-丁醇耐受植物乳杆菌PN0512菌株的IC50值。结果总结在表5中。
基于测得的每种化合物的IC50值，以及对1-丁醇耐受性和对每种其它测试化合物耐受性间的相关性，预期经鉴定的耐受性菌株在含有3.9％w/v 2-丁醇、2.7％w/v异丁醇、5.0％w/v 2-丁酮或9.0％w/v乙醇的固体培养基上生长。
表5 PN0512对2-丁醇、异丁醇和2-丁酮的耐受性
 
化合物 IC50(％)
异丁醇 2.4
2-丁醇 3.1
2-丁酮 4.5
乙醇 5.9
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.
<120>Solvent Tolerant Microorganisms and Methods of Isolation
<130>CL3550 PCT
<160>44
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1179
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>1
<210>2
<211>392
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>2
Figure A200780022430D00411
Figure A200780022430D00421
<210>3
<211>1179
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>3
Figure A200780022430D00422
Figure A200780022430D00431
<210>4
<211>392
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>4
Figure A200780022430D00432
Figure A200780022430D00441
<210>5
<211>849
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyl icum)
<400>5
Figure A200780022430D00442
Figure A200780022430D00451
<210>6
<211>282
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>6
<210>7
<211>786
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>7
<210>8
<211>261
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>8
Figure A200780022430D00463
<210>9
<211>1197
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>9
Figure A200780022430D00472
<210>10
<211>398
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>10
Figure A200780022430D00482
<210>11
<211>1407
<212>DNA
<213>拜季林斯基梭菌(Clostridium beijerinckii)
<400>11
Figure A200780022430D00501
<210>12
<211>468
<212>PRT
<213>拜季林斯基梭菌(Clostridium beijerinckii)
<400>12
Figure A200780022430D00502
Figure A200780022430D00511
Figure A200780022430D00521
<210>13
<211>1215
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>13
Figure A200780022430D00522
<210>14
<211>390
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>14
Figure A200780022430D00532
Figure A200780022430D00541
<210>15
<211>1170
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>15
<210>16
<211>389
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>16
Figure A200780022430D00561
<210>17
<211>780
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<400>17
Figure A200780022430D00562
Figure A200780022430D00571
<210>18
<211>259
<212>PRT
<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<400>18
Figure A200780022430D00572
Figure A200780022430D00581
<210>19
<211>1680
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌(Klehsiel lapneumoniae)
<400>19
Figure A200780022430D00582
Figure A200780022430D00591
<210>20
<211>559
<212>PRT
<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<400>20
Figure A200780022430D00592
Figure A200780022430D00601
Figure A200780022430D00611
<210>21
<211>771
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<400>21
<210>22
<211>256
<212>PRT
<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<400>22
Figure A200780022430D00613
Figure A200780022430D00621
<210>23
<211>1665
<212>DNA
<213>催产克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)
<400>23
Figure A200780022430D00622
<210>24
<211>554
<212>PRT
<213>催产克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)
<400>24
Figure A200780022430D00632
Figure A200780022430D00641
Figure A200780022430D00651
<210>25
<211>675
<212>DNA
<213>催产克雷伯氏菌(Klebsiel la oxytoca)
<400>25
Figure A200780022430D00652
Figure A200780022430D00661
<210>26
<211>224
<212>PRT
<213>催产克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)
<400>26
Figure A200780022430D00671
<210>27
<211>522
<212>DNA
<213>催产克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)
<400>27
<210>28
<211>173
<212>PRT
<213>催产克雷伯氏菌(Klcbsiella oxytoca)
<400>28
Figure A200780022430D00673
Figure A200780022430D00681
<210>29
<211>1041
<212>DNA
<213>赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400>29
Figure A200780022430D00682
<210>30
<211>346
<212>PRT
<213>赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400>30
Figure A200780022430D00683
Figure A200780022430D00691
Figure A200780022430D00701
<210>31
<211>1476
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>31
Figure A200780022430D00702
<210>32
<211>491
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>32
Figure A200780022430D00711
Figure A200780022430D00721
<210>33
<211>1851
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>33
Figure A200780022430D00722
Figure A200780022430D00731
<210>34
<211>616
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>34
Figure A200780022430D00732
Figure A200780022430D00741
Figure A200780022430D00751
Figure A200780022430D00761
<210>35
<211>1662
<212>DNA
<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
<400>35
Figure A200780022430D00762
<210>36
<211>548
<212>PRT
<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
<400>36
Figure A200780022430D00771
Figure A200780022430D00781
<210>37
<211>1164
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>37
Figure A200780022430D00791
<210>38
<211>387
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>38
Figure A200780022430D00792
Figure A200780022430D00801
Figure A200780022430D00811
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
Figure A200780022430D00812
<210>40
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
<210>41
<211>1468
<212>DNA
<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400>41
Figure A200780022430D00814
Figure A200780022430D00821
<210>42
<211>1469
<212>DNA
<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400>42
Figure A200780022430D00822
Figure A200780022430D00831
<210>43
<211>1450
<212>DNA
<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400>43
Figure A200780022430D00832
<210>44
<211>1469
<212>DNA
<213>亚利桑那乳杆菌(lactobaillus arizonensis)
<400>44

Claims (57)

1.分离丁醇耐受的微生物的方法，其包含：
a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；
b)使所述微生物聚生体与包含可发酵碳源的生长培养基接触，直至所述微生物聚生体的成员生长；
c)使步骤(b)的所述生长的微生物聚生体与丁醇接触；以及
d)分离步骤(c)的能存活成员，其中丁醇耐受的微生物被分离。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)的生长聚生体处于对数生长期。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)后所述聚生体置于固体培养基上。
4.根据权利要求3的方法，其中所述固体培养基含有丁醇。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)所述的接触重复一次或多次。
6.根据权利要求1的方法，其中所述接触步骤(c)的所述丁醇浓度为约0.8％w/v至约3.0％w/v。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的所述分离包含步骤：
i)使步骤(d)的可存活成员在无丁醇存在的液体培养基内生长；从而使所述可存活成员繁殖；
ii)使步骤(i)的所述细胞在丁醇存在下生长；以及
iii)收集丁醇存在下生长的步骤(i)的所述细胞，其中所述丁醇耐受的微生物被分离。
8.根据权利要求1的方法，其中所述可发酵碳源选自蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸及其混合物。
9.根据权利要求1的方法，其中所述丁醇主要是1-丁醇。
10.根据权利要求1的方法，其中所述丁醇主要是2-丁醇。
11.根据权利要求1的方法，其中所述丁醇主要是异丁醇。
12.根据权利要求1的方法，其中所述聚生体是在厌氧条件下生长。
13.根据权利要求1的方法，其中所述聚生体是在微需氧条件下生长。
14.根据权利要求1的方法，其中所述聚生体是在需氧条件下生长。
15.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少2.5％w/v的1-丁醇。
16.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少3.9％w/v的2-丁醇。
17.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少2.7％w/v异丁醇。
18.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少5.0％w/v的2-丁酮。
19.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少9.0％w/v的乙醇。
20.根据权利要求1的方法，其中所述微生物样品是环境样品。
21.根据权利要求1的方法，其中所述丁醇耐受的微生物是乳杆菌。
22.丁醇耐受微生物，其通过权利要求1所述的方法分离。
23.根据权利要求22的丁醇耐受微生物，其中所述微生物是乳杆菌属的细菌。
24.分离丁醇耐受的乳杆菌的方法，其包含：
a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；
b)在含有可发酵碳源的培养基中，富集存在乳杆菌的所述微生物聚生体，以生成乳杆菌富集培养物，其中所述乳杆菌富集培养物的成员正在生长；
c)使步骤(b)所述的生长的乳杆菌富集培养物与丁醇接触；以及
d)分离步骤(c)的可存活成员，其中丁醇耐受的乳杆菌被分离。
25.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)的所述生长的乳杆菌处于对数生长期。
26.根据权利要求24的方法，其中所述微生物样品是环境样品。
27.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)后所述聚生体的所述成员置于固体培养基上。
28.根据权利要求27的方法，其中所述固体培养基含有丁醇。
29.根据权利要求28的方法，其中所述固体培养基是含有丁醇的乳酸细菌培养基。
30.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)所述的接触重复一次或多次。
31.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)所述的接触是用浓度为约0.8％w/v至约3.0％w/v间的所述丁醇进行的。
32.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的所述分离包含步骤：
i)使步骤(d)的所述可存活成员在无丁醇的液体培养基中生长，从而使所述可存活成员繁殖；
ii)使步骤(i)的所述细胞在丁醇存在下生长；以及
iii)收集丁醇存在下生长的步骤(ii)的所述细胞，其中丁醇耐受微生物被分离。
33.根据权利要求24的方法，其中所述可发酵碳源选自蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸，及其混合物。
34.根据权利要求24的方法，其中所述丁醇主要是1-丁醇。
35.根据权利要求24的方法，其中所述丁醇主要是2-丁醇。
36.根据权利要求24的方法，其中所述丁醇主要是异丁醇。
37.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少2.5％w/v的1-丁醇。
38.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少3.9％w/v的2-丁醇。
39.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少2.7％w/v的异丁醇。
40.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少5.0％w/v的2-丁酮。
41.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的所述可存活成员37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少9.0％w/v的乙醇。
42.丁醇耐受的乳杆菌，其通过权利要求24所述的方法分离。
43.权利要求42的丁醇耐受乳杆菌，其在固体培养基上生长时耐受至少2.5％w/v的丁醇。
44.根据权利要求42的丁醇耐受乳杆菌，其中所述乳杆菌具有以下特性：
i)是无芽孢形成的兼性厌氧菌；以及
ii)是革兰氏阳性；以及
iii)是不能运动的；以及
iv)具有杆状细胞形态学；以及
v)包含选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的16S rRNA基因序列。
45.丁醇耐受乳杆菌，其具有下列特性：
i)是无芽孢形成的兼性厌氧菌；以及
ii)是革兰氏阳性；以及
iii)是不能运动的；以及
iv)具有杆状细胞形态学；以及
v)在固体培养基上生长时，耐受至少2.5％w/v的丁醇。
46.根据权利要求45的丁醇耐受乳杆菌，其包含选自SEQID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的16S rRNA基因序列。
47.丁醇耐受乳杆菌，其选自ATCC PTA-8318(植物乳杆菌PN0510)、ATCC PTA-8320(植物乳杆菌PN0511)、ATCC PTA-7727(植物乳杆菌PN0512)和ATCC PTA-8319(亚利桑那乳杆菌PN0514)。
48.制备丁醇的方法，其包含：
a)提供包含编码丁醇生物合成途径的基因构建物的乳杆菌，其具有以下特性：
i)无芽孢形成的兼性厌氧菌；以及
ii)革兰氏阳性；以及
iii)不能运动的；以及
iv)杆状细胞形态学；以及
v)37℃下在固体培养基上生长时，耐受至少2.5％w/v的丁醇，以及
b)使步骤(a)的乳杆菌在可产生丁醇的条件下生长。
49.制备丁醇的方法，其包含：
a)提供通过权利要求24所述的方法分离的乳杆菌，其包含编码丁醇生物合成途径的基因构建物；以及
b)使步骤(a)的乳杆菌在可产生丁醇的条件下生长。
50.根据权利要求48或49的方法，其中所述丁醇主要是1-丁醇。
51.根据权利要求48或49的方法，其中所述丁醇主要是2-丁醇。
52.根据权利要求48或49的方法，其中所述丁醇主要是异丁醇。
53.根据权利要求48或49的方法，其中所述乳杆菌选自ATCC PTA-8318(植物乳杆菌PN0510)、ATCC PTA-8320(植物乳杆菌PN0511)、ATCC PTA-7727(植物乳杆菌PN0512)和ATCC PTA-8319(亚利桑那乳杆菌PN0514)。
54.丁醇耐受的乳杆菌，其用于丁醇的制备。
55.2-丁酮耐受的乳杆菌，其用于2-丁酮的制备。
56.制备2-丁酮的方法，其包含：
a)提供包含编码2-丁酮生物合成途径的基因构建物的乳杆菌，其具有以下特性：
i)是无芽孢形成的兼性厌氧菌；以及
ii)是革兰氏阳性；以及
iii)是不能运动的；以及
iv)具有杆状细胞形态学；以及
v)在固体培养基上生长时，耐受至少5.0％w/v的2-丁酮，以及
b)使步骤(a)的乳杆菌在可产生2-丁酮的条件下生长。
57.制备2-丁酮的方法，其包含：
a)提供通过权利要求24的方法分离的乳杆菌，其包含编码2-丁酮生物合成途径的基因构建物；以及
b)使步骤(a)的乳杆菌在可产生2-丁酮的条件下生长。
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