CN104745530A - 一种人肝细胞癌细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人肝细胞癌细胞系及其建立方法和应用。所述的人肝细胞癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201114。建立方法的步骤：1）获得新鲜的临床肝癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，接种哺乳动物；2）接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。本发明的人肝细胞癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，具有成瘤性，可以成功制备肝癌动物模型，可用来分析体外、体内药物敏感性进而建立体外、体内两个相关联的药物筛选平台，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人原发性肝癌细胞系。

Description

一种人肝细胞癌细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞系领域，特别涉及一种人肝细胞癌细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

原发性肝癌具有发病例高、预后较差及病死率高等特点，是常见的恶性肿瘤的一种。据最新的统计数据，肝癌全球新发例数约74.8万，死亡病例69.6万，而其中半数发生在中国。其发病例和死亡率在男性肿瘤患者中分别居于第5位，第2位；在女性肿瘤患者中分别居于第7位和第6位。

原发性肝癌起病隐匿，早期缺乏典型症状，早期诊断较困难，病程发展快，一旦症状明显，自行就诊患者多属于中晚期。晚期肝癌患者常有肝区疼痛、食欲减退、乏力、消瘦和肝肿大等症状。少数晚期患者表现为恶病质状。恶病质是机体营养异常的综合征，60%～80%晚期肿瘤患者都存在此综合征。临床表现为极度消瘦、营养摄入不足、肌力软弱、厌食等，是癌症患者死亡的主要原因之一。尽管临床上对恶病质的认识较早，但至今其发生机制仍未得到完全阐明，从而限制了有明确理论依据、针对性强的治疗手段的发展。目前报道的应用于研究的肝癌细胞系，所建成的动物模型表现为恶病质的非常少，建立这样一种细胞系，可以为进一步研究恶病质的发生机制提供材料，也可以为筛选治疗改善恶病质症状的药物提供平台。

体外建立肝癌细胞系是研究肝癌机制、探索其治疗方法必不可少的手段，但包括肝癌细胞在内的许多肿瘤细胞的体外培养建系均非常困难，原发肿瘤组织由于离体后环境变化，细胞往往会发生衰退死亡，导致体外细胞建系的成功率极低，即使能在体外生存，也常发生某些生物学特性的改变或丢失。

另一方面，临床60%-80%肿瘤晚期病人受恶病质痛苦，因此，建议恶病质动物模型，对于肿瘤的研究显得格外重要。但是鲜有技术中，鲜少有肝癌细胞系能够实现上述功能，极大的制约了对于肿瘤研究的进展，该现象亟待解决。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的人肝细胞癌细胞系存在的生物多样性低，与临床上肝癌的生物学性状相差较大的不足，而提供一种新的人肝细胞癌细胞系及其建立方法和应用。本发明的人肝细胞癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，具有成瘤性，可以成功制备肝癌动物模型，可用来分析体外、体内药物敏感性进而建立体外、体内两个相关联的药物筛选平台，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人原发性肝癌细胞系，并且，本发明的人肝细胞癌细胞系可建立恶病质动物模型的特性，使得通过原代培养建立的人源肿瘤细胞更接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的耐药性及敏感性将具有更好的预测性，可用于临床前抗肿瘤药物的筛选，为进一步研究恶病质的发生机制和药物筛选提供了难得的材料。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人肝细胞癌细胞系，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201114。

本发明还提供如上所述的人肝细胞癌细胞系的子代细胞。

本发明还提供如上所述的人肝细胞癌细胞系的用途，用于制备在哺乳动物中产生肝癌的试剂。所述的哺乳动物为本领域常规的哺乳动物，较佳地为免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠较佳地为SCID小鼠或Nu/Nu裸小鼠。所述的肝癌较佳地为低分化或中分化肝细胞癌。

本发明还提供一种上述人肝细胞癌细胞系的建立方法，所述的建立方法包括以下步骤：

1）获得新鲜的临床肝癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，接种哺乳动物；

2）接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。

其中，所述的哺乳动物、所述的肝癌都如上所述。

所述的新鲜的临床肝癌手术切除标本较佳地用新鲜的HBSS缓冲液（含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B）漂洗后，再进行皮下穿刺接种。

所述的接种的方式可以是皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种。对于肝癌，所述的接种的方式较佳地为皮下穿刺接种。

所述的原代培养方法为本领域常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳地所述的原代培养方法包括以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，翻转培养瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱5%CO₂条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入DMEM/F12培养液（DMEM/F12培养液包括：10ng/mL重组人表皮生长因子，10μg/mL重组人胰岛素，6.7ng/mL***钠，5.5μg/mL转铁蛋白，2μg/mL乙醇胺，0.1%牛血清白蛋白，100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B），静置培养至长出的细胞布满培养瓶底部。

所述的传代培养方法为本领域常规哺乳动物细胞的传代培养方法。较佳地所述的传代培养方法包括以下步骤：吸弃进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入新鲜的0.05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面；收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶；当细胞传代到第五代以后，将培养液更换为RPMI1640培养液（含10％胎牛血清，10μg/mL重组人胰岛素，100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B），即可。

本发明还提供一种筛选治疗肝癌的候选药物的方法，包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肝癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上所述的人肝细胞癌细胞系所导致的肝癌肿瘤。

具体的，本发明的动物模型建立和筛选治疗肝癌的候选药物的方法包括以下步骤：

（1）将所述的肝癌细胞或其子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得人肝癌动物模型；

（2）观察和测量动物的体重与肿瘤生长情况；

（3）将测试化合物施用于动物模型，施用后导致肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肝癌的候选化合物。

其中，所述的动物模型优选裸小鼠。较佳地可采用细胞悬液注射来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于肝癌荷瘤动物。较佳地使用对照实验，一种优选的方式是：同时还使用不含测试化合物的溶剂施用于肝癌荷瘤动物作为对照。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明的人肝细胞癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，甲胎蛋白，细胞角蛋白，肝细胞特异性蛋白表达阳性，为肝癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料；

2、本发明的人肝细胞癌细胞系具有成瘤性，可以成功制备肝癌动物模型，所制得的动物模型具有恶病质表现，荷瘤裸小鼠随着肿瘤的增长，体重减轻；可以为进一步研究恶病质的发生机制提供材料，也可以为筛选治疗改善恶病质症状的药物提供平台；

3、本发明的人肝细胞癌细胞系可用来分析体外、体内药物敏感性进而可以建立体外、体内两个相关联的药物筛选平台。是应用于基础研究和临床前期应用的理想人原发性肝癌细胞系。

生物材料的保藏

本发明的人肝细胞癌细胞系，于2011年4月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（地址：中国武汉武汉大学邮编430072），培养物名称为：人源肝癌细胞LIXC-012，保藏编号为CCTCC NO：C201114。

附图说明

图1LIXC-012细胞的形态学观察（100×）。

图2LIXC-012细胞的染色体分析。A.油镜1000×下的LIXC-012染色体；B.油镜1000×下鼠源细胞的染色体（参照）。

图3LIXC-012细胞生长曲线。

图4LIXC-012细胞倍增时间曲线。

图5LIXC-012细胞周期。

图6LIXC-012细胞免疫组化。A：对照组；B：甲胎蛋白；C：细胞角蛋白；D：肝细胞特异性蛋白(200×)。

图7LIXC-012细胞的成瘤性。A.LIXC-012细胞在裸小鼠体内生长曲线（肿瘤体积）；B.LIXC-012细胞移植瘤对小鼠体重影响。

图8LIXC-012细胞裸鼠移植瘤组织病理学。A：临床手术标本；B：裸小鼠体内传代亲本肿瘤；C：LIXC-012细胞在裸小鼠体内所成肿瘤。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

LIXC-012细胞的制备

SCID小鼠：5只SCID小鼠，雄性，体重16.0±1.0克，鼠龄5周，饲养于SPF环境。SCID小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

从上海中山医院获得新鲜的临床肝癌切除标本（男，71岁，原发性肝癌，病理诊断结果为：（肝右叶）肝细胞肝癌，分化II级，周围肝组织结节性肝硬化，脉管内见癌栓），立即浸入预冷的无菌HBSS缓冲液中（含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B）。在生物安全柜中，用新鲜的该无菌HBSS缓冲液冲洗标本，切成20～50mg的小块，穿刺接种SCID小鼠腋背部皮下。接种30天后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结节于接种40天后开始生长明显，至接种后60天时，肿瘤体积超过300mm³。

原代培养：皮下穿刺接种人肝癌70～90天后，将荷瘤裸小鼠用过量二氧化碳气体麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下：用HBSS缓冲液（含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B）漂洗肿瘤组织块3次，去除***和坏死组织；用无菌手术刀片将肿瘤组织剪切成约1mm³小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱内，在5%CO₂条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入10mL的DMEM/F12培养液（含10ng/mL重组人表皮生长因子，10μg/mL重组人胰岛素，6.7ng/mL***钠，5.5μg/mL转铁蛋白，2μg/mL乙醇胺，0.1%牛血清白蛋白，100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B），静置培养至细胞布满培养瓶底部；原代培养每3天换液1次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。

传代培养：当由组织块中长出的细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代培养，具体步骤如下：吸弃进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入1mL新鲜的0.05%胰蛋白酶溶液，轻轻润洗贴壁细胞层，吸弃，再加入1mL新鲜的0.05%胰蛋白酶溶液，于37℃孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3mL新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，计数，分别接种于新的培养瓶。当细胞传代到第5代以后，将培养液逐步更换为RPMI1640培养液（含10％胎牛血清，10μg/mL重组人胰岛素，100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素），细胞生长良好，形态较为均一。传代至50代以上。

在本申请中，来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞呈上皮样，倒置显微镜下细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状呈辅路石样，细胞形态较为均一，无接触抑制，初期生长速度较为缓慢；随着传代次数的增加，生长速度逐步加快；将细胞传代培养30代以上，得到细胞系，将该细胞系命名为LIXC-012，提交保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201114。

实施例2

LIXC-012细胞的生物学特性及应用

本发明采用含有胎牛血清和胰岛素的RPMI1640培养液培养LIXC-012细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的LIXC-012细胞呈上皮样，倒置显微镜下细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状呈辅路石样，细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制，呈恶性生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该LIXC-012细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。荷瘤裸小鼠随着肿瘤的增长，体重逐渐减轻，可以作为恶病质模型应用于基础研究及药物筛选。该LIXC-012细胞和其来源的临床肝癌肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可以为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性，以及肝癌的发生、发展和生物标志物提供新的试验材料。具体如下：

a.形态学观察

将培养LIXC-012细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照。结果见图1所示：倒置显微镜下细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状为多边形，呈铺路石样，具有上皮样细胞特征。

b.染色体的鉴定

将培养的LIXC-012细胞置于4℃12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为0.4μg/mL，再于37℃孵箱中继续培养10小时。采集***中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果如图2所示：染色体检测细胞核型为异倍体，随机对细胞的中期***相核型进行计数，并进行统计，染色体数目变化很大，数目为57-120，根据频数分析（Originlab7.5）运算得出：众数集中于70±5，占统计中期***相的46.9%。染色体形态呈中央及亚中央着丝粒染色体，可分辨出此为人源细胞染色体。可见该LIXC-012细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。

c.短片段重复序列（STR）鉴定

短串联重复序列又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位（2-6个碱基对），串联重复形成的一类DNA序列（重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下）；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。

收集新鲜培养的LIXC-012细胞，用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒（购自Axygen公司的AxyPrep^TMMultisource Genomic DNA Miniprep Kit，货号为AP-MN-MS-GDNA）提取细胞基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，分析包括Amelogenin，THO1，TPOX，D13S317，vWA，D16S539，D5S818，CSF1PO以及D7S820等各个STR位点的序列重复数，其中STR位点的引物序列及拷贝数如表1和表2所示。上述序列和ATCC，DSMZ等细胞保存库的数据库进行查询对比，未返回相同的遗传图谱，在美国典型培养物保藏中心（ATCC）数据库中，进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果，可证明其独一无二性，且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染。

表1：STR位点的引物序列

表2：STR位点的引物序列及拷贝数

d.细胞生长曲线

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用新鲜培养基重悬，分别接种1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000细胞/孔的细胞密度在细胞培养板中，放入37℃的CO₂培养箱中培养，分别在1、24、48、72、96、120小时，取出一块板，按照发光法细胞活性检测试剂盒（购买厂家为Promega，货号为G7573）的说明书，加CELLTITER-GLO试剂（简称：CTG，是发光法细胞活性检测试剂盒的主要成分，该试剂通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目），测生物发光值。将5天的测量值汇总绘制细胞生长曲线，如图3所示，图3以测定的时间为横坐标，测出的生物发光值为纵坐标。由图3可知：可见在5天的观察期内，细胞浓度从1000/孔增加至9000/孔，其生长速度呈浓度依赖性，根据体外药效学的实验要求，结合该生长曲线，可以确定：5000/孔的细胞密度为4天培养的最适密度。

e.细胞动力学

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用新鲜培养基重悬。接种2000细胞/孔的细胞密度于37℃CO₂培养箱中培养，在12、24、36、48、72、96小时六个时间点分别取出一块板，加CTG，分析并计算其倍增时间。将4天的测量值汇总绘制细胞生长曲线，如图4所示。

倍增时间的计算公式为：倍增时间=Log2/曲线斜率；

图4中倍增时间(X)与Log荧光信号(Y)的曲线方程为：

Y=0.0106X+4.0124(R²=0.9837)。

可知斜率Slope=0.0106；由此可以得到LIXC-012细胞的群体倍增时间=LOG(2)/Slope=28.39小时。

f.细胞周期检测

利用碘化吡啶标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。检测方法参考：人肝细胞癌细胞亚群的克隆分离及异质性机制的初步研究[J].世界华人消化杂志，2006，14（5）：481-485.。消化细胞后用PBS清洗重悬细胞，用冰乙醇固定，-20℃过夜保存。离心并用PBS清洗和重悬细胞，加入RNA酶重悬细胞，37℃条件消化30分钟。除去RNA酶，加入碘化吡啶，4℃避光染色30分钟。转入流式检测管，分析细胞周期。

检测结果：如图5所示：LIXC-012细胞G₁期为62.3%，S期为17.79%，G₂/M期为18.91%。

g.免疫组化蛋白表达

将LIXC-012细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％甲醛固定，进行免疫组化染色（DAB显色法）。阴性对照（图6A）显示该方法不造成背景。检测结果如图6所示，显示了LIXC-012符合肝细胞肝癌的特征：肝癌标志物甲胎蛋白（图6B）、细胞角蛋白（图6C）和肝细胞特异性蛋白（图6D）的染色均为阳性。

h.细胞的成瘤性

体外大规模培养和收集LIXC-012细胞，皮下接种Nu/Nu裸小鼠（每只动物接种1.0×10⁶个细胞），接种后约2周，肿瘤形成并开始生长，选取6只成瘤小鼠调查其体重和肿瘤，绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积＝（长×宽×宽）÷2。肿瘤生长较快，接种后30天肿瘤体积平均值达到1500mm³，如图7A所示：该LIXC-012细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

i.荷瘤裸小鼠的体重变化与摄食量

上述h步骤成瘤性实验的同时设置正常对照组，皮下接种6只Nu/Nu裸小鼠（每只动物接种等量PBS）。接种后14天，肿瘤开始增长后，每隔2天或3天测定体重和摄食量。由于肿瘤后期的快速生长，摄食量减少（见下表3），对小鼠产生影响，小鼠后期体重出现下降，其结果见表4和图7B（图7B中，▲表示对照样，■表示1.0×10⁶个细胞/只），与晚期癌症患者恶病质表现一致。

表3荷瘤裸小鼠的体重变化表

	D15-D17	D18-D19	D20-D21
				正常对照组	3.97	3.96	4.39
xLIXC-012模型组	3.57	3.64	4.48
					D22-D24	D25-D26	D27-D28
正常对照组	3.91	4.27	4.55

xLIXC-012模型组

1.72

1.85

0.89

表4荷瘤裸小鼠的摄食量变化表

j.肿瘤的病理学鉴定

将实施例1的从上海中山医院获得新鲜的临床肝癌切除标本、穿刺接种于裸小鼠背部皮下90天后皮下长出的肿瘤、和上述h步骤中LIXC-012细胞在裸小鼠皮下接种30天后形成的肿瘤，进行石蜡包埋切片和H&E染色，结果如图8所示，病理诊断结果见下表5。可见临床标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤和LIXC-012细胞在裸小鼠体内所成肿瘤的结构类似，形成对应关系。裸小鼠体内所成肿瘤癌组织细胞异型明显，血管生长丰富，排列致密，染色质增加，核内常有多个核仁，核大深染，嗜苏木素。

表5各肿瘤标本的病理诊断结果

标本名称	病理诊断结果
		临床手术标本（图8A）	（肝右叶）肝细胞肝癌，分化II级
裸小鼠体内传代亲本肿瘤（图8B）	低分化肝细胞癌
		LIXC-012细胞在裸小鼠体内所成肿瘤（图8C）	低分化肝细胞癌

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种人肝细胞癌细胞系，其特征在于：所述的人肝细胞癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201114。

2.如权利要求1所述的人肝细胞癌细胞系的子代细胞。

3.如权利要求1或2所述的人肝细胞癌细胞系的用途，其特征在于：所述的人肝细胞癌细胞系用于制备在哺乳动物中产生肝癌的试剂。

4.如权利要求3所述的人肝细胞癌细胞系的用途，其特征在于：所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠为SCID小鼠或Nu/Nu裸小鼠。

5.如权利要求3所述的人肝细胞癌细胞系的用途，其特征在于：所述的肝癌为低分化或中分化肝细胞癌。

6.一种如权利要求1或2所述的人肝细胞癌细胞系的建立方法，其特征在于：所述的建立方法包括以下步骤：

1）获得新鲜的临床肝癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，接种哺乳动物；

2）接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。

7.如权利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠为SCID小鼠或Nu/Nu裸小鼠。

8.如权利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的新鲜的临床肝癌手术切除标本用HBSS缓冲液漂洗后，再进行皮下穿刺接种；所述的HBSS缓冲液包括500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B。

9.如权利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的原代培养方法包括以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，翻转培养瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱5%CO₂条件下培养；次日，将培养瓶翻转平放，向瓶内加入DMEM/F12培养液，静置培养至长出的细胞布满培养瓶底部；其中，所述的DMEM/F12培养液包括：10ng/mL重组人表皮生长因子，10μg/mL重组人胰岛素，6.7ng/mL***钠，5.5μg/mL转铁蛋白，2μg/mL乙醇胺，0.1%牛血清白蛋白，100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B。

10.如权利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的传代培养方法包括以下步骤：吸弃进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入0.05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入DMEM/F12培养液，吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀挂擦培养瓶表面；收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶；当细胞传代到第五代以后，将培养液更换为RPMI1640培养液，即可。