CN1243443A

CN1243443A - 用于增殖双歧杆菌的鲜地黄提取物及其提取方法

Info

Publication number: CN1243443A
Application number: CN98801822A
Authority: CN
Inventors: 罗燕燕; 李光慧; 郝仙娣; 索建政; 龚韬
Original assignee: BEIJING COMPREHENSIVE INSTITUTE FOR TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Current assignee: Qingdao Guofeng Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1998-01-14
Publication date: 2000-02-02
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: CN1094762C; WO1998031379A1; AU5475598A; CN1188000A

Abstract

本发明涉及一种用于增殖双歧杆菌的地黄提取物及其提取方法,该提取物是以鲜地黄或鲜地黄干片为原料,按照下述方法制成的:以溶剂提取鲜地黄或鲜地黄干片;加活性炭使所得提取液脱色;将脱色后的液体离心分离和过滤;并将得到的滤液减压浓缩和冷藏,或加乙醇沉淀,收集沉淀部分;将所得分离物加水调成溶剂。

Description

用于增殖双歧杆菌

的鲜地黄提取物及其提取方法

发明所属技术领域

本发明涉及一种用于增殖双歧杆菌的地黄提取物及其提取方法，更详细地是涉及一种从鲜地黄中提取的能够使人体内自身双歧杆菌成倍增生的鲜地黄提取物及高收率地从鲜地黄中进行提取的方法。

背景技术

目前已经知道在人体肠道内栖居的细菌中，与人的健康最密切相关的是双歧杵菌，这种双歧杆菌定植于肠粘膜的深层，形成了一道生物屏障，阻止外来细菌的入侵，抑制肠内腐败，增强人体免疫力，促进营养物质的吸收，合成 B族维生素及维生素 K，减少肠源性内毒素的来源，从而对保护肝脏、防治肿瘤以及抗衰老起到有益的作用。但由于某种原因，例如长期大量服用抗生素、使用免疫抑制剂、施行化疗或放疗、手术、精神及肉体刺激或饮食不当等，会造成双歧杆菌的数量减少，这时其他有害菌就会侵入，引起菌群失调和代谢异常，各种毒素、腐败物质、致癌物质增加，产生多种病变，如腹泻、便秘、消化功能紊乱，以及一些难以治愈的慢性疾病，如动脉硬化、肝脏损害、肠道癌变等，其中腹泻是上述这些疾病中最明显且发病率最高的病症。

目前对于腹泻的治疗多采用抗生素或抗动力药物，其中抗生素的使用率已高达 84 % , 滥用情况十分严重。抗生素的滥用会导致菌群失调，严重的会导致二重感染，而实际上 70 %的感染型腹泻是不需要抗生素治疗的。另外，抗动力药的使用不当会抑制病毒及毒素的排泻，使病情加重。

研究结果表明，腹泻引起肠道内的菌群失调，尤为明显的是双歧杵菌数量大大减少，因此保持和恢复肠道内双歧杆菌的优势地位是预防和治疗腹泻的重要条件。基于上述的认识，最近十年来对以双歧杵菌及其增殖剂为代表的微生态制剂和治疗方法进行了深入的研究。但是，目前为止许多国家都侧重于双歧杵菌活菌制剂的研制。双歧杵菌活菌的制剂技术要求相当高，若不严格控制条件则质量很难保证，且存在着一定的潜在危险。另外，对于活菌制剂的使用、保存等都有特殊严格的要求。同时活菌制剂中一般只选用一种双歧杆菌菌种，存在菌种单一、不能完全满足人体需要的双歧杆菌菌种构成的问题。

鉴于上述情况，迫切需要开发一种即可以使双歧杆菌增殖，又能克服活菌制剂的缺点的新型歧杆菌增殖制剂。

在日本科学家正井辉久所著的《大豆低聚糖的开发及其制品特性》一文中记载了大豆中的水苏糖及棉籽糖对双歧軒菌具有极好的增殖作用，确认了水苏糖及棉籽糖是一种非常好的双歧杆菌增殖剂。但是，如该文中所记载，大豆中的水苏糖及棉籽糖的含量低，其中水苏糖含量为 24 % , 棉籽糖含量为 8 % , 总计为 32 % , 而且蔗糖、果糖、葡萄糖等可吸收糖含量很高，达 55 %以上（含量均以干品计算）。因此不适合糖尿病人、肥胖者和老年人服用，使用范围受到限制。

鉴于上述情况，本发明人等以开发水苏糖及棉籽糖含量高且可吸收糖含量低的新型双歧杵菌增殖剂为目的，进行了深入的研究，结果发现在中药鲜地黄中水苏糖及棉籽糖的总含量很高，用适当的提取方法从其中提取的提取物可以满足上述要求，从而完成了本发明。

发明概述

本发明提供了用于增殖肠道内双歧杆菌的鲜地黄提取物 , 以及以中药鲜地黄或鲜地黄干片为原料进行提取的方法，利用该方法可以迅速、高收率地进行提取，在提取过程中不会发生长菌等不良现象，不会由此而导致收率的下降。

发明详细说明

本发明的鲜地黄提取物中含有有效成分水苏糖 55 % - 70重量％和棉籽糖 2.5 - 5重量％，可吸收的蔗糖和果糖总计为 5― 10重量％ (均以干品计算），其余为其他的糖和不可避免的杂质。

本发明的鲜地黄提取物是以天然中药鲜地黄或鲜地黄干片为原料，其提取方法由如下步骤组成：

( 1 )提取：取鲜地黄或鲜地黄干片加入可与水混溶的溶剂提取 2次, 合并 2次的提取液；

( 2 )脱色：在提取液中加入活性碳脱色，脱色后得到淡黄色或灰黄色液体；

( 3 )过滤：将脱色后的液体离心分离，然后使用砂芯过滤，减压抽滤后使用中空纤维过滤；

( 4 ) 浓缩冷藏：将上述得到的滤液减压浓缩，浓缩液冷藏保存； ( 5 ) 分离：将冷藏后的上清液采用下述四种方法之一进行分离，方法 1 : 将冷藏液进行活性碳柱层析，留取前 2/3的洗脱液；

方法 2 : 将冷藏液进行大孔吸附树脂柱层析，留取前 2/3的洗脱液；方法 3 : 将冷藏液进行 C18柱层析，留取前 2/3的洗脱液；

方法 4 : 将冷藏液用醇沉淀法沉淀，收集沉淀部分；

( 6 )配制：将由上述分离方法 1至 3中任意一种方法得到的前 2/3洗脱液减压浓缩，或将方法四的醇沉淀部分挥发至无醇味后加水调制成溶液。

上述步骤（ 1 ) 中使用的可与水混溶的溶剂优选采用浓度为 95 %以下的乙醇溶液。第 1次提取优选加入 10 - 20倍量的溶剂，第 2次提取优选加入 5 - 10倍量的溶剂，提取时间优选为 2 - 4小时（ 2次之和）。

上述步骤（ 2 ) 中使用的活性碳的量优选为相对于提取液的 0.15-5重量％, 脱色温度优选为 85 ― 95 *C。

上述步骤（ 3 )中进行的离心分离优选以 5000 - 20000转 /分的速度进行 5 - 10分钟，所用的砂芯的孔径优选为 10 - 15μ，所用的中空纤维的孔径优选为 0.15-0.20μ。

在上述步骤（ 4 ) 中优选将滤液减压浓缩至比重为 1.05 - 1.27 ( 25 V )，浓缩液优选冷藏保存 24 - 48小时。

在上述步骤（ 5 ) 的分离方法二中使用的大孔吸附树脂优选采用 ZTC - I型和 II型，在分离方法三中使用的 C18柱的粒度优选为 50 - 100μ。

在上述步骤（ 6 ) 中优选将洗脱液减压浓缩至比重为 1.05 - 1.45 (室温 25 ),将醇沉淀部分挥发至无醇味后加水制成的溶液的比重优选为 1.05 - 1.45 (室温 25 " ) 。利用本发明的提取方法，可以快速、高收率地从鲜地黄或鲜地黄干片中提取有效成分，可以避免以往的常用过滤方法中出现的长菌现象，由此可以避免作为有效成分的水苏糖及棉籽糖的分解，大大地提高了收率。

本发明的提取物可以制成口服液服用。此外，本发明的上述提取物还可以利用常用方法如冷冻干燥法或喷雾干燥法制成粉剂，或加入药理学上可接收的载体或赋形剂，制成任何一种常见的口服固体制剂，这些制剂例如可以举出粉剂、片剂、胶嚢剂、颗粒剂、散剂等。当然，任何一种本专业人员可以想到的制剂形式都包括在本发明的范围之内。本发明的提取物的口服剂型优选为口服液，口服液的制备方法是将上述提取液加水调制成含水苏糖和棉籽糖总计为 150 - 300毫克 /亳升的溶液，经灭菌后装瓶即得。

下面举出实施例及药理试验例，对本发明进行更详细的说明。

实施例

实施例 1

取鲜地黄 5000克，加入 20 %乙醇 15升，加热回流 2小时，过滤，滤液备用。过滤后的药渣再加 20 %乙醇 10升，加热回流 1小时，过滤，合并两次的滤液，回收乙醇至无醇味，将回收乙醇后的溶液加入 1重量％ (相对于溶液的重量）的活性碳脱色，温度为 85 得到淡黄色液体，再以 15000 转 /分离心 5分钟，上清液减压浓缩至比重为 1.20 ( 25 °C ) , 浓缩液冷藏 24小时，倾出上清液，进行活性碳柱层析，收集前 25000亳升，洗脱液减压浓缩至比重为 1.19 ( 25 "C ) , 浓缩液冷藏保存 24小时，倾出上清液，进一步浓缩至比重为 1.39 ( 25€ ) , 即得黄褐色鲜地黄浸膏 600克。

经高效液相色谱法分析，其中含有水苏糖 57.5 %、棉籽糖 3.6 %、蔗糖 4.2 %、果糖 3.6 % (均以干品计算）。

实施例 2

取鲜地黄干片（由鲜地黄切片后经烘烤制成） 1000克，加入水 15升，加热回流 1.5小时，过滤，滤液备用。过滤后的药渣再加水 10升，加热回流 1小时，过滤，合并两次的滤液。在滤液中加入 1.0重量％ (相对于滤液重量）的活性碳，于 95 °C下脱色，得淡黄色液体，以 10000转 /分离心 5 分钟，再将上清液以砂芯（ 15μ )过滤，再进行中空纤维过滤（ 0.2μ )，滤液减压浓缩至比重为 1.15 (室温 25 " ) , 浓缩液冷藏 48小时，倾出上清液，使用大孔吸附树脂（ ZTC - I型和 II型的混合物，上海试剂一厂生产）进行层析，收集前 20000毫升洗脱液，将洗脱液浓缩至比重 1.25 (室温 25 " ) ，即得黄褐色鲜地黄浸膏 650克。

经高效液相色谱法分析，其中含有水苏糖 52.3 %、棉籽糖 2.5 %、蔗糖 3.7 %、果糖 4.2 % (均以干品计算）。

实施例 3

取鲜地黄干片 1000克，加水 12升，加热回流 1.5小时，过滤，药渣再加水 10升，加热回流 1小时，合并两次滤液，滤液中加入 1.5重量％活性炭（相对于滤液重量），于 9(TC下脱色，得淡黄色液体，以 10000转 /分离心 5分钟，砂芯过滤（ 10 - 15μ ) , 中空纤维（ 0.15μ )过滤，滤液減压浓缩至比重 1.15 (室温 25 ) ,冷藏 48小时，倾出上清液，使用 C18 ( 50 ― 100μ )进行层析，用水洗脱，收集前 10000亳升洗脱液，将洗脱液浓缩至比重 1.25 ( 25 ) , 即得黄褐色鲜地黄流浸膏 700克。

经高效液相色傳法分析，该浸膏含有水苏糖 53 %、棉籽糖 2 %、蔗糖 2 %、果糖 3 % (均以干品计算）。

实施例 4

取鲜地黄 5000克，加 60 %乙醇 15升，加热回流 2小时，过滤，药渣再加入 60 %乙醇 15升，加热回流 1 。 5小时，过滤，合并两次提取液，减压回收乙醇至无醇味，调节提取液体积为 2000亳升，加入 3重量％活性炭（相对于滤液重量），于 90 °C下脱色，得淡黄色液体，以 10000转 /分离心 5分钟，砂芯（ 10 - 15μ )过滤，中空纤维（ 0.15μ )过滤，滤液减压浓缩至 1500亳升，于 80 1加热，加入 95 %乙醇，使含醇量达 90 % , 静置一夜，收集沉淀，干燥，得干浸膏 520克。

经高效液相色谱法分析，该浸膏含水苏糖 65 %、棉籽糖 3 %、蔗糖 2 %、果糖 4 % (均以干品计算）。制剂例 1

取由上述实施例 1得到的鲜地黄浸膏 1000克，加入 2200毫升的蒸馏水，调制成含水苏糖及梯籽糖总计为 200毫克 /亳升的溶液，灌入小瓶中，每瓶 10毫升，灭菌后密封即得口服液。

制剂例 1

取由上述实施例 2得到的鲜地黄浸膏 1000克，利用冷冻干燥机 (江苏冷冻干燥设备厂生产）进行冷冻干燥，得到浸膏粉 830克。

取上述得到的浸膏粉 100克，加入羧甲基纤维素 10克，混合，制粒，，制得含水苏糖为 45.5 %的颗粒剂。药理试验例

试验例 1、对双歧杆菌的体外增殖作用

(一）材料和方法

培养基：使用选择性促双歧杆菌生长的专用 ΧΥ培养基，主要含蛋白胨等两种营养成分，使双歧杆菌能在此培养基中生长而又不旺盛，以突出水苏糖的作用。在培养基中加入水苏糖纯品，使水苏糖浓度达到 1.5重量％ (相对于培养基的重量）。

将冷冻干燥菌抹经碎裂法开启后，接种于相应培养基中， 37 °C 48小时厌氧培养后，挑 3 - 4个菌落至相应的液体培养基中，再厌氧培养，取出作纯菌检查合格后，稀释 1000倍，取 10⁵ - 10⁶CFU/ml接种到含水苏糖的相应培养基中，作平板活菌计数记录各菌生长情况。试验重复 3次，并作统计学处理。

(二）试验结果

水苏糖在体外试验中促进肠道双歧杵菌菌种生长情况见表 1 。表 1 水苏糖促双歧杆菌生长情况（ CFU/ml以 LoglO计）

与空白培养基活菌数相比， *表示 PO.05; **表示 PO.01

结果表明水苏糖对长双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、角双歧杆菌、婴儿双歧杵菌都具有促生长作用，而对两歧双歧杵菌几乎无促进作用。

试验例 2、对小鼠体内双歧杆菌的增殖作用

(一）实验设备及材料

( 1 )动物：昆明种小白鼠，体重 18 ~ 20克，雌雄各半。

( 2 ) 药物：鲜地黄提取物。

( 3 )仪器：美国 VITEK - AMS 全自动细菌鉴定仪， AN1鉴定卡。

(二）实验方法与结果

将动物随机分为 4组，除空白组外，每只小鼠每日口服给药一次，剂量见表 2 , 连续给药一个月，于末次给药后 12小时，取小鼠粪便，即刻置于备好的厌氧瓶中。将定量的粪便标本用组织匀浆器匀盾，用 0.1 %琼脂蛋白胨水溶液连续 10倍稀释，制成 10 ^{_ 1} ~ 10— ^1(>悬浮液，用刻度滴管取各种稀释悬浮液接种于烘干的 Bib培养基表面，每个稀释度 3滴，并迅速将接种的平板置于厌氧环境中， 35 Γ培养 48小时，然后对 Bib培养基上的菌落根据形状、大小、外观、透明度、颜色、边缘以及是否溶血等特征进行分离、鉴定、计数。鉴定用美国 VITEK - AMS全自动细菌鉴定仪，鉴定卡为 AN1 , 通过 30种特定的生化反应计算出相似筛选值和标准化百分概率及生化数码，报告为 A.bifidobacterium的细菌经定量计算得出双歧杆菌的数量 (cfu/克），结果见表 2 。表 2 鲜地黄提取物对小鼠体内默歧杆菌的增殖作用

***Ρ<0·001 *Ρ<0.05

实验结果表明，连续给小鼠口服鲜地黄提取物一个月，可以非常有效地增加肠中双歧杆菌的数量，与空白对照组比， PO.001 , 有非常显著性差异。

试验例 3、对番泻叶引起急性腹泻的拮抗作用

(一 ) 实验材料

( 1 )动物：昆明种小白鼠，体重 20 ~ 22g , 雌雄皆可。

( 2 ) 药物：鲜地黄提取物。

(二）实验方法与结果

番泻叶 50g加入 5倍量的水，小火煮沸 10分钟，过滤，药渣中再加入 3倍量的水煮沸 10分钟，过滤》滤液减压浓缩至 lg/ml , 备用。

将小鼠按体重随机分成 4組，每曰灌胃给药一次，模型組给等体积生理盐水，连续给药三天，于末次给药前 30分钟，给各組小鼠按 20g/kg灌胃番泻叶煎剂，在给药后把小鼠单独放在垫有 12.5 X 23.0cm滤纸的笼内，每 1小时更换一次滤纸，观察 4小时，记录各时间内滤纸上的湿粪粒数, 检验比较組间各时间的累记腹泻次数，结果见表 1。表 3 鲜地黄提取物抗小鼠急性腹泻作用

与空白组比较 A P<0.01, A A A P<0.001

与模型组比较 *P<0.05， **P<0.01, ***P<0.001

实验结果表明鲜地黄提取物对番泻叶引起的急性腹泻有显箸的拮抗作用，经数理统计 PO.001 , 有非常显著性差异。

试验例 4、对盐酸林可霉素所致抗生素性肠炎及双歧杆菌减少保护作用

(一）实验材料

( 1 )动物：昆明种小鼠 50只，体重 18 - 20g , 雌雄均可。

( 2 ) 药物：鲜地黄提取物；盐酸林可霉素，批号： 9601152 , 江苏省新沂制药厂生产。

(二）实验方法与结果

将小鼠随机分为 4组，除空白组外，各组小鼠均口服盐酸林可霉素水溶液（浓度 100mg/ml ) 0.5ml/次， 2次 /日，口服 3天。鲜地黄提取物组按表中剂量给药，每日给药 1次，共给药 10天。于第 4天和第 10天给药后 1小时观察各组小鼠 2小时内的排便次数，结果见表 4。取第 10天的各組小鼠的粪便做双歧杆菌的培养，并记数，结果见表 5。表 4 各組小鼠排便次数比较（ X士 SD )

与空白组比较： A p<0.05 与模型组比较： *P<0.05， **P<0.01 表 5 各组小鼠粪便中双歧杵菌数的比较（ X士 SD )

与模型組比较： ***P<0.001，与空白组比较： A A A p<0.001

实验结果表明，鲜地黄提取物对林可霉素所致小鼠抗生素性肠炎有明显保护作用，给药第 4天记粪点数，大剂量组与模型組比较， P< 0.01 , 有非常显著性差异。给药 10天后粪点结果表明，各给药组小鼠肠炎症状已完全恢复。同时鲜地黄提取物对盐酸林可霉素引起的体内双歧杆菌减少有明显的增殖作用，达 2 3个数量级， P<0.01 。

Claims

1. 用于使双歧杵菌增殖的鲜地黄提取物，其中含有效成分水苏糖 55 ― 70重量％和棉籽糖 2.5― 5重量％, 可吸收的蔗糖和果糖总计为 5 - 10 重量％ (均以干品计算），其余为其他的糖和不可避免的杂质，该鲜地黄提取物使用鲜地黄或鲜地黄干片为原料，利用由如下步骤组成的方法制得：

( 1 )提取：取鲜地黄或权鲜地黄干片加入可与水混溶的溶剂提取 2次，合并 2次的提取液；

禾

( 3 )过滤：将脱色后的液体离心分离，然后使用砂芯过滤，使用中求

空纤维过滤；

( 4 ) 浓缩冷藏：将上述得到的滤液减压浓缩，浓缩液冷藏保存；

( 5 )分离：将冷藏后的上清液采用下列方法之一进行分离，

方法 1 : 将冷藏液进行活性碳柱层析，留取前 2/3的洗脱液；

方法 2 : 将冷液进行大孔吸附树脂柱层析，留取前 2/3的洗脱液；方法 3 : 将冷藏液进行 C18柱层析，留取前 2/3的洗脱液；

方法 4 : 将冷藏液用醇沉淀法沉淀，收集沉淀部分；

( 6 ) 配制：将由上述分离方法 1至 3中任意一种方法得到的前 2/3 的洗脱液减压浓缩，或将分离方法 4得到的醇沉淀部分挥发至无醇味后加水调制成溶液。

2.如权利要求 1所述的鲜地黄提取物，其中

步骤 ( 1 ) 中使用的可与水混溶的溶剂为浓度 95 %以下的乙醇溶液，第 1次提取加入 10― 20倍量的溶剂，第 2次提取加入 5 - 10倍量的溶剂, 提取时间为 2 - 4小时（ 2次之和）；

步骤（ 2 ) 中使用的活性碳的量为相对于提取液的 0.15 - 5重量％，脱色温度为 85 - 95 * ;

步驟（ 3 ) 中进行的离心分离以 5000 - 20000转 /分的速度进行 5 - 10分钟，所用的砂芯的孔径为 10 一 15μ，所用的中空纤维的孔径为 0.15μ ;

在步骤（ 4 ) 中将滤液减压浓缩至比重为 1.05 - 1.27 ( 25 ) , 浓缩液冷藏保存 24 - 48小时；在上述步骤（ 5 ) 的分离方法 2中使用的大孔吸附树脂采用 ZTC - I 型和 II型，在分离方法 3中使用的 C18柱的粒度为 50 - 100μ ;

在上述步骤（ 6 )中将洗脱液减压浓缩至比重为 1.05― 1.45 (室温 25 。C ) , 将醇沉淀部分挥发至无醇味后加水制成比重为 1.05 一 1.45 (室温 25

°C ) 的溶液。

3.从鲜地黄或鲜地黄干片中提取含有水苏糖和棉籽糖作为主要成分的提取物的方法，其特征在于由如下步骤组成：

( 3 )过滤：将脱色后的液体离心分离，然后使用砂芯过滤，使用中空纤维过滤；

( 5 )分离：将冷藏后的上清液采用下列方法之一进行分离，

方法 1 : 将冷藏液进行活性碳柱层析，留取前 2/3的洗脱液；

方法 4 : 将冷藏液用醇沉淀法沉淀，收集沉淀部分；

4.如权利要求 3所述的从鲜地黄或鲜地黄千片中提取含有水苏糖和棉籽糖作为主要成分的提取物的方法，其中

步骤（ 1 ) 中使用的可与水混溶的溶剂为浓度 95 %以下的乙醇溶液，第 1次提取加入 10 - 20倍量的溶剂，第 2次提取加入 5 - 10倍量的溶剂，提取时间为 2 - 4小时（ 1次之和）；

步骤（ 2 ) 中使用的活性碳的量为相对于提取液的 0.15 - 5重量％, 脱色温度为 85 - 95

步骤（ 3 ) 中进行的离心分离以 5000 - 20000转 /分的速度进行 5 - 10分钟，所用的砂芯的孔径为 10 - 15μ ,所用的中空纤维的孔径为 0.15μ ;

在步骤（ 4 ) 中将滤液减压浓缩至比重为 1.05 - 1.27 ( 25 "C ) , 浓缩液冷藏保存 24 - 48小时；

在上述步骤（ 5 ) 的分离方法 2中使用的大孔吸附树脂采用 ZTC - I 型和 II型，在分离方法 3中使用的 C18柱的粒度为 50 - ΙΟΟμ ;

在上述步骤（ 6 )中将洗脱液减压浓缩至比重为 1.05 - 1.45 (室温 25 °C ) , 将醇沉淀部分挥发至无醇味后加水制成比重为 1.05 - 1.45 (室温 25 。C ) 的溶液。

5.—种用于促进肠道内双歧杵菌增殖的口服制剂，由权利要求 1中记载的鲜地黄提取物制成。

6.如权利要求 5所述的口服制剂，所说的口服制剂是口服液、颗粒剂、胶嚢剂、片剂、散剂或粉剂。

7.如权利要求 5所述的口服制剂，用于治疗腹泻、便秘、肠道内菌群失调、消化功能紊乱等胃肠道疾病。