CN1241944A - 具有抗病毒活性的鼠尾草种类的提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了鼠尾草种类的提取物,主要由从pH≤3的鼠尾草水溶液中沉淀出来的馏分组成的,该沉淀物具有这样的特性,即几乎全部溶于pH为6的水溶液中,具有在大约pH4时开始容易观察到的溶解性,该提取物的分子量为≤3500道尔顿。本发明的优选实施方案提供了分子量为≤1000道尔顿的活性剂。
Description
本发明涉及在远东发现的鼠尾草属植物的提取物抑制病毒复制的用途。
在传统中医里丹参早已用来治疗心血管疾病和肝病。这些植物含有好几种能够被提取出来的组份。根的组份是开始用95％的乙醇提取，接着用冷水或热水萃取。用水萃取的馏分已经显示出抗病毒活性并且也已经显示出对动物的最小毒性。
逆转录病毒具有逆转遗传信息从基因组DNA向mRNA正常流动的能力。尽管逆转录病毒来自清楚限定的并相对一致的病毒属，但是在历史上又主要以感染的病理结果为依据，把它们分成三个分类组。肿瘤病毒亚型包括具有在感染的宿主中能够引起肿瘤疾病的能力的病毒以及几种相关的还显示为良性的病毒。慢病毒会引起迟缓的慢性疾病，这些慢性疾病尽管不常是，但一般缺乏肿瘤组份。泡沫病毒亚型的成员会在组织培养物中引起显著的泡沫样细胞病变作用。还不清楚它们与人或动物的哪一种疾病相关。
逆转录病毒的复制起始于病毒颗粒核的胞质内穿透，通过病毒包膜糖蛋白与专一细胞表面受体的专一相互作用来实现这一过程。随后，与病毒颗粒相关的依赖于RNA的DNA聚合酶把单股RNA基因组转录到双股线性DNA原病毒中间体上(逆转录)。整合蛋白(整合酶)能够特异性地识别病毒DNA的两端并从3’-端(3’-供体过程)去除两个核苷酸。然后把处理过的病毒DNA和整合酶迁移到核上，在此，病毒整合酶把逆转录病毒基因组共价连接到宿主染色体的DNA(股转移)，从而形成逆转录原病毒。
人免疫缺陷病毒型(HIV)的出现作为一种人的重要病理已经在逆转录病毒方面带来了对科学的挑战。特别是，科学证据表明上述简单的生命周期不是对这个病毒属所有成员的复制循环完整地精确描述。例如，除了特征性逆转录病毒Gag、Pol和Env外，HIV-1还编码六个以上基因产物，并且这些都是从新的一组单独拼接和多种拼接的病毒mRNA族中翻译的。这些额外蛋白中至少两种，称之为Tat和Rev，在直接调节HIV-1基因表达上起作用。所以，对MLV(鼠的白血病病毒)和HIV-1二者来说，穿透和原病毒整合之间的步骤似乎非常相似，尽管在后者中发现后整合过程是更加复杂的。最近，已经逐渐清楚HIV-1只不过是动物逆转录病毒(现称作为复杂的逆转录病毒)整个类中的一员。逆转录病毒属于复杂的逆转录病毒，它包括所有的慢病毒、泡沫病毒以及HTLV-1以及相关的病毒(表1)。表1：逆转录病毒的主要分类区种类 亚型 原型 其它例子简单逆 C-型逆转录 RSV ALV、ASV转录病毒 病毒组A
C-型逆转录 MLV FeLV、MSV、
病毒组B SNV、REV、SSV
B-型逆转录 MMTV
病毒
D-型逆转录 MPMV SRV-1
病毒复杂逆 慢病毒 HIV-1 HIV-2、SIV、绵转录病毒 羊髓鞘脱落病
毒、FIV
T-细胞白血 HTLV-1 EIAV HTLV-II、
病病毒 STLV、BLV
泡沫病毒 HSRV SFV、BFV缩写：RSV，劳斯肉瘤病毒；ALV，鸟白血病病毒；ASV，鸟肉瘤病毒；FeLV，猫白血病病毒；MSV，鼠肉瘤病毒；SNV，脾坏死病毒；REV，网状内皮组织增殖病毒；SSV，猿肉瘤病毒；MMTV，鼠***肿瘤病毒；MPMV，Mason-Pfizer猴病毒；SRV-1，猿逆转录病毒1型；STLV，猿T-细胞白血病病毒；BFV，牛泡沫病毒。
作为人的病理的HIV-1的重要性已使人们对慢病毒复制和基因调整的研究成为主要焦点。确实，可以把HIV-1看作不仅是慢病毒亚型的原型而且是更广泛地说是一般复杂逆转录病毒的原型。
就开发抗病毒药物来说，抑制逆转录病毒生命周期(逆转录酶、蛋白酶和整合酶)成为最有吸引力的目标。到目前为止，已经确定出许多已鉴别并通过FDA许可进入市场的化合物，对HIV来说，它们仅仅是逆转录酶和蛋白酶的抑制剂。
近期的研究已经证实抗逆转录酶(RT)和蛋白酶的结合治疗能够消除T淋巴细胞中的许多HIV病毒。遗憾的是，即使在这些药物存在下，仍有少部分残留的病毒变异并继续繁殖。高增殖率、病毒序列的变异和病毒数量的快速翻倍是逆转录病毒的典型特性。对HIV-1来说，这些特性甚至更令人担心。
尽管在研究HIV的分子机理方面已经有了显著性进步，但是当前抗-HIV的化疗法具有许多缺点，包括毒性作用和在相对短的治疗期后诱导有抵抗性的病毒菌株。所以，这些药物缺乏完全治疗或预防HIV-感染所必需的长期效果。
当前所用的具有复杂化学分子的逆转录酶和蛋白酶的抑制剂都是极其昂贵的。目前的调查表明典型的HIV-1阳性患者无论在何地每年都需花费12,000-20,000美元。感染HIV的患者有90％的人处在发展中国家，所以，即使这些患者中的大多数在发达国家，也不可能得到这些药剂。因此，很显然必需寻找更经济更可行的方法。
本发明提供了具有抗病毒活性的鼠尾草属的提取物来替代目前已知和所用的病毒抑制剂。本发明提供了鼠尾草种类的提取物，该提取物主要由从pH≤3的鼠尾草水溶液中沉淀出来的馏分所组成，该沉淀物具有这样的特性，它几乎完全溶于pH为6的水溶液中，具有在大约pH为4时开始容易观察到的溶解性，该提取物具有≤3500道尔顿的分子量。本发明的一种优选方案提供了分子量为≤1000道尔顿的活性剂。本说明书也首次报道了云南鼠尾草的水溶性提取物可用于治疗逆转录病毒的感染。在此使用丹参(SM)和云南鼠尾草(SY)来举例说明本发明。该活性分离物是在pH≤3的条件下从鼠尾草种类的水溶液中沉淀出来的。该沉淀物大约在pH4开始溶解，在PH≥6完全溶解并且pI大约是6.5。最具有活性的馏分具有≤1000道尔顿的分子量，这正如通过透析和通过电动喷雾离子化质谱所测定的。质谱数据测得该组份具有原子质子单位大约如下：79.8、110.0、136.1、180.1、198.4、296.2、494.3和984.1。本发明的药物可以与药学上可接受的载体一起全身或口服给药。
本发明使用了一种方法来制备来自植物提取物的药物。这些活性剂能够对逆转录病毒生命周期中的重要步骤逆转录病毒的整合和复制进行抑制。对简单和复杂的逆转录病毒二者来说，在原病毒整合中所包括的步骤似乎非常相似。到目前已研究的所有类型或组的逆转录病毒整合酶和逆转录酶(RT)中在结构和功能特性上发现存在显著的相似性。由于这种机理的共同性，聚合酶、病毒整合酶和/或RT的抑制剂将抑制较宽范围的生物如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫白血病病毒(FeLV)、鼠白血病病毒(MuLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、人T-细胞白血病病毒(HTLV)。本发明活性剂也可以用作其它病毒复制蛋白如逆转录酶、聚合酶和类整合蛋白的抑制剂。除了这些逆转录病毒，本发明的活性剂可以用作抗能够产生致命聚合酶和较大的T-抗原(参与把病毒DNA整合到宿主染色体中的蛋白)蛋白如肝炎的成因剂(包括肝炎B病毒(HBV))和人的***瘤病毒的抑制剂。SM和SY提取物的制备：
制备SM和SY的植物提取物。通过下列步骤得到植物提取物的各中馏分(见流程图1)：
开始用水洗涤所选植物的根来除去从收获的植物中保留的残余碎屑。把根干燥，然后切成小片。向干燥过的根的切片中加入10倍多(v∶v)的Mili-Q dH2O(18mOhm/cm)并且将根在98-100℃下煮沸4小时。然后把混合物通过50μm过滤器过滤。在50℃和720mmHg把过滤得到的提取液浓缩成最终密度为1.3g/ml最终产率大约是碎根总重的34％。
步骤1：用dH2O按1∶5稀释提取液，在25℃用GS-3旋转器以8,000rpm离心90分钟。去掉丸状物保留上清液。向该上清液中加入1/10体积的1.0N HCl溶液最终浓度为0.1N的HCl。在25℃把该产物培养过夜。在25℃用GS-3旋转器以8,000rpm把溶液离心90分钟并且用95％的乙醇洗涤所得到的丸状物然后用0.2μm的过滤***过滤。重复这一步骤直到洗涤液变清。然后在室温下过滤单位中干燥该丸状物接着在70℃的炉中干燥该丸状物过夜。以丸状物与水1∶5(w/w)的重量比把该粉状物悬浮在dH2O中。在25℃用Ti45旋转器以25,000rpm把所得到的产物离心30分钟；去掉上清液用95％的乙醇洗涤所得到的丸状物并使用0.2μm过滤***过滤并如上所述干燥。把该粉末定义为馏分I。该丸状物的产率大约是总碎根的0.5％。
步骤2：把馏分I悬浮在3％NH4OH溶液并在25℃用Ti45旋转器以25,000rpm离心30分钟。保留上清液并加入100％乙醇到最终的乙醇浓度为75％。在25℃培养过夜后，在25℃用Ti45旋转器以25,000rpm把该溶液离心30分钟。去掉上清液并用95％的乙醇洗涤该丸状物，过滤，并如上所述干燥。把该干燥丸状物定义为馏分II。
步骤3：把馏分I用77％的乙醇洗涤直到上清液变清。用0.2μm过滤***过滤该上清液(定义为馏分IV)。在70℃把不溶的丸状物通过过夜的培养干燥。把该干燥粉末定义为馏分III。
步骤4：在25℃搅拌下用dH2O把馏分III培养过夜。然后在25℃用Ti45旋转器以25,000rpm离心该溶液30分钟。通过在70℃过夜培养，干燥该丸状物。把该干燥的粉状物定义为馏分V。把上清液溶液定义为馏分VI。
步骤5：把馏分V用1/10体积的1.0N HCl溶液处理到最终浓度为0.1NHcl。在25℃把样品培养过夜，然后在25℃用Ti45旋转器以25,000rpm离心30分钟。把干燥的丸状物定义为馏分VII。把上清液定义为馏分VIII。
步骤6：用旋转蒸发器把馏分IV浓缩10倍。由于pH降低到了3以下，沉淀主要在pH2完成，所以去除乙醇并浓缩样品得到提取物的部分沉淀。用水把混合物稀释为1∶5(v/v)，然后在25℃用Ti45旋转器以25,000rpm离心30分钟。分别把干燥的丸状物和上清液定义为馏分IX和馏分X。
步骤7：用1/10体积的1.0N HCl溶液处理馏分X得到最终浓度为0.1NHCl，然后在25℃培养过夜。在25℃用GS-3旋转器以8,000rpm把溶液离心90分钟。分别把所得到的干燥丸状物和上清液定义为馏分XI和馏分XII。各种S.M.和S.Y.镏分的物理和化学特性1.pH依赖溶解度的测定
用酸得到的沉淀物包括表I所总结的大多数抗病毒活性组分。在该提取物的分离过程中，根据不同pH处理，可观察到不同的溶解度特性。为了精确评估各馏分依赖pH的溶解度特性，进行下列一系列的试验。实施例1：
把900微升馏分VI的样品(3.6mg/ml)放入到15个Eppendorf试管中的每只中，向其中加入100μl适当浓度的HCl和NaOH使得溶液的pH为1到7。在微型离心管中混合该溶液并在4℃以14,000rpm离心30分钟。从每只试管中去除上清液。按1∶10稀释各pH浓度的溶解馏分之后，通过加入850μl50mM NH4OH稀释150μl等分液。把不溶馏分溶于1ml 50mM NH4OH，然后通过向每个150μl馏分加入850μl50mM NH4OH来稀释。对1ml各pH溶解或不溶解的馏分进行200到500nm的吸收扫描。测定在每个溶液在280nm的峰吸收值。结果表明馏分VI包括这样的产物，该产物在大约pH4开始沉淀并且在pH2或更低(在pH2.75，50％产物从溶液中沉淀)完全沉淀。实施例2：
为了测定乙醇对溶解度的作用，用含有或不含25％乙醇的具有pH1到14的一系列溶液重复试验。如上所述，把pH溶液离心，去除上清液，系列稀释并对每种可溶馏分进行200到500nm的吸收扫描。对每种溶液测定在280nm处的峰吸收值。结果表明在pH低于3的pH溶液中乙醇增加了所要产物的溶解度两倍，(发现是一种很好的活性剂，下文称之为“AA”)。在25％乙醇的存在下，该植物提取物在所有pH范围都显示了较高的溶解度。实施例3：
为了测定馏分VI、馏分VII和馏分VIII之间依赖pH的不同溶解度，把等量的各馏分干燥并称重装入7个Eppendorf试管。向这些试管中加入0.2M从pH2.2到8.0的磷酸盐-柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液。把溶液混合5分钟，然后在4℃以14,000rpm离心30分钟。去除上清液，用相同pH缓冲液系列稀释1.5到1000倍，并且从200到500nm扫描吸收。用完全依赖pH的馏分吸收扫描在280nm的吸收值对pH的函数显示出各馏分具有依赖pH的溶解度。结果证实各馏分具有不同的依赖pH的可溶性成份。馏分VI在pH3开始溶解，在pH5溶解了大约50％并且在pH6完全溶解。馏分VII在pH5.0以下是不溶的，但在pH7时完全溶解。馏分VIII在pH2.0和8.0之间保持溶解。活性馏分的表观分子量组份的测定a)透析：
如流程图2所示，把两种馏分，馏分II和馏分IV经过三种不同分子截断10,000、3,500和1,000的透析膜透析。
实施例4：
把溶于0.1％(v/v)NH4OH溶液中的馏分II放在分子量截断为10,000的膜中并用2升0.1％NH4OH溶液透析过夜。把留在透析袋中的溶液定义为馏分XIII并把透析出的溶液定义为馏分XIV。
通过旋转蒸发器把馏分XIV浓缩到100ml并放入分子量截断为3,500的膜中。把该馏分用2升0.1％(v/v)NH4OH溶液透析过夜。把留在透析袋中的溶液定义为馏分XV并把从该袋中透析出的溶液定义为馏分XVI。
通过旋转蒸发器把馏分XVI浓缩到100ml并放入分子量截断为1,000的膜中。把该馏分用2升0.1％(v/v)NH4OH溶液透析过夜。分别把所得道的非透析的和透析出来的溶液定义为馏分XVII和馏分XVIII。实施例5：
把溶于77％乙醇溶液(v/v)的馏分IV用6升77％的乙醇溶液(v/v)透析过夜。如流程图2和实施例1所述馏分XIX、XXI和XXIII分别不能透析过10,000、3,500和1,000的分子量截断膜。馏分XX、XXII和XXIV分别都能透析过10,000、3,500和1,000的分子量截断膜。
表2(如下)中总结了上述馏分体外HIV-1整合酶测定的结果。电动喷射离子化质谱：
用阳性和阴性的电动喷射离子化质谱分析1,000分子量可透析的馏分和3,500分子量可透析的/1,000分子量不能透析的馏分。对两种馏分来说下列原子质子单位重量是共同的：79.8±5，110.1±5，136.1±5，198.4±5，296.2±5，494.3±5和984.1±5。c.S.M.和S.Y.提取物的生物特性
本发明的目的是提供纯化鼠尾草属植物的水溶性提取物的活性馏分方法来获得抑制整合酶活性和作为抗病毒剂的那些馏分。对抗病毒的两种要求是在药物的低浓度时的有效性和安全性。下列部分证实了馏分I的效果和安全性。1.病毒抑制的效果
体外HIV-1整合酶测定：如下所述进行监控HIV-1整合酶活性的体外测定。这些测定使用了纯化的重组HIV整合酶和寡核苷酸底物，该底物与病毒DNA的LTR末端相对应。这些测定反映出在体内发生的实际功能状况。荧光测定(Lee等，(1995)分析生物化学227，295-301)和放射性测定都改进了以前公开的体外测定(Lee等，(1995)生物化学34，10205-10214；Lee等，(1995)生物化学34，10215-10223)。酶制备方法的改良已经改善了HIV-1整合酶样品的功能特性(Lee和Han(1996)生物化学35，3837-3844；Lee等(1997)生物化学)。在测定和样品制备中的这些改良提供了更好反应体内出现状况的体外测定。所以，当寻找潜在的整合酶抑制剂时，体外测定的结果是非常有用的病毒感染活性的预言。
在评估各种提取物馏分在抑制HIV-1整合酶活性的活性时，首先把提取物馏分溶于适当体积的0.1％NH4OH(w/v)来使得最终浓度为每每ml含15mg馏分。然后把这些样品以10,000rpm离心30分钟。如果形成丸状物，则除去上清液，将上清液干燥然后再溶于0.1％NH4OH。所得到的溶液是该提取物馏分的储备溶液。从这些储备液中，制备下列稀释液：1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1；700、1∶800、1∶900、1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000和1∶10,000。向每个反应混合物中加入1μl各种稀释液(总体积20μ1)，相应地最终浓度分别为75、15、7.5、3.75、2.5、1.875、1.5、1.25、1.07、0.9375、0.833、0.75、0.375、0.25、0.1875、0.15、0.075μg/ml然后如前所述进行测定(Lee等，(1995)生物化学34，10215-10214；Lee等，(1995)生物化学34，10215-10223；Lee和Han(1996)生物化学35，3837-3844)。
为了测定各馏分的IC50和IC90，把凝胶暴露给磷光图像筛选仪并通过分子动态磷光图像仪来测定裂解的百分数。抑制％率是通过阳性对照的％裂解率减去各馏分的裂解率并把所得到的数值再除以阳性对照的％裂解率来测定的。将这些值对浓度作图从而测定IC50和IC90。比较馏分I(起始物质)、馏分XVII(透析)和馏分VIII(从酸沉淀的上清液)的活性。馏分VIII具有很低的活性而馏分XVII显示出超过起始物质(馏分I)总活性的改进。下表中总结了从所有其它馏分中得到的IC50和IC90的数值：表2：从流程图1中得到的各种SY和SM馏分体外抗HIV-1整合酶活性的抑制活性。
表3：从流程图2中得到的各种SY馏分体外抗HIV-1整合酶活性的抑制活性。
| SM馏分 | IC50(μg/ml) | IC90(μg/ml) |
| I | 2.8 | 3.5 |
| III | 2.1 | 4.0 |
| SY馏分 | ||
| I | 1.2 | 2.5 |
| II | 1.2 | 2.5 |
| III | 1.9 | 2.5 |
| IV | 1.9 | 2.5 |
| V | 1.9 | 2.8 |
| VI | 1.8 | 5.0 |
| VII | 1.2 | 2.5 |
| VIII | 8.0 | 15.0 |
| IX | 2.5 | 7.0 |
| X | N.D. | N.D. |
| XI | 0.9 | 3.5 |
| XII | 4.0 | 8.0 |
| 馏分 | IC50(μg/ml) | IC90(μg/ml) |
| XIII | 1.9 | 4.0 |
| XIV | ||
| XV | 1.4 | 3.1 |
| XVI | ||
| XVII | 0.85 | 1.6 |
| XVIII | 2.2 | 5.0 |
| XIX | ||
| XX | ||
| XXI | 2.4 | 4.0 |
| XXII | 2.4 | 7.0 |
| XXIII | 1.5 | 4.0 |
| XXIV | 1.5 | 4.0 |
这些数据表明具有最大抑制活性的馏分是从酸沉淀过程中得到的那些沉淀物。重复酸沉淀然后用碱溶解并透析后能够改善馏分的抗整合活性，这是因为这些步骤连续除去了非活性化合物。来自沉淀已经形成的低pH溶液的上清液显示了最小的活性。此外，用分子量截断为1000的膜透析表明从酸沉淀的可透析和非透析的馏分都具有活性。
尽管可能期望非透析的馏分将不含分子量小于1000道尔顿的分子，但是该馏分的质谱显示该馏分含有小于1000道尔顿的分子。对此的解释可能是用77％的乙醇进行的透析，该乙醇使得孔径变小，从而使得透析成为依赖时间的过程。但是，这不能排除一种说法，即最大抑制性分子小于1000道尔顿，因为可透析的馏分也具有抑制活性。
b.)体内逆转录的测定：
把来自体外整合酶测定中相同的馏分VII的稀释液用来测定抗Moloney鼠白血病病毒(MMLV)RNaseH’逆转录酶(Gibco BRL)的功效。该测定是基于逆转录酶从多rA-RNA模板合成多dT-DNA并且在RNA/DNA的杂交双螺旋的信息中掺入(3H)dTTP。该步骤见A1dovini和Walker编辑的出版物(HIV研究的技术(1990)第98页)。使用每50μl反应中10个单位的逆转录酶，可定量所掺入并结合到玻璃过滤器的(3H)dTTP量。测定三份馏分VII稀释液的并证实IC90和IC50分别为28和1.7μg/ml。MMLV逆转录酶的IC50与HIV-1整合酶的IC50相当，但是IC90大约是10倍多。这些结果表明馏分VII的活性馏分包括抗逆转录酶的活性，尽管该部分抑制转录酶与抑制整合酶不是同样有效的。此外，用逆转录酶测定法来测定HIV-1 RT(BoehringerMannheim)。这种测定表明IC90和IC50分别为52μg/ml和12μg/ml。
c.)体内FIV的模型：
对研究用于抗HIV感染的药物来说，猫的免疫缺乏性病毒(FIV)模型是一种可接收的动物模型。FIV是从猫中分离出来的一种T细胞-营养慢病毒。FIV在生物学方面和生物化学方面都与HIV相似，在FIV和HIV整合酶之间具有高的相同之处。用FIV感染的猫发展为猫可获得的免疫缺乏症(FAIDS)，这与人的AIDS相似。
体外细胞中的FIV模型：
Crandell-Reese猫肾(CrFK)细胞系是容易受FIV感染的并且支持病毒的复制。对产生病毒并测定FIV感染来说，CrFK细胞是有效的方法。尽管FIV不是FIV感染的CrFK细胞的细胞病理，但是诊断方法可用于筛选组织培养物中的FIV感染。研究已经证实S.Y.的馏分I具有预防FIV感染的效果。
ED90和ED50的测定：
S.Y.的馏分I能够保护CrFK细胞不受FIV的感染。以1×105个细胞/T25***密度把CrFK细胞进行涂布，共3份。为了细胞附着和生长而进行24小时培养后，把馏分I的溶液涂到细胞培养基上24小时。该溶液的制备是以100mg/ml的浓度把馏分I溶于dH2O中。然后在25℃用Ti45旋转器以25,000rpm把样品离心30分钟。取出上清液并在真空炉离心来干燥三份(每份1ml)以测定该溶液的浓度。还用dH2O或DMEM把馏分I稀释到2mg/ml，通过0.2μm乙酸纤维素过滤器过滤，并且通过测定与称过皮重的对照组相比的干燥溶解物的质量来测定浓度。用含有10％胎牛血清的DMEM补足单个馏分I的浓度并加到细胞培养基中。
在馏分I存在下把细胞培养24小时后，用FIVp26捕获测定法(IDEXX***，Inc.FIV PET CHEK)将感染有FIV-AZR-1(AZT拮抗菌株)的CrFK细胞的培养液用于测定FIV的相对滴定度。把FIV稀释到630nm吸收值为0.2。把1毫升FIV涂敷到培养基1小时，接着除去病毒的浮在表面的液体层并再使用各种浓度的馏分I。在第3天用不同浓度的馏分I改变该细胞培养基。在第6天，用FIV p26捕获测定法测定0.2ml的细胞培养基中FIV存在。该FIV p26-捕获测定法使用了两种不同的抗FIV的单克隆抗体，其中一个固定在能够捕获FIV的96-孔平皿的孔中并且另一个单克隆抗体与辣根过氧化酶(HRPO)接合。在底物(过氧化氢和TMB，发色团)存在下，抗-FIV p26-HRPO单克隆抗体产生的色彩信号与存在于培养基FIV p26中抗原的量成正比。用96孔平皿读数器读取色彩信号在630nm处的吸收值。浓度高到100μg/ml的馏分I不干扰FIV p26的捕获测定法。
在该试验中，馏分I在预防CrFK细胞FIV感染中显示出ED90为5.0μg/ml并且ED50为2.5μg/ml。该试验表明馏分I在预防FIV感染中是有效的。
处理时间-过程的测定：
为了测定治疗暴露于FIV细胞所需的时间，进行下列两种研究。在第一个研究中，以1×105个细胞/T25把细胞放在平皿上24小时。一组(-24小时)在FIV感染之前，用50μg/ml馏分I处理。一小时后，用FIV-AZR-1感染各组。感染后1、24、36、48、60和72小时，给各组使用50μg/ml馏分I。一组不用馏分I处理。在FIV感染后第3天改变所有组的培养基，感染七天后测定在培养基中FIV的存在。
在感染前、感染后1小时和24小时用馏分I处理CrFK细胞能够完全保护该细胞不受FIV的感染。36小时后处理会造成少量百分比的细胞被感染，但是馏分I的存在能够预防其余的培养物不受感染。这种趋向在48、60和72小时的读数将会持续被看到。72小时后，抑制的FIV最高达50％。这些结果表明在开始暴露给病毒时，使用馏分I能够保护并减少FIV的感染程度。
在第二个研究中，如上所述把CrFK细胞植于平皿上，但是除了未处理的对照组外将全部细胞用50μg/ml馏分I处理24小时。在馏分I存在下把细胞培养24小时后，用FIV-AZR-1感染细胞1小时，然后再用馏分I处理。在感染后24、48和72小时后，把常规培养基用于该细胞培养物。感染5天后，测定该细胞培养物培养基中的FIV。在FIV感染后24小时短的时间把细胞暴露给馏分I能够保护细胞不受感染。这些结果表明去除馏分I不会去掉抗FIV感染的保护。在FIV感染后24小时短的时间把细胞暴露给馏分I能够保护细胞不受感染。因此，在该研究表明保护不受感染的窗口存在于感染前到暴露后24小时。这种结果表明馏分I可作为逆转录病毒的抑制剂。它的治疗益处是因为抑制了从感染细胞所释放的病毒以不感染没被感染的细胞从而当感染的细胞死去时其它细胞不被感染。由此干扰了感染的繁殖并且病毒的量减少。
c.)细胞培养物的毒理学：
为了测定细胞培养物中馏分I的毒性，进行下列两种毒性研究。首先，通过计算融合的CrFK细胞培养基上细胞死亡的百分化来测定馏分I的毒性。其次，通过对CrFK细胞生长的抑制来测定馏分I的毒性。
LD90和LD50的测定：
为了测定馏分I对融合的CrFK细胞的90％和50％的致死量，把1×106个细胞植于每只T25烧瓶。培养48小时后，用含有10％FBS的DMEM制备浓度为1.6、1.2、1.0、0.8、0.4、0.2、0.1和0mg/ml的馏分I的溶液并用于三份培养物中。在馏分I存在下培养该细胞72小时后，用台盼蓝排除测定法测定每组存活的细胞数。把CrFK细胞用胰酶消化并用0.4％的台盼蓝稀释成1∶1。用血细胞计数器计算细胞数来测定细胞的数目，该试验表明馏分I的LD90和LD50分别为1.6mg/ml和0.8mg/ml。治疗指数(LD50/ED50)的范围为320。
IC50的测定：为了测定馏分I对90％和50％的生长抑制剂量，以每只T25烧瓶1×105个细胞把CrFK细胞植于平皿上。24小时后，用含有10％FBS的DMEM制备浓度为0.8、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.08、0.05、0.04、0.03、0.02和0mg/ml的馏分I的溶液并用于各三份培养物中。在第3条和第6天改变培养基并如上所述用台盼蓝排除测定法测定每组存活的细胞数。在该测定中，0.4mg/ml的剂量抑制了90％CrFK细胞的生长而0.2mg/ml的剂量抑制了50％CrFK细胞的生长。
d.体内毒理学：为了测定馏分I在体内模型的急性毒性，用口腔管饲法对10只年轻的雌性Balb/C鼠给药600mg/kg馏分I 28天。10只小鼠中的8只存活并且没有任何发病的迹象。尸检表明两只死于把馏分I通过口腔管饲法给予小鼠中的人工技术失误。
试验的结果证实在器官或血液中没有毒性的迹象。获取在试验期间存活的8只小鼠的器官样本并对其分析(Vet Research Inc.)。在大脑、甲状腺、气管、胸腺、胰腺、骨骼肌、尿膀胱、宫颈、***、肾脏、脾脏、心脏、肺、肝脏、肾上腺、肾脏、子宫、***、鏻状和含腺胃、小肠和大肠、食管、皮肤、卵巢或脂肪的切片中没发现毒性的显微证据。此外，对完成试验后小鼠的血液进行血液的化学分析。表4列出了大多数血液组份是在正常范围。表4.标准血液的化学值和试验值。
| 试验组份 | 高-低的值 | 平均值和标准差 | 数值 |
| 葡萄糖(mg/dl) | 124-250 | 185±75 | 正常 |
| 肌酸(mg/dl) | 0.21-0.66 | 0.71±0.21 | 高 |
| 总蛋白(g/dl) | 3.95-6.21 | 4.6±0.44 | 正常 |
| 白蛋白 | 2.85-4.58 | 3.11±0.23 | 正常 |
| (g/dl) | |||
| 总胆红素(mg/dl) | 0.04-0.74 | 0.19±0.09 | 正常 |
| 钙(mg/dl) | 8.2-12.6 | 8.8±0.37 | 低于正常 |
| 无机磷(mg/dl) | 6.0-10.0 | 10.45±7.3 | 高 |
| 碱性磷酶(IU/L) | 45-175 | 51.4±32.5 | 低于正常 |
| ALT(GPT)(IU/L) | 24-77 | 27.4±10.0 | 低于正常 |
| AST(GOT)(IU/L) | 53-269 | 162.8±110.5 | 正常 |
| 钠(mEq/L) | 115-189 | 147.6±3.7 | 正常 |
| 钾(mEq/L) | 5.1-10.4 | 7.8±2.4 | 正常 |
| 氯(mEq/L) | 82-114 | 117±5.3 | 高 |
其它大量试验评价了鼠模型中馏分I的急性毒性。有计划地评估长期暴露于大于馏分I浓度的对数差异的潜在危险/副作用。该试验是由下列8组每组12个Balb/c小鼠组成：
组 性别 处理
1 雌性 水
2 雌性 500mg/kg
3 雌性 100mg/kg
4 雌性 25mg/kg
5 雄性 水
6 雄性 500mg/kg
7 雄性 100mg/kg
8 雄性 25mg/kg
在盲性试验中，用手工控制的口腔管饲法以每天500、100和25mg/kg动物重量把馏分I对8组(每组)12只Balb/C小鼠给药。每周从小组(4只小鼠)中收集血样并汇集在一起进行血液化学分析。28天后，把小鼠麻醉并通过心脏穿刺来放血。收集单个小鼠的血液来进行有差异的全血血细胞计数和SMAC24的生物化学血浆分析。取组织样本来进行组织病理学观察和评估。对血液或组织样本的分析没有发现毒性证据。
本发明的组合物可以与药学上可接受的载体给药。应当把该组合物以足够的剂量给药从而得到含有提取物中≤3500道尔顿分子作活性剂的10hM到1000nM血液浓度。当组合物包括大分子提取物时，给予能够达到最高10000nM血液浓度的剂量是必要的。一般，SY的提取物需要约1/5的SM提取物的剂量。当使用SY提取物时，血液浓度低到1nM也是足够的。
本发明的组合物可以通过口服、全身或局部给药。口服的组合物可以以液体形式或片剂或胶囊形式给药。对于胃肠外给药来说，可以使用载体如盐水、葡萄糖、磷酸盐缓冲盐水等。对于中枢神经***给药来说，可以把该组合物给入脑脊液中。对于鞘内给药来说，胃肠外给药的载体，尤其是如葡萄糖水或盐水的载体是适宜的。也可以把组合物制备成脂质体来提高穿过膜屏障的转运。当然，胃肠外使用的组合物包括静脉内、肌肉内、皮下或鞘内给药的组合物将都是用无菌溶液形式提供的。
对于局部使用来说，该组合物可以在固体支持物如纱布或海绵上给药。例如，可以把这种固体支持物***到***或直肠来提供治疗。本发明的活性剂也可以涂到避孕套来提高抗感染的保护性。该组合物也可以制备成洗剂或软膏来局部使用。例如，可以栓剂、灌肠剂或冲洗剂的形式把活性剂用于***或直肠。
当本发明的活性剂包括从pH≤3的鼠尾草属的水溶液中沉淀并再溶于pH4-6的所有部分时，以前从未报导过的具有抗逆转录病毒活性的云南鼠尾草的所有提取物也包括在本发明中，所有已发现的该提取物出人意料地是具有意外的较高活性。
组合物可以作为雾来鼻内给药。本发明的组合物也可以以凝胶剂或洗剂的形式局部给药。
也可以把活性部分冷冻干燥并放于小瓶内。然后把冷冻干燥物溶解来提供剂型。此外，也可以把冷冻干燥物直接喷鼻来鼻部给药。
本发明的活性剂也可以以饮料或食品的形式给予。例如，把该提取物放于猫的饲料中来治疗或预防猫的白血病病毒。
Claims (19)
1、云南鼠尾草的水溶性提取物。
2、组合物，其含有作为活性剂的权利要求1的水溶性提取物及药学上可接受的载体。
3、组合物，其含有抗病毒有效量的鼠尾草属的提取物及药用载体，该提取物是从pH≤3的水溶液中沉淀得到的，该沉淀物具有这样的特性即几乎全溶于pH≤6的水溶液，该活性剂的分子量为≤3500道尔顿。
4、权利要求3所述的组合物为胶囊或片剂。
5、权利要求3所述的组合物为无菌溶液。
6、权利要求3所述的组合物为在固体支持物上的形式。
7、一种治疗或预防由借助聚合酶、反转录酶、整合酶或类整合酶的活性复制的病毒引起的病毒感染的方法，它包括给病毒感染的或经受病毒感染的哺乳动物服用抑制病毒有效剂量的权利要求3的组合物。
8、一种治疗或预防由病毒引起的病毒感染的方法，它包括给病毒感染的或经受病毒感染的哺乳动物服用抑制病毒有效剂量的权利要求2的组合物。
9、权利要求2的组合物，其中活性剂是由≤1000道尔顿的分子组成。
10、权利要求3的组合物，其中活性剂是由≤1000道尔顿的分子组成。
11、鼠尾草种类的提取物，它主要是由从pH≤3的鼠尾草水溶液中沉淀的馏分组成，该沉淀物具有这样的特性即可以溶于pH≤6的水溶液，分子量为≤3500道尔顿。
12、权利要求11的提取物，分子量为≤1000道尔顿。
13、权利要求7的方法，其中感染是通过逆转录病毒引起的。
14、权利要求8的方法，其中感染是通过逆转录病毒引起的。
15、权利要求7的方法，其中组合物是通过鼻给药的。
16、权利要求7的方法，其中组合物是通过口给药的。
17、权利要求7的方法，其中组合物是在固体支持物上给药的。
18、权利要求7的方法，其中病毒感染是通过能够产生整合酶的病毒或具有类整合酶活性的蛋白引起的。
19、权利要求8的方法，其中病毒感染是通过能够产生整合酶的病毒或具有类整合酶活性的蛋白引起的。
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1997
- 1997-12-04 CN CN 97181110 patent/CN1241944A/zh active Pending
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