CN1239100C - 灵芝孢子油及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
灵芝孢子油及其制备方法和用途,涉及以灵芝菌的孢子为原料,提取的一种活性成分及其制备方法,和用途。孢子油中含有24-35%的总三萜,相对密度为0.88~0.92,折光率为1.45~1.48,酸价14~35;其制备方法是用破壁的灵芝孢子为原料,用乙醇溶液制粒干燥后于超临界二氧化碳萃取釜萃取、二级分离,提取得到油状物,经离心分离得到淡黄色油状物;产品用于制备提高机体免疫调节作用的药物和食品。本发明所提供的方法,产品质量稳定,工艺流程简单,操作方便,提取收率高,适合于工业生产;产品的质量稳定,质量控制方便有可操作性;产品有良好的提高机体免疫作用。
Description
技术领域
本发明涉及以灵芝菌的孢子为原料,提取的一种活性成分及其制备方法,并涉及其用途。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,是我国传统扶正固本、滋补强壮的名贵中药,在我国有5000多年的药用、食用历史。在不同生态环境均有相适宜的种类分布,已构成了丰富的灵芝类群,尤其赤灵芝效用最为突出。
灵芝孢子是灵芝在成熟时期不断从菌盖下喷射出的生殖细胞,这些微细孢子是繁殖下一代灵芝的种子,它是灵芝的全部遗留物质和孕育新生命所必须的营养精华。其主要功效成分可分为三萜类、多糖类、核苷、酶类、氨基酸、有机锗、甾醇类、生物碱类及多种维生素等。
灵芝孢子有坚韧的外壳,由几丁质、钙、磷、铁等构成,不溶解与水、弱酸等,不容易被胃酸所破坏,成为人体吸收其有效成分的主要障碍。通常采用超微粉体破壁或酶解破壁技术对灵芝孢子进行破壁,破壁率达95%以上,粒度达到300目以上。
Kutoba等1982年首次从灵芝中分离得到三萜类化合物-灵芝酸A、B以来,迄今为止从灵芝中分离得到的三萜类化合物已达120余种。三萜类化合物是灵芝特有的一种次级代谢成分,具有显著的药理活性。专利CN1094766c公开了一种灵芝孢子油的超临界萃取加工方法,涉及到采用孢子粉制粒成型后进行超临界萃取,制粒的工艺是以水、明胶或淀粉的混合物为粘合剂,室温自然干燥而成。涉及的超临界萃取的温度、压力条件也相对较宽,生产时难以掌握好的工艺条件,制得纯度高的灵芝孢子油产品。同时,萃取时间也长达35小时,这在工业化过程中是难以真正实施。
专利CN1114446c也公开了一种灵芝孢子有效活性物质的萃取方法。具体的也是涉及灵芝孢子经破壁、超临界CO2萃取的方法。但是提及到更为宽泛的超临界萃取的技术条件,萃取压力5~60Mpa,萃取温度32~85℃,萃取时间0.5~6hr,在实际生产中下更是难以在如此宽泛的工艺条件下均得到纯度高的产品和达到高的出油率。
专利CN1445346A也公开了一种灵芝孢子油超临界CO2萃取制备方法。该专利除了在超临界萃取条件方面与上述两专利有所重叠外,涉及到采用膨化破壁技术完成灵芝孢子粉的破壁。由于采用的膨化温度较高(80~140℃),完全可能加速破壁后孢子粉内的油脂类物质的氧化和酸败过程,对孢子油的产品质量带来不利的影响。由于上述的缺点,我们需要进一步摸索最佳的适合工业生产的工艺条件,提取具有生理活性的灵芝孢子油并能控制产品质量用于制备药物、食品和保健食品。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有生理活性的灵芝孢子油及其适合工业生产的制备方法和应用于制备药物或食品。
本发明所采用的技术方案是:所制得的灵芝孢子油是用破壁的灵芝孢子粉采用超临界二氧化碳提取得到的灵芝孢子油中含有以熊果酸计达24~35%的总三萜,孢子油的相对密度为0.88~0.92(20℃/4℃),折光率在25℃下为1.45~1.48,酸价14~35。
灵芝孢子油中总三萜的含量测定方法可采用可见分光光度法:将灵芝孢子油样品溶于乙酸乙酯中并于水浴上蒸干后,加入香草醛-冰乙酸溶液和高氯酸,于水浴加热后,再加入冰乙酸用分光光度计测定样品中的总三萜含量。取熊果酸为对照品绘制标准曲线,样品溶液配制后用分光光度计于548.1nm波长处测定。
相对密度、折光率、酸价的测定方法按中国药典附录的方法测定。
其灵芝孢子油的制备方法是选用破壁的灵芝孢子为原料,用乙醇的水溶液制粒并干燥后,投料于超临界二氧化碳萃取釜中,采用超临界二氧化碳萃取、二级分离的方法,提取得到油状物,进一步经5000~15000rpm离心分离,得到淡黄色油状物。
为了保证提取的出油率和产品的质量,制粒时所用的乙醇水溶液的体积百分比浓度为5~95%,优选乙醇水溶的体积百分比浓度为30~40%,制粒后在30~55℃温度,进行减压干燥或热风循环干燥,颗粒的含水量小于5%。直接采用破壁的灵芝孢子粉进行超临界二氧化碳萃取,由于少量孢子微粉进入油状物中,即使经过离心分离,孢子油的颜色依然偏深;同时,工业生产时,批与批之间连续萃取可以使萃取釜内筒上端的烧结板变形,严重者会带来超压操作的危险。为切实解决生产的安全操作问题,确保孢子油萃取过程质量的稳定,本发明采取了将灵芝孢子粉用乙醇的溶液制粒后,优选在30~55℃下减压干燥或热风循环干燥,成型后颗粒的含水量小于5%为宜。如果颗粒含水量>5%,不但孢子油的生产得率降低,而且容易造成循环***结冰而导致CO2气路堵塞。灵芝孢子粉在不同乙醇溶液浓度下的制粒结果以及颗粒的含水量对比结果见表1。
表1不同乙醇溶液浓度的制粒结果比较
粘合液浓度 | 原粉∶粘合液比例(g/ml) | 制粒后粒径分布 | 干燥5小时的含水量(%) | ||
<20目 | 20-60目 | >60目 | |||
95%乙醇溶液 | 1∶0.58 | 45.12% | 43.98% | 11.69% | 1.23 |
80%乙醇溶液 | 1∶0.65 | 49.9% | 41.6% | 8.5% | 1.64 |
60%乙醇溶液 | 1∶0.73 | 53.2% | 38.4% | 8.4% | 2.45 |
40%乙醇溶液 | 1∶0.8 | 57.5% | 34.5% | 8.0% | 3.59 |
20%乙醇溶液 | 1∶0.78 | 61.5% | 32.6% | 5.6% | 3.68 |
5%乙醇溶液 | 1∶0.75 | 64.0% | 31.2% | 4.8% | 4.22 |
所说的二氧化碳萃取时的工艺条件经研究,优选萃取釜压力为25~32MPa,温度为40~45℃,萃取时间为2~3小时,二氧化碳流量为30~40kg/hr;二级分离的工艺条件是:第一级分离压力8~10MPa,分离温度45~50℃;第二级分离压力5~6MPa,分离温度30~40℃为佳。我们通过大量的试验证明,萃取条件在低于25Mpa,孢子油中总三萜萃取不完全,其含量以熊果酸计小于20%,而在高于32Mpa条件下,总三萜含量并未有显著的增加,详见下表。同时,考虑到目前我国的超临界萃取的中试或生产型设备的操作压力一般小于35Mpa。如采用高压力的生产设备,生产投资会增加很多,并存在设备的保养、维修、生产安全等系列问题。因此,经过优化的超临界萃取条件确定为25~32Mpa,萃取温度为40~45℃。
表2灵芝孢子油在不同萃取条件下的总三萜类含量
(40%乙醇溶液制粒)
超临界萃取条件 | 酸价 | 总三萜类含量(%) |
15Mpa/45℃ | 25.67 | 12.26 |
20Mpa/45℃ | 24.84 | 18.54 |
25Mpa/45℃ | 18.92 | 26.38 |
30Mpa/45℃ | 21.42 | 27.69 |
32Mpa/45℃ | 20.54 | 28.32 |
35Mpa/45℃ | 20.98 | 28.55 |
为了保证产品的质量,尤其是控制孢子油中的含水量,经反复试验,得出采用二级分离方法可获得解决,在解析过程中绝大部分的灵芝孢子油主要在分离釜I解析出来,而水集中在分离釜II解析出来,从而避免只用一级分离带来孢子油含水量过高的问题。
本发明的另一个目的是所得的灵芝孢子油用于制备提高机体免疫调节作用的药物和食品。
下面通过药效试验证明本发明所提供的灵芝孢子油的用途。
试验条件:
样品:以上述工艺获得的灵芝孢子油,通过压制法在符合GMP的条件下制备出灵芝孢子油软胶囊,规格400mg/粒。为了更好地检测孢子油的功效,按60公斤成人为0.04g/kg b.w,设计低、中、高剂量组。各实验剂量组所需浓度均用玉米油稀释样品配成。
组别与剂量:设玉米油对照组和低、中、高三个剂量组,剂量如下:
(1)低剂量组0.02g/kg b.w,相当于推荐日服用量5倍。
(2)中剂量组0.40g/kg b.w,相当于推荐日服用量10倍。
(3)中剂量组1.20g/kg b.w,相当于推荐日服用量30倍
动物:SPF级昆明种雌性小白鼠,6~8周龄(体重:18~22g)
给药途径:每天按10ml/kg b.w量灌胃动物给予受试动物。
1、灵芝孢子油软胶囊对小鼠的迟发型***反应的影响见表3。
表3灵芝孢子油软胶囊对小鼠迟发型***反应的影响
组别 | 剂量(g/kg b.w) | 动物数(只) | 足跖增厚(mm) | P值(与对照组比) |
对照组低剂量中剂量高剂量F值 | 0.00.20.41.2 | 12121212 | 0.37±0.280.59±0.290.49±0.300.73±0.313.249 | >0.05>0.05<0.01 |
试验结果:高剂量组足跖增厚值与对照组比较,差异有统计学意义,表明该试验结果为阳性。
2、灵芝孢子油软胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应见表4。
表4灵芝孢子油软胶囊对小鼠淋巴细胞转化反应的影响
组别 | 剂量(g/kg b.w) | 动物数(只) | 光密度差值 | P值(与对照组比) |
对照组低剂量中剂量高剂量F值 | 0.00.20.41.2 | 12121212 | 0.118±.0550.164±.0600.187±.0620.179±.0423.691 | <0.05<0.01<0.05 |
试验结果:各剂量组光密度值与对照组比较,差异均有统计学意义,表明灵芝孢子油软胶囊对脾淋巴细胞转化反为阳性结果。
3、灵芝孢子油软胶囊对受试动物血清溶血素抗体滴度反应见表5。
表5灵芝孢子油软胶囊对小鼠血清溶血素抗体滴度反应的影响
组别 | 剂量(g/kg b.w) | 动物数(只) | 抗体体积(mm) | P值(与对照组比) |
对照组低剂量中剂量高剂量F值 | 0.00.20.41.2 | 12121212 | 48.17±4.8161.17±1.3385.50±0.7582.83±8.259.727 | >0.05<0.01<0.01 |
试验结果:由表可见,中、高剂量组的抗体体积数均高于对照组,差异比较有统计学意义,表明灵芝孢子油软胶囊对受试动物血清溶血素抗体滴度反应为阳性。
4、灵芝孢子油软胶囊对小鼠碳廓清吞噬功能的影响见表6。
表6灵芝孢子油软胶囊对小鼠碳廓清吞噬功能的影响
组别 | 剂量(g/kg b.w) | 动物数(只) | 抗体体积(mm) | P值(与对照组比) |
对照组低剂量中剂量高剂量F值 | 0.00.20.41.2 | 10101010 | 3.58±0.694.91±1.235.14±1.155.62±1.385.858 | <0.05<0.01<0.01 |
试验结果:各剂量组吞噬指数与对照组比较,差异均有统计学意义。表明灵芝孢子油软胶囊对小鼠碳廓清吞噬作用为阳性结果。
5、结论
小鼠经口每日分别给予灵芝孢子油软胶囊0.20、0.40、1.20g/kg b.w,相当于推荐日服用量5、10、30倍,试验时间共30天。结果显示:
(1)绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型***反应试验(足跖增厚法)结果阳性。
(2)小鼠脾淋巴细胞转化实验阳性,样品具有增强免疫功能作用。
(3)绵羊红细胞免疫小鼠血清溶血素试验(血凝法)结果阳性,样品具有增强体液免疫功能作用。
(4)小鼠碳廓清试验结果阳性,样品具有增强单核-巨噬细胞功能作用。
依据《保健食品检验与评价技术规范》增强免疫力功能判定标准判断,灵芝孢子油软胶囊具有增强免疫力功能作用。
本发明的有益效果:
1、采用本发明所提供的方法,产品质量稳定,工艺流程简单,操作方便,提取收率高,适合于工业生产的安全可靠的制备方法。
2、灵芝孢子油产品的质量稳定,产品质量控制方便有可操作性。
3、产品具有良好的提高具体免疫功能的作用。
下面通过具体实施例阐述本发明的技术方案。
具体实施方式
实施例1取破壁的灵芝孢子粉5Kg,用20%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒后,在45℃下干燥5小时,得含水量为3.6%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中,CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为25MPa,温度40℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离5MPa、40℃。连续萃取2.5小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。5000rpm离心后,得油状物1.082kg,收率21.64%。
实施例2取破壁的灵芝孢子粉5kg,用40%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒,在50℃下干燥4小时,得含水量为4.3%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中,CO2经高压泵加压CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为28MPa,温度45℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离6MPa、40℃。连续萃取2小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。5000rpm离心后,得油状物1.189kg,收率23.78%。
实施例3.取破壁的灵芝孢子粉5kg,用10%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒,在35℃下干燥6小时,得含水量为4.6%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中,CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为25MPa,温度45℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离6MPa、40℃。连续萃取3小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。10000rpm离心分离得油状物1.142kg,收率22.84%。
实施例4取破壁的灵芝孢子粉5Kg,用80%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒后,在45℃下干燥4小时,得含水量为3.4%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中,CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为28MPa,温度45℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离5MPa、40℃。连续萃取2.5小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。12000rpm离心后,得油状物1.202kg,收率24.04%。
实施例5取破壁的灵芝孢子粉5Kg,用90%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒后,在45℃下干燥4小时,得含水量为2.6%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中,CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为30MPa,温度40℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离5MPa、40℃。连续萃取2.5小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。12000rpm离心后,得油状物1.227kg,收率24.54%。
实施例6取破壁的灵芝孢子粉5Kg,用60%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒后,在40℃下干燥5小时,得含水量为3.6%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中,CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为30MPa,温度45℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离5MPa、40℃。连续萃取2.5小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。5000rpm离心后,得油状物1.239kg,收率24.78%。
实施例7取破壁的灵芝孢子粉5Kg,用50%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒后,在45℃下干燥5小时,得含水量为3.6%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中,CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为32MPa,温度45℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离5MPa、40℃。连续萃取2.5小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。5000rpm离心后,得油状物1.256kg,收率25.12%。
实施例8取破壁的灵芝孢子粉5Kg,用70%乙醇溶液作湿润剂,制成软材,挤压造粒后,在45℃下干燥5小时,得含水量为2.8%的孢子粉颗粒。置于50升超临界二氧化碳萃取釜中CO2经高压泵加压,循环萃取。萃取釜的压力为32MPa,温度45℃,一级分离10MPa、50℃,二级分离5MPa、40℃。连续萃取2.5小时后,于分离器中收集孢子油,可得淡黄色具有孢子粉特殊气味的孢子油。15000rpm离心后,得油状物1.249kg,收率24.98%。
实施例9取实施例1~8制得的纯灵芝孢子油9.5kg,以明胶为囊材,采用常规的压制法制备成每粒400mg的软胶囊,可用于食品、保健食品或药品。
表7不同实施例检测结果对比
实施例编号 | 出油率(%) | 总三萜含量(%) | 酸价 | 相对密度(20℃/4℃) | 折光率(25℃) |
实施例1 | 21.64 | 26.63 | 19.2 | 0.8839 | 1.4538 |
实施例2 | 23.78 | 27.12 | 20.4 | 0.8996 | 1.4661 |
实施例3 | 22.84 | 24.35 | 14.4 | 0.9012 | 1.4638 |
实施例4 | 24.04 | 33.83 | 16.8 | 0.9150 | 1.4679 |
实施例5 | 24.54 | 28.51 | 23.5 | 0.9106 | 1.4652 |
实施例6 | 24.78 | 28.49 | 25.3 | 0.9148 | 1.4682 |
实施例7 | 25.12 | 30.81 | 32.7 | 0.9139 | 1.4701 |
实施例8 | 24.98 | 29.46 | 26.5 | 0.9165 | 1.4752 |
Claims (3)
1、一种灵芝孢子油的制备方法,其特征在于:选用破壁的灵芝孢子粉为原料,用体积百分比浓度为5~95%的乙醇的水溶液制粒,在30~55℃温度进行减压干燥或热风循环干燥,颗粒的含水量小于5%,投料于超临界二氧化碳萃取釜中,采用超临界二氧化碳萃取、二级分离的方法,提取得的油状物,进一步经过5000~15000rpm离心分离,得到淡黄色油状物。
2、根据权利要求1所述的灵芝孢子油的制备方法,其特征在于:制粒时所用的乙醇水溶液的体积百分比浓度为30~40%。
3、根据权利要求1所述的灵芝孢子油的制备方法,其特征在于:所说的超临界二氧化碳萃取时的萃取压力为25~32MPa,温度为40~45℃,萃取时间为2~3小时,二氧化碳流量为30~40kg/hr;二级分离的工艺条件是:第一级分离压力8~10MPa,分离温度45~50℃;第二级分离压力5~6MPa,分离温度30~40℃。
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