CN1238375C

CN1238375C - 钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白

Info

Publication number: CN1238375C
Application number: CNB011249862A
Authority: CN
Inventors: 清野进; 矢野秀树; 王长征
Original assignee: Japan Chemical Industries Co ltd
Current assignee: Japan Chemical Industries Co ltd
Priority date: 2000-08-09
Filing date: 2001-08-09
Publication date: 2006-01-25
Anticipated expiration: 2021-08-09
Also published as: DE60123888T2; KR20020013454A; DE60123888D1; CA2354726A1; EP1179591B1; US6673899B2; TWI281498B; US7067265B2; KR100748914B1; AU785067B2; AU5775001A; JP4673968B2; US20020064846A1; JP2002119290A; CN1337405A; US20040063125A1; EP1179591A1

Abstract

本发明公开了含有序列表SEQ ID NO：1或NO：3所示的编码Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO：2或NO：4所示氨基酸序列的蛋白质，以及它们的类似蛋白质，这些类似蛋白质的氨基酸序列含有氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列，这些蛋白质在细胞中表达时具有Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的功能，以及异源表达该蛋白质的细胞。

Description

钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白

技术领域

本发明涉及人和小鼠Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白(钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白(sodium ion-driven chloride/bicarbonate exchanger))，它是一类涉及胞内pH调节的蛋白质。更具体地说，本发明涉及钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白，经设计表达该蛋白质之一的细胞，这些细胞与原始表达蛋白质之一的种类不同，编码该蛋白质的DNA，针对该蛋白质的抗体，以及选择钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的激动剂/拮抗剂的方法。

背景技术

响应各种刺激的胞内pH(pH_i)的调节是众多细胞功能中一种关键的功能。在动物细胞中，碳酸氢根运载蛋白家族是生理条件下的一种主要的pH_i调节剂。碳酸氢根(HCO₃ ^-)运载蛋白根据其功能分为四类[Boron，W.F，等人，J.Exp.Biol.，200：263-268(1997)]：Na⁺非依赖性Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白(也称为阴离子交换蛋白，AE)，Na⁺-HCO₃ ^-共同运载蛋白(NBC)，K⁺-HCO₃ ^-共同运载蛋白，和Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白。现在已经克隆了三种AE和三种NBC，并对它们作了功能鉴定，但是K⁺-HCO₃ ^-共同运载蛋白以及Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的分子结构仍然未知。

Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白首先发现于无脊椎动物神经元内，后来发现于脊椎动物神经元和非神经元细胞中，包括脑细胞、血管内皮细胞、***、肾和胰β-细胞。Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白是一种胞内pH调节剂，它将胞外的Na⁺和HCO₃ ^-输送到细胞内与胞内的Cl^-交换，从而在细胞碱化中起重要作用。

在胰β-细胞中，葡萄糖是胰岛素分泌最重要的生理调节剂。葡萄糖代谢诱导胰细胞中胞内pH提高。已经表明，这种葡萄糖诱导的pH_i升高主要由Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白作用引起[Pace，C.S.等人，J.Membrane Biol.，73：39-43(1983)]。

因此，Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白是各种细胞中重要的胞内pH调节剂，但是其分子学基础未知。分析Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的分子结构和功能不仅对于胰β-细胞分泌胰岛素的功能分析有价值，而且对于根据该分子结构进行目的为开发糖尿病治疗药物的筛选和药物设计也有价值。

在上述背景下，本发明的目的是克隆Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白，从而获得其DNA用于测序，提供表达该DNA的不同种类的细胞，以及测定Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的结构和功能。

发明内容

因此，本发明提供了含有序列表中SEQ ID NO：2或NO：4所示氨基酸序列的Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白。

本发明还提供了包含相对于序列表中SEQ ID NO：2或NO：4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质，当该蛋白质在细胞中表达时，它有Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的功能。

本发明还提供了上述蛋白质，其中Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白依靠胞外碳酸氢根和胞内氯离子将胞外钠离子摄入细胞内，并将胞内钠离子转运到细胞外。

本发明还提供了一种细胞，该细胞中表达了上述蛋白质中的一种，其中该细胞的种类与该蛋白质之一的原始种类不同。这些不同种类的细胞的非限制性例子包括Xenopus laevis***和HEK293细胞。Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白在这些不同种类细胞中的表达可通过编码Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的DNA的转染，或对应于Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的cRNA的导入来实现。

本发明还提供了针对上述蛋白质的抗体。这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体。

本发明还提供了选择Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的激动剂和拮抗剂的方法，该方法包括使表达该蛋白质的不同种类的细胞与候选化合物接触，测定Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白功能，将所得结果与通过未接触候选化合物的细胞的Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白功能所测得结果相比较，从而确定该候选化合物是否增强或抑制该功能。

本发明还提供了包含序列表SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的DNA，含有序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核苷酸67-3330组成的核苷酸序列的DNA，以及含有序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核苷酸83-3346组成的核苷酸序列的DNA。

本发明还提供了一种DNA，该DNA的核苷酸序列相对于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中核苷酸67-3330的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***，且该DNA编码：

(1)含有序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，或

(2)含有相对于序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质在细胞中表达时起Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的功能。

本发明还提供了一种DNA，该DNA的核苷酸序列相对于序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中核苷酸83-3346的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***，且该DNA编码：

(1)含有序列表SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质，或

(2)含有相对于序列表SEQ ID NO：4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质在细胞中表达时起Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的功能。

附图说明

图1显示了大鼠组织和分泌激素的细胞系中NCBE mRNA的RNA印迹分析(a)，和小鼠胰岛NCBE mRNA的RT-PCR(b)。

图2说明了胞外Na⁺浓度对于²²Na⁺摄入的影响。

图3说明了胞外HCO₃ ^-浓度对于²²Na⁺摄入的影响。

图4说明了胞内Cl^-对于³⁶Cl^-流出量的影响。

图5说明了DIDS对于²²Na⁺摄入的影响。

图6说明了在300μM DIDS存在和不存在下，胞内pH的变化以及对照(未转染)细胞中胞内pH的变化。

图7说明了在无HCO₃ ^-的条件下当将环境从无Na⁺溶液切换到含Na⁺溶液时观察到的胞内pH变化。

图8说明了在无Cl^-的条件下当将环境从无Na⁺溶液切换到含Na⁺溶液时观察到的胞内pH变化。

具体实施方式

在本发明中，表达本发明蛋白质的不同种类的细胞例如可以是Xenopus laevis***和HEK293细胞，它们是根据给定目的从小鼠或人以外的各种细胞中选出的。利用本领域熟知的常规方法可使与蛋白质来源种类不同的细胞种类表达本发明蛋白质。

在本说明书中，术语“一个或多个”在用于“有一个或多氨基酸发生缺失、置换、加入或***的氨基酸序列”中时，通常指1-10的数，较佳的为一个至几个(例如3或4个)。

另外，在本说明书中，术语“一个或多个”在用于“有一个或多核苷酸发生缺失、置换、加入或***的DNA”中时，通常指1-10的数，较佳的为一个至几个(例如3或4个)。

利用重组DNA技术，可产生各种突变型DNA以及这些DNA编码的突变型蛋白质。首先，可通过各种不同的化学或酶促方法将突变导入克隆的DNA片段内。然后对所得突变型DNA进行测序，以便选出具有所需优点的特定突变型。该方法能***地制备不同的突变型，无论其表型如何。制备突变型克隆的常用方法如下。

1.利用寡核苷酸，可在给定DNA序列中直接诱导一个或多个核苷酸发生置换、缺失、***或加入。该方法可将多个突变导入给定DNA的一个小区域内。

2.利用较长的寡核苷酸，可以合成所需基因。

3.利用区域特异性诱变技术，可将所需突变导入大的(1-3kb)DNA区域中。

4.DNA的接头扫描诱变是一种适合于将一簇点突变导入一较小(4-10bp)DNA区域中的方法。

5.还可用PCR作为直接导入突变的方法。

[参考文献：《当代分子生物学方法》，第3卷，Ausubel F.M.等人编辑，John Wiley& Sons，Inc.，Current Protocols，第1卷，第8章：“克隆DNA的诱变”，8.0.1-8.5.10页]

制备能表达包括上述方法所得不同突变的所需基因的质粒或其它载体的方法也是本领域技术人员所熟知的。即，用限制性酶和连接酶的组合将包含所需基因的DNA***表达载体DNA中，不难构建携带所需基因的重组质粒。然后将这样获得的重组质粒导入不同细胞中以转染这些细胞，从而产生转化的细胞。可采用的细胞范围包括原核细胞如大肠杆菌，到酵母、昆虫、植物和动物细胞。

[参考文献：《载体的基本资料》Gacesa P.和Ramji D.P.，166页，BIOS ScientificPublishers Limited 1994.，John Wiley & Sons in association with BIOS ScientificPublishers Ltd.″表达载体″，9-12页]

重组质粒导入宿主细胞可通过氯化钙方法或电穿孔来实现。氯化钙方法是实现转化的一种有效的方法，无需任何为其特殊设计的装置。如果需要更高的效率，建议采用电穿孔。

[参考文献：《当代分子生物学方法》，第3卷，Ausubel F.M.等人编辑，John Wiley& Sons，Inc.，Current Protocols，第1卷，1.8单元：“质粒DNA引入细胞内”，1.8.1-1.8.10页]

通常在动物细胞系上进行的转染已知有两类，即瞬时和永久型。在瞬时转染中，培育转化的细胞1至4天，以实现导入基因的转录和复制，然后收获细胞分析它们的DNA。或者，在许多研究中，产生稳定的转化子细胞系，其中导入的基因被掺入染色体中。转染方法的例子包括磷酸钙法、电穿孔以及脂质融合方法。

[参考文献：《当代分子生物学方法》，第3卷，Ausubel F.M.等人编辑，John Wiley& Sons，Inc.，Current Protocols，第1卷，第9章：“DNA引入哺乳细胞内”，9.0.1-9.17.3页]

用本领域熟知的方法不难制得针对本发明的Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的多克隆和单克隆抗体、或它们的片段或类似物。如此获得的抗体例如可用于不同种类细胞表达的Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的免疫组织化学，或用于通过阻断该蛋白抑制其功能。Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白功能受抑制的不同种类的细胞在选择该蛋白质的激动剂/拮抗剂中可用作对照。

以毫克规模制得针对本发明Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白的单克隆抗体的通用方法如下：用该抗原蛋白之一接种小鼠进行免疫。从显示有足够抗体滴度的小鼠中取出脾脏。分离脾细胞，选出B细胞与B细胞来源的骨髓瘤细胞融合形成分泌该抗体的杂交瘤细胞。用亲和层析、离子交换或凝胶过滤等方法从培养液中纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。本发明的多克隆抗体可用以下的常规方法制得：用家兔、马、小鼠或豚鼠作为受免疫动物，按照本领域已知的一个方案接种抗原蛋白来免疫动物，然后从收集的血清中分离出IgG等。

[参考文献：《当代分子生物学方法》，第3卷，Ausubel F.M.等人编辑，John Wiley& Sons，Inc.，Current Protocols，第2卷，11章：“免疫学”，11.0.1-11.16.13页]

实施例

下面本发明将参照实施例作更详细的描述。然而本发明并不局限于这些实施例。

为了测定其结构和功能作用，本发明从MIN6(分泌胰岛素的小鼠细胞系)的cDNA文库克隆了Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白(命名为NCBE)。下面将描述Na⁺推动的氯离子(Cl^-)/碳酸氢根(HCO₃ ^-)交换蛋白(NCBE)的一级结构、组织分布和功能特征。

已经揭示，小鼠NCBE蛋白质(SEQ ID NO：2)由1088个氨基酸组成，其与人肌肉、视网膜和肾的碳酸氢钠共运载蛋白分别有65、65和41％的氨基酸相同性。已经发现小鼠NCBE具有阴离子交换蛋白和碳酸氢钠共运载蛋白特征性的10个推定的跨膜区域和保守的4，4′-二异硫氰酸二苯乙烯-2，2′-二磺酸(DIDS)结合基序。已经表明NCBE mRNA在脑和小鼠胰岛瘤细胞系MIN6中高水平表达，但在垂体、睾丸、肾和回肠中也有低水平表达。通过对Xenopus laevis***和HEK293细胞中表达的NCBE蛋白质的功能分析，证实该蛋白质通过将胞外Na⁺和HCO₃ ^-转运入细胞内与胞内Cl^-交换而使胞内pH升高。根据这一发现，本发明中得出结论，即克隆的NCBE是天然细胞中调节胞内pH的Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白。

然后，为了另行鉴定人NCBE，首先用PCR扩增上述所得小鼠Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白cDNA的部分序列(2746bp)。对于该扩增，用序列表SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸250-270组成的序列的DNA片段作为有义引物，用具有与序列表SEQID NO：1所示序列核苷酸2976-2995组成的序列互补的序列的DNA片段作为反义引物。PCR条件如下：

最初变性：94℃，2分钟

扩增(20轮)

·变性：94℃，15秒

·退火：60℃，30秒

·延伸：72℃，2分钟

最终延伸：72℃，7分钟

以切口平移法用³²P-dCTP标记所得PCR产物，用于从人胎脑cDNA文库(Clontech)中筛选出大约1百万个噬菌体。获得4个阳性克隆，用EcoRI消化它们的DNA。琼脂糖电泳后，切下对应的条带，提取出各自DNA，获得***物。另外，用EcoRI消化pGEM72(Promega)并用碱性磷酸酶处理。在其中分别连接入从阳性噬菌体获得的***物，用于亚克隆。然后，在自动测序仪(ABI 310)上对各***物分别测序，根据所得序列，确定对应于人NCBE蛋白质的cDNA核苷酸序列(如SEQ ID NO：3所示)。根据该结果，确定人NCBE蛋白的序列(如序列表SEQ ID NO：4所示)。

下面将侧重于所按照的程序以及小鼠NCBE获得的结果来描述上述实验的方法和结果。

[材料和方法]

<cDNA克隆>

用人肾cDNA作为模板，PCR扩增人肾NBC cDNA的部分cDNA片段[Burnham，C.E.，等人，J.Biol.Chem.272：19111-19114(1997)]。其中所用的有义和反义引物是5′-TTTGGAGAAAACCCCTGGT-3′(核苷酸2232-2250)(SEQ ID NO：5)和5′-TGACATCATCCAGGAAGCTG-3′(核苷酸2912-2931)(SEQ ID NO：6)。在热循环仪GeneAmp PCR***9600(PE Applied biosystems，Foster，CA)中，在下列条件下进行40轮PCR：94℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒。如以前所述[Fukumoto，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5434-5438(1988)]，用700bp的PCR产物作为探针，在低严谨度条件下筛选MIN6 cDNA文库[Inagaki，N.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：2679-2638(1994)]。将阳性克隆亚克隆到pGEM-3Z载体(Promega，Madison，WI)中，用ABI PRISM^TM 377 DNA测序仪(PE Applied Biosystems)在两个方向上测序。

<RNA印迹分析>

用来自各种组织和细胞的10微克总RNA进行RNA印迹分析。用甲醛使RNA变性，在1％琼脂糖凝胶上电泳，转移到尼龙膜上。在前述[Wang，C-Z.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，220：196-202(1996)]标准条件下，用NCBE cDNA探测印迹。在放射自显影之前，用0.1×SSC和0.1 SDS在室温下洗涤印迹1小时，然后在50℃下再洗涤1小时。

<反转录聚合酶链反应(RT-PCR)>

用TRIZOL试剂(Life Technologies，Inc.，Rockvill，MD)从分离的小鼠胰岛制得总RNA。用Superscript^TM II反转录酶(Life Technologies)和随机引物产生第一链cDNA(10毫微克)。用1毫微克模板DNA，在20微升反应体积中标准条件下用ExpandHigh Fidelity PCR***(Roch Diagnostics，Mannheim，Germany)进行PCR。所用的有义和反义引物是5′-GTCATGTTAGACCAACAGGT-3′(核苷酸4283-4302)(SEQ ID NO：7)和5′-GTTGTAATAGCGACACTC-3′(核苷酸4911-4928)(SEQ ID NO：8)。在1％琼脂糖凝胶上分辨该PCR产物，用DNA测序确认。

如前所述(Wang，C-Z.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，220：196-202(1996))，用FspI消化，使pSD5中的NCBE的编码序列线性化，并用SP6 RNA聚合酶作体外转录。将NCBE cRNA(50毫微升，0.5微克/微升)或水注射入去除泡囊的***中，研究前在1×MBS培养基(88mM NaCl，1mM KCl，0.8mM MgCl₂，0.4mM CaCl₂，0.3mM Ca(NO₃)₂，2.4mM NaHCO₃和7.5mM Tris，pH7.4)中于18℃培育3-5天。***在标准溶液(100mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl₂，1mM CaCl₂，和8mM NaHCO₃，pH7.4)中于18℃预培育1小时。

为了研究对胞外Na⁺浓度的依赖性，然后将***培育在1.4毫升鼓入1.5％CO₂的1、10、30或100mM Na⁺溶液(pH7.4，有0.074MBq ²²Na⁺(NEN^TM Life ScienceProducts，Boston，MA))中。在每种溶液中，用等摩尔量的胆碱代替标准溶液的Na⁺。从培育溶液中取出10微升等份，用于随后测定²²Na⁺比活。15分钟后，终止²²Na⁺的摄入，方法是分别用含有1、10、30或100mM Na⁺的冰***液(pH7.4)洗涤三次，然后使***在0.5毫升5％SDS中裂解，加入4.5毫升水性计数闪烁剂(AmershamPharmacia Biotech)。²²Na⁺摄入在不含Cl^-的1、10、30或100mM Na⁺溶液(pH7.4)中进行。胞外Cl^-用等摩尔量的葡糖酸代替，胞外Na⁺用等摩尔量的N-甲基-D-葡聚糖胺(NMG)代替。另外，还在300μM 4，4′-二异硫氰酸二苯乙烯-2，2′-二磺酸(DIDS，Sigma，它是标准溶液中阴离子运载蛋白的抑制剂)存在或不存在下，检查15分钟的²²Na⁺摄入。

为了研究对胞外HCO₃ ^-浓度的依赖性，在18℃下，在pH7.4、鼓入1.5％CO₂、含有0.074MBq ²²Na⁺的1、3、10或30mM HCO₃ ^-溶液中进行Na⁺摄入实验。溶液含有2mM KCl，1mM MgCl₂和1mM CaCl₂，pH7.4，1mM HCO₃ ^-溶液中还含有107mM NaCl和1mM NaHCO₃；3mM HCO₃ ^-溶液中还含有105mM NaCl和3mM NaHCO₃，10mMHCO₃ ^-溶液中还含有98mM NaCl和10mM NaHCO₃，30mM HCO₃ ^-溶液中还含有78mMNaCl和30mM NaHCO₃。

对于³⁶Cl^-流出量实验，使***在不含Cl^-的溶液中预培育1小时，以消耗除去胞内Cl^-，或在含有Cl^-的标准溶液中培育。使***在18℃、鼓入1.5％CO₂、含有0.074MBq ³⁶Cl^-的溶液(NEN^TM Life Science Products)中培育1小时。用对应的各溶液迅速洗涤***三次，然后转移到1.5毫升鼓入1.5％CO₂、pH7.4、不含Cl^-的各个溶液中。从培养液中取出10微升等份用于以后测定³⁶Cl^-比活。在0、5、15、25和35分钟时，测定溶液中³⁶Cl^-的活性。如上所述处理***，用于测定胞内剩余的³⁶Cl^-。对各时间点的培养基部分进行计数，归纳数值，以确定流通量。³⁶Cl^-流出量表示成相对于细胞³⁶Cl^-释放总量的百分数。用β闪烁计数器(Aloka，Japan)测定²²Na⁺和³⁶Cl^-活性。

<HEK293细胞中NCBE的功能分析>

在每个含盖波片的直径为3.5厘米的碟中以3×10⁵的细胞密度接种HEK293细胞，在95％空气和5％CO₂的湿润条件下，37℃下培育在添加了10％胎牛血清、链霉素(60.5微克/毫升)和青霉素(100微克/毫升)的Dulbecco′s改进的Eagele′s培养基(DMEM，高葡萄糖)中。用脂转染胺试剂(Lipofectamnine)、Lipofectamine Plus和Opti-MEM I试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，根据生产商说明书，用1微克pcDNA3.1载体(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中的全长NCBE cDNA转染细胞。转染后，研究细胞48-72小时。用2′，7′-二-(2-羧乙基)-5-(6)-羧基荧光素，乙酰氧甲酯(BCECF-AM，Molecular Probe，Eugene，OR)(Burnham，C.E.，等人，J.Biol.Chem.，272：19111-19114(1997))监测胞内pH变化。在HEK293细胞中加入1μM BCECF-AM 1小时，用计算机化图象处理器(Argus-50；Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，Japan)通过双重激发波长方法(490纳米/450纳米；520-560纳米发射)，监测胞内pH的变化。测定在切换成测试溶液前和切换10分钟后胞内pH之间的差值ΔpHi。用KCl/尼日菌素技术(Thomas，J.A.等人，Biochemistry 18：2210-2218(1979))产生pH_i标定曲线。在所有实验中，细胞首先用含40mM NH₄Cl的溶液通过NH₄ ⁺前置脉冲来酸化5分钟，然后切换成含有Na⁺的各个测试溶液(Burnham，C.E.，等人，J.Biol.Chem.，272：19111-19114(1997))。

为了估计胞内酸化恢复胞内pH(ΔpHi)的Na⁺依赖性，采用不含Na⁺的溶液(115mM四甲基氯化铵(TMA-Cl)，25mM KHCO₃，0.8mM K₂HPO₄，0.2mM KH₂PO₄，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，10mM HEPES)和含有Na⁺的溶液(用90mM NaCl，25mM KCl和25mMNaHCO₃代替不含Na⁺溶液中的TMA-Cl和碳酸氢钾)。

为了测试HCO₃ ^-依赖性，采用不含HCO₃ ^-、不含Na⁺的溶液(115mM TMA-Cl，0.8mM K₂HPO₄，0.2mM KH₂PO₄，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，10mM HEPES)和不含HCO₃ ^-、含有Na⁺的溶液(用90mM NaCl和25mM KCl代替不含HCO₃ ^-，不含Na⁺溶液中的TMA-Cl)。

为了测定Cl^-依赖性，采用不含Cl^-、不含Na⁺的溶液(25mM KHCO₃，0.8mMK₂HPO₄，0.2mM KH₂PO₄，10mM HEPES，115mM NMG-葡糖酸盐)和不含Cl^-、含Na⁺的溶液(其中用115mM葡糖酸钠代替NMG-葡糖酸盐)，相互比较结果。

所有溶液中鼓入95％O₂和5％CO₂，它们的pH调节至7.4。用蔗糖调节各溶液的重量渗透克分子浓度。试验在37℃下进行。

<统计分析>

结果表示成平均值±标准误差。实验之间的统计学意义用司徒登特t检验确定。

[结果和讨论]

NCBE在结构上与Na⁺-HCO₃ ^-运载蛋白有关。

如上所述，用部分人肾Na⁺-HCO₃ ^-共运载蛋白(NBC)cDNA作为探针，筛选MIN6cDNA，克隆得到编码Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白(NCBE)的cDNA。如此测得的核苷酸序列(NCBE)示于序列表SEQ ID NO：1中。复合的5385bp核苷酸序列含有一个开放读框，它在“ATG”上游框内终止信号之后，编码了SEQ ID NO：1所示1088个氨基酸的蛋白质，其预计分子量为122kDa。疏水性分析表明，该氨基酸序列分别在下列位置具有推定的跨膜片段(TM1-TM10)。

TM1：氨基酸479-499

TM2：氨基酸514-534

TM3：氨基酸564-584

TM4：氨基酸693-713

TM5：氨基酸733-753

TM6：氨基酸780-800

TM7：氨基酸826-846

TM8：氨基酸882-901

TM9：氨基酸905-924

TM10：氨基酸972-992

在该氨基酸序列中，在第三(TM3)和第四(TM4)跨膜区之间胞外环中有三个潜在的N-连接的糖基化位点(Asn-647，Asn-657和Asn-667)。推定的DIDS结合基序是氨基酸815-818。

NCBE和其它NBC的氨基酸序列比较表明，NCBE与人肌肉NBC[Pushkin，A.等人，J.Biol.Chem.，274：16569-16575(1999)]、人视网膜NBC[Ishibashi，K.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，24：535-538(1998)]、以及人肾NBC[Burnham，C.E.，等人，J.Biol.Chem.，272：19111-19114(1997)]分别有65％、65％和41％的氨基酸相同性。这表明，NCBE代表了新的碳酸氢根运载蛋白。推定跨膜区中的氨基酸序列以及DIDS结合基序Lys Leu Lys Lys(残基815-818)在NCBE中是高度保守的，而胞内氨基和羧基端区域以及第三和第四跨膜区之间的大的胞外环中的氨基酸有相当的差异。

NCBE在脑细胞以及分泌胰岛素的克隆的胰β-细胞中高水平表达。

RNA印迹分析揭示，脑细胞和胰岛素分泌性细胞系MIN6细胞中高水平地表达了5.5kb的NCBE mRNA，而其在垂体、睾丸、肾和回肠中的表达水平低(图1a)。RT-PCR分析显示NCBE在胰岛中也有表达(图1b)。

在该图中，“a”代表NCBE mRNA在大鼠组织和分泌激素的细胞系中的RNA印迹分析结果。图中显示了杂交转录物的大小。“b”代表小鼠胰岛中NCBE mRNA的RT-PCR检测结果。DNA长度标记物和RT-PCR产物分别显示在泳道1和2中。

NCBE是一种调节胞内pH(pH_i)的Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白。

本发明者用Xenopus laevis***体系检查了NCBE的功能性质。在注射cRNA或水(对照)后3-5天，测定²²Na⁺摄入和³⁶Cl^-流出量。通过鼓入1.5％CO₂使***酸化，本发明者首先检查了胞外Na⁺浓度对于²²Na⁺摄取的影响。结果显示在图3中。

图3描述了²²Na⁺摄入(毫微摩尔/***/小时)与胞外Na⁺浓度之间的关系。在该图中，■和●表示用注射有NCBE cRNA的细胞获得的结果，□和○表示用注射水的细胞获得的结果。■和□表示用含有Cl^-的胞外溶液获得的结果，●和○表示用不含Cl^-的胞外溶液获得的结果。各数据均用两个独立实验的7-16个***的平均值±标准误差(SE)表示。^*和(p＜0.05)表示与注射水细胞的差别以及与在不含Cl^-的分别有10、30或100mM Na⁺的胞外溶液中培育的差别有/没有统计学意义。

如图2所示，²²Na⁺摄入的增加依赖于胞外Na⁺浓度，在注射了NCBE cRNA的***中在Na⁺浓度的生理范围内观察到这种依赖呈线性方式。注射了水的***显示²²Na⁺摄入没有增加。比较含Cl^-和不含Cl^-溶液所得结果之间的Na⁺摄入表明，有胞外Cl^-存在时的Na⁺摄入明显高于没有胞外Cl^-时(图2)。这些结果表明，NCBE将胞外Na⁺转运入细胞内，且胞外Cl^-参与促进NCBE的活性。

然后，本发明者检查了胞外碳酸氢根离子对²²Na⁺摄入的影响。结果显示在图3中。各数据均用两个独立实验的11-16个***的平均值±标准误差(SE)表示。^*(p＜0.05)表示与注射水细胞的比较。从该图看出，增加胞外碳酸氢根离子能以浓度依赖性方式显著增加注射了NCBE cRNA的***的Na⁺摄入，而注射水的***不显示钠摄入的任何变化。这些结果表明，胞外碳酸氢根离子是将Na⁺转运到细胞中所必需的。

为了确定Cl^-是否由NCBE转运出入细胞，本发明者检查了Xenopus laevis***的³⁶Cl^-流出量。由于在注射了水的***中没有检测到³⁶Cl^-流入量，因此只分析注入NCBE cRNA的***的³⁶Cl^-流出量。在胞内Cl^-消耗的条件下(用不含Cl^-的溶液预培育)和胞内Cl^-未消耗的条件下(与含有Cl^-的溶液预培育)，测定从0到35分钟注射了NCBE cRNA的***的³⁶Cl^-流出量比例(％)。结果显示在图4中。在该图中，●表示在胞内Cl^-未消耗的条件(与含有Cl^-的溶液预培育)下的细胞所得结果，▲表示在胞内Cl^-消耗的条件(与不含Cl^-的溶液预培育)下的细胞所得结果。数据用三个独立实验的16-17个***的平均值±标准误差(SE)表示。^*(p＜0.05)表示5、15、25和35分钟时与胞内Cl^-消耗的细胞的比较。

不同条件下³⁶Cl^-流出量结果的比较表明，NCBE将胞内Cl^-转运到细胞外。总之，这些结果证明NCBE使胞外Na⁺以及碳酸氢根离子与胞内Cl^-交换。

本发明者还检查了阴离子运载蛋白抑制剂DIDS对²²Na⁺摄入的影响。在有或没有0.3mM DIDS存在下评价了表达。结果示于图5。数据用三个独立实验的21-22个***的平均值±标准误差(SE)表示。^*(p＜0.05)表示与cRNA+DIDS的比较。

在没有DIDS时，注射了NCBE cRNA的***的²²Na⁺摄入为31.4±2.1毫微摩尔/***/小时(n＝21)，在300μM DIDS存在下为6.0±0.7毫微摩尔/***/小时(n＝14)。在注射水的***中，没有和有DIDS存在时的钠摄入分别为1.6±0.3(n＝22)和2.1±0.4(n＝19)毫微摩尔/***/小时。因此，表明DIDS部分抑制NCBE驱使的²²Na⁺摄入(图5)。

为了阐明NCBE在调节胞内pH中的作用，用经NCBE瞬时转染的HEK293细胞在不同条件下测定胞内pH的变化。所有实验均在用NH₄ ⁺前置脉冲酸化胞内pH的条件下进行。为了确定胞内pH变化是否依赖于胞外Na⁺，将细胞环境从不含Na⁺的溶液切换到含有Na⁺的溶液。结果显示在图6中。图6描述了对照(未转染)细胞和NCBE转染细胞加或不加300μM DIDS的描绘图。细胞环境从不含Na⁺的溶液切换成含有Na⁺的溶液。

如图所示，在1mM 5-(N-乙基-N-异丙基)-氨氯吡脒(EIPA)(Na⁺/H⁺交换蛋白的特异性抑制剂)存在下，仅在NCBE转染细胞中观察到胞内pH(ΔpH_i)恢复迅速(NCBE转染细胞中的ΔpH_i为0.239±0.028(n＝97)，在对照中为0.003±0.015(n＝70)。p＜0.05)(图6)。此胞内pH的恢复部分受到300μM DIDS的抑制(ΔpH_i为0.023±0.042(n＝89)。p＜0.05)。

为了确定胞内pH的该变化是否依赖于碳酸氢根离子，在1mM EPIA存在下，将NCBE转染细胞的环境从不含HCO₃ ^-、不含Na⁺的溶液换成不含HCO₃ ^-、但是含Na⁺的溶液。然而，如图7所示，未检测到胞内pH有恢复(ΔpH_i为0.002±0.014(n＝71))。

最后，本发明者还检查了Cl^-依赖性。在整个实验中，将NCBE转染细胞置于不含Cl^-的溶液中(在胞外Cl^-消耗的条件下)。在该条件下，将细胞环境从不含Na⁺的溶液换成含有Na⁺的溶液。如图8所示，在1mM EIPA存在下，未检测到胞内pH恢复[ΔpH_i为0.067±0.012(n＝95)]。

这些结果表明，只有当胞外Na⁺和HCO₃ ^-以及胞内Cl^-存在时，胞内pH才会胞内酸化恢复。

Xenopus laevis***和HEK293细胞中异源表达的NCBE功能研究表明NCBE能通过转运胞外Na⁺和HCO₃ ^-与胞内Cl^-交换而短时胞内酸化恢复胞内pH(图3和4)。NCBE在功能上与以前报道的阴离子交换蛋白以及Na⁺-HCO₃ ^-共同运载蛋白有显著不同。这是因为：1)在Xenopus laevis中表达的NCBE表现出Na⁺摄入增加依赖于胞内Cl^-，2)它表现出能将Cl^-输送到细胞外，和3)HEK293细胞中表达的NCBE以依赖于胞外Na⁺和HCO₃ ^-以及胞内Cl^-的方式使胞内pH升高。这些性质与天然细胞中所述的Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白相似。因此，得出结论，克隆的NCBE是一种Na⁺推动的Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白。

NCBE的可能的生理学相关性

NCBE mRNA在胰岛素分泌性细胞系MIN6和胰岛中表达暗示了它的生理相关性。现已表明，葡萄糖诱导的胰岛素分泌伴随着胰β-细胞胞内pH的升高。尽管已经提出胰β-细胞中存在几种胞内pH调节剂，但是它们的分子基础至今仍不知道。NCBE是一级结构和功能性质已经确定的第一个调节胞内pH的交换蛋白(exchager)。NCBE最有可能对因葡萄糖代谢而酸化的胰β细胞中胞内pH的恢复过程有贡献。NCBEmRNA也存在于睾丸中，但是其表达水平很低。现已表明，胞内pH调节***的许多功能，包括***获能。由于***获能使得胞内pH升高，它需要功能性的Na⁺、Cl^-和HCO₃ ^-依赖型酸流出通道，因此NCBE可能参与***获能过程。NCBE mRNA也在脑中高水平表达。尽管生理学研究提示NCBE存在于海马神经元和星形细胞中，但是这些细胞的生理学意义目前仍不知道。

序列表

<110>日本化学研究株式会社

<120>钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白

<130>GP44

<160>8

<210>1

<211>5385

<212>DNA

<213>肌肉

<400>1

ggctgagtgg aagacactga agacactgca gagcaaggtg ctttttttcc agaggtgtta 60

cagaac atg gag att aaa gac cag gga gcc caa atg gag ccg ctg ctg 108

Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu

1 5 10

cct acg aga aat gat gaa gaa gcc gtt gtg gat aga ggt gga aca cgc 156

Pro Thr Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg

15 20 25 30

tct att ctc aaa aca cat ttt gag aaa gaa gat tta gaa ggt cat cgg 204

Ser Ile Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg

35 40 45

aca tta ttt att gga gtt cat gtg ccc ctg ggt gga aga aaa agc cat 252

Thr Leu Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His

50 55 60

cgt cgt cac agg cat cgt ggt cat aag cac aga aag agg gac aga gag 300

Arg Arg His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu

65 70 75

aga gat tcg gga ctg gag gat gga aga gag tcc cct tct ttt gac acc 348

Arg Asp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr

80 85 90

cca tcg cag agg gtg cag ttt att ctt gga act gag gac gat gat gag 396

Pro Ser Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu

95 100 105 110

gag cac ctc cct cat gac ctt ttc aca gag ctg gat gag att tgc tgg 444

Glu His Leu Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp

115 120 125

cgt gaa ggg gaa gat gct gag tgg cga gag aca gcc agg tgg ttg aaa 492

Arg Glu Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys

130 135 140

ttt gaa gag gat gtg gaa gat gga gga gaa aga tgg agt aag ccc tat 540

Phe Glu Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr

145 150 155

gtg gcc acg ctt tca tta cac agc ttg ttt gag ttg aga agc tgc atc 588

Val Ala Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile

160 165 170

ctg aat gga act gtg cta ctg gac atg cat gcc aac acg ata gaa gaa 636

Leu Asn Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Ile Glu Glu

175 180 185 190

att gca gat atg gtc ctt gac cag cag gtc agc tca ggc cag ctg aat 684

Ile Ala Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser Gly Gln Leu Asn

195 200 205

gaa gat gtt cgc cac agg gtc cac gaa gca ttg atg aag cag cat cat 732

Glu Asp Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His

210 215 220

cac cag aat cag aaa aaa ctg gct aac agg att cct att gtc cga tct 780

His Gln Asn Gln Lys Lys Leu Ala Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser

225 230 235

ttg gct gat att ggc aag aaa caa tca gaa cca aat tcc atg gat aaa 828

Leu Ala Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn Ser Met Asp Lys

240 245 250

aat gca ggt cag gtt gtt tct cct cag tct gct cca gcc tgt gct gag 876

Asn Ala Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro Ala Cys Ala Glu

255 260 265 270

aat aaa aat gat gtc agc agg gaa aac agc act gta gac ttc agc aag 924

Asn Lys Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys

275 280 285

gtt gat ctg cat ttt atg aaa aag att cct ccg ggt gct gaa gct tca 972

Val Asp Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser

290 295 300

aac atc ttg gta gga gaa ctg gag ttc cta gac aga gct gtg gtt gcc 1020

Asn Ile Leu Val Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Ala Val Val Ala

305 310 315

ttt gtc agg ttg tct cca gct gtc ttg ctc caa gga ctt gct gaa gtt 1068

Phe Val Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Val

320 325 330

cca atc cca agc aga ttt ctg ttc atc ctt ctg gga ccc ctg gga aag 1116

Pro Ile Pro Ser Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Leu Gly Lys

335 340 345 350

ggt caa cag tac cac gag att ggc aga tcg att gcg acc tta atg act 1164

Gly Gln Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala Thr Leu Met Thr

355 360 365

gat gag gtg ttt cat gat gtt gct tac aaa gct aaa gac cgc aat gac 1212

Asp Glu Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg Asn Asp

370 375 380

ttg gta tca gga att gat gag ttt ctg gat cag gtt acc gtt ctt cct 1260

Leu Val Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val Thr Val Leu Pro

385 390 395

cct gga gaa tgg gat cca agc ata cga ata gaa cct ccc aaa aat gtc 1308

Pro Gly Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Asn Val

400 405 410

cct tcc cag gag aag agg aag att cct gct gta cca aat gga aca gca 1356

Pro Ser Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro Asn Gly Thr Ala

415 420 425 430

gct cat ggc gaa gct gag cca cat gga gga cac agc gga cct gaa ctc 1404

Ala His Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser Gly Pro Glu Leu

435 440 445

cag cga act ggg agg att ttt ggg gga ctt atg tta gat atc aaa aga 1452

Gln Arg Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Met Leu Asp Ile Lys Arg

450 455 460

aag gct cca ttc ttc tgg agc gac ttc agg gat gct ttc agc ctg cag 1500

Lys Ala Pro Phe Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala Phe Ser Leu Gln

465 470 475

tgc tta gca tcg ttc ctg ttt ctc tac tgt gca tgc atg tct cct gtc 1548

Cys Leu Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys Met Ser Pro Val

480 485 490

atc aca ttt gga gga ctg ttg gga gaa gca act gaa ggt cgt ata agt 1596

Ile Thr Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu Gly Arg Ile Ser

495 500 505 510

gca atc gaa tca ctc ttt gga gca tct atg acc ggg ata gcc tat tct 1644

Ala Ile Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly Ile Ala Tyr Ser

515 520 525

ctt ttt ggt gga cag ccc ctg acc ata tta ggc agc aca gga cct gtt 1692

Leu Phe Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val

530 535 540

ttg gtg ttt gaa aag atc ttg ttt aag ttt tgc aag gaa tac ggc ctg 1740

Leu Val Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys Glu Tyr Gly Leu

545 550 555

tcg tac ttg tcc tta cgg gcc agc att ggg ctc tgg act gca aca ctg 1788

Ser Tyr Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp Thr Ala Thr Leu

560 565 570

tgc atc atc ctt gtg gcc acg gac gcg agc tca ctc gtc tgc tac atc 1836

Cys Ile Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu Val Cys Tyr Ile

575 580 585 590

acc cgg ttt acc gaa gag gct ttt gct tct ctc att tgc atc att ttt 1884

Thr Arg Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile Cys Ile Ile Phe

595 600 605

atc tat gaa gcc ctg gag aag ttg ttt gag ctc agt gaa acc tat cca 1932

Ile Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser Glu Thr Tyr Pro

610 615 620

atc aat atg cac aat gat ttg gaa ctg ctg aca caa tac tca tgt aac 1980

Ile Asn Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Ser Cys Asn

625 630 635

tgt atg gag cca cat agt ccc agc aat gac aca ctg aag gaa tgg cgg 2028

Cys Met Glu Pro His Ser Pro Ser Asn Asp Thr Leu Lys Glu Trp Arg

640 645 650

gag tcc aac ctt tct gcc tct gac ata atc tgg ggg aac cta act gtg 2076

Glu Ser Asn Leu Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Gly Asn Leu Thr Val

655 660 665 670

tca gag tgc aga tca ctg cac ggg gag tat gtc ggg cga gcc tgt ggc 2124

Ser Glu Cys Arg Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly Arg Ala Cys Gly

675 680 685

cat ggc cac ccc tac gtg cca gat gtt ctc ttc tgg tcg gtg atc ctg 2172

His Gly His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp Ser Val Ile Leu

690 695 700

ttc ttc tcc aca gtt acc atg tca gcc acc ctg aag cag ttc aag acc 2220

Phe Phe Ser Thr Val Thr Met Ser Ala Thr Leu Lys Gln Phe Lys Thr

705 710 715

agc cgc tat ttc cca acc aag gtt cga tcc ata gtg agt gat ttt gcg 2268

Ser Arg Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val Ser Asp Phe Ala

720 725 730

gtt ttt ctt aca att ctg tgt atg gtt tta att gac tat gcc att ggg 2316

Val Phe Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp Tyr Ala Ile Gly

735 740 745 750

atc cca tca cca aaa cta caa gta cca agc gtt ttc aag ccg acc ata 2364

Ile Pro Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe Lys Pro Thr Ile

755 760 765

tac gac cgt ggc tgg ttt gtt aca cct ttg ggt cca aac cca tgg tgg 2412

Tyr Asp Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro Asn Pro Trp Trp

770 775 780

aca atc ata gct gcc atc atc cca gct tta ctc tgt act att ctg att 2460

Thr Ile Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys Thr Ile Leu Ile

785 790 795

ttc atg gac cag cag att aca gct gtc atc atc aac aga aaa gag cac 2508

Phe Met Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn Arg Lys Glu His

800 805 810

aag cta aag aaa ggt tgt ggc tat cac ctg gat ctg tta atg gtg gca 2556

Lys Leu Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu Leu Met Val Ala

815 820 825 830

gtc atg ctc ggg gtc tgc tcc att atg ggc ctg cca tgg ttt gtg gct 2604

Val Met Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro Trp Phe Val Ala

835 840 845

gcc aca gtt ctc tcc atc act cat gtc aac agc ctc aag ctc gaa tca 2652

Ala Thr Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu Lys Leu Glu Ser

850 855 860

gag tgc tct gct cca gga gaa caa ccc aag ttt ctc ggc att cgg gag 2700

Glu Cys Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu Gly Ile Arg Glu

865 870 875

cag agg gtg acc ggg ctc atg att ttt att ctt atg ggt tca tcc gtt 2748

Gln Arg Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met Gly Ser Ser Val

880 885 890

ttc atg acc agc att ctg aag ttt atc ccc atg cca gtg tta tac gga 2796

Phe Met Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly

895 900 905 910

gtg ttt ctt tat atg ggt gct tcg tct ctc aaa gga att cag tta ttt 2844

Val Phe Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly Ile Gln Leu Phe

915 920 925

gat aga ata aag ctc ttc tgg atg cca gcc aaa cat caa cca gat ttc 2892

Asp Arg Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His Gln Pro Asp Phe

930 935 940

atc tat cta agg cac gtg ccc ctc cgg aaa gtc cat ctc ttc aca gtc 2940

Ile Tyr Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His Leu Phe Thr Val

945 950 955

att cag atg agt tgt ctc ggc ctt ctg tgg ata atc aaa gtt tcg aga 2988

Ile Gln Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile Lys Val Ser Arg

960 965 970

gct gct att gtc ttt cct atg atg gtg ttg gca cta gtg ttt gtg aga 3036

Ala Ala Ile Val Phe Pro Met Met Val Leu Ala Leu Val Phe Val Arg

975 980 985 990

aag ttg atg gac ttc ttg ttt acc aaa cgg gaa ctc agc tgg ctt gat 3084

Lys Leu Met Asp Phe Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu Ser Trp Leu Asp

995 1000 1005

gat tta atg cct gag agt aaa aag aag aaa ctt gaa gat gct gag aaa 3132

Asp Leu Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu Asp Ala Glu Lys

1010 1015 1020

gaa gaa gaa caa agt atg cta gcc atg gag gac gag ggc aca gta caa 3180

Glu Glu Glu Gln Ser Met Leu Ala Met Glu Asp Glu Gly Thr Val Gln

1025 1030 1035

ctc cca ctg gag gga cac tac aga gac gac ccg tct gtg atc aat att 3228

Leu Pro Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser Val Ile Asn Ile

1040 1045 1050

tct gat gaa atg tca aag act gcc atg tgg ggg aac ctt cta gtt act 3276

Ser Asp Glu Met Ser Lys Thr Ala Met Trp Gly Asn Leu Leu Val Thr

1055 1060 1065 1070

gct gac aac tca aaa gaa aag gag tca cgc ttt cct tct aaa agc tcc 3324

Ala Asp Asn Ser Lys Glu Lys Glu Ser Arg Phe Pro Ser Lys Ser Ser

1075 1080 1085

cct tcc taa tcactctaga agctgattcc ccaaagcaat gaaagccgaa aggagaa 3380

Pro Ser

gaaagctgac tcagggaaag gcgttgacag ggagacttgt ctatgacttg atcttcaatt 3440

tattttttac atatatatat atgagaagag tgtcacaatt attaacaaaa ctgctttgat 3500

catgtaattg taaaccctct ctcccatccc accttcatac tgtaagtagt gcaagccttc 3560

attctatttc tgtgttcagc ctctgagcag gtcgacaccc ttgtaagcag atccaatagc 3620

taatgcaaga gtctccagtg ttactgccgt aagacattcg ccaacacagg attctcattg 3680

ttgacattaa gagaacaaag ctttctttaa aagataagtt atatttgcct agtttgtatt 3740

ttcctacctt agtaacctga agatgcctga taattttatt cagaagaatt ttgaaaggta 3800

gtcgtacttt ttatttttta tggcttagca ttcgttactg gttttgaaag acccaaatca 3860

aaaagttact ctgaaagcat ttttaataat tgtatttatg tatttccttg acttaatatg 3920

aaacatttaa tacttaataa ctgttacttc aagtcatttg agaaagagac ctgttcatat 3980

cttcttaaaa gacatactgc aaagagtcaa gtagtgttca cttagaattc aagttgtaac 4040

catgcagtca aaaactaggc ttgtattaaa tgctttagag atatttgaag agttttgtgg 4100

ggcttttcat tttaaatctt taccagaaat atgctactga gtttctctcc cattgacaag 4160

ggttgcttcc cgaataagcc tatgacatac atacttacgg aatgccacat ggtgcaacat 4220

tgtacatttg atgccagccc tggcagctgt tctgctgacc atggtcatgt gctgctaagt 4280

ttggttccta tcatgttgtc atgttagacc aacaggtctc caactgtatt ttgttttttt 4340

tgcaaagctc ttttccacat tttaactaaa tgcatgttgt ggaaaaatag tctttgaaat 4400

aaaatttcag attttgttag aaaaggttat gtaaatactt cagtccatat gaaacagttc 4460

aactttattg aaacaggaag gagattatgg atttttgagt attactaaat ataaatttca 4520

tttaattttc aataaatgtg ctttaataca aaacaaaata tcataggggt cttagttcct 4580

aaaaaagtat caatgattaa caaccttata atctttcaat gtccaggttt agaaaaattc 4640

agagccttct gggttttata aattacatgt actctgtgta aatacacata attagaaaaa 4700

tcctctttgc ttttaagcta atgaagacga gagacaacag agcctacata accttaatat 4760

tctgatatct tgaacaaaaa atttcctcag aatcctttca ggagccattt ttttaatgag 4820

atatgagcca aaattgtgag aagaattttc agttcgtaaa gtctgtattt ataaatggta 4880

aagaaaaatg caaaattctt ttccaaatgt gctacctttg tgatagttgt aatagcgaca 4940

ctctctctaa acattctcgc tgtctatgac ttagcaggcc aatccccaaa gcactctcct 5000

ggtgtctcta gagtgtcatg tctgttctgt tgaaatgacc agtgagtgac acttcacatg 5060

atcactggtt taaacaggca atcagcctat gaaattctgt atttctgaat atttttatag 5120

taattttgtt cttgtgtgaa ttttaatgct atctctatct taatcttaat attttgaaat 5180

cacataaaat ataagaaaat gtagtattct atatttactc taatttcaga ttcctggtca 5240

aaattactga atatcttgaa tgtaatttat tgcaatgttt aagtactgtg taaatgtgac 5300

aggatattgt gtttttcaaa actaagaaat gttatgtgga aataaatatt tatcctaaaa 5360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 5385

<210>2

<211>1088

<212>蛋白质

<213>肌肉

<400>2

Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu Pro Thr

1 5 10 15

Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg Ser Ile

20 25 30

Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg Thr Leu

35 40 45

Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His Arg Arg

50 55 60

His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu Arg Asp

65 70 75 80

Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr Pro Ser

85 90 95

Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His

100 105 110

Leu Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp Arg Glu

115 120 125

Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys Phe Glu

130 135 140

Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr Val Ala

145 150 155 160

Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile Leu Asn

165 170 175

Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Ile Glu Glu Ile Ala

180 185 190

Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser Gly Gln Leu Asn Glu Asp

195 200 205

Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His His Gln

210 215 220

Asn Gln Lys Lys Leu Ala Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser Leu Ala

225 230 235 240

Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn Ser Met Asp Lys Asn Ala

245 250 255

Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro Ala Cys Ala Glu Asn Lys

260 265 270

Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys Val Asp

275 280 285

Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser Asn Ile

290 295 300

Leu Val Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Ala Val Val Ala Phe Val

305 310 315 320

Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Val Pro Ile

325 330 335

Pro Ser Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Leu Gly Lys Gly Gln

340 345 350

Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala Thr Leu Met Thr Asp Glu

355 360 365

Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg Asn Asp Leu Val

370 375 380

Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val Thr Val Leu Pro Pro Gly

385 390 395 400

Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Asn Val Pro Ser

405 410 415

Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro Asn Gly Thr Ala Ala His

420 425 430

Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg

435 440 445

Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Met Leu Asp Ile Lys Arg Lys Ala

450 455 460

Pro Phe Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala Phe Ser Leu Gln Cys Leu

465 470 475 480

Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys Met Ser Pro Val Ile Thr

485 490 495

Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ile

500 505 510

Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly Ile Ala Tyr Ser Leu Phe

515 520 525

Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val Leu Val

530 535 540

Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys Glu Tyr Gly Leu Ser Tyr

545 550 555 560

Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp Thr Ala Thr Leu Cys Ile

565 570 575

Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu Val Cys Tyr IIe Thr Arg

580 585 590

Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile Cys Ile Ile Phe Ile Tyr

595 600 605

Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser Glu Thr Tyr Pro Ile Asn

610 615 620

Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Ser Cys Asn Cys Met

625 630 635 640

Glu Pro His Ser Pro Ser Asn Asp Thr Leu Lys Glu Trp Arg Glu Ser

645 650 655

Asn Leu Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Gly Asn Leu Thr Val Ser Glu

660 665 670

Cys Arg Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly Arg Ala Cys Gly His Gly

675 680 685

His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp Ser Val Ile Leu Phe Phe

690 695 700

Ser Thr Val Thr Met Ser Ala Thr Leu Lys Gln Phe Lys Thr Ser Arg

705 710 715 720

Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val Ser Asp Phe Ala Val Phe

725 730 735

Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp Tyr Ala Ile Gly Ile Pro

740 745 750

Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe Lys Pro Thr Ile Tyr Asp

755 760 765

Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro Asn Pro Trp Trp Thr Ile

770 775 780

Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys Thr Ile Leu Ile Phe Met

785 790 795 800

Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn Arg Lys Glu His Lys Leu

805 810 815

Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu Leu Met Val Ala Val Met

820 825 830

Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro Trp Phe Val Ala Ala Thr

835 840 845

Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu Lys Leu Glu Ser Glu Cys

850 855 860

Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu Gly Ile Arg Glu Gln Arg

865 870 875 880

Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met Gly Ser Ser Val Phe Met

885 890 895

Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly Val Phe

900 905 910

Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly Ile Gln Leu Phe Asp Arg

915 920 925

Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His Gln Pro Asp Phe Ile Tyr

930 935 940

Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His Leu Phe Thr Val Ile Gln

945 950 955 960

Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile Lys Val Ser Arg Ala Ala

965 970 975

Ile Val Phe Pro Met Met Val Leu Ala Leu Val Phe Val Arg Lys Leu

980 985 990

Met Asp Phe Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu Ser Trp Leu Asp Asp Leu

995 1000 1005

Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu Asp Ala Glu Lys Glu Glu

1010 1015 1020

Glu Gln Ser Met Leu Ala Met Glu Asp Glu Gly Thr Val Gln Leu Pro

1025 1030 1035 1040

Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser Val Ile Asn Ile Ser Asp

1045 1050 1055

Glu Met Ser Lys Thr Ala Met Trp Gly Asn Leu Leu Val Thr Ala Asp

1060 1065 1070

Asn Ser Lys Glu Lys Glu Ser Arg Phe Pro Ser Lys Ser Ser Pro Ser

1075 1080 1085

<210>3

<211>4138

<212>DNA

<213>智人

<400>3

taagcagagc gagtgccggg ctgagtgtaa gacactgaag acactgcaga gcaaggtgct 60

tattccagag gcgttacaaa ac atg gag att aaa gac cag gga gcc caa atg 112

Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met

1 5 10

gag ccg ctg ctg cct acg aga aat gat gaa gaa gca gtt gtg gat aga 160

Glu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg

15 20 25

ggt gga act cgt tct att ctc aaa aca cac ttt gag aaa gaa gat tta 208

Gly Gly Thr Arg Ser Ile Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu

30 35 40

gaa ggt cat cga aca cta ttt att gga gta cat gtg ccc ttg gga gga 256

Glu Gly His Arg Thr Leu Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly

45 50 55

aga aaa agc cat cga cgt cac agg cat cgt ggt cat aaa cac aga aag 304

Arg Lys Ser His Arg Arg His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys

60 65 70

aga gac aga gaa aga gat tca gga tta gag gat gga agg gag tca cct 352

Arg Asp Arg Glu Arg Asp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro

75 80 85 90

tct ttt gac acc cca tca cag agg gta cag ttt att ctt gga acc gag 400

Ser Phe Asp Thr Pro Ser Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu

95 100 105

gat gat gac gag gaa cac att cct cat gac ctt ttc aca gaa ctg gat 448

Asp Asp Asp Glu Glu His Ile Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp

110 115 120

gag att tgt tgg cgt gaa ggt gag gac gct gag tgg cga gaa aca gcc 496

Glu Ile Cys Trp Arg Glu Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala

125 130 135

agg tgg ttg aag ttt gaa gaa gat gtg gaa gat gga gga gaa agg tgg 544

Arg Trp Leu Lys Phe Glu Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp

140 145 150

agc aag cct tat gtg gct act ctt tca ttg cac agc ttg ttt gaa ttg 592

Ser Lys Pro Tyr Val Ala Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu

155 160 165 170

aga agt tgt att ctg aat gga act gtg ttg ctg gac atg cat gcc aac 640

Arg Ser Cys Ile Leu Asn Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn

175 180 185

act tta gaa gaa att gca gat atg gtt ctt gac caa caa gtg agc tca 688

Thr Leu Glu Glu Ile Ala Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser

190 195 200

ggt cag ctg aat gaa gat gta cgc cat agg gtc cat gag gca ttg atg 736

Gly Gln Leu Asn Glu Asp Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met

205 210 215

aaa cag cat cat cat cag aat cag aaa aaa ctc acc aac agg att ccc 784

Lys Gln His His His Gln Asn Gln Lys Lys Leu Thr Asn Arg Ile Pro

220 225 230

att gtt cgt tcc ttt gct gat att ggc aag aaa cag tca gaa cca aat 832

Ile Val Arg Ser Phe Ala Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn

235 240 245 250

tcc atg gac aaa aat gca ggt cag gtt gtt tct cct cag tct gct cca 880

Ser Met Asp Lys Asn Ala Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro

255 260 265

gcc tgt gtt gaa aat aaa aat gat gtt agc aga gaa aac agc act gtt 928

Ala Cys Val Glu Asn Lys Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val

270 275 280

gac ttt agc aag gtt gat ctg cat ttt atg aaa aag att cct cca ggt 976

Asp Phe Ser Lys Val Asp Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly

285 290 295

gct gaa gca tcg aac atc tta ctg gga gaa ctg gag ttc ttg gat cga 1024

Ala Glu Ala Ser Asn Ile Leu Leu Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg

300 305 310

aca gta gtt gcg ttt gtc agg ttg tct cca gct gta ttg ctt caa gga 1072

Thr Val Val Ala Phe Val Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly

315 320 325 330

ctg gct gaa gtc cca atc cca acc aga ttt ttg ttc att ctt ctg gga 1120

Leu Ala Glu Val Pro Ile Pro Thr Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly

335 340 345

ccc ctg gga aag ggt caa cag tac cat gag att ggc aga tca att gca 1168

Pro Leu Gly Lys Gly Gln Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala

350 355 360

acc cta atg aca gat gag gta ttt cat gat gtt gcc tat aaa gct aaa 1216

Thr Leu Met Thr Asp Glu Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys

365 370 375

gat cgt aat gac ttg gta tca gga att gat gag ttt ctg gat cag gtt 1264

Asp Arg Asn Asp Leu Val Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val

380 385 390

act gtt ctc cct cct gga gaa tgg gat cca agc att cga ata gag cct 1312

Thr Val Leu Pro Pro Gly Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro

395 400 405 410

ccc aaa aat gtt cct tcc cag gag aag agg aag att cct gct gta cca 1360

Pro Lys Asn Val Pro Ser Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro

415 420 425

aat gga aca gca gct cat ggg gaa gca gag ccc cac gga gga cat agt 1408

Asn Gly Thr Ala Ala His Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser

430 435 440

gga cct gaa ctc cag cga act gga agg att ttt ggg gga ctt att tta 1456

Gly Pro Glu Leu Gln Arg Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Ile Leu

445 450 455

gat atc aaa aga aaa gct cca tac ttc tgg agt gac ttc aga gat gct 1504

Asp Ile Lys Arg Lys Ala Pro Tyr Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala

460 465 470

ttc agc ctg cag tgc tta gca tct ttt cta ttt ctc tac tgc gcg tgt 1552

Phe Ser Leu Gln Cys Leu Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys

475 480 485 490

atg tct cct gtc atc acg ttt gga gga ctg ctg gga gaa gca act gaa 1600

Met Ser Pro Val Ile Thr Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu

495 500 505

ggg cgt ata agt gca att gaa tct ctc ttt gga gca tcc atg acc ggg 1648

Gly Arg Ile Ser Ala Ile Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly

510 515 520

ata gcc tat tct ctc ttt ggt gga cag cct ctt acc ata tta ggc agt 1696

Ile Ala Tyr Ser Leu Phe Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser

525 530 535

aca gga cca gtt ttg gtg ttt gaa aag att ttg ttt aaa ttt tgc aaa 1744

Thr Gly Pro Val Leu Val Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys

540 545 550

gaa tat ggg ctg tca tac cta tct tta aga gct agc att gga ctt tgg 1792

Glu Tyr Gly Leu Ser Tyr Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp

555 560 565 570

act gca act cta tgt atc ata ctt gtg gcc aca gat gct agt tcc ctt 1840

Thr Ala Thr Leu Cys Ile Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu

575 580 585

gtc tgc tac atc act cgg ttt act gaa gaa gct ttt gct tcc ctg att 1888

Val Cys Tyr Ile Thr Arg Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile

590 595 600

tgc atc att ttc att tat gag gcc ctg gag aag ttg ttt gaa ctc agt 1936

Cys Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser

605 610 615

gaa gca tat cca atc aac atg cat aat gat ctg gaa ctg ctg aca caa 1984

Glu Ala Tyr Pro Ile Asn Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln

620 625 630

tac tcg tgt aac tgt gtg gaa ccg cat aat ccc agc aat ggc aca ttg 2032

Tyr Ser Cys Asn Cys Val Glu Pro His Asn Pro Ser Asn Gly Thr Leu

635 640 645 650

aag gaa tgg agg gaa tcc aat att tct gcc tct gac ata att tgg gag 2080

Lys Glu Trp Arg Glu Ser Asn Ile Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Glu

655 660 665

aac cta act gtg tca gaa tgc aaa tca ttg cat gga gag tat gtt gga 2128

Asn Leu Thr Val Ser Glu Cys Lys Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly

670 675 680

cgg gcc tgt ggc cat gat cac cca tat gtt cca gat gtt cta ttt tgg 2176

Arg Ala Cys Gly His Asp His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp

685 690 695

tct gtg atc ctg ttc ttt tcc aca gtt act ctg tca gcc acc ctg aag 2224

Ser Val Ile Leu Phe Phe Ser Thr Val Thr Leu Ser Ala Thr Leu Lys

700 705 710

cag ttc aag act agc aga tat ttt cca acc aag gtt cga tcc ata gtg 2272

Gln Phe Lys Thr Ser Arg Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val

715 720 725 730

agt gac ttt gct gtc ttt ctt aca att ctg tgt atg gtt tta att gac 2320

Ser Asp Phe Ala Val Phe Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp

735 740 745

tat gcc att ggg atc cca tct cca aaa cta caa gta cca agt gtt ttc 2368

Tyr Ala Ile Gly Ile Pro Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe

750 755 760

aag ccc act aga gat gat cgt ggc tgg ttt gtt acg cct tta ggt cca 2416

Lys Pro Thr Arg Asp Asp Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro

765 770 775

aac cca tgg tgg aca gta ata gct gct ata att cca gct ctg ctt tgt 2464

Asn Pro Trp Trp Thr Val Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys

780 785 790

act att cta att ttc atg gac caa cag att aca gct gtc atc atc aac 2512

Thr Ile Leu Ile Phe Met Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn

795 800 805 810

agg aaa gag cat aag cta aag aaa ggt tgt ggg tac cat ctg gac cta 2560

Arg Lys Glu His Lys Leu Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu

815 820 825

tta atg gtg gct gtc atg ctc ggt gta tgc tcc atc atg ggc ctg cca 2608

Leu Met Val Ala Val Met Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro

830 835 840

tgg ttt gtg gct gcc aca gtc ctc tcc atc act cat gtc aat agc cta 2656

Trp Phe Val Ala Ala Thr Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu

845 850 855

aaa ctg gaa tca gaa tgc tca gct cca gga gaa caa ccc aaa ttt ctc 2704

Lys Leu Glu Ser Glu Cys Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu

860 865 870

ggc att cgg gag caa agg gtt act ggg ctt atg att ttt att ctt atg 2752

Gly Ile Arg Glu Gln Arg Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met

875 880 885 890

ggt tca tca gtc ttt atg acc agt att ctg aag ttt att ccc atg cca 2800

Gly Ser Ser Val Phe Met Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro

895 900 905

gtg cta tat gga gtg ttt ctt tat atg ggt gct tca tct cta aag gga 2848

Val Leu Tyr Gly Val Phe Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly

910 915 920

att cag ttc ttt gat agg ata aag ctc ttc tgg atg ccg gca aaa cat 2896

Ile Gln Phe Phe Asp Arg Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His

925 930 935

caa cca gat ttt ata tac cta agg cac gta ccg ctt cga aaa gtg cat 2944

Gln Pro Asp Phe Ile Tyr Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His

940 945 950

ctc ttc aca att att cag atg agt tgc ctt ggc ctt ttg tgg ata ata 2992

Leu Phe Thr Ile Ile Gln Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile

955 960 965 970

aaa gtt tca aga gct gct att gtc tct ccc atg atg gtg tta tcc ctg 3040

Lys Val Ser Arg Ala Ala Ile Val Ser Pro Met Met Val Leu Ser Leu

975 980 985

gtt ttt gta aga aag ttg atg gac ttg ttg ttc acg aaa cgg gaa ctc 3088

Val Phe Val Arg Lys Leu Met Asp Leu Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu

990 995 1000

tgc tgg ttg gat gat ttg atg cct gag agt aag aaa aag aaa ctg gaa 3136

Cys Trp Leu Asp Asp Leu Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu

1005 1010 1015

tat gct gaa aaa gaa gaa gaa caa tgt gtg cta cct atg gaa gat gag 3184

Tyr Ala Glu Lys Glu Glu Glu Gln Cys Val Leu Pro Met Glu Asp Glu

1020 1025 1030

ggc aca gta caa ctc cca ttg gaa ggg cac tat aga gat gat cca tct 3232

Gly Thr Val Gln Leu Pro Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser

1035 1040 1045 1050

gtg atc aat ata tct gat gaa atg tca aag act gcc ttg tgg agg aac 3280

Val Ile Asn Ile Ser Asp Glu Met Ser Lys Thr Ala Leu Trp Arg Ash

1055 1060 1065

ctt ctg att act gcc gat aac tca aaa gat aag gag tca agc ttt cct 3328

Leu Leu Ile Thr Ala Asp Asn Ser Lys Asp Lys Glu Ser Ser Phe Pro

1070 1075 1080

tcc aaa agc tcc cct tcc taa tcactctaga agctgattcc ccaaagcatt 3379

Ser Lys Ser Ser Pro Ser

1085

gaaagccgaa aagagaagaa agctgactca gggatagttg ttgacaggga gacttgtcta 3439

tgactcgatc ttcaatttat tttttacata tatatgagaa gagtgtcaca attattaata 3499

aaactgcttg gatcatgtat ggtaaattct gtccctcaac ccaaatccac tttcatacgg 3559

taagtagggc aaaacttgtt tcatttcggt gttaaaattt cggagcagga gacatccctg 3619

tgagcagaaa caatagccaa tgcagaatct gtgtgttcct tgctgaacgt aagacatttg 3679

taaactggat tctgattgtc agttttatga gagcaatagc ttccttaaag agataagtca 3739

tatacaccta gtttgtattc tcatacttta gagacctgaa gacgcctgat aatttcattc 3799

aggagaattt ttgaaaggta gtcaaacttc tttttagttt ttatagctta gcattagtga 3859

cttatttcaa aagacccaaa tcaaaaagtt agtttgaaag cattttttaa taattgtatt 3919

tatgcatttg gctactgtaa gttttgctcc atggaataat gatgtgatag caaaaatgaa 3979

taagactatg aataagttcc tacatgaagg ttaatgtcag tggtgaaaaa tcttattatg 4039

ctccaatata ctgccagcat gctgagtata cttggatcat aaaaaactgt ttcatttttc 4099

ttatttattt tatgcatagg aatattcatt ccggaattc 4138

<210>4

<211>1088

<212>蛋白质

<213>智人

<400>4

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1 5 10 15

Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg Ser Ile

20 25 30

Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg Thr Leu

35 40 45

Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His Arg Arg

50 55 60

His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu Arg Asp

65 70 75 80

Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr Pro Ser

85 90 95

Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His

100 105 110

Ile Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp Arg Glu

115 120 125

Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys Phe Glu

130 135 140

Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr Val Ala

145 150 155 160

Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile Leu Asn

165 170 175

Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Leu Glu Glu Ile Ala

180 185 190

Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser Gly Gln Leu Asn Glu Asp

195 200 205

Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His His Gln

210 215 220

Asn Gln Lys Lys Leu Thr Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser Phe Ala

225 230 235 240

Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn Ser Met Asp Lys Asn Ala

245 250 255

Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro Ala Cys Val Glu Asn Lys

260 265 270

Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys Val Asp

275 280 285

Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser Asn Ile

290 295 300

Leu Leu Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Thr Val Val Ala Phe Val

305 310 315 320

Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Val Pro Ile

325 330 335

Pro Thr Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Leu Gly Lys Gly Gln

340 345 350

Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala Thr Leu Met Thr Asp Glu

355 360 365

Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg Asn Asp Leu Val

370 375 380

Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val Thr yal Leu Pro Pro Gly

385 390 395 400

Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Asn Val Pro Ser

405 410 415

Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro Asn Gly Thr Ala Ala His

420 425 430

Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg

435 440 445

Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Ile Leu Asp Ile Lys Arg Lys Ala

450 455 460

Pro Tyr Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala Phe Ser Leu Gln Cys Leu

465 470 475 480

Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys Met Ser Pro Val Ile Thr

485 490 495

Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ile

500 505 510

Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly Ile Ala Tyr Ser Leu Phe

515 520 525

Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val Leu Val

530 535 540

Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys Glu Tyr Gly Leu Ser Tyr

545 550 555 560

Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp Thr Ala Thr Leu Cys Ile

565 570 575

Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu Val Cys Tyr Ile Thr Arg

580 585 590

Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile Cys Ile Ile Phe Ile Tyr

595 600 605

Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser Glu Ala Tyr Pro Ile Asn

610 615 620

Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Ser Cys Asn Cys Val

625 630 635 640

Glu Pro His Asn Pro Ser Asn Gly Thr Leu Lys Glu Trp Arg Glu Ser

645 650 655

Asn Ile Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Glu Asn Leu Thr Val Ser Glu

660 665 670

Cys Lys Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly Arg Ala Cys Gly His Asp

675 680 685

His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp Ser Val Ile Leu Phe Phe

690 695 700

Ser Thr Val Thr Leu Ser Ala Thr Leu Lys Gln Phe Lys Thr Ser Arg

705 710 715 720

Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val Ser Asp Phe Ala Val Phe

725 730 735

Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp Tyr Ala Ile Gly Ile Pro

740 745 750

Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe Lys Pro Thr Arg Asp Asp

755 760 765

Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro Asn Pro Trp Trp Thr Val

770 775 780

Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys Thr Ile Leu Ile Phe Met

785 790 795 800

Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn Arg Lys Glu His Lys Leu

805 810 815

Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu Leu Met Val Ala Val Met

820 825 830

Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro Trp Phe Val Ala Ala Thr

835 840 845

Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu Lys Leu Glu Ser Glu Cys

850 855 860

Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu Gly Ile Arg Glu Gln Arg

865 870 875 880

Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met Gly Ser Ser Val Phe Met

885 890 895

Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly Val Phe

900 905 910

Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly Ile Gln Phe Phe Asp Arg

915 920 925

Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His Gln Pro Asp Phe Ile Tyr

930 935 940

Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His Leu Phe Thr Ile Ile Gln

945 950 955 960

Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile Lys Val Ser Arg Ala Ala

965 970 975

Ile Val Ser Pro Met Met Val Leu Ser Leu Val Phe Val Arg Lys Leu

980 985 990

Met Asp Leu Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu Cys Trp Leu Asp Asp Leu

995 1000 1005

Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Lys Glu Glu

1010 1015 1020

Glu Gln Cys Val Leu Pro Met Glu Asp Glu Gly Thr Val Gln Leu Pro

1025 1030 1035 1040

Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser Val Ile Asn Ile Ser Asp

1045 1050 1055

Glu Met Ser Lys Thr Ala Leu Trp Arg Asn Leu Leu Ile Thr Ala Asp

1060 1065 1070

Asn Ser Lys Asp Lys Glu Ser Ser Phe Pro Ser Lys Ser Ser Pro Ser

1075 1080 1085

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>智人

<400>5

tttggagaaa acccctggt 19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>智人

<400>6

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<211>20

<212>DNA

<213>智人

<400>7

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<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>智人

<400>8

gttgtaatag cgacactc 18

Claims

1.一种蛋白质，它由序列表SEQ ID NO：2或NO：4所示的氨基酸序列组成。

2.一种蛋白质，它包含相对于序列表SEQ ID NO：2或NO：4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列，当该蛋白质在细胞中表达时，它具有将胞外的Na⁺和HCO₃ ^-输送到细胞内与胞内的Cl^-交换的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能。

3.一种细胞，该细胞中表达了权利要求1或2所述的蛋白质，其中该细胞的种类与该蛋白质之一的原始种类不同。

4.一种抗体，它针对权利要求1或2所述的蛋白质。

5.一种选择钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的激动剂和拮抗剂的方法，该方法包括使权利要求3所述的细胞与候选化合物接触，测定钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能，将所得结果与未接触候选化合物的权利要求3所述细胞的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能测定所得的结果相比较，确定该候选化合物是否增强或抑制该功能，其中所述钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能是将胞外的Na⁺和HCO₃ ^-输送到细胞内与胞内的Cl^-交换。

6.一种DNA，它由序列表SEQ ID NO：1或NO：3所示的核苷酸序列组成。

7.一种DNA，它由序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中核苷酸67-3330组成的核苷酸序列组成。

8.一种DNA，它由序列表SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中核苷酸83-3346组成的核苷酸序列组成。

9.一种DNA，该DNA包含的核苷酸序列相对于包含序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中核苷酸67-3330的DNA的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***的核苷酸序列，且该DNA编码：

(1)含有序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，或

(2)含有相对于序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质在细胞中表达时具有将胞外的Na⁺和HCO₃ ^-输送到细胞内与胞内的Cl^-交换的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能。

10.一种DNA，该DNA包含的核苷酸序列相对于包含序列表SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中核苷酸83-3346的DNA的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***，且该DNA编码：

(1)含有序列表SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质，或

(2)含有相对于序列表SEQ ID NO：4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质在细胞中表达时具有将胞外的Na⁺和HCO₃ ^-输送到细胞内与胞内的Cl^-交换的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能。