CN1238375C - 钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含有序列表SEQ ID NO:1或NO:3所示的编码Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的核苷酸序列的DNA,包含SEQ ID NO:2或NO:4所示氨基酸序列的蛋白质,以及它们的类似蛋白质,这些类似蛋白质的氨基酸序列含有氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列,这些蛋白质在细胞中表达时具有Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的功能,以及异源表达该蛋白质的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及人和小鼠Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白(钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白(sodium ion-driven chloride/bicarbonate exchanger)),它是一类涉及胞内pH调节的蛋白质。更具体地说,本发明涉及钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白,经设计表达该蛋白质之一的细胞,这些细胞与原始表达蛋白质之一的种类不同,编码该蛋白质的DNA,针对该蛋白质的抗体,以及选择钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的激动剂/拮抗剂的方法。
背景技术
响应各种刺激的胞内pH(pHi)的调节是众多细胞功能中一种关键的功能。在动物细胞中,碳酸氢根运载蛋白家族是生理条件下的一种主要的pHi调节剂。碳酸氢根(HCO3 -)运载蛋白根据其功能分为四类[Boron,W.F,等人,J.Exp.Biol.,200:263-268(1997)]:Na+非依赖性Cl-/HCO3 -交换蛋白(也称为阴离子交换蛋白,AE),Na+-HCO3 -共同运载蛋白(NBC),K+-HCO3 -共同运载蛋白,和Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白。现在已经克隆了三种AE和三种NBC,并对它们作了功能鉴定,但是K+-HCO3 -共同运载蛋白以及Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的分子结构仍然未知。
Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白首先发现于无脊椎动物神经元内,后来发现于脊椎动物神经元和非神经元细胞中,包括脑细胞、血管内皮细胞、***、肾和胰β-细胞。Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白是一种胞内pH调节剂,它将胞外的Na+和HCO3 -输送到细胞内与胞内的Cl-交换,从而在细胞碱化中起重要作用。
在胰β-细胞中,葡萄糖是胰岛素分泌最重要的生理调节剂。葡萄糖代谢诱导胰细胞中胞内pH提高。已经表明,这种葡萄糖诱导的pHi升高主要由Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白作用引起[Pace,C.S.等人,J.Membrane Biol.,73:39-43(1983)]。
因此,Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白是各种细胞中重要的胞内pH调节剂,但是其分子学基础未知。分析Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的分子结构和功能不仅对于胰β-细胞分泌胰岛素的功能分析有价值,而且对于根据该分子结构进行目的为开发糖尿病治疗药物的筛选和药物设计也有价值。
在上述背景下,本发明的目的是克隆Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白,从而获得其DNA用于测序,提供表达该DNA的不同种类的细胞,以及测定Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的结构和功能。
发明内容
因此,本发明提供了含有序列表中SEQ ID NO:2或NO:4所示氨基酸序列的Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白。
本发明还提供了包含相对于序列表中SEQ ID NO:2或NO:4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质,当该蛋白质在细胞中表达时,它有Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的功能。
本发明还提供了上述蛋白质,其中Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白依靠胞外碳酸氢根和胞内氯离子将胞外钠离子摄入细胞内,并将胞内钠离子转运到细胞外。
本发明还提供了一种细胞,该细胞中表达了上述蛋白质中的一种,其中该细胞的种类与该蛋白质之一的原始种类不同。这些不同种类的细胞的非限制性例子包括Xenopus laevis***和HEK293细胞。Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白在这些不同种类细胞中的表达可通过编码Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的DNA的转染,或对应于Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的cRNA的导入来实现。
本发明还提供了针对上述蛋白质的抗体。这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
本发明还提供了选择Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的激动剂和拮抗剂的方法,该方法包括使表达该蛋白质的不同种类的细胞与候选化合物接触,测定Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白功能,将所得结果与通过未接触候选化合物的细胞的Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白功能所测得结果相比较,从而确定该候选化合物是否增强或抑制该功能。
本发明还提供了包含序列表SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA,含有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核苷酸67-3330组成的核苷酸序列的DNA,以及含有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核苷酸83-3346组成的核苷酸序列的DNA。
本发明还提供了一种DNA,该DNA的核苷酸序列相对于序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中核苷酸67-3330的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***,且该DNA编码:
(1)含有序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质,或
(2)含有相对于序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质,该蛋白质在细胞中表达时起Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的功能。
本发明还提供了一种DNA,该DNA的核苷酸序列相对于序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中核苷酸83-3346的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***,且该DNA编码:
(1)含有序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白质,或
(2)含有相对于序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质,该蛋白质在细胞中表达时起Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的功能。
附图说明
图1显示了大鼠组织和分泌激素的细胞系中NCBE mRNA的RNA印迹分析(a),和小鼠胰岛NCBE mRNA的RT-PCR(b)。
图2说明了胞外Na+浓度对于22Na+摄入的影响。
图3说明了胞外HCO3 -浓度对于22Na+摄入的影响。
图4说明了胞内Cl-对于36Cl-流出量的影响。
图5说明了DIDS对于22Na+摄入的影响。
图6说明了在300μM DIDS存在和不存在下,胞内pH的变化以及对照(未转染)细胞中胞内pH的变化。
图7说明了在无HCO3 -的条件下当将环境从无Na+溶液切换到含Na+溶液时观察到的胞内pH变化。
图8说明了在无Cl-的条件下当将环境从无Na+溶液切换到含Na+溶液时观察到的胞内pH变化。
具体实施方式
在本发明中,表达本发明蛋白质的不同种类的细胞例如可以是Xenopus laevis***和HEK293细胞,它们是根据给定目的从小鼠或人以外的各种细胞中选出的。利用本领域熟知的常规方法可使与蛋白质来源种类不同的细胞种类表达本发明蛋白质。
在本说明书中,术语“一个或多个”在用于“有一个或多氨基酸发生缺失、置换、加入或***的氨基酸序列”中时,通常指1-10的数,较佳的为一个至几个(例如3或4个)。
另外,在本说明书中,术语“一个或多个”在用于“有一个或多核苷酸发生缺失、置换、加入或***的DNA”中时,通常指1-10的数,较佳的为一个至几个(例如3或4个)。
利用重组DNA技术,可产生各种突变型DNA以及这些DNA编码的突变型蛋白质。首先,可通过各种不同的化学或酶促方法将突变导入克隆的DNA片段内。然后对所得突变型DNA进行测序,以便选出具有所需优点的特定突变型。该方法能***地制备不同的突变型,无论其表型如何。制备突变型克隆的常用方法如下。
1.利用寡核苷酸,可在给定DNA序列中直接诱导一个或多个核苷酸发生置换、缺失、***或加入。该方法可将多个突变导入给定DNA的一个小区域内。
2.利用较长的寡核苷酸,可以合成所需基因。
3.利用区域特异性诱变技术,可将所需突变导入大的(1-3kb)DNA区域中。
4.DNA的接头扫描诱变是一种适合于将一簇点突变导入一较小(4-10bp)DNA区域中的方法。
5.还可用PCR作为直接导入突变的方法。
[参考文献:《当代分子生物学方法》,第3卷,Ausubel F.M.等人编辑,John Wiley& Sons,Inc.,Current Protocols,第1卷,第8章:“克隆DNA的诱变”,8.0.1-8.5.10页]
制备能表达包括上述方法所得不同突变的所需基因的质粒或其它载体的方法也是本领域技术人员所熟知的。即,用限制性酶和连接酶的组合将包含所需基因的DNA***表达载体DNA中,不难构建携带所需基因的重组质粒。然后将这样获得的重组质粒导入不同细胞中以转染这些细胞,从而产生转化的细胞。可采用的细胞范围包括原核细胞如大肠杆菌,到酵母、昆虫、植物和动物细胞。
[参考文献:《载体的基本资料》Gacesa P.和Ramji D.P.,166页,BIOS ScientificPublishers Limited 1994.,John Wiley & Sons in association with BIOS ScientificPublishers Ltd.″表达载体″,9-12页]
重组质粒导入宿主细胞可通过氯化钙方法或电穿孔来实现。氯化钙方法是实现转化的一种有效的方法,无需任何为其特殊设计的装置。如果需要更高的效率,建议采用电穿孔。
[参考文献:《当代分子生物学方法》,第3卷,Ausubel F.M.等人编辑,John Wiley& Sons,Inc.,Current Protocols,第1卷,1.8单元:“质粒DNA引入细胞内”,1.8.1-1.8.10页]
通常在动物细胞系上进行的转染已知有两类,即瞬时和永久型。在瞬时转染中,培育转化的细胞1至4天,以实现导入基因的转录和复制,然后收获细胞分析它们的DNA。或者,在许多研究中,产生稳定的转化子细胞系,其中导入的基因被掺入染色体中。转染方法的例子包括磷酸钙法、电穿孔以及脂质融合方法。
[参考文献:《当代分子生物学方法》,第3卷,Ausubel F.M.等人编辑,John Wiley& Sons,Inc.,Current Protocols,第1卷,第9章:“DNA引入哺乳细胞内”,9.0.1-9.17.3页]
用本领域熟知的方法不难制得针对本发明的Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的多克隆和单克隆抗体、或它们的片段或类似物。如此获得的抗体例如可用于不同种类细胞表达的Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的免疫组织化学,或用于通过阻断该蛋白抑制其功能。Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白功能受抑制的不同种类的细胞在选择该蛋白质的激动剂/拮抗剂中可用作对照。
以毫克规模制得针对本发明Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白的单克隆抗体的通用方法如下:用该抗原蛋白之一接种小鼠进行免疫。从显示有足够抗体滴度的小鼠中取出脾脏。分离脾细胞,选出B细胞与B细胞来源的骨髓瘤细胞融合形成分泌该抗体的杂交瘤细胞。用亲和层析、离子交换或凝胶过滤等方法从培养液中纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。本发明的多克隆抗体可用以下的常规方法制得:用家兔、马、小鼠或豚鼠作为受免疫动物,按照本领域已知的一个方案接种抗原蛋白来免疫动物,然后从收集的血清中分离出IgG等。
[参考文献:《当代分子生物学方法》,第3卷,Ausubel F.M.等人编辑,John Wiley& Sons,Inc.,Current Protocols,第2卷,11章:“免疫学”,11.0.1-11.16.13页]
实施例
下面本发明将参照实施例作更详细的描述。然而本发明并不局限于这些实施例。
为了测定其结构和功能作用,本发明从MIN6(分泌胰岛素的小鼠细胞系)的cDNA文库克隆了Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白(命名为NCBE)。下面将描述Na+推动的氯离子(Cl-)/碳酸氢根(HCO3 -)交换蛋白(NCBE)的一级结构、组织分布和功能特征。
已经揭示,小鼠NCBE蛋白质(SEQ ID NO:2)由1088个氨基酸组成,其与人肌肉、视网膜和肾的碳酸氢钠共运载蛋白分别有65、65和41%的氨基酸相同性。已经发现小鼠NCBE具有阴离子交换蛋白和碳酸氢钠共运载蛋白特征性的10个推定的跨膜区域和保守的4,4′-二异硫氰酸二苯乙烯-2,2′-二磺酸(DIDS)结合基序。已经表明NCBE mRNA在脑和小鼠胰岛瘤细胞系MIN6中高水平表达,但在垂体、睾丸、肾和回肠中也有低水平表达。通过对Xenopus laevis***和HEK293细胞中表达的NCBE蛋白质的功能分析,证实该蛋白质通过将胞外Na+和HCO3 -转运入细胞内与胞内Cl-交换而使胞内pH升高。根据这一发现,本发明中得出结论,即克隆的NCBE是天然细胞中调节胞内pH的Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白。
然后,为了另行鉴定人NCBE,首先用PCR扩增上述所得小鼠Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白cDNA的部分序列(2746bp)。对于该扩增,用序列表SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸250-270组成的序列的DNA片段作为有义引物,用具有与序列表SEQID NO:1所示序列核苷酸2976-2995组成的序列互补的序列的DNA片段作为反义引物。PCR条件如下:
最初变性:94℃,2分钟
扩增(20轮)
·变性:94℃,15秒
·退火:60℃,30秒
·延伸:72℃,2分钟
最终延伸:72℃,7分钟
以切口平移法用32P-dCTP标记所得PCR产物,用于从人胎脑cDNA文库(Clontech)中筛选出大约1百万个噬菌体。获得4个阳性克隆,用EcoRI消化它们的DNA。琼脂糖电泳后,切下对应的条带,提取出各自DNA,获得***物。另外,用EcoRI消化pGEM72(Promega)并用碱性磷酸酶处理。在其中分别连接入从阳性噬菌体获得的***物,用于亚克隆。然后,在自动测序仪(ABI 310)上对各***物分别测序,根据所得序列,确定对应于人NCBE蛋白质的cDNA核苷酸序列(如SEQ ID NO:3所示)。根据该结果,确定人NCBE蛋白的序列(如序列表SEQ ID NO:4所示)。
下面将侧重于所按照的程序以及小鼠NCBE获得的结果来描述上述实验的方法和结果。
[材料和方法]
<cDNA克隆>
用人肾cDNA作为模板,PCR扩增人肾NBC cDNA的部分cDNA片段[Burnham,C.E.,等人,J.Biol.Chem.272:19111-19114(1997)]。其中所用的有义和反义引物是5′-TTTGGAGAAAACCCCTGGT-3′(核苷酸2232-2250)(SEQ ID NO:5)和5′-TGACATCATCCAGGAAGCTG-3′(核苷酸2912-2931)(SEQ ID NO:6)。在热循环仪GeneAmp PCR***9600(PE Applied biosystems,Foster,CA)中,在下列条件下进行40轮PCR:94℃变性15秒,60℃退火30秒,72℃延伸45秒。如以前所述[Fukumoto,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5434-5438(1988)],用700bp的PCR产物作为探针,在低严谨度条件下筛选MIN6 cDNA文库[Inagaki,N.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2679-2638(1994)]。将阳性克隆亚克隆到pGEM-3Z载体(Promega,Madison,WI)中,用ABI PRISMTM 377 DNA测序仪(PE Applied Biosystems)在两个方向上测序。
<RNA印迹分析>
用来自各种组织和细胞的10微克总RNA进行RNA印迹分析。用甲醛使RNA变性,在1%琼脂糖凝胶上电泳,转移到尼龙膜上。在前述[Wang,C-Z.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,220:196-202(1996)]标准条件下,用NCBE cDNA探测印迹。在放射自显影之前,用0.1×SSC和0.1 SDS在室温下洗涤印迹1小时,然后在50℃下再洗涤1小时。
<反转录聚合酶链反应(RT-PCR)>
用TRIZOL试剂(Life Technologies,Inc.,Rockvill,MD)从分离的小鼠胰岛制得总RNA。用SuperscriptTM II反转录酶(Life Technologies)和随机引物产生第一链cDNA(10毫微克)。用1毫微克模板DNA,在20微升反应体积中标准条件下用ExpandHigh Fidelity PCR***(Roch Diagnostics,Mannheim,Germany)进行PCR。所用的有义和反义引物是5′-GTCATGTTAGACCAACAGGT-3′(核苷酸4283-4302)(SEQ ID NO:7)和5′-GTTGTAATAGCGACACTC-3′(核苷酸4911-4928)(SEQ ID NO:8)。在1%琼脂糖凝胶上分辨该PCR产物,用DNA测序确认。
<Xenopus laevis***中NCBE的功能分析>
如前所述(Wang,C-Z.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,220:196-202(1996)),用FspI消化,使pSD5中的NCBE的编码序列线性化,并用SP6 RNA聚合酶作体外转录。将NCBE cRNA(50毫微升,0.5微克/微升)或水注射入去除泡囊的***中,研究前在1×MBS培养基(88mM NaCl,1mM KCl,0.8mM MgCl2,0.4mM CaCl2,0.3mM Ca(NO3)2,2.4mM NaHCO3和7.5mM Tris,pH7.4)中于18℃培育3-5天。***在标准溶液(100mM NaCl,2mM KCl,1mM MgCl2,1mM CaCl2,和8mM NaHCO3,pH7.4)中于18℃预培育1小时。
为了研究对胞外Na+浓度的依赖性,然后将***培育在1.4毫升鼓入1.5%CO2的1、10、30或100mM Na+溶液(pH7.4,有0.074MBq 22Na+(NENTM Life ScienceProducts,Boston,MA))中。在每种溶液中,用等摩尔量的胆碱代替标准溶液的Na+。从培育溶液中取出10微升等份,用于随后测定22Na+比活。15分钟后,终止22Na+的摄入,方法是分别用含有1、10、30或100mM Na+的冰***液(pH7.4)洗涤三次,然后使***在0.5毫升5%SDS中裂解,加入4.5毫升水性计数闪烁剂(AmershamPharmacia Biotech)。22Na+摄入在不含Cl-的1、10、30或100mM Na+溶液(pH7.4)中进行。胞外Cl-用等摩尔量的葡糖酸代替,胞外Na+用等摩尔量的N-甲基-D-葡聚糖胺(NMG)代替。另外,还在300μM 4,4′-二异硫氰酸二苯乙烯-2,2′-二磺酸(DIDS,Sigma,它是标准溶液中阴离子运载蛋白的抑制剂)存在或不存在下,检查15分钟的22Na+摄入。
为了研究对胞外HCO3 -浓度的依赖性,在18℃下,在pH7.4、鼓入1.5%CO2、含有0.074MBq 22Na+的1、3、10或30mM HCO3 -溶液中进行Na+摄入实验。溶液含有2mM KCl,1mM MgCl2和1mM CaCl2,pH7.4,1mM HCO3 -溶液中还含有107mM NaCl和1mM NaHCO3;3mM HCO3 -溶液中还含有105mM NaCl和3mM NaHCO3,10mMHCO3 -溶液中还含有98mM NaCl和10mM NaHCO3,30mM HCO3 -溶液中还含有78mMNaCl和30mM NaHCO3。
对于36Cl-流出量实验,使***在不含Cl-的溶液中预培育1小时,以消耗除去胞内Cl-,或在含有Cl-的标准溶液中培育。使***在18℃、鼓入1.5%CO2、含有0.074MBq 36Cl-的溶液(NENTM Life Science Products)中培育1小时。用对应的各溶液迅速洗涤***三次,然后转移到1.5毫升鼓入1.5%CO2、pH7.4、不含Cl-的各个溶液中。从培养液中取出10微升等份用于以后测定36Cl-比活。在0、5、15、25和35分钟时,测定溶液中36Cl-的活性。如上所述处理***,用于测定胞内剩余的36Cl-。对各时间点的培养基部分进行计数,归纳数值,以确定流通量。36Cl-流出量表示成相对于细胞36Cl-释放总量的百分数。用β闪烁计数器(Aloka,Japan)测定22Na+和36Cl-活性。
<HEK293细胞中NCBE的功能分析>
在每个含盖波片的直径为3.5厘米的碟中以3×105的细胞密度接种HEK293细胞,在95%空气和5%CO2的湿润条件下,37℃下培育在添加了10%胎牛血清、链霉素(60.5微克/毫升)和青霉素(100微克/毫升)的Dulbecco′s改进的Eagele′s培养基(DMEM,高葡萄糖)中。用脂转染胺试剂(Lipofectamnine)、Lipofectamine Plus和Opti-MEM I试剂(Life Technologies,Gaithersburg,MD),根据生产商说明书,用1微克pcDNA3.1载体(Invitrogen,Groningen,The Netherlands)中的全长NCBE cDNA转染细胞。转染后,研究细胞48-72小时。用2′,7′-二-(2-羧乙基)-5-(6)-羧基荧光素,乙酰氧甲酯(BCECF-AM,Molecular Probe,Eugene,OR)(Burnham,C.E.,等人,J.Biol.Chem.,272:19111-19114(1997))监测胞内pH变化。在HEK293细胞中加入1μM BCECF-AM 1小时,用计算机化图象处理器(Argus-50;Hamamatsu Photonics,Hamamatsu,Japan)通过双重激发波长方法(490纳米/450纳米;520-560纳米发射),监测胞内pH的变化。测定在切换成测试溶液前和切换10分钟后胞内pH之间的差值ΔpHi。用KCl/尼日菌素技术(Thomas,J.A.等人,Biochemistry 18:2210-2218(1979))产生pHi标定曲线。在所有实验中,细胞首先用含40mM NH4Cl的溶液通过NH4 +前置脉冲来酸化5分钟,然后切换成含有Na+的各个测试溶液(Burnham,C.E.,等人,J.Biol.Chem.,272:19111-19114(1997))。
为了估计胞内酸化恢复胞内pH(ΔpHi)的Na+依赖性,采用不含Na+的溶液(115mM四甲基氯化铵(TMA-Cl),25mM KHCO3,0.8mM K2HPO4,0.2mM KH2PO4,1mM CaCl2,1mM MgCl2,10mM HEPES)和含有Na+的溶液(用90mM NaCl,25mM KCl和25mMNaHCO3代替不含Na+溶液中的TMA-Cl和碳酸氢钾)。
为了测试HCO3 -依赖性,采用不含HCO3 -、不含Na+的溶液(115mM TMA-Cl,0.8mM K2HPO4,0.2mM KH2PO4,1mM CaCl2,1mM MgCl2,10mM HEPES)和不含HCO3 -、含有Na+的溶液(用90mM NaCl和25mM KCl代替不含HCO3 -,不含Na+溶液中的TMA-Cl)。
为了测定Cl-依赖性,采用不含Cl-、不含Na+的溶液(25mM KHCO3,0.8mMK2HPO4,0.2mM KH2PO4,10mM HEPES,115mM NMG-葡糖酸盐)和不含Cl-、含Na+的溶液(其中用115mM葡糖酸钠代替NMG-葡糖酸盐),相互比较结果。
所有溶液中鼓入95%O2和5%CO2,它们的pH调节至7.4。用蔗糖调节各溶液的重量渗透克分子浓度。试验在37℃下进行。
<统计分析>
结果表示成平均值±标准误差。实验之间的统计学意义用司徒登特t检验确定。
[结果和讨论]
NCBE在结构上与Na+-HCO3 -运载蛋白有关。
如上所述,用部分人肾Na+-HCO3 -共运载蛋白(NBC)cDNA作为探针,筛选MIN6cDNA,克隆得到编码Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白(NCBE)的cDNA。如此测得的核苷酸序列(NCBE)示于序列表SEQ ID NO:1中。复合的5385bp核苷酸序列含有一个开放读框,它在“ATG”上游框内终止信号之后,编码了SEQ ID NO:1所示1088个氨基酸的蛋白质,其预计分子量为122kDa。疏水性分析表明,该氨基酸序列分别在下列位置具有推定的跨膜片段(TM1-TM10)。
TM1:氨基酸479-499
TM2:氨基酸514-534
TM3:氨基酸564-584
TM4:氨基酸693-713
TM5:氨基酸733-753
TM6:氨基酸780-800
TM7:氨基酸826-846
TM8:氨基酸882-901
TM9:氨基酸905-924
TM10:氨基酸972-992
在该氨基酸序列中,在第三(TM3)和第四(TM4)跨膜区之间胞外环中有三个潜在的N-连接的糖基化位点(Asn-647,Asn-657和Asn-667)。推定的DIDS结合基序是氨基酸815-818。
NCBE和其它NBC的氨基酸序列比较表明,NCBE与人肌肉NBC[Pushkin,A.等人,J.Biol.Chem.,274:16569-16575(1999)]、人视网膜NBC[Ishibashi,K.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,24:535-538(1998)]、以及人肾NBC[Burnham,C.E.,等人,J.Biol.Chem.,272:19111-19114(1997)]分别有65%、65%和41%的氨基酸相同性。这表明,NCBE代表了新的碳酸氢根运载蛋白。推定跨膜区中的氨基酸序列以及DIDS结合基序Lys Leu Lys Lys(残基815-818)在NCBE中是高度保守的,而胞内氨基和羧基端区域以及第三和第四跨膜区之间的大的胞外环中的氨基酸有相当的差异。
NCBE在脑细胞以及分泌胰岛素的克隆的胰β-细胞中高水平表达。
RNA印迹分析揭示,脑细胞和胰岛素分泌性细胞系MIN6细胞中高水平地表达了5.5kb的NCBE mRNA,而其在垂体、睾丸、肾和回肠中的表达水平低(图1a)。RT-PCR分析显示NCBE在胰岛中也有表达(图1b)。
在该图中,“a”代表NCBE mRNA在大鼠组织和分泌激素的细胞系中的RNA印迹分析结果。图中显示了杂交转录物的大小。“b”代表小鼠胰岛中NCBE mRNA的RT-PCR检测结果。DNA长度标记物和RT-PCR产物分别显示在泳道1和2中。
NCBE是一种调节胞内pH(pHi)的Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白。
本发明者用Xenopus laevis***体系检查了NCBE的功能性质。在注射cRNA或水(对照)后3-5天,测定22Na+摄入和36Cl-流出量。通过鼓入1.5%CO2使***酸化,本发明者首先检查了胞外Na+浓度对于22Na+摄取的影响。结果显示在图3中。
图3描述了22Na+摄入(毫微摩尔/***/小时)与胞外Na+浓度之间的关系。在该图中,■和●表示用注射有NCBE cRNA的细胞获得的结果,□和○表示用注射水的细胞获得的结果。■和□表示用含有Cl-的胞外溶液获得的结果,●和○表示用不含Cl-的胞外溶液获得的结果。各数据均用两个独立实验的7-16个***的平均值±标准误差(SE)表示。*和(p<0.05)表示与注射水细胞的差别以及与在不含Cl-的分别有10、30或100mM Na+的胞外溶液中培育的差别有/没有统计学意义。
如图2所示,22Na+摄入的增加依赖于胞外Na+浓度,在注射了NCBE cRNA的***中在Na+浓度的生理范围内观察到这种依赖呈线性方式。注射了水的***显示22Na+摄入没有增加。比较含Cl-和不含Cl-溶液所得结果之间的Na+摄入表明,有胞外Cl-存在时的Na+摄入明显高于没有胞外Cl-时(图2)。这些结果表明,NCBE将胞外Na+转运入细胞内,且胞外Cl-参与促进NCBE的活性。
然后,本发明者检查了胞外碳酸氢根离子对22Na+摄入的影响。结果显示在图3中。各数据均用两个独立实验的11-16个***的平均值±标准误差(SE)表示。*(p<0.05)表示与注射水细胞的比较。从该图看出,增加胞外碳酸氢根离子能以浓度依赖性方式显著增加注射了NCBE cRNA的***的Na+摄入,而注射水的***不显示钠摄入的任何变化。这些结果表明,胞外碳酸氢根离子是将Na+转运到细胞中所必需的。
为了确定Cl-是否由NCBE转运出入细胞,本发明者检查了Xenopus laevis***的36Cl-流出量。由于在注射了水的***中没有检测到36Cl-流入量,因此只分析注入NCBE cRNA的***的36Cl-流出量。在胞内Cl-消耗的条件下(用不含Cl-的溶液预培育)和胞内Cl-未消耗的条件下(与含有Cl-的溶液预培育),测定从0到35分钟注射了NCBE cRNA的***的36Cl-流出量比例(%)。结果显示在图4中。在该图中,●表示在胞内Cl-未消耗的条件(与含有Cl-的溶液预培育)下的细胞所得结果,▲表示在胞内Cl-消耗的条件(与不含Cl-的溶液预培育)下的细胞所得结果。数据用三个独立实验的16-17个***的平均值±标准误差(SE)表示。*(p<0.05)表示5、15、25和35分钟时与胞内Cl-消耗的细胞的比较。
不同条件下36Cl-流出量结果的比较表明,NCBE将胞内Cl-转运到细胞外。总之,这些结果证明NCBE使胞外Na+以及碳酸氢根离子与胞内Cl-交换。
本发明者还检查了阴离子运载蛋白抑制剂DIDS对22Na+摄入的影响。在有或没有0.3mM DIDS存在下评价了表达。结果示于图5。数据用三个独立实验的21-22个***的平均值±标准误差(SE)表示。*(p<0.05)表示与cRNA+DIDS的比较。
在没有DIDS时,注射了NCBE cRNA的***的22Na+摄入为31.4±2.1毫微摩尔/***/小时(n=21),在300μM DIDS存在下为6.0±0.7毫微摩尔/***/小时(n=14)。在注射水的***中,没有和有DIDS存在时的钠摄入分别为1.6±0.3(n=22)和2.1±0.4(n=19)毫微摩尔/***/小时。因此,表明DIDS部分抑制NCBE驱使的22Na+摄入(图5)。
为了阐明NCBE在调节胞内pH中的作用,用经NCBE瞬时转染的HEK293细胞在不同条件下测定胞内pH的变化。所有实验均在用NH4 +前置脉冲酸化胞内pH的条件下进行。为了确定胞内pH变化是否依赖于胞外Na+,将细胞环境从不含Na+的溶液切换到含有Na+的溶液。结果显示在图6中。图6描述了对照(未转染)细胞和NCBE转染细胞加或不加300μM DIDS的描绘图。细胞环境从不含Na+的溶液切换成含有Na+的溶液。
如图所示,在1mM 5-(N-乙基-N-异丙基)-氨氯吡脒(EIPA)(Na+/H+交换蛋白的特异性抑制剂)存在下,仅在NCBE转染细胞中观察到胞内pH(ΔpHi)恢复迅速(NCBE转染细胞中的ΔpHi为0.239±0.028(n=97),在对照中为0.003±0.015(n=70)。p<0.05)(图6)。此胞内pH的恢复部分受到300μM DIDS的抑制(ΔpHi为0.023±0.042(n=89)。p<0.05)。
为了确定胞内pH的该变化是否依赖于碳酸氢根离子,在1mM EPIA存在下,将NCBE转染细胞的环境从不含HCO3 -、不含Na+的溶液换成不含HCO3 -、但是含Na+的溶液。然而,如图7所示,未检测到胞内pH有恢复(ΔpHi为0.002±0.014(n=71))。
最后,本发明者还检查了Cl-依赖性。在整个实验中,将NCBE转染细胞置于不含Cl-的溶液中(在胞外Cl-消耗的条件下)。在该条件下,将细胞环境从不含Na+的溶液换成含有Na+的溶液。如图8所示,在1mM EIPA存在下,未检测到胞内pH恢复[ΔpHi为0.067±0.012(n=95)]。
这些结果表明,只有当胞外Na+和HCO3 -以及胞内Cl-存在时,胞内pH才会胞内酸化恢复。
Xenopus laevis***和HEK293细胞中异源表达的NCBE功能研究表明NCBE能通过转运胞外Na+和HCO3 -与胞内Cl-交换而短时胞内酸化恢复胞内pH(图3和4)。NCBE在功能上与以前报道的阴离子交换蛋白以及Na+-HCO3 -共同运载蛋白有显著不同。这是因为:1)在Xenopus laevis中表达的NCBE表现出Na+摄入增加依赖于胞内Cl-,2)它表现出能将Cl-输送到细胞外,和3)HEK293细胞中表达的NCBE以依赖于胞外Na+和HCO3 -以及胞内Cl-的方式使胞内pH升高。这些性质与天然细胞中所述的Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白相似。因此,得出结论,克隆的NCBE是一种Na+推动的Cl-/HCO3 -交换蛋白。
NCBE的可能的生理学相关性
NCBE mRNA在胰岛素分泌性细胞系MIN6和胰岛中表达暗示了它的生理相关性。现已表明,葡萄糖诱导的胰岛素分泌伴随着胰β-细胞胞内pH的升高。尽管已经提出胰β-细胞中存在几种胞内pH调节剂,但是它们的分子基础至今仍不知道。NCBE是一级结构和功能性质已经确定的第一个调节胞内pH的交换蛋白(exchager)。NCBE最有可能对因葡萄糖代谢而酸化的胰β细胞中胞内pH的恢复过程有贡献。NCBEmRNA也存在于睾丸中,但是其表达水平很低。现已表明,胞内pH调节***的许多功能,包括***获能。由于***获能使得胞内pH升高,它需要功能性的Na+、Cl-和HCO3 -依赖型酸流出通道,因此NCBE可能参与***获能过程。NCBE mRNA也在脑中高水平表达。尽管生理学研究提示NCBE存在于海马神经元和星形细胞中,但是这些细胞的生理学意义目前仍不知道。
序列表
<110>日本化学研究株式会社
<120>钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白
<130>GP44
<160>8
<210>1
<211>5385
<212>DNA
<213>肌肉
<400>1
ggctgagtgg aagacactga agacactgca gagcaaggtg ctttttttcc agaggtgtta 60
cagaac atg gag att aaa gac cag gga gcc caa atg gag ccg ctg ctg 108
Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu
1 5 10
cct acg aga aat gat gaa gaa gcc gtt gtg gat aga ggt gga aca cgc 156
Pro Thr Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg
15 20 25 30
tct att ctc aaa aca cat ttt gag aaa gaa gat tta gaa ggt cat cgg 204
Ser Ile Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg
35 40 45
aca tta ttt att gga gtt cat gtg ccc ctg ggt gga aga aaa agc cat 252
Thr Leu Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His
50 55 60
cgt cgt cac agg cat cgt ggt cat aag cac aga aag agg gac aga gag 300
Arg Arg His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu
65 70 75
aga gat tcg gga ctg gag gat gga aga gag tcc cct tct ttt gac acc 348
Arg Asp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr
80 85 90
cca tcg cag agg gtg cag ttt att ctt gga act gag gac gat gat gag 396
Pro Ser Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu
95 100 105 110
gag cac ctc cct cat gac ctt ttc aca gag ctg gat gag att tgc tgg 444
Glu His Leu Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp
115 120 125
cgt gaa ggg gaa gat gct gag tgg cga gag aca gcc agg tgg ttg aaa 492
Arg Glu Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys
130 135 140
ttt gaa gag gat gtg gaa gat gga gga gaa aga tgg agt aag ccc tat 540
Phe Glu Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr
145 150 155
gtg gcc acg ctt tca tta cac agc ttg ttt gag ttg aga agc tgc atc 588
Val Ala Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile
160 165 170
ctg aat gga act gtg cta ctg gac atg cat gcc aac acg ata gaa gaa 636
Leu Asn Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Ile Glu Glu
175 180 185 190
att gca gat atg gtc ctt gac cag cag gtc agc tca ggc cag ctg aat 684
Ile Ala Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser Gly Gln Leu Asn
195 200 205
gaa gat gtt cgc cac agg gtc cac gaa gca ttg atg aag cag cat cat 732
Glu Asp Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His
210 215 220
cac cag aat cag aaa aaa ctg gct aac agg att cct att gtc cga tct 780
His Gln Asn Gln Lys Lys Leu Ala Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser
225 230 235
ttg gct gat att ggc aag aaa caa tca gaa cca aat tcc atg gat aaa 828
Leu Ala Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn Ser Met Asp Lys
240 245 250
aat gca ggt cag gtt gtt tct cct cag tct gct cca gcc tgt gct gag 876
Asn Ala Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro Ala Cys Ala Glu
255 260 265 270
aat aaa aat gat gtc agc agg gaa aac agc act gta gac ttc agc aag 924
Asn Lys Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys
275 280 285
gtt gat ctg cat ttt atg aaa aag att cct ccg ggt gct gaa gct tca 972
Val Asp Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser
290 295 300
aac atc ttg gta gga gaa ctg gag ttc cta gac aga gct gtg gtt gcc 1020
Asn Ile Leu Val Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Ala Val Val Ala
305 310 315
ttt gtc agg ttg tct cca gct gtc ttg ctc caa gga ctt gct gaa gtt 1068
Phe Val Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Val
320 325 330
cca atc cca agc aga ttt ctg ttc atc ctt ctg gga ccc ctg gga aag 1116
Pro Ile Pro Ser Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Leu Gly Lys
335 340 345 350
ggt caa cag tac cac gag att ggc aga tcg att gcg acc tta atg act 1164
Gly Gln Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala Thr Leu Met Thr
355 360 365
gat gag gtg ttt cat gat gtt gct tac aaa gct aaa gac cgc aat gac 1212
Asp Glu Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg Asn Asp
370 375 380
ttg gta tca gga att gat gag ttt ctg gat cag gtt acc gtt ctt cct 1260
Leu Val Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val Thr Val Leu Pro
385 390 395
cct gga gaa tgg gat cca agc ata cga ata gaa cct ccc aaa aat gtc 1308
Pro Gly Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Asn Val
400 405 410
cct tcc cag gag aag agg aag att cct gct gta cca aat gga aca gca 1356
Pro Ser Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro Asn Gly Thr Ala
415 420 425 430
gct cat ggc gaa gct gag cca cat gga gga cac agc gga cct gaa ctc 1404
Ala His Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser Gly Pro Glu Leu
435 440 445
cag cga act ggg agg att ttt ggg gga ctt atg tta gat atc aaa aga 1452
Gln Arg Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Met Leu Asp Ile Lys Arg
450 455 460
aag gct cca ttc ttc tgg agc gac ttc agg gat gct ttc agc ctg cag 1500
Lys Ala Pro Phe Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala Phe Ser Leu Gln
465 470 475
tgc tta gca tcg ttc ctg ttt ctc tac tgt gca tgc atg tct cct gtc 1548
Cys Leu Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys Met Ser Pro Val
480 485 490
atc aca ttt gga gga ctg ttg gga gaa gca act gaa ggt cgt ata agt 1596
Ile Thr Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu Gly Arg Ile Ser
495 500 505 510
gca atc gaa tca ctc ttt gga gca tct atg acc ggg ata gcc tat tct 1644
Ala Ile Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly Ile Ala Tyr Ser
515 520 525
ctt ttt ggt gga cag ccc ctg acc ata tta ggc agc aca gga cct gtt 1692
Leu Phe Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val
530 535 540
ttg gtg ttt gaa aag atc ttg ttt aag ttt tgc aag gaa tac ggc ctg 1740
Leu Val Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys Glu Tyr Gly Leu
545 550 555
tcg tac ttg tcc tta cgg gcc agc att ggg ctc tgg act gca aca ctg 1788
Ser Tyr Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp Thr Ala Thr Leu
560 565 570
tgc atc atc ctt gtg gcc acg gac gcg agc tca ctc gtc tgc tac atc 1836
Cys Ile Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu Val Cys Tyr Ile
575 580 585 590
acc cgg ttt acc gaa gag gct ttt gct tct ctc att tgc atc att ttt 1884
Thr Arg Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile Cys Ile Ile Phe
595 600 605
atc tat gaa gcc ctg gag aag ttg ttt gag ctc agt gaa acc tat cca 1932
Ile Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser Glu Thr Tyr Pro
610 615 620
atc aat atg cac aat gat ttg gaa ctg ctg aca caa tac tca tgt aac 1980
Ile Asn Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Ser Cys Asn
625 630 635
tgt atg gag cca cat agt ccc agc aat gac aca ctg aag gaa tgg cgg 2028
Cys Met Glu Pro His Ser Pro Ser Asn Asp Thr Leu Lys Glu Trp Arg
640 645 650
gag tcc aac ctt tct gcc tct gac ata atc tgg ggg aac cta act gtg 2076
Glu Ser Asn Leu Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Gly Asn Leu Thr Val
655 660 665 670
tca gag tgc aga tca ctg cac ggg gag tat gtc ggg cga gcc tgt ggc 2124
Ser Glu Cys Arg Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly Arg Ala Cys Gly
675 680 685
cat ggc cac ccc tac gtg cca gat gtt ctc ttc tgg tcg gtg atc ctg 2172
His Gly His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp Ser Val Ile Leu
690 695 700
ttc ttc tcc aca gtt acc atg tca gcc acc ctg aag cag ttc aag acc 2220
Phe Phe Ser Thr Val Thr Met Ser Ala Thr Leu Lys Gln Phe Lys Thr
705 710 715
agc cgc tat ttc cca acc aag gtt cga tcc ata gtg agt gat ttt gcg 2268
Ser Arg Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val Ser Asp Phe Ala
720 725 730
gtt ttt ctt aca att ctg tgt atg gtt tta att gac tat gcc att ggg 2316
Val Phe Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp Tyr Ala Ile Gly
735 740 745 750
atc cca tca cca aaa cta caa gta cca agc gtt ttc aag ccg acc ata 2364
Ile Pro Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe Lys Pro Thr Ile
755 760 765
tac gac cgt ggc tgg ttt gtt aca cct ttg ggt cca aac cca tgg tgg 2412
Tyr Asp Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro Asn Pro Trp Trp
770 775 780
aca atc ata gct gcc atc atc cca gct tta ctc tgt act att ctg att 2460
Thr Ile Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys Thr Ile Leu Ile
785 790 795
ttc atg gac cag cag att aca gct gtc atc atc aac aga aaa gag cac 2508
Phe Met Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn Arg Lys Glu His
800 805 810
aag cta aag aaa ggt tgt ggc tat cac ctg gat ctg tta atg gtg gca 2556
Lys Leu Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu Leu Met Val Ala
815 820 825 830
gtc atg ctc ggg gtc tgc tcc att atg ggc ctg cca tgg ttt gtg gct 2604
Val Met Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro Trp Phe Val Ala
835 840 845
gcc aca gtt ctc tcc atc act cat gtc aac agc ctc aag ctc gaa tca 2652
Ala Thr Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu Lys Leu Glu Ser
850 855 860
gag tgc tct gct cca gga gaa caa ccc aag ttt ctc ggc att cgg gag 2700
Glu Cys Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu Gly Ile Arg Glu
865 870 875
cag agg gtg acc ggg ctc atg att ttt att ctt atg ggt tca tcc gtt 2748
Gln Arg Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met Gly Ser Ser Val
880 885 890
ttc atg acc agc att ctg aag ttt atc ccc atg cca gtg tta tac gga 2796
Phe Met Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly
895 900 905 910
gtg ttt ctt tat atg ggt gct tcg tct ctc aaa gga att cag tta ttt 2844
Val Phe Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly Ile Gln Leu Phe
915 920 925
gat aga ata aag ctc ttc tgg atg cca gcc aaa cat caa cca gat ttc 2892
Asp Arg Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His Gln Pro Asp Phe
930 935 940
atc tat cta agg cac gtg ccc ctc cgg aaa gtc cat ctc ttc aca gtc 2940
Ile Tyr Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His Leu Phe Thr Val
945 950 955
att cag atg agt tgt ctc ggc ctt ctg tgg ata atc aaa gtt tcg aga 2988
Ile Gln Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile Lys Val Ser Arg
960 965 970
gct gct att gtc ttt cct atg atg gtg ttg gca cta gtg ttt gtg aga 3036
Ala Ala Ile Val Phe Pro Met Met Val Leu Ala Leu Val Phe Val Arg
975 980 985 990
aag ttg atg gac ttc ttg ttt acc aaa cgg gaa ctc agc tgg ctt gat 3084
Lys Leu Met Asp Phe Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu Ser Trp Leu Asp
995 1000 1005
gat tta atg cct gag agt aaa aag aag aaa ctt gaa gat gct gag aaa 3132
Asp Leu Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu Asp Ala Glu Lys
1010 1015 1020
gaa gaa gaa caa agt atg cta gcc atg gag gac gag ggc aca gta caa 3180
Glu Glu Glu Gln Ser Met Leu Ala Met Glu Asp Glu Gly Thr Val Gln
1025 1030 1035
ctc cca ctg gag gga cac tac aga gac gac ccg tct gtg atc aat att 3228
Leu Pro Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser Val Ile Asn Ile
1040 1045 1050
tct gat gaa atg tca aag act gcc atg tgg ggg aac ctt cta gtt act 3276
Ser Asp Glu Met Ser Lys Thr Ala Met Trp Gly Asn Leu Leu Val Thr
1055 1060 1065 1070
gct gac aac tca aaa gaa aag gag tca cgc ttt cct tct aaa agc tcc 3324
Ala Asp Asn Ser Lys Glu Lys Glu Ser Arg Phe Pro Ser Lys Ser Ser
1075 1080 1085
cct tcc taa tcactctaga agctgattcc ccaaagcaat gaaagccgaa aggagaa 3380
Pro Ser
gaaagctgac tcagggaaag gcgttgacag ggagacttgt ctatgacttg atcttcaatt 3440
tattttttac atatatatat atgagaagag tgtcacaatt attaacaaaa ctgctttgat 3500
catgtaattg taaaccctct ctcccatccc accttcatac tgtaagtagt gcaagccttc 3560
attctatttc tgtgttcagc ctctgagcag gtcgacaccc ttgtaagcag atccaatagc 3620
taatgcaaga gtctccagtg ttactgccgt aagacattcg ccaacacagg attctcattg 3680
ttgacattaa gagaacaaag ctttctttaa aagataagtt atatttgcct agtttgtatt 3740
ttcctacctt agtaacctga agatgcctga taattttatt cagaagaatt ttgaaaggta 3800
gtcgtacttt ttatttttta tggcttagca ttcgttactg gttttgaaag acccaaatca 3860
aaaagttact ctgaaagcat ttttaataat tgtatttatg tatttccttg acttaatatg 3920
aaacatttaa tacttaataa ctgttacttc aagtcatttg agaaagagac ctgttcatat 3980
cttcttaaaa gacatactgc aaagagtcaa gtagtgttca cttagaattc aagttgtaac 4040
catgcagtca aaaactaggc ttgtattaaa tgctttagag atatttgaag agttttgtgg 4100
ggcttttcat tttaaatctt taccagaaat atgctactga gtttctctcc cattgacaag 4160
ggttgcttcc cgaataagcc tatgacatac atacttacgg aatgccacat ggtgcaacat 4220
tgtacatttg atgccagccc tggcagctgt tctgctgacc atggtcatgt gctgctaagt 4280
ttggttccta tcatgttgtc atgttagacc aacaggtctc caactgtatt ttgttttttt 4340
tgcaaagctc ttttccacat tttaactaaa tgcatgttgt ggaaaaatag tctttgaaat 4400
aaaatttcag attttgttag aaaaggttat gtaaatactt cagtccatat gaaacagttc 4460
aactttattg aaacaggaag gagattatgg atttttgagt attactaaat ataaatttca 4520
tttaattttc aataaatgtg ctttaataca aaacaaaata tcataggggt cttagttcct 4580
aaaaaagtat caatgattaa caaccttata atctttcaat gtccaggttt agaaaaattc 4640
agagccttct gggttttata aattacatgt actctgtgta aatacacata attagaaaaa 4700
tcctctttgc ttttaagcta atgaagacga gagacaacag agcctacata accttaatat 4760
tctgatatct tgaacaaaaa atttcctcag aatcctttca ggagccattt ttttaatgag 4820
atatgagcca aaattgtgag aagaattttc agttcgtaaa gtctgtattt ataaatggta 4880
aagaaaaatg caaaattctt ttccaaatgt gctacctttg tgatagttgt aatagcgaca 4940
ctctctctaa acattctcgc tgtctatgac ttagcaggcc aatccccaaa gcactctcct 5000
ggtgtctcta gagtgtcatg tctgttctgt tgaaatgacc agtgagtgac acttcacatg 5060
atcactggtt taaacaggca atcagcctat gaaattctgt atttctgaat atttttatag 5120
taattttgtt cttgtgtgaa ttttaatgct atctctatct taatcttaat attttgaaat 5180
cacataaaat ataagaaaat gtagtattct atatttactc taatttcaga ttcctggtca 5240
aaattactga atatcttgaa tgtaatttat tgcaatgttt aagtactgtg taaatgtgac 5300
aggatattgt gtttttcaaa actaagaaat gttatgtgga aataaatatt tatcctaaaa 5360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 5385
<210>2
<211>1088
<212>蛋白质
<213>肌肉
<400>2
Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu Pro Thr
1 5 10 15
Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg Ser Ile
20 25 30
Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg Thr Leu
35 40 45
Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His Arg Arg
50 55 60
His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr Pro Ser
85 90 95
Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His
100 105 110
Leu Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp Arg Glu
115 120 125
Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys Phe Glu
130 135 140
Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr Val Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile Leu Asn
165 170 175
Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Ile Glu Glu Ile Ala
180 185 190
Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser Gly Gln Leu Asn Glu Asp
195 200 205
Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His His Gln
210 215 220
Asn Gln Lys Lys Leu Ala Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser Leu Ala
225 230 235 240
Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn Ser Met Asp Lys Asn Ala
245 250 255
Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro Ala Cys Ala Glu Asn Lys
260 265 270
Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys Val Asp
275 280 285
Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser Asn Ile
290 295 300
Leu Val Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Ala Val Val Ala Phe Val
305 310 315 320
Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Val Pro Ile
325 330 335
Pro Ser Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Leu Gly Lys Gly Gln
340 345 350
Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala Thr Leu Met Thr Asp Glu
355 360 365
Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg Asn Asp Leu Val
370 375 380
Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val Thr Val Leu Pro Pro Gly
385 390 395 400
Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Asn Val Pro Ser
405 410 415
Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro Asn Gly Thr Ala Ala His
420 425 430
Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg
435 440 445
Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Met Leu Asp Ile Lys Arg Lys Ala
450 455 460
Pro Phe Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala Phe Ser Leu Gln Cys Leu
465 470 475 480
Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys Met Ser Pro Val Ile Thr
485 490 495
Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ile
500 505 510
Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly Ile Ala Tyr Ser Leu Phe
515 520 525
Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val Leu Val
530 535 540
Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys Glu Tyr Gly Leu Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp Thr Ala Thr Leu Cys Ile
565 570 575
Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu Val Cys Tyr IIe Thr Arg
580 585 590
Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile Cys Ile Ile Phe Ile Tyr
595 600 605
Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser Glu Thr Tyr Pro Ile Asn
610 615 620
Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Ser Cys Asn Cys Met
625 630 635 640
Glu Pro His Ser Pro Ser Asn Asp Thr Leu Lys Glu Trp Arg Glu Ser
645 650 655
Asn Leu Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Gly Asn Leu Thr Val Ser Glu
660 665 670
Cys Arg Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly Arg Ala Cys Gly His Gly
675 680 685
His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp Ser Val Ile Leu Phe Phe
690 695 700
Ser Thr Val Thr Met Ser Ala Thr Leu Lys Gln Phe Lys Thr Ser Arg
705 710 715 720
Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val Ser Asp Phe Ala Val Phe
725 730 735
Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp Tyr Ala Ile Gly Ile Pro
740 745 750
Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe Lys Pro Thr Ile Tyr Asp
755 760 765
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770 775 780
Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys Thr Ile Leu Ile Phe Met
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Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn Arg Lys Glu His Lys Leu
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu Lys Leu Glu Ser Glu Cys
850 855 860
Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu Gly Ile Arg Glu Gln Arg
865 870 875 880
Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met Gly Ser Ser Val Phe Met
885 890 895
Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly Val Phe
900 905 910
Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly Ile Gln Leu Phe Asp Arg
915 920 925
Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His Gln Pro Asp Phe Ile Tyr
930 935 940
Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His Leu Phe Thr Val Ile Gln
945 950 955 960
Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile Lys Val Ser Arg Ala Ala
965 970 975
Ile Val Phe Pro Met Met Val Leu Ala Leu Val Phe Val Arg Lys Leu
980 985 990
Met Asp Phe Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu Ser Trp Leu Asp Asp Leu
995 1000 1005
Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu Asp Ala Glu Lys Glu Glu
1010 1015 1020
Glu Gln Ser Met Leu Ala Met Glu Asp Glu Gly Thr Val Gln Leu Pro
1025 1030 1035 1040
Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser Val Ile Asn Ile Ser Asp
1045 1050 1055
Glu Met Ser Lys Thr Ala Met Trp Gly Asn Leu Leu Val Thr Ala Asp
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Asn Ser Lys Glu Lys Glu Ser Arg Phe Pro Ser Lys Ser Ser Pro Ser
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<210>3
<211>4138
<212>DNA
<213>智人
<400>3
taagcagagc gagtgccggg ctgagtgtaa gacactgaag acactgcaga gcaaggtgct 60
tattccagag gcgttacaaa ac atg gag att aaa gac cag gga gcc caa atg 112
Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met
1 5 10
gag ccg ctg ctg cct acg aga aat gat gaa gaa gca gtt gtg gat aga 160
Glu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg
15 20 25
ggt gga act cgt tct att ctc aaa aca cac ttt gag aaa gaa gat tta 208
Gly Gly Thr Arg Ser Ile Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu
30 35 40
gaa ggt cat cga aca cta ttt att gga gta cat gtg ccc ttg gga gga 256
Glu Gly His Arg Thr Leu Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly
45 50 55
aga aaa agc cat cga cgt cac agg cat cgt ggt cat aaa cac aga aag 304
Arg Lys Ser His Arg Arg His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys
60 65 70
aga gac aga gaa aga gat tca gga tta gag gat gga agg gag tca cct 352
Arg Asp Arg Glu Arg Asp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro
75 80 85 90
tct ttt gac acc cca tca cag agg gta cag ttt att ctt gga acc gag 400
Ser Phe Asp Thr Pro Ser Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu
95 100 105
gat gat gac gag gaa cac att cct cat gac ctt ttc aca gaa ctg gat 448
Asp Asp Asp Glu Glu His Ile Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp
110 115 120
gag att tgt tgg cgt gaa ggt gag gac gct gag tgg cga gaa aca gcc 496
Glu Ile Cys Trp Arg Glu Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala
125 130 135
agg tgg ttg aag ttt gaa gaa gat gtg gaa gat gga gga gaa agg tgg 544
Arg Trp Leu Lys Phe Glu Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp
140 145 150
agc aag cct tat gtg gct act ctt tca ttg cac agc ttg ttt gaa ttg 592
Ser Lys Pro Tyr Val Ala Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu
155 160 165 170
aga agt tgt att ctg aat gga act gtg ttg ctg gac atg cat gcc aac 640
Arg Ser Cys Ile Leu Asn Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn
175 180 185
act tta gaa gaa att gca gat atg gtt ctt gac caa caa gtg agc tca 688
Thr Leu Glu Glu Ile Ala Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser
190 195 200
ggt cag ctg aat gaa gat gta cgc cat agg gtc cat gag gca ttg atg 736
Gly Gln Leu Asn Glu Asp Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met
205 210 215
aaa cag cat cat cat cag aat cag aaa aaa ctc acc aac agg att ccc 784
Lys Gln His His His Gln Asn Gln Lys Lys Leu Thr Asn Arg Ile Pro
220 225 230
att gtt cgt tcc ttt gct gat att ggc aag aaa cag tca gaa cca aat 832
Ile Val Arg Ser Phe Ala Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn
235 240 245 250
tcc atg gac aaa aat gca ggt cag gtt gtt tct cct cag tct gct cca 880
Ser Met Asp Lys Asn Ala Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro
255 260 265
gcc tgt gtt gaa aat aaa aat gat gtt agc aga gaa aac agc act gtt 928
Ala Cys Val Glu Asn Lys Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val
270 275 280
gac ttt agc aag gtt gat ctg cat ttt atg aaa aag att cct cca ggt 976
Asp Phe Ser Lys Val Asp Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly
285 290 295
gct gaa gca tcg aac atc tta ctg gga gaa ctg gag ttc ttg gat cga 1024
Ala Glu Ala Ser Asn Ile Leu Leu Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg
300 305 310
aca gta gtt gcg ttt gtc agg ttg tct cca gct gta ttg ctt caa gga 1072
Thr Val Val Ala Phe Val Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly
315 320 325 330
ctg gct gaa gtc cca atc cca acc aga ttt ttg ttc att ctt ctg gga 1120
Leu Ala Glu Val Pro Ile Pro Thr Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly
335 340 345
ccc ctg gga aag ggt caa cag tac cat gag att ggc aga tca att gca 1168
Pro Leu Gly Lys Gly Gln Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala
350 355 360
acc cta atg aca gat gag gta ttt cat gat gtt gcc tat aaa gct aaa 1216
Thr Leu Met Thr Asp Glu Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys
365 370 375
gat cgt aat gac ttg gta tca gga att gat gag ttt ctg gat cag gtt 1264
Asp Arg Asn Asp Leu Val Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val
380 385 390
act gtt ctc cct cct gga gaa tgg gat cca agc att cga ata gag cct 1312
Thr Val Leu Pro Pro Gly Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro
395 400 405 410
ccc aaa aat gtt cct tcc cag gag aag agg aag att cct gct gta cca 1360
Pro Lys Asn Val Pro Ser Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro
415 420 425
aat gga aca gca gct cat ggg gaa gca gag ccc cac gga gga cat agt 1408
Asn Gly Thr Ala Ala His Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser
430 435 440
gga cct gaa ctc cag cga act gga agg att ttt ggg gga ctt att tta 1456
Gly Pro Glu Leu Gln Arg Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Ile Leu
445 450 455
gat atc aaa aga aaa gct cca tac ttc tgg agt gac ttc aga gat gct 1504
Asp Ile Lys Arg Lys Ala Pro Tyr Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala
460 465 470
ttc agc ctg cag tgc tta gca tct ttt cta ttt ctc tac tgc gcg tgt 1552
Phe Ser Leu Gln Cys Leu Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys
475 480 485 490
atg tct cct gtc atc acg ttt gga gga ctg ctg gga gaa gca act gaa 1600
Met Ser Pro Val Ile Thr Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu
495 500 505
ggg cgt ata agt gca att gaa tct ctc ttt gga gca tcc atg acc ggg 1648
Gly Arg Ile Ser Ala Ile Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly
510 515 520
ata gcc tat tct ctc ttt ggt gga cag cct ctt acc ata tta ggc agt 1696
Ile Ala Tyr Ser Leu Phe Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser
525 530 535
aca gga cca gtt ttg gtg ttt gaa aag att ttg ttt aaa ttt tgc aaa 1744
Thr Gly Pro Val Leu Val Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys
540 545 550
gaa tat ggg ctg tca tac cta tct tta aga gct agc att gga ctt tgg 1792
Glu Tyr Gly Leu Ser Tyr Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp
555 560 565 570
act gca act cta tgt atc ata ctt gtg gcc aca gat gct agt tcc ctt 1840
Thr Ala Thr Leu Cys Ile Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu
575 580 585
gtc tgc tac atc act cgg ttt act gaa gaa gct ttt gct tcc ctg att 1888
Val Cys Tyr Ile Thr Arg Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile
590 595 600
tgc atc att ttc att tat gag gcc ctg gag aag ttg ttt gaa ctc agt 1936
Cys Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser
605 610 615
gaa gca tat cca atc aac atg cat aat gat ctg gaa ctg ctg aca caa 1984
Glu Ala Tyr Pro Ile Asn Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln
620 625 630
tac tcg tgt aac tgt gtg gaa ccg cat aat ccc agc aat ggc aca ttg 2032
Tyr Ser Cys Asn Cys Val Glu Pro His Asn Pro Ser Asn Gly Thr Leu
635 640 645 650
aag gaa tgg agg gaa tcc aat att tct gcc tct gac ata att tgg gag 2080
Lys Glu Trp Arg Glu Ser Asn Ile Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Glu
655 660 665
aac cta act gtg tca gaa tgc aaa tca ttg cat gga gag tat gtt gga 2128
Asn Leu Thr Val Ser Glu Cys Lys Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly
670 675 680
cgg gcc tgt ggc cat gat cac cca tat gtt cca gat gtt cta ttt tgg 2176
Arg Ala Cys Gly His Asp His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp
685 690 695
tct gtg atc ctg ttc ttt tcc aca gtt act ctg tca gcc acc ctg aag 2224
Ser Val Ile Leu Phe Phe Ser Thr Val Thr Leu Ser Ala Thr Leu Lys
700 705 710
cag ttc aag act agc aga tat ttt cca acc aag gtt cga tcc ata gtg 2272
Gln Phe Lys Thr Ser Arg Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val
715 720 725 730
agt gac ttt gct gtc ttt ctt aca att ctg tgt atg gtt tta att gac 2320
Ser Asp Phe Ala Val Phe Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp
735 740 745
tat gcc att ggg atc cca tct cca aaa cta caa gta cca agt gtt ttc 2368
Tyr Ala Ile Gly Ile Pro Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe
750 755 760
aag ccc act aga gat gat cgt ggc tgg ttt gtt acg cct tta ggt cca 2416
Lys Pro Thr Arg Asp Asp Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro
765 770 775
aac cca tgg tgg aca gta ata gct gct ata att cca gct ctg ctt tgt 2464
Asn Pro Trp Trp Thr Val Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys
780 785 790
act att cta att ttc atg gac caa cag att aca gct gtc atc atc aac 2512
Thr Ile Leu Ile Phe Met Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn
795 800 805 810
agg aaa gag cat aag cta aag aaa ggt tgt ggg tac cat ctg gac cta 2560
Arg Lys Glu His Lys Leu Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu
815 820 825
tta atg gtg gct gtc atg ctc ggt gta tgc tcc atc atg ggc ctg cca 2608
Leu Met Val Ala Val Met Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro
830 835 840
tgg ttt gtg gct gcc aca gtc ctc tcc atc act cat gtc aat agc cta 2656
Trp Phe Val Ala Ala Thr Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu
845 850 855
aaa ctg gaa tca gaa tgc tca gct cca gga gaa caa ccc aaa ttt ctc 2704
Lys Leu Glu Ser Glu Cys Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu
860 865 870
ggc att cgg gag caa agg gtt act ggg ctt atg att ttt att ctt atg 2752
Gly Ile Arg Glu Gln Arg Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met
875 880 885 890
ggt tca tca gtc ttt atg acc agt att ctg aag ttt att ccc atg cca 2800
Gly Ser Ser Val Phe Met Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro
895 900 905
gtg cta tat gga gtg ttt ctt tat atg ggt gct tca tct cta aag gga 2848
Val Leu Tyr Gly Val Phe Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly
910 915 920
att cag ttc ttt gat agg ata aag ctc ttc tgg atg ccg gca aaa cat 2896
Ile Gln Phe Phe Asp Arg Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His
925 930 935
caa cca gat ttt ata tac cta agg cac gta ccg ctt cga aaa gtg cat 2944
Gln Pro Asp Phe Ile Tyr Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His
940 945 950
ctc ttc aca att att cag atg agt tgc ctt ggc ctt ttg tgg ata ata 2992
Leu Phe Thr Ile Ile Gln Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile
955 960 965 970
aaa gtt tca aga gct gct att gtc tct ccc atg atg gtg tta tcc ctg 3040
Lys Val Ser Arg Ala Ala Ile Val Ser Pro Met Met Val Leu Ser Leu
975 980 985
gtt ttt gta aga aag ttg atg gac ttg ttg ttc acg aaa cgg gaa ctc 3088
Val Phe Val Arg Lys Leu Met Asp Leu Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu
990 995 1000
tgc tgg ttg gat gat ttg atg cct gag agt aag aaa aag aaa ctg gaa 3136
Cys Trp Leu Asp Asp Leu Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu
1005 1010 1015
tat gct gaa aaa gaa gaa gaa caa tgt gtg cta cct atg gaa gat gag 3184
Tyr Ala Glu Lys Glu Glu Glu Gln Cys Val Leu Pro Met Glu Asp Glu
1020 1025 1030
ggc aca gta caa ctc cca ttg gaa ggg cac tat aga gat gat cca tct 3232
Gly Thr Val Gln Leu Pro Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser
1035 1040 1045 1050
gtg atc aat ata tct gat gaa atg tca aag act gcc ttg tgg agg aac 3280
Val Ile Asn Ile Ser Asp Glu Met Ser Lys Thr Ala Leu Trp Arg Ash
1055 1060 1065
ctt ctg att act gcc gat aac tca aaa gat aag gag tca agc ttt cct 3328
Leu Leu Ile Thr Ala Asp Asn Ser Lys Asp Lys Glu Ser Ser Phe Pro
1070 1075 1080
tcc aaa agc tcc cct tcc taa tcactctaga agctgattcc ccaaagcatt 3379
Ser Lys Ser Ser Pro Ser
1085
gaaagccgaa aagagaagaa agctgactca gggatagttg ttgacaggga gacttgtcta 3439
tgactcgatc ttcaatttat tttttacata tatatgagaa gagtgtcaca attattaata 3499
aaactgcttg gatcatgtat ggtaaattct gtccctcaac ccaaatccac tttcatacgg 3559
taagtagggc aaaacttgtt tcatttcggt gttaaaattt cggagcagga gacatccctg 3619
tgagcagaaa caatagccaa tgcagaatct gtgtgttcct tgctgaacgt aagacatttg 3679
taaactggat tctgattgtc agttttatga gagcaatagc ttccttaaag agataagtca 3739
tatacaccta gtttgtattc tcatacttta gagacctgaa gacgcctgat aatttcattc 3799
aggagaattt ttgaaaggta gtcaaacttc tttttagttt ttatagctta gcattagtga 3859
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tatgcatttg gctactgtaa gttttgctcc atggaataat gatgtgatag caaaaatgaa 3979
taagactatg aataagttcc tacatgaagg ttaatgtcag tggtgaaaaa tcttattatg 4039
ctccaatata ctgccagcat gctgagtata cttggatcat aaaaaactgt ttcatttttc 4099
ttatttattt tatgcatagg aatattcatt ccggaattc 4138
<210>4
<211>1088
<212>蛋白质
<213>智人
<400>4
Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu Pro Thr
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Claims (10)
1.一种蛋白质,它由序列表SEQ ID NO:2或NO:4所示的氨基酸序列组成。
2.一种蛋白质,它包含相对于序列表SEQ ID NO:2或NO:4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列,当该蛋白质在细胞中表达时,它具有将胞外的Na+和HCO3 -输送到细胞内与胞内的Cl-交换的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能。
3.一种细胞,该细胞中表达了权利要求1或2所述的蛋白质,其中该细胞的种类与该蛋白质之一的原始种类不同。
4.一种抗体,它针对权利要求1或2所述的蛋白质。
5.一种选择钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的激动剂和拮抗剂的方法,该方法包括使权利要求3所述的细胞与候选化合物接触,测定钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能,将所得结果与未接触候选化合物的权利要求3所述细胞的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能测定所得的结果相比较,确定该候选化合物是否增强或抑制该功能,其中所述钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能是将胞外的Na+和HCO3 -输送到细胞内与胞内的Cl-交换。
6.一种DNA,它由序列表SEQ ID NO:1或NO:3所示的核苷酸序列组成。
7.一种DNA,它由序列表SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中核苷酸67-3330组成的核苷酸序列组成。
8.一种DNA,它由序列表SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中核苷酸83-3346组成的核苷酸序列组成。
9.一种DNA,该DNA包含的核苷酸序列相对于包含序列表SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中核苷酸67-3330的DNA的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***的核苷酸序列,且该DNA编码:
(1)含有序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质,或
(2)含有相对于序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质,该蛋白质在细胞中表达时具有将胞外的Na+和HCO3 -输送到细胞内与胞内的Cl-交换的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能。
10.一种DNA,该DNA包含的核苷酸序列相对于包含序列表SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中核苷酸83-3346的DNA的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、置换、加入或***,且该DNA编码:
(1)含有序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白质,或
(2)含有相对于序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、置换、加入或***的氨基酸序列的蛋白质,该蛋白质在细胞中表达时具有将胞外的Na+和HCO3 -输送到细胞内与胞内的Cl-交换的钠离子推动的氯离子/碳酸氢根交换蛋白的功能。
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