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药物化合物菠萝酰酯及其制备方法和用途，涉及一种从菠萝叶中分离出来的新的药物化合物及其制备方法。该化合物具有结构式(I)。本发明还涉及该化合物在制备治疗体内过氧化物升高、氧化型低密度或高密度脂蛋白升高所引起的疾病的药物中的应用。

Description

药物化合物菠萝酰酯及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种新的药物化合物菠萝酰酯、制备方法及其在医药方面的新用途，属中药技术领域。
菠萝，为凤梨科植物凤梨Ananas comosus(L.)Merr.[Bromelia comosa L.；A.sativusSchult.Et Schult.f.]的果实。原产美洲，现广植于热带地区，我国福建、广东、海南、广西、云南等地均有种植。本品始载于清.吴其睿《植物名实图考》，以露兜子为名。该书记载：“露兜子产广东，一名波罗，生山野间，实如萝卜，上生叶一簇，尖长深齿，味色香具佳。果熟金黄色，皮坚如鱼鳞状，去皮食肉，香甜无渣，六月熟”。
古时对于菠萝叶无明确记载，现代人们常用菠萝叶纤维为编织和造纸的原料(《中国高等植物图鉴.第5册》科学出版社1976)。近时有记载菠萝叶具有消食和胃，止泻的功效，主治夏日暑泻，消化不良，胃脘胀痛等(《中华本草.第8卷》上海科学技术出版社1999)。
菠萝叶作为药用的记载比较少见，尤其是未见报道从菠萝叶中分离提取的新化合物—菠萝酰酯及其在医药方面的新用途。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的药物化合物菠萝酰酯。
本发明的另一目的是提供菠萝酰酯的一种制备方法。
本发明的再一目的是提供菠萝酰酯在医药方面的用途。
本发明提供的药物化合物菠萝酰酯，其化学结构式(I)所示：
具体地说本发明提供的菠萝酰酯为从菠萝叶分离制备的一种新的化合物，***命名为1，3-O-di[β-(3，4-dihydroxyphenyl)propenoyl]glycerides，中文名，1，3-O-二-β-3，4-二-羟基苯基丙烯酰甘油酯，其结构如下式(II)：
Figure C0313757600041
所述的新化合物菠萝酰酯的理化性质及其各种波谱特征如下：
该化合物为淡黄色无定形固体，mp 210-216℃，FeCl3显蓝黑色，易溶于丙酮、甲醇和乙醇等有机溶剂。
UVλmax(MeOH)nm：219，244，326。
IRνmax(KBr)cm-1：3386，1683，1638，1601，1532，1446，1375，1284，1184，1112，976，811，596。
HRFAB-MS：415.1034[M-1]-，(计算值为415.1034，分子式为C21H20O9)
核磁共振1HNMR、13CNMR及DEPT数据如下表：
           菠萝酰酯的核磁共振波谱数据(acetone-d6，δppm)
NO.   13C-NMR   DEPT   1H-NMR
123>＝0α，α′β，β′1′，1″2′，2″3′，3″4′，4″5′，5″6′，6″OH   65.0967.4765.09166.43114.35145.12126.70114.49145.41147.91115.48121.66   CH2CHCH2CHCHCHCHCH   4.26(2H，m)4.17(1H，m)4.26(2H，m)6.31(2H，d，J＝16Hz)7.60(2H，d，J＝16Hz)7.16(2H，d，J＝2.0Hz)6.86(2H，d，J＝8.0Hz)7.04(2H，dd，J＝2.0，8.0Hz)8.32(4H，s)
本发明还提供了上述菠萝酰酯的一种制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)先用药材重量的5～10倍的醇溶剂将菠萝叶进行常规加热提取，得到提取液；
(2)将提取液在50～90℃温度下减压浓缩后，用药材重量的2～5倍水溶解，离心或静止过滤，弃去沉淀，取上清液；
(3)将上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用浓度大于70％乙醇洗脱，将洗脱液在温度50～90℃下减压浓缩，然后减压干燥或冷冻干燥，得到菠萝叶提取物；
(4)将菠萝叶提取物用稀乙醇溶剂溶解，再用硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，用氯仿∶甲醇或石油醚∶丙酮或氯仿∶丙酮梯度洗脱，用葡聚糖凝胶纯化，即制得化合物菠萝酰酯。
在上述制备方法中，步骤(1)中所述的常规加热提取方法的加热温度为50℃～90℃，提取次数为3次，每次为30分钟至2小时；加热提取所用的醇溶液为乙醇、甲醇、丙醇或丁醇，其浓度大于30％。
本发明的方法中所述的用稀乙醇溶液对菠萝叶提取物进行溶解时的乙醇浓度为50～70％。
本发明所提供的新的药物化合物菠萝酰酯的用途，主要是指在制备治疗体内过氧化物升高及其由此引起的疾病的药物中的应用以及在制备治疗体内氧化型低密度脂蛋白和高密度脂蛋白升高的药物中的应用。更具体的说，该药物化合物在学习记忆功能障碍，痴呆，动脉粥样硬化，冠心病心绞痛，脑血栓等疾病中的应用。
在临床应用时，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物。如散剂，丸剂，胶囊剂，片剂，微囊剂，软胶囊剂，膜剂，栓剂，注射剂，膏剂，酊剂，散剂，冲剂，气雾剂，各种外用制剂等。
本发明的实验结果表明，菠萝酰酯具有明显的抑制脑过氧化物MDA升高的作用。体外给药，最小有效终浓度为3×10-6g/ml，随着浓度的增加，抑制作用增强。体外给药，能够明显抑制氧化型低密度脂蛋白的生成，有效浓度为0.3-30ug/ml。药理实验表明，菠萝酰酯具有抗氧化和抑制氧化型低密度脂蛋白升高的作用，以该化合物为活性成分，可以用来制备治疗体内过氧化物升高所引起病症，以及低密度脂蛋白升高所引起的相关性疾病，如脂代谢紊乱，动脉粥样硬化，冠心病，痴呆，学习记忆功能障碍，脑血栓等。
具体实施方式
下面的实施例和药物实验资料使本发明所说的菠萝酰酯的制备及其用途得以证实，同时又不应将下列实施例看作是对本发明的限制。
制备实施例l：
首先用药材(500克)重量的5倍的100％甲醇将菠萝叶在50℃加热提取3次，每次为30分钟。然后将提取液在50℃温度下减压(压力98Kpa)浓缩后，用药材重量的2倍水溶解，离心，弃去沉淀；上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用95％乙醇洗脱，洗脱液在50℃温度下减压(压力98Kpa)浓缩，浓缩物减压(压力98Kpa)干燥，得到菠萝叶提取物。菠萝叶提取物用80％乙醇溶解，再用200～300目硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，石油醚∶丙酮梯度洗脱，用葡聚糖凝胶纯化，最后得到该化合物---菠萝酰酯，每公斤药材能得到约40mg菠萝酰酯。
制备实施例2：
首先用药材(500克)重量的10倍的30％乙醇将菠萝叶在90℃加热提取3次，每次为2小时。然后提取液在减压(压力98Kpa)，温度在90℃浓缩后，用药材重量的5倍水溶解，离心，弃去沉淀，上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用70％乙醇洗脱，洗脱液在温度为90℃(压力98Kpa)减压浓缩，浓缩物减压(压力98Kpa)干燥，得到菠萝叶提取物。菠萝叶提取物用60％乙醇溶解，再用60-80目硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，用氯仿∶甲醇梯度洗脱，用葡聚糖凝胶纯化，最后得到该化合物---菠萝酰酯，每公斤药材能得到约10mg菠萝酰酯。
制备实施例3：菠萝酰酯的提取和分离制备
首先用药材(500克)重量的10倍的70％乙醇将菠萝叶在80℃加热提取3次，每次为1小时。然后提取液在减压(压力98Kpa)，温度在50℃浓缩后，用药材重量的5倍水溶解，离心，弃去沉淀，上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用80％乙醇洗脱，洗脱液在温度为50℃(压力98Kpa)减压浓缩，浓缩物减压(压力98Kpa)干燥，得到菠萝叶提取物。菠萝叶提取物用30％乙醇溶解，再用100-200目硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，用氯仿∶丙酮梯度洗脱，用葡聚糖凝胶纯化，最后得到该化合物---菠萝酰酯，每公斤药材能得到约50mg菠萝酰酯。
药效实验例1：对脑MDA生成的影响
观察本发明菠萝叶提取物对小鼠脑MDA生成的抑制作用。本发明所用菠萝酰酯，批号：030228。将菠萝酰酯以生理盐水配制成所需浓度。实验所用动物为雄性ICR小鼠，非近交系封闭群，北京维通利华实验动物中心提供，体重为18-22g。实验室室温20-22℃，相对湿度40％～60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼10只，每三日清扫笼舍一次。
取正常小鼠，处死后取脑，加入生理盐水做匀浆液(与脑比例为5∶1)。4℃冰箱静置5分钟，取上部均匀混浊液。每管加入脑组织液150uL，加入不同浓度药液50ul，37℃水浴孵育30分。依次加入10％SDS 0.1ml，50％冰醋酸硫代巴比妥酸液0.5ml和1％盐酸液2ml。沸水浴15分钟，取出后冷水置10分钟，1500转离心15分钟，取上清于532nm处测吸光度A值。每组做三复管。计算抑制率＝[(对照组A-给药组A)/对照组A×100％]。
所得数据经EXCEL软件处理。组间t检验。
本试验菠萝酰酯给药终浓度分别为3×10-7g/ml，3×10-6g/ml，3×10-5g/ml，3×10-4g/ml，3×10-3g/ml。
本试验为体外实验。本试验空白对照为等体积生理盐水.阳性药对照为维生素E，购自Sigma公司。实验终浓度为3×10-4g/ml。本试验数据均以Excel软件处理。
             表2 菠萝酰酯体外对脑MDA生成的抑制作用(x±s)
  分组   药物终浓度(g/ml)   吸光值(532nm)
  生理盐水菠萝酰酯 3×10-3   0.236±0.0030.07±0.003**
  菠萝酰酯菠萝酰酯菠萝酰酯菠萝酰酯维生素C   3×10-43×10-53×10-63×10-73×10-4   0.074±0.002**0.102±0.004**0.161±0.004**0.202±0.003*0.146±0.0011**
与生理盐水组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝3
本实验结果显示，菠萝酰酯体外有较强地抑制缺糖缺氧脑组织MDA生成的作用，最低有效浓度为3×10-6g/ml。提示菠萝酰酯具有一定的抗氧化的作用，对于防治因脑内过氧化物升高所引起的神经精神功能障碍，痴呆等都有积极的意义。
药效实验例2：体外对氧化型低度脂蛋白升成的抑制作用
本发明所用雄性家兔，体重2.274±0.537Kg。由中国医学科学院阜外医院动物室提供。合格证号：京动管质字(96)第006号。本发明所用菠萝酰酯，批号：030228。将菠萝酰酯以生理盐水配制成所需浓度。
本发明试验LDL的提取制备。25％的乌拉坦耳缘静脉麻醉(2ml-4ml/kg)，耳静脉体内肝素抗凝，颈总动脉取血100ml左右，用终浓度为0.4mg/ml的EDTA抗氧化。1500rpm离心10min，取血浆。
配密度梯度液：
d＝1.0即0液的配制：0.01％EDTA，PH＝7.4-8.0
d＝1.1液的配制：取0液100mL+NaBr 13.5g
d＝1.2液的配制：取0液100mL+NaBr29.5g
d＝1.21液的配制取0液100mL+NaBr 30g
d＝1.3液的配制：取血浆100mL+NaBr 40g
铺梯度密度层：先用长针头管吸取0液7mL铺于容量为25.9mL的Beckman离心管底部，而后小心将吸取了约7mL的d＝1.1液长针头***Beckman试管底部缓缓加入液体，使0液上浮，余下依此法加入d＝1.3液的血浆，注意一定要使各液面分层。
超速离心：角度转头Ti50.2，XL-90Beckman离心管25.9mL，45000rpm，1.4h，10℃。
透析：
透析袋的处理。以2％(W/V)NaHCO3+1mmoL/LEDTA(PH8.0)1000mL煮10分钟(称2gNaHCO3溶于100mLD.W.中，称0.37gEDTA溶于1000mLD.W.中即可)。重D.W.洗用1mmoL/LEDTA(PH8.0)煮10分钟。冷至4℃备用。用前用重D.W.洗内壁。透析液配制：0.85％NaCl 8.5g，0.02Mtris-HCl 2.42g，0.01％EDTA 0.1g，0.03％NaN30.3g，共1000mL(pH7.4)。
透析条件：避光，密闭，4℃，24h，换4-5次液。
将PEG-20000覆盖于透析袋上，随时观察浓缩情况(一般浓缩为1mg/mL左右)。
蛋白定量。于UV-280nm处测LDL中蛋白浓度，用1.0mg/mL的牛血清白蛋白为标准品.
LDL稀释。将LDL蛋白浓度稀释到0.25mg/mL，2mL。用时2倍稀释，即蛋白浓度0.125mg/mL。每个剂量做3复管。
LDL测试。取0.125mg/mL的LDL的液内加入测试药物，即时测OD值，然后水浴(20℃)30分钟后加入CuSO4H2O 5umoL/L，水浴30分钟后测定OD234nm.以加入CuSO4H2O后30分钟的OD值与加入CuSO4H2O前所测OD值的差值[OD(30分钟)-OD(0分钟)]，表明其氧化型低密度脂蛋白生成的速率，以此反应药物的抑制作用。
本发明所用蒸馏水为空白对照。阳性对照药为维生素C(分析纯)，批号：011206。北京芳草医药化工研制公司生产。
本实验结果如表3：
            表3不同药物对氧化低密脂蛋白生成的影响
  剂量(ug/ml)   OD(30分钟)-OD(0分钟)
 生理盐水模型+生理盐水模型+菠萝酰酯模型+菠萝酰酯模型+菠萝酰酯模型+维生素C 0.33300.5   0.0073±0.00150.0847±0.0161##0.039±0.0164*0.0163±0.0068**0.017±0.003**0.0203±0.0108**
与生理盐水组相比，##P＜0.01。与模型+生理盐水组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝3。
菠萝酰酯在终浓度为0.3，3，30ug/ml时，对Cu2SO4诱导的LDL氧化为氧化型LDL(ox-LDL)有明显的抑制作用。阳性对照药VC，具有明显的抑制ox-LDL产生的作用。已知ox-LDL对于动脉平滑肌有明显的侵蚀作用，它可以使内皮细胞受损，从而使血管内壁受损，而使血栓形成并附壁。因此菠萝酰酯的这种抑制ox-LDL的作用对于防止冠心病和脑血栓具有重要的临床意义。

Claims (7)

1.一种药物化合物菠萝酰酯，其化学结构式如(I)所示：
2.一种如权利要求1所述药物化合物菠萝酰酯的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)先用药材重量的5～10倍的醇溶剂将菠萝叶在50℃～90℃下进行加热提取，得到提取液；
(2)将提取液在50～90℃温度下减压浓缩后，用药材重量的2～5倍水溶解，离心或静止过滤，弃去沉淀，取上清液；
(3)将上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用浓度大于70％的乙醇洗脱，将洗脱液在温度50～90℃下减压浓缩，然后减压干燥或冷冻干燥，得到菠萝叶提取物；
(4)将菠萝叶提取物用稀乙醇溶剂溶解，再用硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，用氯仿：甲醇或石油醚：丙酮或氯仿：丙酮梯度洗脱，用葡聚糖凝胶纯化，即制得化合物菠萝酰酯。
3.按照权利要求2所述的菠萝酰酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的加热提取所用的醇溶液为乙醇、甲醇、丙醇或丁醇，其浓度大于30％。
4.按照权利要求2所述的菠萝酰酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取次数为3次，每次为30分钟至2小时。
5.按照权利要求2所述的菠萝酰酯的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的稀乙醇的浓度为50～70％。
6.权利要求1所述的菠萝酰酯在制备治疗体内过氧化物升高及其由此引起的疾病的药物中的应用。
7.权利要求1所述的菠萝酰酯在制备治疗体内氧化型低密度脂蛋白和高密度脂蛋白升高的药物中的应用。
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