CN1225554C - 乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵方法生产乳酸的工艺。取重量比为菌悬液∶2%卡拉胶溶液∶8～12%聚乙烯醇和2～4%海藻酸钠的混合液＝1∶1∶3～5配制的包埋剂与菌悬液的混合液对乳酸菌进行细胞固定化，结合用pH控制器自动控制乳酸发酵的适宜酸度在pH值＝5.0～6.2，每当发酵液中pH计显示为pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵工作，当发酵液pH计显示为pH值为6.5时，继电器切断电源，循环泵停止工作，发酵继续进行，实现原位分离发酵生产乳酸。

Description

乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸工艺

技术领域

本发明要求保护的技术方案涉及乳酸的制备方法，具体地说是采用发酵方法生产乳酸的工艺。

背景技术

生物发酵和生物催化中有很多是产物抑制性过程，如果不及时将产物中和或分离，发酵反应进程将无法持续下去。乳酸发酵就是一个典型的产物抑制性发酵过程。乳酸发酵的适宜酸度是pH值＝5.0～6.2，当pH值＜5时发酵被抑制，乳酸产率降低。乳酸发酵过程中，由于乳酸的积累，导致发酵液的pH值逐渐降低，严重抑制了乳酸菌的生长和乳酸的合成。采用传统发酵法生产乳酸时，为消除这种抑制作用，发酵液中加入碳酸钙来中和发酵过程中产生的乳酸，转化为乳酸钙，随后再将乳酸钙和硫酸反应，并经脱色、离子交换精制而成乳酸。传统发酵法生产乳酸，不但工艺流程长、操作条件差、固体废物处理困难，而且由于乳酸钙具有较高的溶解度，乳酸的收率一般只有50～60％。近年来，原位分离技术在乳酸发酵中得到应用。在《乳酸菌及其发酵制品生产技术》一书、汤凤霞等人的文章“原位分离技术在L-乳酸发酵中的应用”(宁夏农学院学报，2001，22(2)：70-72)及其他一些专利和非专利文献中报道了现有的几种原位分离技术，包括：电渗析发酵法(JP02-286090)、吸附交换法(CN 1332144A)、萃取发酵法(CN 1234387A)、膜发酵法(CN 1348992A)、中空纤维固定法(JP 07-067672)、用离子交换树脂提取乳酸(印度Aradhana)等。但是，这些方法仍存在着以下缺点：发酵过程中发酵液中的活性细胞降低、转化率低、乳酸损失过大、能耗大、成本高。US 4,698,303和US 4,771,001披露了生产乳酸的培养基发酵、细胞-循环发酵、肉汤酸化发酵和乳酸分离的连续发酵法，该法工艺复杂，效率也不高。

固定化细胞技术是70年代初发展起来的生物工程新技术。该技术可以大大提高细胞的活性，因此一些人对固定化细胞生产乳酸进行了研究(常秀莲.固定化细胞乳酸发酵的动力学研究.山东轻工业学院学报.1999；王建龙周定.固定化细胞利用离子交换树脂萃取发酵乳酸的研究.生物技术.1994；郑一舟丁新华.乳酸固定化细胞柱发酵过程研究化学反应工程与工艺.1992；郑一舟丁新华.乳酸的固定化细胞发酵及其在聚乙烯基吡啶树脂上的吸附研究化工学报.1992；刘晓兰严复.固定化细胞发酵废蜜生产乳酸的研究中国甜菜糖业.1991；刘晓兰严复.糖蜜原料固定化细胞乳酸发酵的研究.四川制糖发酵.1991；刘晓兰严复.固定化细胞乳酸发酵动力学及工艺的研究.齐齐哈尔轻工业学院学报.1991)。在这些研究中，固定化细胞方法均采用了包埋法，主要是利用高聚物在形成凝胶的过程中将微生物细胞固定在其内部。包埋法相对于其它固定化细胞方法，具有操作简单、对细胞影响小、固定效果好及包埋颗粒强度高等优点(李彗蓉等.卡拉胶与明胶包埋黄孢原毛平革菌的方法研究.上海环境科技.2002，21(4))。然而，这些优点取决于所选择的包埋剂和包埋条件。包埋剂要具备以下条件：来源丰富，造价低，具有良好的坚实性及韧性，无毒无害，能使反应的底物和产物易于出入载体而细胞又不易通过，细胞在载体中增殖快，生长稳定，寿命长。到目前为止，乳酸菌固定化细胞所用的包埋剂都是海藻酸钙或海藻酸。这些包埋剂的机械强度不高、使用寿命短。

哈尔滨工业大学王建龙等人将固定化细胞方法与离子交换树脂萃取提取乳酸原位分离技术相结合；浙江大学郑一舟等人将固定化细胞方法吸附交换法原位分离技术相结合。前一方法的缺点是，由阴离子交换树脂从流过的发酵液中吸附乳酸，同时菌体、营养成份等也流入树脂柱，被吸附或滞留，这样长时间连续发酵，大量菌体和悬浮物就会阻塞树脂柱入口，使发酵液不能连续均匀地通过。后一方法的缺点是，采用甲醇为洗脱剂进行乳酸洗脱，既不经济又不环保。离子交换树脂作为吸附剂目前在工业化生产中还只是被用于从粗乳酸清液，经树脂吸附、洗脱，得到精制乳酸的后处理中。上述两种方法也都只是见诸于实验研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种用具有良好的机械强度、使用寿命长的包埋剂来固定化细胞的方法和自动化控制水平高的将生物反应与微生物代谢产物快速移去的分离过程紧密结合起来的乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸工艺。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：先制备重量百分比浓度为8～12％的聚乙烯醇和2～4％的海藻酸钠的混合液及2％卡拉胶溶液，用按重量比为菌悬液∶2％卡拉胶溶液∶8～12％聚乙烯醇和2～4％海藻酸钠的混合液＝1∶1∶3～5配制成的包埋剂与菌悬液的混合液对乳酸菌进行细胞固定化，再结合用pH控制器自动控制乳酸发酵的适宜酸度在pH值＝5.0～6.2，每当置于发酵液中的pH计显示为pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵工作，使发酵液经过滤网开始向吸附装置移动，经吸附装置除去发酵产生的乳酸后的发酵液返回发酵罐中，当置于发酵液中的pH计显示为pH值为6.5时，继电器切断电源，循环泵停止工作，发酵继续进行，实现原位分离发酵生产乳酸。

本发明乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产工艺中细胞固定化步骤是：

a.菌悬液的制备：取培养至指数生长术期的乳酸菌，用离心机进行离心10分钟，离心力为8000g～10000g，弃去上层清液，用等重量的已灭菌生理盐水打散成菌悬液；

b.包埋剂与菌悬液的混合液的制备：先制备重量百分比浓度为8～12％的聚乙烯醇和2～4％的海藻酸钠的混合液及2％卡拉胶溶液，再按重量比为菌悬液∶2％卡拉胶溶液∶8～12％聚乙烯醇和2～4％海藻酸钠的混合液＝1∶1∶3～5配制成包埋剂与菌悬液的混合液，所用溶剂均为蒸馏水；

c.交联剂的制备：将重量百分比浓度为氯化钙2～8％和硼酸1～10％的蒸馏水溶液，调节pH值为6.4～6.7，灭菌待用；

d.珠型固定化细胞颗粒的制备：取两根孔径为3mm的乳胶管，其中部装在蠕动泵内，分别在一端装上内径为0.5～1.0mm的滴头，滴头端分别固定在装有磁力搅拌器的c步的氯化钙和硼酸交联剂溶液之上，无滴头端分别浸入b步的包埋剂与菌悬液的混合液中，调节蠕动泵速度，以流滴尽量快又能成珠为宜，打开蠕动泵和搅拌器，两个滴头同时进行珠型固定化细胞颗粒的制备，制好的珠型固定化乳酸菌珠于4℃下在c步的交联剂中硬化4～12小时后用无菌水洗三遍备用。

本发明乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产工艺中原位分离发酵生产乳酸的步骤是：

A.发酵，在发酵罐中将糖化液和麸皮浸液混合，使麸皮浸液最终浓度为1.5～2.0％，糖化液最终浓度为10～12％，调节pH值为6.2～6.4，用压力0.1Mpa灭菌15～30分钟，于无菌操作条件下，在发酵罐中加入本发明的珠型固定化乳酸菌珠，接珠量为5～6％，经实验测试该接珠量的菌含量相当于液体接种量的8～10倍，此时乳酸量为0，开启搅拌，在45～50℃条件下发酵；

B.pH值控制，发酵过程中pH值逐渐降低，每当发酵液中的pH计显示pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵工作，使发酵液经过滤网开始向吸附装置移动，经吸附装置除去发酵产生的乳酸后的发酵液返回发酵罐中，当发酵液中的pH计显示pH值为6.5时，继电器切断电源，循环泵停止工作，发酵继续进行；

C.分离精制，发酵产生的乳酸经吸附装置吸附，用pH试纸检测，当第一吸附柱吸附乳酸后流出液的pH值为5.0时，即为该柱吸附乳酸达到饱和，则将发酵液切换入第二吸附柱吸附，第二吸附柱吸附饱和后切入第三吸附柱吸柱，余此类推，吸附柱数量视生产规模而定，将已饱和的吸附柱用洗脱装置中的10～40％硫酸洗脱出粗乳酸，粗乳酸再进入脱色装置、除杂装置和浓缩装置，经脱色、除杂和浓缩精制后得到纯度≥95％的乳酸，洗脱后的吸附柱经再生后重复使用；

D.循环，当发酵液中的pH计再次显示为pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵启动，全过程同B和C，与此同时，用酶膜生物传感分析仪随时检测发酵液含糖量，多次循环完成后，当发酵液含糖浓度低于2％时，从可灭菌高位计量罐向发酵罐中补充浓糖液，直至发酵液含糖浓度达到10～12％为止，整个工艺形成一个封闭式的pH平衡发酵分离***。

本发明的有益效果是：经过反复实验，配置出本发明工艺所用的乳酸细胞固定化包埋剂具有如下显著的优点：①机械强度高。单一海藻酸钙或海藻酸包埋剂都几乎形不成珠体，而用本发明的8～12％的聚乙烯醇和2～4％的海藻酸钠的混合液及2％卡拉胶溶液的包埋剂制成的珠体效果为最佳，具体数据见表1；②使用寿命长。乳酸菌未固定化细胞只能使用一次即失去活性，而用本发明的乳酸菌固定化细胞可以反复使用多次仍保持较高的活性，实验结果见表5。本发明工艺采用固定化细胞与用pH控制器自动控制乳酸发酵的适宜酸度，并将微生物生产的代谢产物快速移去相结合的方法，与现有技术相比，其优点还在于：第一，本发明避免了长时间连续发酵大量菌体和悬浮物阻塞树脂入口，发酵液不能连续均匀通过的问题；第二，本发明的乳酸菌固定化细胞具有良好的坚实性，能使反应物易于顺利出入载体而细胞不易漏出，细胞在载体中增殖快、生长稳定、寿命长；第三，在发酵过程中，不加任何中和剂，避免由于产生大量固体废料而导致的分离困难和污染环境，又免去了许多沉淀、分离和净化的工艺和设备，因此本发明工艺和设备简单、低消耗、低成本；第四，乳酸产品质量高，乳酸产品的纯度不低于95％；第六，自动化控制水平高，随时检测发酵物的pH值，及时分离产物，避免产物抑制作用的发生，因此本发明也可以广泛应用于反应过程中因酸度变化而产生抑制作用的有机酸的原位分离发酵生产。

附图说明

图1是制备珠型固定化细胞颗粒流程示意图。

图2是本发明生产乳酸工艺流程示意图。

图中，1.发酵罐，2.过滤网，3.循环泵，4.柱型吸附装置，5.继电器，6.pH控制器，7.可灭菌高位计量罐，8.洗脱装置，9.脱色装置，10.除杂装置，11.浓缩装置，12.再生装置，13.包埋剂与菌悬液的混合液，14.乳胶管，15.蠕动泵，16.滴头，17.交联剂，18.磁力搅拌器。

下面结合图1、图2和实施例对本发明进一步说明。虽然下列实施例只列举了乳酸菌固定化细胞的原位分离发酵生产的工艺，但是因本发明可以广泛应用于在发酵过程中因酸度增加而产生抑制作用的各种有机酸生产，所以本发明的权利要求并不限于下列实施例。

具体实施方式：

图1表示乳胶管(14)被装入蠕动泵(15)，乳胶管(14)无滴头的一端浸入包埋剂与菌悬液的混合液(13)中，乳胶管(14)另一端上的两个滴头(16)分别固定在装有磁力搅拌器(18)的交联剂溶液(17)之上；包埋剂与菌悬液的混合液(13)在蠕动泵(15)的作用下通过乳胶管滴头(16)成珠，滴入磁力搅拌器(18)上的交联剂溶液(17)中。

图2表明可灭菌高位计量罐(7)与发酵罐(1)连接，pH控制器(6)中的pH电极安置在发酵罐(1)中，pH控制器(6)通过电子线路与继电器(5)相连，以控制循环泵(3)的开关，发酵罐(1)下方出口处装有过滤网(2)，在此处用管道经循环泵(3)与柱型吸附装置(4)连接，柱型吸附装置(4)与洗脱装置(8)和再生装置(12)之间、洗脱装置(8)与脱色装置(9)之间、脱色装置(9)与除杂装置(10)之间、除杂装置(10)与浓缩装置(11)之间均通过管道连接。

实施例1

A.细胞固定化

(a)菌悬液的制备：将乳酸菌培养至指数生长末期，用离心机离心10分钟，离心力为9000g，弃去上层清液，用等重量的已灭菌生理盐水打散成菌悬液，取该菌悬液22～38.7克；

(b)包埋剂与菌悬液的混合液的制备：取8～12克聚乙烯醇和2～4克海藻酸钠溶于100毫升蒸馏水中，水浴加热使之溶解，混匀后灭菌，冷却至40℃后，与22～38.7克灭好菌的2％卡拉胶蒸馏水溶液一起加入到(a)的菌悬液中，按重量比为菌悬液∶2％卡拉胶溶液∶8～12％聚乙烯醇和2～4％海藻酸钠的混合液＝1∶1∶3～5混合均匀；

(c)交联剂的制备：称取2～8克氯化钙和1～10克硼酸溶于100毫升蒸馏水中，调节PH值为6.4～6.7灭菌待用；

(d)珠型固定化细胞颗粒的制备：如图1所示，取两根孔径为3mm的乳胶管，其中部装在蠕动泵内，分别在一端装上内径约0.5～1.0mm的滴头。滴头端分别固定在装有磁力搅拌器的氯化钙和硼酸交联剂溶液之上。无滴头端浸入包埋剂与菌悬液的混合液中。调节蠕动泵速度，以流滴尽量快又能成珠为宜。打开蠕动泵和搅拌器，两个滴头同时进行固定化细胞珠型颗粒的制备，制好的乳酸菌珠型固定化细胞颗粒菌珠于4℃下在交联剂中硬化4～12小时后用无菌水洗三遍备用；

B.发酵

(a)糖化液的制备：取淀粉质原料500～1000重量单位、水2000～4000重量单位，60℃浸泡1～2小时，加入淀粉酶5～8U/g淀粉，这里的“U”是通用的酶活单位，在不断搅拌下升温至75～95℃，保温0.5～1小时，用碘指示剂检测淀粉至兰色完全消失，呈棕黄色，过滤，上层清液降温至55～60℃，加入糖化酶5～8U/g淀粉，保温1～2小时，用酶膜生物传感分析仪测定糖度不再增加，即为糖化完全的糖化液；

(b)麸皮浸液的制备：按重量百分比30％取麸皮于50℃水中浸泡24小时，过滤为麸皮浸液；

(c)发酵培养基的配制：取一定量的糖化液和麸皮浸液加入发酵罐中，自来水定容至2升，使糖化液最终浓度为10～12％，麸皮浸液最终浓度为1.5～2.0％，调节该混合液的pH值为6.2～6.4，压力为0.1Mpa灭菌15～30分钟；

(d)无菌操作条件下，在发酵罐中加入A步所制得的乳酸菌珠型固定化细胞颗粒菌珠，接珠量为5～6％，即菌含量为液体接种量的8～10倍，此时乳酸量为0，开启搅拌，在45～50℃，条件下发酵；

C.pH值控制，发酵过程中pH值逐渐降低，每当发酵液中的pH计显示pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵工作，使发酵液经过滤网开始向吸附装置移动，经吸附装置除去发酵产生的乳酸后的发酵液返回发酵罐中，当发酵液中的pH计显示pH值为6.5时，继电器切断电源，循环泵停止工作，发酵继续进行；

D.分离精制，发酵产生的乳酸经吸附装置吸附，用pH试纸检测，当第一吸附柱吸附乳酸后流出液的pH值为5.0时，即为该柱吸附乳酸达到饱和，则将发酵液切换入第二吸附柱吸附，第二吸附柱吸附饱和后切入第三吸附柱吸柱，将已饱和的吸附柱用洗脱装置中的10～40％硫酸洗脱出粗乳酸，粗乳酸再进入脱色装置、除杂装置和浓缩装置，经脱色、除杂和浓缩精制后得到纯度≥95％的乳酸，洗脱后的吸附柱经再生后重复使用；

E.循环，当发酵液中的pH计再次显示为pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵启动，全过程同C和D，与此同时，用酶膜生物传感分析仪随时检测发酵液含糖量，多次循环完成后，当发酵液含糖浓度低于2％时，从可灭菌高位计量罐向发酵罐中补充浓糖液，直至发酵液含糖浓度达到10～12％为止。

实施例2

选择聚乙烯醇、海藻酸钠、卡拉胶按照表1中的百分比浓度配制成四种不同比例的包埋剂，分别用来制成珠型固定化细胞颗粒菌珠，用以下方法测试包埋菌珠的强度：在两块载玻片之间放置粒径相等的包埋颗粒，在载玻片上放砝码直至颗粒被压碎，以砝码的重量表征颗粒的强度，测其各项指标，结果见表1。

                   表1不同成分浓度配制的包埋剂的质量测试

序号	聚乙烯醇(％)	海藻酸钠(％)	卡拉胶(％)	菌含量(％)	转化率(％)	机械强度(g)	颗粒现象
								1234	681012	1234	2222	0.10.10.10.1	90.2090.6390.7990.22	＜50＞50＞50＞50	粘连好好较好

实验证明，用单一海藻酸钙或海藻酸为包埋剂几乎形不成珠体。单用聚乙烯醇或海藻酸钠作为包埋剂制备珠体时，包埋剂在交联时则易粘在一起而形成一大团凝聚物。而采用卡拉胶和海藻酸钠作为包埋剂制备珠体时，强度不能满足要求。经过反复实验，本发明才找出最好的包埋剂成分配比为：2％卡拉胶溶液∶8～12％聚乙烯醇和2～4％海藻酸钠的混合液＝1∶3～5，由此制成的珠体各项指标均较好、机械强度符合要求，又克服了颗粒粘连现象。

实施例3

按实施例1的工艺生产乳酸，并将本发明的固定化乳酸菌珠反复使用三次。在完全相同的条件下，再使用未固定化乳酸菌珠生产。产物浓度结果对比如表2所示。

        表2本发明的固定化乳酸菌珠与未固定化菌液对比实验

反应体系	未固定化1次	未固定化2次	未固定化3次	固定化1次	固定化2次	固定化3次
							产物浓度(g/L)	93.5	0	0	86.0	83.6	81.1

从试验结果看出，本发明的固定化乳酸菌珠，虽然第一次使用时产物浓度略低于未固定化菌液，但可以重复使用且可以保持反应活性。

实施例4

取玉米粉1000g，水4000mL，60℃浸泡1～2小时，加入淀粉酶5～8U/g淀粉，在不断搅拌下升温至75～95℃，保温0.5～1小时，用碘指示剂检测淀粉至蓝色完全消失，液体呈棕黄色，过滤，上层清液降温至55～60℃，加入糖化酶5～8U/g淀粉，保温1～2小时，用酶膜生物传感分析仪测定糖度不再增加，即为糖化完全的糖化液；按30％取麸皮于50℃水中浸泡24小时，过滤为麸皮浸液；将糖化液和麸皮浸液加至3L发酵罐中，用自来水定容，使二者终浓度分别为10～12％和1.5～2.0％，总体积2000mL，调节pH值为6.2～6.4，在0.1Mp压力下灭菌15分钟，待温度降至45～50℃时，在无菌操作条件下加入110g实施例1的乳酸菌珠型固定化细胞颗粒菌珠，保持发酵温度在45℃，发酵罐中的pH计显示为6.2。此时发酵罐中的发酵液的总糖量为233g，乳酸量为0；开启搅拌发酵，当发酵液中pH计第一次显示pH值为5.0时，pH控制器自动控制继电器接通电源，循环泵开始工作，使发酵液经过滤网流向装填有弱碱性阴离子交换树脂的柱型吸附装置，经柱型吸附装置除去发酵产生的乳酸后的发酵液又返回到发酵罐中，当发酵液中pH计显示pH值为6.5时，继电器切断电源，发酵继续进行；当发酵液中pH计再次显示pH值为5.0时，pH控制器自动控制继电器接通电源，循环泵开始工作，全过程同上一次；用酶膜生物传感分析仪随时检测发酵液含糖量，经九次循环后，发酵液含糖浓度小于2％。每次过程的产酸量见表3。

     表3第一次补糖前九次循环的发酵结果

时间(累计h)	总糖量(g/L)	产酸量(累计g/L)
			0	116.5	0
6	109.5	6.3
			12	98.5	16.2
24	79.2	33.76
			30	58.6	52.3
36	44.4	65.83
			48	36.5	72.62
54	31.5	77.12
			60	28.0	80.24
72	25.1	82.79

实施例5

在实施例4的九次循环后，从可灭菌高位计量罐向发酵罐中流加经过浓缩后的糖化液，即浓糖液，直至发酵液含糖浓度为10～12％为止，再进行九次循环产生。这九次循环产生的测试结果见表4。由表4结果可以看出，本发明连续发酵工艺稳定。为提高单位效率，当发酵48～72小时后，开始补加浓糖液，直至发酵液含糖浓度为10～12％为止。以此类推，循环发酵。

实施例6

每当发酵48～72小时后，开始重复实施例5补加浓糖液和实施例4的循环发酵，以此类推，进行半连续发酵。随着发酵时间的持续，菌珠发酵能力有所减弱，当菌珠发酵能力即菌珠产酸量低于初始产酸量60％时，则发酵终止。本实施例共补糖16次，每次平均补糖量相当于净糖142.9g，历时30多天，发酵产酸总量为2049g。由表5列出的测试结果可以看出本发明的乳酸菌珠型固定化细胞颗粒菌珠反复使用16次之后菌珠活性仍接近初始时的60％，可见本发明的乳酸菌珠型固定化细胞颗粒菌珠能够反复使用较长时间。

表4第一次补充供给浓糖液后继续九次循环发酵结果

时间(累计h)	总糖量(g/L)	产酸量(累计g/L)
			0	108.8	0
6	101.5	6.6
			12	91.5	15.6
24	73.5	32.2
			30	55.5	49.5
36	41.2	62.3
			48	33.2	69.4
54	27.2	74.8
			60	22.7	78.9
72	20.4	81.0

          表5本发明的乳酸菌珠型固定化细胞颗粒菌珠反复使用活性测试结果

补加糖次数	1	2	3	4
					菌珠活性(乳酸g/L)	80.96	78.53	76.10	72.86
补加糖次数	5	6	7	8
					菌珠活性(乳酸g/L)	71.24	68.82	66.39	64.78
补加糖次数	9	10	11	12
					菌珠活性(乳酸g/L)	62.34	60.72	58.29	56.67
补加糖次数	13	14	15	16
					菌珠活性(乳酸g/L)	55.05	53.43	51.00	47.32

实施例7

在吸附柱中装有处理好的NK-D301树脂。每当发酵液中pH计显示为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵工作，使发酵液经过滤网开始向吸附装置移动，发酵液开始通过吸附柱；当发酵液pH计显示为6.5时，继电器切断电源，循环泵停止工作，发酵液暂时停止通过吸附柱。随时测定吸附柱进出口的乳酸浓度及pH值，经反复循环，当吸附柱流出液pH值达到进口发酵液pH值时，即为吸附柱已吸附饱和。通过检测吸附柱进出口发酵液乳酸浓度，经计算该吸附柱对乳酸的吸附效率达85％以上。

当第一吸附柱吸附乳酸饱和后切换第二吸附柱，第二吸附柱饱和后切换第三吸附柱，余此类推。同时将已饱和的吸附柱用25％硫酸洗脱，收集粗乳酸。随时用氯化钡检测，当收集液中发现硫酸出现时停止收集。接着收集乳酸和硫酸的混合液，至无乳酸为止，此混合液作为下一吸附柱的洗脱液。将洗脱后的粗乳酸液通过装有处理好的活性炭的脱色装置，再通过装有处理好的NK-001×7强酸性阳离子树脂柱的除杂装置和浓缩装置，经浓缩得到纯度≥95％的乳酸。该流程提取收率为80％左右。

上述实施例中所用测定发酵液总糖量和乳酸含量的酶膜生物传感分析仪为SBA-40C酶膜生物传感分析，乳酸纯度使用高压液相色谱仪WATERS 600E测定。

Claims (3)

1.乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸工艺，其特征在于：先制备重量百分比浓度为8～12％的聚乙烯醇和2～4％的海藻酸钠的混合液及2％卡拉胶溶液，用按重量比为菌悬液∶2％卡拉胶溶液∶8～12％聚乙烯醇和2～4％海藻酸钠的混合液＝1∶1∶3～5配制成的包埋剂与菌悬液的混合液对乳酸菌进行细胞固定化，再结合用pH控制器自动控制乳酸发酵的适宜酸度在pH值＝5.0～6.2，每当置于发酵液中的pH计显示为pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵工作，使发酵液经过滤网开始向吸附装置移动，经吸附装置除去发酵产生的乳酸后的发酵液返回发酵罐中，当置于发酵液中的pH计显示为pH值为6.5时，继电器切断电源，循环泵停止工作，发酵继续进行，实现原位分离发酵生产乳酸。

2.根据权利要求1所述的乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸工艺，其特征在于：乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产工艺中细胞固定化的步骤是：

a.菌悬液的制备：取培养至指数生长末期的乳酸菌，用离心机进行离心10分钟，离心力为8000g～10000g，弃去上层清液，用等重量的已灭菌生理盐水打散成菌悬液；

b.包埋剂与菌悬液的混合液的制备：先制备重量百分比浓度为8～12％的聚乙烯醇和2～4％的海藻酸钠的混合液及2％卡拉胶溶液，再按重量比为菌悬液∶2％卡拉胶溶液∶8～12％聚乙烯醇和2～4％海藻酸钠的混合液＝1∶1∶3～5配制成包埋剂与菌悬液的混合液，所用溶剂均为蒸馏水；

c.交联剂的制备：将重量百分比浓度为氯化钙2～8％和硼酸1～10％的蒸馏水溶液，调节pH值为6.4～6.7，灭菌待用；

d.珠型固定化细胞颗粒的制备：取两根孔径为3mm的乳胶管，其中部装在蠕动泵内，分别在一端装上内径为0.5～1.0mm的滴头，滴头端分别固定在装有磁力搅拌器的c步的氯化钙和硼酸交联剂溶液之上，无滴头端分别浸入b步的包埋剂与菌悬液的混合液中，调节蠕动泵速度，以流滴尽量快又能成珠为宜，打开蠕动泵和搅拌器，两个滴头同时进行珠型固定化细胞颗粒的制备，制好的珠型固定化乳酸菌珠于4℃下在c步的交联剂中硬化4～12小时后用无菌水洗三遍备用。

3.根据权利要求2所述的乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸工艺，其特征在于：乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产工艺中原位分离发酵生产乳酸的步骤是：

A.发酵，在发酵罐中将糖化液和麸皮浸液混合，使麸皮浸液最终浓度为1.5～2.0％，糖化液最终浓度为10～12％，调节pH值为6.2～6.4，用压力0.1Mpa灭菌15～30分钟，于无菌操作条件下，在发酵罐中加入珠型固定化乳酸菌珠，接珠量为5～6％，经实验测试该接珠量的菌含量相当于液体接种量的8～10倍，此时乳酸量为0，开启搅拌，在45～50℃条件下发酵；

B.pH值控制，发酵过程中pH值逐渐降低，每当发酵液中的pH计显示pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵工作，使发酵液经过滤网开始向吸附装置移动，经吸附装置除去发酵产生的乳酸后的发酵液返回发酵罐中，当发酵液中的pH计显示pH值为6.5时，继电器切断电源，循环泵停止工作，发酵继续进行；

C.分离精制，发酵产生的乳酸经吸附装置吸附，用pH试纸检测，当第一吸附柱吸附乳酸后流出液的pH值为5.0时，即为该柱吸附乳酸达到饱和，则将发酵液切换入第二吸附柱吸附，第二吸附柱吸附饱和后切入第三吸附柱吸柱，余此类推，吸附柱数量视生产规模而定，将已饱和的吸附柱用洗脱装置中的10～40％硫酸洗脱出粗乳酸，粗乳酸再进入脱色装置、除杂装置和浓缩装置，经脱色、除杂和浓缩精制后得到纯度≥95％的乳酸，洗脱后的吸附柱经再生后重复使用；

D.循环，当发酵液中的pH计再次显示为pH值为5.0时，pH控制***自动接通电源，循环泵启动，全过程同B和C，与此同时，用酶膜生物传感分析仪随时检测发酵液含糖量，多次循环完成后，当发酵液含糖浓度低于2％时，从可灭菌高位计量罐向发酵罐中补充浓糖液，直至发酵液含糖浓度达到10～12％为止，整个工艺形成一个封闭式的pH平衡发酵分离***。

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