CN1221453A - 提高丝状真菌中血红素蛋白产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产血红素蛋白的方法,包括(a)将能表达血红素蛋白的下述序列导入丝状真菌细胞中,(i)一个或多个能指导由该丝状真菌细胞内源的第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的第一种控制序列,其中所述一个或多个第一种控制序列与第一种核酸序列有效相连;和/或(ii)一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝;(b)在适于生产血红素蛋白和血红素生物合成酶的营养培养基中培养该丝状真菌细胞;以及(c)从该丝状真菌细胞的营养培养基中回收血红素蛋白。

Description

提高丝状真菌中血红素蛋白产量的方法
                     发明背景相关申请的相互参考
本申请是1996年6月10日递交的申请号为08/662,752和1997年3月17日递交的申请号为60/041,158的专利申请的后续内容，上述发明申请全文引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及在丝状真菌中生产血红素蛋白的方法，以及能生产血红素蛋白的丝状真菌细胞。
相关技术的描述
血红素是原卟啉IX与铁的螯合复合物，可作为血红素蛋白的辅基(prosthetic group)。原卟啉IX包含一个卟啉环，该卟啉环具有四个甲基、两个乙烯基和两个丙酸基的取代，获得一个铁原子后形成血红素。通过甘氨酸和琥珀酰辅酶A生物合成血红素包括8个酶反应步骤，它们是由5-氨基-γ-酮戊酸合成酶(5-aminolevulinic acid synthase)(EC2.3.1.37)、胆色素原合成酶(EC4.2.1.24)、胆色素原脱氨基酶(EC4.3.1.8)、尿卟啉原III合成酶(EC4.2.11.75)、尿卟啉原III脱羧酶(EC4.1.1.37)、粪卟啉原III氧化酶(EC1.3.3.3)、原卟啉原IX氧化酶(EC1.3.3.4)以及亚铁螯合酶(EC4.99.1.1)所催化的。5-氨基-γ-酮戊酸合成酶催化甘氨酸和琥珀酰辅酶A缩合形成5-氨基-γ-酮戊酸(5-aminolevulinic acid)。胆色素原合成酶(也称为5-氨基-γ-酮戊酸脱水酶)可催化两个分子的5-氨基-γ-酮戊酸缩合形成胆色素原。胆色素原脱氨基酶(也称为羟甲基胆色烷合成酶或uro I合成酶)可催化吡咯胆色素原四聚体化形成前尿卟啉原。尿卟啉原III合成酶(也称为uro III合成酶或uro III共合成酶)可催化前尿卟啉原第4个环的重排，随后通过环化形成尿卟啉原III。尿卟啉原III脱羧酶(也称为uro D或尿卟啉原脱羧酶)可催化尿卟啉原III的全部4条乙酸侧链的脱羧反应形成甲基，从而产生粪卟啉原III。粪卟啉原III氧化酶(也称为粪卟啉原酶)可催化粪卟啉原III的A、B环上第2和4位的2个丙酸基的氧化性脱羧反应形成乙烯基，从而产生原卟啉原IX。原卟啉原IX氧化酶可催化原卟啉原IX发生六电子氧化生成原卟啉IX。亚铁螯合酶(也称为亚铁裂解酶、血红素合成酶或原血红素亚铁裂解酶)可催化将铁***到原卟啉中生成血红素。
脱辅基蛋白转变为血红素蛋白取决于血红素生物合成途径提供血红素的能力。血红素蛋白的脱辅基蛋白形式与血红素结合后，产生活性血红素蛋白。活性血红素蛋白获得的构象使它在蛋白水解的攻击下比脱辅基蛋白更稳定。若微生物体内的血红素生成量相对低于脱辅基蛋白的生成量，脱辅基蛋白将会累积并进行蛋白降解，从而降低了活性血红素蛋白的产量。
为解决这个问题，Jesen证明，在发酵培养基中加入血红素或含血红素的物质，能显著提高米曲霉生产过氧化物酶的产量(WO93/19195)。尽管发酵培养物中补加血红素能显著提高血红素蛋白产量，但在应用于大规模生产时，这种方法有悖常理，既费钱，又难于操作。
Wu等人(1991，细菌学杂志，173：325-333)公开了过量表达大肠杆菌NADPH-亚硫酸盐还原酶(一种Sirohemoprotein)的方法，包括导入一个位于质粒上、编码Siroheme合成必需的尿卟啉原III甲基转移酶的鼠伤寒沙门氏菌cys G基因。
本发明的一个目的是提供几种可提高丝状真菌菌株中血红蛋白产量以获得商用有效量的改进方法。
                     发明简述
本发明涉及生产血红素蛋白的方法，这些方法包括：
(a)将下述序列导入丝状真菌细胞中：
(i)可指导由该丝状真菌细胞内源第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的一个或多个第一种控制序列，其中所述一个或多个第一种控制序列与所述第一种核酸序列有效相连；和/或
(ii)一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝；
(b)在适于生成血红素蛋白和血红素生物合成酶的营养培养基中培养该丝状真菌细胞；以及
(c)从该丝状真菌细胞的营养培养基中回收血红素蛋白。
本发明还涉及重组型丝状真菌细胞，该细胞中含有可指导由该丝状真菌细胞内源第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的一个或多个第一种控制序列，和/或一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝的。
                     附图简述
图1给出了质粒pSE04的限制性图谱。
图2是含有米曲霉5-氨基-γ-酮戊酸合成酶基因的一个4.2kb基因组片段的限制性图谱。图谱下方给出了用千碱基(kb)标示的刻度。箭头指示该基因开放阅读框的位置。
图3给出了米曲霉5-氨基-γ-酮戊酸合成酶基因的核苷酸序列及由此推断出的氨基酸序列(相应为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2)。推想的重要转录位点CCAAT盒和TATA盒由下划线标出。方框表示两个保守的推定HRM基元(motif)。圆圈表示参与磷酸吡哆醛辅因子结合的甘氨酸环。星号指示重要的赖氨酸。
图4给出了多种5-氨基-γ-酮戊酸合成酶基因中保守的血红素调节基元。方框表示戊肽(pentapeptide)基元。
图5给出了米曲霉、构巢曲霉、酿酒酵母和人红细胞的5-氨基-γ-酮戊酸合成酶推断的氨基酸序列(分别为SEQ ID No：2，22，23和24)的比较。保守的氨基酸用方框标出。
图6给出了质粒pBANe6的限制性图谱。
图7给出了质粒pSE31的限制性图谱。
图8给出了质粒pJVi9的构建过程。
图9给出了质粒pJeRS6的限制性图谱。
图10给出了质粒pJRoC50的限制性图谱。
图11给出了质粒pAJ005-1的限制性图谱。
图12给出了米曲霉胆色素原合成酶基因的核苷酸序列和推断的氨基酸序列(分别为SEQ ID No：3与4)。CAAT盒用下划线标出，TATA盒用方框圈出。推测的内含子用下打点标出，推测的锌指结构域用虚线标出。文库探针用下划粗黑线标出，活性赖氨酸则用圆圈出。
图13给出了来源于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、人、豌豆、大鼠、菠菜、酵母和米曲霉的胆色素原合成酶推断的氨基酸序列(分别为SEQ IDNo：25、26、27、28、29、30、31和4)之间的比较。
图14给出了pAJ023的限制性图谱。
图15给出了质粒pSE7t1的限制性图谱。
图16给出了质粒pSE37的限制性图谱。
图17给出了质粒pSE39的限制性图谱。
图18给出了质粒pMT1612的限制性图谱。
图19给出了质粒pBANe13的限制性图谱。
图20给出了质粒pSE38的限制性图谱。
图21给出了质粒pJaL292的限制性图谱。
图22给出了质粒pKS6的限制性图谱。
图23给出了质粒pMHan37的限制性图谱。
图24给出了质粒pBANe8的限制性图谱。
                     发明详述
本发明涉及生产血红素蛋白的方法，这些方法包括：
(a)将下述序列导入丝状真菌细胞中，
(i)可指导由丝状真菌细胞内源第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的一个或多个第一种控制序列，其中所述一个或多个第一种控制序列与所述第一种核酸序列有效相连；和/或
(ii)一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝；
(b)在适于生产血红素蛋白和血红素生物合成酶的营养培养中培养该丝状真菌细胞；以及
(c)从该丝状真菌细胞的营养培养基中回收血红素蛋白。
本文将“血红素蛋白”定义为含有血红素作为辅基的一组蛋白质中的任一个成员。血红素蛋白可以是含有血红素作为辅基的珠蛋白、细胞色素、氧化还原酶或任何其它蛋白质。含有血红素的珠蛋白包括血红蛋白和肌红蛋白。含有血红素的细胞色素包括细胞色素P450、细胞色素b、细胞色素c1和细胞色素c。含有血红素的氧化还原酶包括但不限于过氧化氢酶、氧化酶、加氧酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)以及过氧化物酶。在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶是过氧化氢酶。在另一个优选实施方案中，该氧化还原酶是氧化酶。在又一个优选实施方案中，该氧化还原酶是加氧酶。在又一个优选实施方案中，该氧化还原酶是卤素过氧化物酶。在又一个优选实施方案中，该氧化还原酶是一种过氧化物酶。在一更优选的实施方案中，所述过氧化物酶得自于鬼伞属菌株、Arthromyces属菌株或Phanerochaete属菌株。在一个甚至更优选的实施方案中，该过氧化物酶得自于灰盖鬼伞菌株如灰盖鬼伞IFO8371、长根鬼伞菌株，或Arthromyces ramosus菌株。在另一个更优选的实施方案中，所述过氧化氢酶得自于Scytalidium菌株、曲霉菌株或腐质霉菌株。在另一个甚至更优选的实施方案中，该过氧化氢酶得自于Scytalidiumthermophilum菌株如Scytalidium thermophilum CBS 117.65，黑曲霉菌株或Humicola insolens菌株。
该血红素蛋白对于所述丝状真菌来说可以是天然的或外源的。
可通过本领域熟知方法将所述控制序列和/或核酸序列导入丝状真菌细胞中。例如，可通过同源或非同源重组将这些序列导入并整合至宿主基因组中，其中这些序列的一或多拷贝被整合到单个和/或多个靶序列中。或者，可将这些序列以未整合表达载体如自身复制型染色体外质粒形式导入和保持。本领域中将核酸序列导入丝状真菌细胞的标准方法包括以其自身所知的方式进行的原生质体形成、原生质体转化以及经转化的原生质体的细胞壁再生(参见EP238023和Malardier等，1989，基因，78：147-156)。优选利用含有核酸构建体的整合载体转化细胞，所述核酸构建体含有控制序列和/或编码血红素生物合成酶的核酸序列，其中该构建体便利地整合到了丝状真菌细胞的宿主基因组中，优选染色体中。本文中术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，它分离自天然存在的基因，或是已被修饰而包含了以自然界并不存在的方式联合并置的数段核酸。
利用本领域已知方法，在适于生产血红素蛋白和血红素生物合成酶的营养培养基中培养本发明的丝状真菌细胞。例如，可在实验室或工业用发酵罐内，在合适的培养基中、允许表达和/或分离血红素蛋白的条件下经摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固相发酵)培养该细胞。培养是利用本领域已知方法(参见如Bennett J.W.和LaSureL.编，More Gene Manipulations in Fungi，学术出版社，CA，1991)，在含碳、氮源和无机盐的适宜营养培养基中进行的。适当的培养基可商购，或按照公开的组合物(如美国典型培养物保藏中心的目录中)配制而成。若血红素蛋白被分泌至营养培养基中，则可直接从培养基中回收该血红素蛋白。用于丝状真菌宿主细胞中血红素蛋白分泌的信号肽编码区可得自于米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola Lanuginosa纤维素酶基因或Rhizomucor miehei脂肪酶基因。若血红素蛋白不被分泌，则可从细胞裂解物中回收该蛋白质。
可通过本领域已知方法回收所产生的血红素蛋白。例如，可通过包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀等常规方法，从营养培养基中回收血红素蛋白。然后可通过一系列层析方法如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等对所回收的蛋白质进行进一步纯化。
在本发明的一个方面，通过将可指导由丝状真菌细胞内源第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的一个或多个第一种控制序列导入丝状真菌细胞内，从而在丝状真菌细胞中更大量生产血红素蛋白，其中所述一个或多个第一种控制序列与所述第一种核酸序列有效相连。
所述第一种核酸序列可以是编码选自下述的血红素生物合成酶的任何丝状真菌核酸序列：5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、胆色素原合成酶、胆色素原脱氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脱羧酶、粪卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶以及亚铁螯合酶，其中第一种核酸序列对该丝状真菌宿主细胞而言是内源的。本文中术语“内源的”是指最初来源于该丝状真菌宿主细胞。
本文中术语“控制序列”是指包括第一种核酸序列的编码序列的表达所必需的或有益的所有组分。该控制序列对编码血红素生物合成酶的第一种核酸序列而言可以是天然的，或可得自其它来源，或可以是天然和外源控制序列的组合。外源控制序列可简单替换或添加到天然控制序列中，以获得与编码序列正常相连的天然控制序列相比更高水平的所需血红素生物合成酶的产量。这类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列以及转录终止子。为了能在控制序列的指导下进行表达，将根据本发明所用的第一种核酸序列与控制序列有效相连，从而在与控制序列相容的条件下获得第一种核酸序列的编码序列的表达。本文中术语“编码序列”定义为一旦置于上述控制序列的控制下即可转录成mRNA并翻译成血红素生物合成酶的序列。编码序列的边界确定为5′-末端翻译起始密码子和3′-末端的翻译终止密码子。编码序列包括但不限于DNA、cDNA及重组核酸序列。
第一种控制序列可以是适当的启动子序列，即可被丝状真菌宿主识别而用于第一种核酸序列表达的核酸序列。启动子序列含有可介导血红素生物合成酶表达的转录和翻译控制序列。该启动子可以是在选定的宿主细胞内具有转录活性的任何启动子序列，可得自与宿主细胞同源或异源的基因。可在丝状真菌宿主中指导第一种核酸序列转录的适当启动子的实例有得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶等的基因的启动子或其杂合体。特别优选的启动子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(来源于编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合体)以及glaA启动子。
第一种控制序列也可以是适当的转录终止序列，即可被丝状真菌宿主识别而终止转录的一段序列。该终止序列与编码血红素生物合成酶的第一种核酸序列的3′末端有效相连。终止序列可能对编码血红素生物合成酶的第一种核酸序列来说是天然的，也可以得自其它来源，即是一种外源终止序列。在选定的丝状真菌宿主细胞内有效的任何终止子在本发明中很可能也有用处，但特别优选得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸盐合成酶及黑曲霉α-葡糖苷酶的基因的终止子。
该第一种控制序列也可能是适当的前导序列，即mRNA中对丝状真菌宿主的翻译具有重要作用的非翻译区。该前导序列与编码血红素生物合成酶的第一种核酸序列的5′末端有效相连。前导序列可能对第一种核酸序列是天然的，或可得自其它来源即外源前导序列。在选定的丝状真菌宿主细胞内有功能的任何前导序列很可能在本发明中也是有用的，但特别优选得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的前导序列。
该第一种控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即与第一种核酸序列的3′末端有效相连、并且转录时能被丝状真菌宿主识别以将聚腺苷酸残基加到转录mRNA中的一段序列。该聚腺苷酸化序列可能对编码血红素生物合成酶的第一种核酸序列来说是天然的，或可得自其它来源，即外源聚腺苷酸化序列。在选定的真菌宿主中有功能的任何聚苷酸化序列很可能在本发明中也是有用的，但特别优选得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸盐合成酶及黑曲霉α-葡糖苷酶的基因的聚腺苷酸化序列。
第一种控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与血红素生物合成酶的氨基末端相连的氨基酸序列，从而将血红素生物合成酶定位于特定细胞区室中。该信号肽编码区可能对编码血红素生物合成酶的第一种核酸序列来说是天然的，或可以得自外源。第一种核酸序列的编码序列的5′末端本身可能含有信号肽编码区，该信号肽编码区与编码定位血红素生物合成酶的编码区的片段在翻译读框内自然连接。或者，该编码序列的5′末端可含有编码相对于编码定位血红素生物合成酶的编码序列部分而言是外源的信号肽编码区的核酸。信号肽编码区可得自粗糙脉孢霉ATPase基因(Viebrock等，1982，EMBO Journal 1：565-571)或酿酒酵母细胞色素C过氧化物酶基因(Kaput等，1982，生物化学杂志，257：15054-15058)。然而，能够在选定的丝状真菌宿主中促使血红素生物合成酶定位的任何信号肽编码区在本发明中均有可能使用。
第一种控制序列也可以是编码位于成熟并具生物化学活性的多肽的氨基末端氨基酸序列的肽原编码区，所获得的多肽公知为酶原或多肽原(或在某些情形下为酶原)。酶原通常是没有活性的，通过肽原的催化或自身催化切割可从酶原转变为成熟的活性多肽。本文将有生物化学活性的多肽限定为以可发挥其天然对应物的生物化学活性的活性形式生产的血红素生物合成酶。该肽原序列可以是对于编码血红素生物合成酶的第一种核酸序列来说是天然的，也可得自其它来源，即一种外源肽原序列。编码肽原的核酸序列可得自编码酿酒酵母α-因子和Myceliphthorathermophilum漆酶的基因。
在本发明的另一方面，通过将编码血红素生物合成酶的一个或多个第二种核酸序列的一或多拷贝导入丝状真菌细胞内而在丝状真菌细胞中更大量生产血红素蛋白。该第二种核酸序列可以是编码选自下述的血红素生物合成酶的任何一种核酸序列：5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、胆色素原合成酶、胆色素原脱氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脱羧酶、粪卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶以及亚铁螯合酶。第二种核酸序列可得自任何微生物来源。第二种核酸序列的来源的选择将取决于丝状真菌宿主细胞，但优选真菌来源，如酵母和丝状真菌。优选的丝状真菌来源包括但不限于枝顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢霉属、青霉属、Phanerochaete属、梭孢壳属、Tolypocladium属及木霉属。优选酵母源包括但不限于假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酶母属、酵母属、裂殖酵母属和Yarrowia属。另外，第二种核酸序列可以是丝状真菌宿主细胞的天然序列。
第二种核酸序列可以是下述序列之一或若干：1.5-氨基-γ-酮戊酸合成酶基因：
a.酿酒酵母(Urban-Grimal等，1986，欧洲生物化学杂志，156：511-59)；
b.构巢曲霉(Bradshaw等，1993，现代遗传学，23：501-507)；
c.类球红细菌(Tai等，1988，基因，70：139-152)；
d.荚膜红细菌(Hornberger等，1990，分子普通遗传学，211：371-378)；以及
e.大肠杆菌(Drolet等，1989，分子普通遗传学，216：347-352)。2.胆色素原合成酶基因：
a.酿酒酵母(Myers等，1987，生物化学杂志，262：16822-16829)；
b.金黄色葡萄球菌(Kafala和Sasarman，1994，加拿大微生物学杂志，40：651-657)；
c.类球红细菌(Delaunay等，1991，细菌学杂志，173：2712-2715)；
d.大肠杆菌(Echelard等，1988，分子普通遗传学，214，503-508)；以及
e.枯草芽孢杆菌(Hansson等，1991，细菌学杂志，173：2590-2599)。3.胆色素原脱氨基酶基因：
a.酿酒酵母(Keng等，1992，分子普通遗传学，234：33-433)；
b.人(Yoo等，1993，基因组，15：221-29；Raich等，1986，核酸研究，14：5955-5968)；
c.大肠杆菌(Thomas和Jordan，1986，核酸研究，14：6215-6226)；以及
d.枯草芽孢杆菌(Petricek等，1990，细菌学杂志，172：2250-2258)。4.尿卟啉原III合成酶基因：
a.酿酒酵母(Amillet和Labbe-bois，1995，酵母，11：419-424)；
b.枯草芽孢杆菌(Hansson等，1991，细菌学杂志，173：2590-2599)；以及
c.大肠杆菌(Jordan等，1987，核酸研究，15：10583)。5.尿卟啉原III脱羧酶基因：
a.酿酒酵母(Garey等，1992，欧洲生物化学杂志，205：1011-1016)；以及
b.人(Romeo等，1986，生物化学杂志，261：9825-9831)。6.粪卟啉原III氧化酶基因：
a.人(Martasek等，1994，美国国家科学院院报，911：3024-3028)；
b.大肠杆菌(Troup等，1994，细菌学杂志，176：673-680)；以及
c.酿酒酵母(zaagorec等，1986，生物化学杂志，263：9718-9724)。7.原卟啉原IX氧化酶基因：
a.人(Taketani等，1995，基因组，29：698-703)；
b.枯草芽孢杆菌(Dailey等，1994，生物化学杂志，269：813-815)；以及
c.大肠杆菌(Sasarman等，1993，加拿大微生物学杂志，39：155-161)。8.亚铁螯合酶基因：
a.酿酒酵母(Labbe-Bois，1990，生物化学杂志，265：7278-72883)；
b.牛(Shibuya等，1995，生物化学与生物物理学学报，1231：117-120)；
c.大豆慢生根瘤菌(Frustaci和O′Brian，1993，应用环境微生物学，59：347-2351)；
d.大肠杆菌(Frustaci和O′Brian，1993，细菌学杂志，175：2154-2156)；以及
e.枯草芽孢杆菌(Hansson和Hederstedt，1992，细菌学杂志，174：8081-88093)。
在一个更优选的实施方案中，所说的第二种核酸序列得自曲霉属种。在一个甚至更优选的实施方案中，所说的第二种核酸序列得自无花果曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。在另一个更优选的实施方案中，第二种核酸序列得自酵母属种。在一个甚至更优选的实施方案中，第二种核酸序列得自酿酒酵母、卡尔酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglassi，克鲁弗酵母、诺地酵母或Saccharomycesoviformis。
在一个最优选的实施方案中，编码5-氨基-γ-酮戊酸合成酶的第二种核酸序列得自米曲霉A1560菌株(IFO4177)，如SEQ ID No：1所示的核酸序列。编码5-氨基-γ-酮戊酸合成酶的第二种核酸序列也可以是编码具有SEQ ID No：2所示氨基酸序列的5-氨基-γ-酮戊酸合成酶的核酸序列，该核酸序列由于遗传密码简并性而与SEQ ID No：1有所不同。在另一个最优选的实施方案中，编码胆色素原合成酶的第二种核酸序列得自米曲霉A1560菌株(IFO4177)，如SEQ ID No：3所示的核酸序列。编码胆色素原合成酶的第二种核酸还可以是编码具有SEQ ID No：4所示氨基酸序列的胆色素原合成酶的核酸序列，该核酸序列由于遗传密码简并性而与SEQID No：3有所不同。本发明的第二种核酸序列还包括由SEQ ID No：1和SEQ ID No：3所示的基因组序列及相应的cDNA和RNA序列。应理解本文所用词语“核酸序列”包括包含合成DNA在内的所有这类变体。
在一个优选实施方案中，将与一个或多个第二种控制序列有效相连的第二种核酸序列导入丝状真菌宿主中。该第二种控制序列可以是对编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列而言是天然的，也可以部分或全部来源于外源。外源控制序列可简单地替换天然控制序列以获得相对于天然控制序列与编码序列正常相连时更高产量的目的血红素生物合成酶。第二种控制序列可以是上述有关第一种控制序列时例举的控制序列中的任何一种。
在本发明的另一方面，将一个或多个第一种控制序列的一或多拷贝与一个或多个第二种核酸序列的一或多拷贝导入丝状真菌细胞中。优选地，该第二种核酸序列与一个或数个第二种控制序列有效相连。
第一种控制序列、第二种核酸序列和/或第二种控制序列可包含在同一核酸构建体中，也可包含在不同的核酸构建体中。每一种核酸构建体都可含有整合元件以用于指导通过同源重组而整合至真菌宿主基因组的精确位点。为了提高在精确位点发生整合的可能性，所述整合元件优选地应含有足够数目的核酸，如100-1500个碱基对，优选400-1500个碱基对，最优选为800-1500个碱基对，该核酸与相应的靶序列高度同源以提高同源重组的概率。整合元件可以是与丝状真菌宿主细胞的基因组内靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码核酸序列或编码核酸序列。另一方面，也可通过非同源重组将每种核酸构建体整合至丝状真菌宿主细胞的基因组中。
利用本领域已知的分子生物学技术，可将核酸构建体***适当的载体中，或可将第二种核酸序列直接***已含有控制序列的载体中。这些载体可以是能便利地进行重组DNA操作并能导致本发明核酸序列表达的任何一种载体。载体的选择通常取决于该载人与欲导入该载体的丝状真菌细胞之间的相容性。该载体可以是自主复制型载体，即在染色体外完整存在、并能独立于染色体复制而进行复制的载体，诸如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。或者，载体也可以是导入丝状真菌细胞时能整合至基因组中并与其整合入的染色体一起复制的一种载体。载体***可以是单个载体或质粒，也可以是合在一起含有待导入丝状真菌宿主基因组内的总DNA的两个或多个载体或质粒。
本发明的载体优选地含有能便于对转化细胞进行筛选的一个或多个选择标记。选择标记是其产物能提供对杀生物剂或对病毒的抗性、重金属抗性、营养缺陷体的原养型等的基因。该选择标记可选自下述组，所述组中含有但并不限于amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC、bar和hygB。在曲霉细胞中，优选使用构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。此外，也可通过共转化完成筛选，如WO91/17243所述，其中选择标记包含于另一个载体中。
本领域普通技术人员熟知用于连接本发明的核酸构建体、启动子、终止子和其它元件以及将它们***至含有复制必需信息的适当载体中的方法(参见如Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)。
本发明方法还包括将一个或多个编码血红素蛋白的第三种核酸序列的一或多拷贝导入丝状真菌细胞中。可以在步骤a之前或之后，但应在步骤b之前导入编码血红素蛋白的第三种核酸序列。第三种核酸序列可与第一种控制序列、第二种核酸序列及第二种控制序列包含在同一载体中，它们也可包含在不同载体上。优选第三种核酸序列与第三种控制序列有效相连。上文就第一种控制序列而列举的控制序列也适用于第三种控制序列。
本发明方法还可包括将血红素源、其类似物或者一个或多个生产途径中间体加入营养培养基中。有关血红素类似物和生产途径中间体的一览表参见Porphyrin Products Inc.(Logan，UT)的产品小册子。比如，若将编码血红素生物合成途径中的某个酶的核酸序列导入丝状真菌细胞，则在此之前的一个或多个步骤中的一个或多个途径中间体可能变得具有限速性。在此情形下，可将一个或多个途径中间体补加到培养基中。为将这些途径中间体导入细胞，可以使用一种能使细胞膜半通透化的酶，如NOVOZYM234TM(Novo Nordisk A/S)。
本发明方法还包括将铁源加入营养培养基中。或者，这些方法还包括加入能诱导卟啉合成的其它任何金属离子。参见如Mamet等，1996，生物金属，9：73-77。
本发明也涉及重组型丝状真菌细胞，该细胞含有一个或多个可指导由丝状真菌细胞内源的第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的第一种控制序列和/或一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝。这些序列可整合至真菌细胞的基因组中，或可包含在染色体外自主复制型载体中。
本发明的丝状真菌细胞还可含有编码血红素蛋白的第三种核酸序列的一或多拷贝，其中第三种核酸序列与可指导丝状真菌细胞中血红素蛋白表达的第三种控制序列有效相连；编码血红素蛋白的第三种核酸序列被整合至真菌细胞基因组中，或包含于染色体外自主复制型载体中。
丝状真菌宿主细胞的选择很大程度上取决于控制序列、编码血红素生物合成酶的核酸序列以及血红素蛋白的来源。在一个优选实施方案中，丝状真菌缩主细胞是下述种但不限于这些种的细胞：枝顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢霉属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium属及木霉属。在一个优选实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是枝顶孢属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是镰孢属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是腐质霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是毛霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是脉孢霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是青霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是梭孢壳属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是Tolypocladium属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。在一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是无花果曲霉细胞、臭曲霉细胞、日本曲霉细胞、黑曲霉细胞、构巢曲霉细胞或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是尖镰孢细胞或禾本科镰孢细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens细胞或Humicola lanuginosus细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是Myceliophthora thermophilum细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是米黑毛霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是粗糙脉孢霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是产紫青霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是Thielaviaterrestris细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是Trichoderma harzianum细胞，康宁木霉细胞、Trichodermalongibrachiatum细胞、Trichoderma reesei细胞，或绿色木霉细胞。
本发明由下列实施例进一步描述。这些实施例不应被认为是对本发明范围的限制。
                        实施例
实施例1：提取米曲霉A1560菌株基因组DNA
于32℃，250rpm下，在25ml 0.5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培养基中将米曲霉A1560菌株(IFO4177)培养24小时，然后通过Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)过滤收集菌丝，用25ml 10mMTris-1mM EDTA(TE)缓冲液洗涤1次，吸干菌丝上多余的缓冲液，随后将其在液氮中冷冻。在电动咖啡磨碎机中将冷冻的菌丝磨成细粉末，将粉末加入一次性塑料离心管内的20ml TE缓冲液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)中，将混合物轻轻颠倒几次以确保混匀。用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)抽提2次。加入醋酸钠(3M溶液)使其终浓度为0.3M，用2.5倍体积的冰冷乙醇沉淀核酸。在15,000×g将此管离心30分钟得到核酸沉淀。将沉淀物风干30分钟，然后重新悬浮于0.5mlTE缓冲液中。加入不含DNA酶的核糖核酸酶A至浓度为100μg/ml，将混合物在37℃下保温30分钟。然后加入蛋白酶K至浓度为200μg/ml。再在37℃下将混合物继续保温1小时。最后，如前述，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)将混合物抽提2次，再用醋酸钠和乙醇沉淀DNA。真空干燥DNA沉淀物，重新悬浮于TE缓冲液中，贮于4℃备用。
实施例2：构建质粒pSE04
利用实施例1所述的同样方法提取构巢曲霉A26菌株(真菌遗传学保藏中心，Kanasas City，KS)的基因组DNA。将通过含有构巢曲霉A26基因组DNA的扩增反应获得的PCR片段连接而构建成质粒pSE04。扩增反应中含有下述组分：构巢曲霉A26基因组DNA 50ng，dATP、dCTP、dGTP、dTTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)各100μM，引物ALAS3d 5′-TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC-3′(SEQ ID No：5)和引物ALAS4e 5′-CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTGG-3′(SEQ ID No：6)各50pmol，Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)2单位，以及1×Taq DNA聚合酶缓冲液(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反应在Perkin-Elmer热循环仪(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)中进行30个循环，每个循环包括95℃1分钟、55℃1分钟以及72℃90秒。在40mM Tris-乙酸-1mM乙二胺四乙酸二钠(TAE)缓冲液中，利用1.1％低熔点琼脂糖凝胶(FMC，Rockland，ME)电泳后通过切割条带分离得到2kb的PCR产物，并按照生产商的说明将其亚克隆至pCRII载体中(Invitrogen，San Diego，CA)以获得pSE04(图1)。
实施例3：米曲霉A1560菌株DNA文库及ALA合成酶(hemA)克隆的鉴定
按照生产商的说明，将E.coli Y1090ZL细胞用作平铺和纯化重组噬菌体的宿主，将E.coli DH10Bzip用作切割各个pZL1-hemA克隆的宿主，利用噬菌体克隆载体λZipLox(Life Technologies，Gaithersburg，MD)构建米曲霉A1560菌株的基因组DNA文库。用Tsp509I部分消化按实施例1制备的总细胞DNA，并在50mM Tris-50mM硼酸盐-1mM乙二胺四乙酸二钠(TBE)缓冲液中利用1％琼脂糖凝胶进行片段大小分离。切下迁移范围在4-7kb的DNA片段，并利用Prep-a-Gene试剂(BioRadLaboratories，Hercules，CA)从凝胶中将DNA片段洗脱下来。将洗脱下来的DNA片段与已经EcoRI切割并去磷酸化的λZipLox载体臂进行连接，利用可商购的包装提取物(Stratagene，La Jolla，CA)对连接混合物进行包装。在E.coli Y1090ZL细胞中平铺和扩增经包装的DNA文库。未扩增的基因组文库含有1×106pfu/ml。
将7×104个噬斑的噬菌体DNA转移至双层圆形Nytran Plus膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上，并利用地高辛(DIG)标记的探针进行探测，此探针是通过PCR扩增来自实施例2所述质粒pSE04的构巢曲霉hemA基因组DNA制备而成。扩增反应含有下述组分：1×DIG探针合成混合液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，dATP、dCTP、dTTP和dGTP各100μM，实施例2所述引物ALAS3d和引物ALAS4e各50pmol，Taq DNA聚合酶2单位，以及1×Taq DNA聚合酶缓冲液。反应在Perkin-Elmer热循环仪中进行30个循环，每个循环包括95℃1分钟、55℃1分钟以及72℃2分钟。以2ng/ml的浓度将经变性的探针加入至杂交缓冲液中，并与经预杂交的膜一起保温过夜。预杂和杂交是在42℃下，在5×SSC、0.1％sarkosyl、0.02％SDS、1％Genius阻断试剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和30％甲酰胺中进行的。在5×SSC-0.1％SDS中将膜洗涤两次，随后在2×SSC-0.1％SDS中洗涤两次，每次洗涤均是在室温下进行15分钟。按照生产商说明，于室温将洗涤好的膜对Kodak X-OMAT AR胶片曝光约2小时，再利用Konica QX-70自动胶片处理机进行显影。对初始噬斑进行再次纯化和筛选。鉴定出5个克隆，再按照生产商说明(Bethesda Research Laboratories Inc.，Gaithersburg，MD)将其切割至pZL衍生物中。将所述pZL衍生物命名为E.coli DH5 α pSE11，pSE13，pSE15，pSE17和pSE20。已发现这些克隆有所重叠，它们跨越一个4.2kb的区域，此区域的限制性图谱示于图2。
实施例4：利用5-氨基-γ-酮戊酸合成酶(hemA)探针对米曲霉A1560菌株基因组DNA进行Southern杂交
将按实施例1所述的方法制备的米曲霉A1560菌株基因组DNA(10μg)用BamHI或EcoRI进行限制性消化。在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳分离片段。按照生产商说明，利用Turbo Blot装置(Schleicher & Schuell，Keene，NH)，在0.4N NaOH中将DNA转移到NytranPlus膜上。在Hybaid烘箱(Labnet，Woodbridge，NJ)内，将膜在5×SSC、0.1％sarkosyl、0.02％SDS、1％Genius阻断试剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和50％甲酰胺中于42℃预杂交2小时。使用DIG标记的hemA探针进行杂交，该探针如实施例3所述通过PCR扩增获得，不同之处在于此处使用HemA克隆pSE17作为模板，并使用引物hemA5′5′-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3′(SEQ ID No：7)和引物hemA3′5′-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3′(SEQ ID No：8)。将DIG标记的hemA探针(1ng探针/ml溶液)加入新鲜的杂交缓冲液中，与膜一起在42℃保温过夜。随后，将膜在5×SSC-0.1％SDS中于室温洗涤2次，每次15分钟，再在2×SSC-0.1％SDS中于相同的条件下洗涤2次。于室温下将洗涤后的膜对Kodak X-OMAT AR胶片曝光约2小时，随后按照生产商说明，利用Konica QX-70自动胶片处理机进行影。
利用米曲霉hemA探针与米曲霉基因组DNA一起进行的Southern印迹杂交结果表明杂交信号与单基因拷贝数一致。BamHI泳道上观察到的1.7kb条带可从限制性图谱上推断出来(图2)。
实施例5：米曲霉A1560 5-氨基-γ-酮戊酸合成酶(hemA)基因的表征
按下述方法，对实施例3中所述的E.coli DH5αpSE17进行DNA测序。利用Applied Biosytems的373A型DNA自动测序仪(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)，使用含染料-终止剂化学的引物步行技术(Giesecke等，1992，病毒学方法杂志，38：47-60)对两条链进行DNA测序，测序中使用了M13反向引物(-48)和M13正向引物(-20)(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)，以及此待测序DNA的特异引物。
如图3(SEQ ID No：1)所示，此克隆基因的核苷酸序列表明其中含有一个具1911个核苷酸的开放阅读框。该编码序列中不包含任何内含子，这一点可通过cDNA克隆和序列分析得到证实；与之相反，构巢曲霉hemA基因在其5′末端含有一个内含子(Bradshaw等，1993，现代遗传学(Current Genetics)，23：501-507)。如其它真菌基因一样，此克隆基因的5′非翻译序列含有一些嘧啶富含区和AT富含区(Gurr等，1987，KinghornJ.R.(编)，《真核微生物的基因结构》，pp93-139，IRL出版社，Oxford)，另外它还含有在-249位的CCAAT序列以及在-35位的推断TATA盒。此CCAAT序列是转录调节子的一致结合位点，所述的转录调节子能对氧作出反应从而调节转录，如酵母和人中的Hap2/3/4转录调节复合物(Olesen和Guarente，1990，分子和细胞生物学，12：2302-2314)。此调节复合物在哺乳动物中也是保守的。在构巢曲霉中也检测到CCAAT结合活性(Davis等，1993，Genetica 90：133-145)。在米曲霉hemA基因中此序列的重要性仍不清楚，并且，由于序列信息有限，构巢曲霉hemA5′区内此序列的重要性也未能确证(Bradshaw等，1993，出处同前)。米曲霉hemA基因对氧作出反应从而受到的转录调控目前还不清楚，但是甚至在氧限制条件下，构巢曲霉hemA基因也没有显现出受到转录调控(Bradshaw等，1993，同处同前)。有趣的是，酵母HEM1基因也是组成型表达，但其表达是通过正调控位点与负调控位点间的平衡来控制的(Keng和Guarente，1987，美国国家科学院院报，84：9113-9117)。此克隆基因的3′非翻译区存在一个(AC)35重复基元(motif)。在哺乳动物和酵母基因的亚端粒、内含子和启动子区也观察到类似的重复区，尽管它们在基因扩增过程中有所参与，但它们的功能仍然是未知的(Passanati等，1987，EMBO Journal6：1697-1703)。
米曲霉A1560菌株之基因产物推断的氨基酸序列示于图3(SEQ IDNo：2)。该核苷酸序列编码分子量为68kDa、含636个氨基酸的预测蛋白质。由于此酶位于线粒体中，推测其N末端含有线粒体前导序列。事实上，此蛋白质前35个氨基酸富含丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸残基，这与作为线粒体前导序列的功能是一致的。在构巢曲霉和米曲霉hemA序列(图4)推测的线粒体前导序列中都有一个可能的血红素调节基元(HRM)。估计位于前导序列中的HRM能通过与血红素直接作用而阻止将5-氨基-γ-酮戊酸合成酶蛋白输入小鼠线粒体中(Lathrop和Timko，1993，科学，259：522-525；Zhang和Guarente，1995，EMBO Journal14：313-320)。另一个可能的HRM也位于推定的成熟蛋白质序列的开始处。HRM很可能在5-氨基-γ-酮戊酸合成酶活性的调控中起着一定的作用。有趣的是，酿酒酵母5-氨基-γ-酮戊酸合成酶蛋白质序列不含有任何可能的HRM，并且，它似乎并不是酵母血红素生物合成中的一个关键调控步骤(Labbe-Bois和Labbe，于Daley，Harry A.所编《血红素和叶绿素的生物合成》中，McGraw Hill Publishers，纽约，pp235-285)。
总的说来，利用Applied Biosystems的GeneAssist程序(blosum 62.mat matrix)测定的结果表明图5所示的推断氨基酸序列与构巢曲霉hemA基因(SEQ ID No：22)有81％相同，与酿酒酵母HEM1基因(SEQ IDNo：23；Urban-Grimal，1986，欧洲生物化学杂志，156：511-519)有57％相同，与人红细胞heml(ALAS2)基因(SEQ ID No：24；Bishop，1990，核酸研究，18：7187-7188)有51％相同。然而，最高程度的保守位于蛋白质包括有催化结构域在内的C端2/3区。另外，在其它5-氨基-γ-酮戊酸合成酶(Ferreira等，1995，生物能和生物膜杂志(Journal ofBioenergetics and Biomembranes)，27：151-159；Ferreira，1995，蛋白质科学，4：1001-1006)中对催化活性和磷酸吡哆醛辅因子结合有重要作用的赖氨酸和甘氨酸环(loop)在此推断的氨基酸序列中也是高度保守的。
实施例6：载体pSE31的构建
通过将PCR扩增的米曲霉hemA DNA定向克隆至pBANe6中构建成质粒pSE31(图6)。PCR扩增反应中使用了来源于实施例3所述之hemA克隆E.coli DH5αpSE17的DNA。反应中含有下述组分：50ngpSE17、2单位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，1×Vent DNA聚合酶缓冲液(New England Biolabs，Beverly，MA)，各400μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，以及各50pmol的引物hemA5′5′-TC ATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3′(SEQ ID No：7)和引物hemA3′5′-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3′(SEQ ID No：8)。反应在Perkin-Elmer热循环仪中进行30个循环，每个循环包括95℃1分钟、55℃1分钟以及72℃90秒。引物hemA 5′含有一个SwaI位点(下划线)，引物hemA3′含有一个PacI位点(下划线)，这两个位点用于将PCR产物克隆至经SwaI和PacI消化的pBANe6中以产生pSE31(图7)。
实施例7：米曲霉JRoC50.3.18A菌株的构建
按下述方法构建含质粒pJROC50的米曲霉JRoC50.3.18A菌株。利用如下所示的特异性寡性苷酸引物(Saiki等，1988，科学，239：487-491)，通过PCR制备灰盖鬼伞IFO 8371的过氧化物酶cDNA片段。这些引物是依据长根鬼伞过氧化物酶的氨基酸序列(Baunsgaard等，1993，欧洲生物化学杂志，213：605-611)设计而成的：1.    5’-GCGCGAATTCGTNGGNATNGGNATNAA(CT)CA(CT)GG-3’(SEQ ID NO：9)2.    3’-TACAGNTT(GA)AC(GA)GGNGGCCTAGGCG-5’(SEQ ID NO：10)3.    5’-GCGAATTCACNCCNCA(GA)GTNTT(CT)GA(CT)AC-3’(SEQ ID NO：11)4.    3’-GGNAA(GA)GGNCCNCT(CT)AA(GA)CCTAGGCG-5’(SEQ ID NO：12)5.    5’-GCGCGAATTCTGGCA(GA)TCNAC-3’(SEQ ID NO：13)6.    5’-GCGCGAATTCTGGCA(GA)AGNATG-3’(SEQ ID NO：14)7.    3’-CGNTACCGNTT(CT)TACAGCCTAGG-5’(SEQ ID NO：15)
按照生产商说明，利用Gene Amp试剂盒和仪器(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)进行PCR。与生产商说明不同之处在于，此反应中前3个循环是在28℃下进行的，以获得与第一链cDNA(由来源于灰盖鬼伞IFO8371菌株的mRNA制备而成)更好的杂交，随后PCR在65℃下进行30个循环。
对引物进行如下组合：1与2；3与4；5与7；6与7；1与4；以及3与7。PCR片段在5′末端延伸了一个EcoRI位点，在3′末端延伸了一个BamHI位点。反应产物在1％琼脂糖-TBE凝胶中进行分析，发现所有反应中均含有预期大小的条带。为了证实这些片段都对应于对氧化物酶特异性序列，对凝胶进行Southern印迹，并利用位于引物3和4之间的具下述序列的寡核苷酸探针进行杂交：
5’-GT(CT)TC(GA)AT(GA)TAGAA(CT)TG-3’(SEQ ID NO：16)
结果表明此探针能与大约130bp、420bp、540bp和240bp的条带进行杂交，由此证实观察到的DNA条带确实对应于过氧化物酶序列。
各个PCR反应来源的DNA经EcoRI和BamHI消化后，克隆至质粒pUC19(New England Biolabs，Beverly，MA)中。利用上文所述寡核苷酸探针(SEQ ID No：16)，通过杂交鉴定含有正确PCR片段的菌落。按照Sanger等所叙述的方法(1977，美国国家科学院院报，74：5463-5476)，通过限制性作图和部分DNA序列分析，对阳性菌落的DNA进行分析。来源于其中一个克隆的、通过利用引物1和4所获得的430bp片段按下述方法用于筛选灰盖鬼伞cDNA文库。
按照Boel等(1984，EMBO Journal 3：1097-1102)和Chirgwin等(1979，生物化学，18：5294-5299)所叙述的方法，在最高过氧化物酶活性的时间点收集灰盖鬼伞IFO8371菌株的菌丝并进行匀浆，从中提取总RNA。按照Aviv和Leder(1972，美国国家科学院院报，69：1408-1412)所叙述的方法，在oligo(dT)-纤维素柱上进行两轮亲和层析获得含有poly(A)的RNA。根据生产商说明，利用cDNA合成试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)合成cDNA。将灰盖鬼伞cDNA文库中大约50,000个E.coli重组子转移至Whatman 540纸滤膜上。按照Gerger等(1979，核酸研究，7：2115-2135)所叙述的方法裂解和固定菌落。在0.2×SSC-0.1％SDS中将滤膜与32P标记的430bp过氧化物酶基因特异性探针一起杂交。在65℃对滤膜进行杂交和洗涤，随后使用增感屏进行24小时放射自显影。放射自显影后，在逐渐递增的温度下洗涤滤膜并与增感屏一起放射自显影24小时。通过此途径，鉴定出50多个阳性克隆。按照标准方法(Birnboim和Doly，1979，核酸研究，7：1513-1523)，从杂交菌落中小量制备质粒DNA，再通过Sanger双脱氧法(Sanger等，1977，美国国家科学院院报，74：5463-5467)测定这些cDNA***片段的DNA序列。从这些菌落中挑选出一个，并将此载体命名为pCiP。经过BamHI/XhoI切割，从载体上切下过氧化物酶cDNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳纯化此片段，进行电洗脱，并经各种处理以备连接反应之用。将此cDNA片段连接至经BamHI/XhoI消化的pHD414以产生pJVi9，其中，如图8所示，cDNA是在米曲霉来源的TAKA启动子和黑曲霉来源的AMGTM(Novo NordiskA/S，Bagsvard，Denmark)终止子的转录调控之下。
从质粒pJVi9中以BamHI/XhoI片段形式切下编码过氧化物酶的cDNA，再克隆至质粒pJeRS6(图9)中，形成质粒pJRoC50(图10)。质粒pJRoC50中含有作为选择标记的pyrG，以及TAKA启动子和amdS终止子。
利用5μg已纯化的质粒pJRoC50，按下述方法，并作如下变动，以制备米曲霉HowB425菌株的转化体。取消琼脂覆盖层，将原生质体直接铺板于基本培养基(Minimal Medium)平板上。转化反应使用浓度为2×107个/ml的原生质体。将100μl原生质体与5μg DNA一起置于冰上30分钟，加入1ml SPTC(40％PEG4000，0.8M山梨醇，0.05M TrispH8.0，0.05M CaCl2)，将原生质体置于34℃保温20分钟。将转化产物直接铺板于含有基本培养基的平板上。每升所述基本培养基(pH6.5)含有：6g NaNO3，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，1ml痕量金属溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4-7H2O，342.3g蔗糖和20g Noble琼脂。每升痕量金属溶液(1000×)含有：22g ZnSO4-7H2O，11g H3BO3，5gMnCl2-4H2O，5g FeSO4-7H2O，1.6g CoCl2-5H2O，1.6g(NH4)6Mo7O24以及50gNa4EDTA。将平板置于34℃保温5-7天，再将转化体转移至含有同样培养基的平板上，在37℃继续保温3-5天。
按下述酶测定方法测定66个转化体中的过氧化物酶活性：在按1∶900稀释的培养上清液20μl中加入180μl底物缓冲液{20ml 0.1M磷酸钾-0.01％吐温80 pH7.0，250μl 2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)(ABTS)溶液(22mg/ml)及2μl 30％过氧化氢}，利用MolecularDevices的Thermomax微量板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)迅速在25℃测定405nm处的光吸收值。在2分钟以上的时间段内不断混合，并每隔10秒钟记录一次测定值，再利用SOFTmax程度(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)计算Vmax值。以已知量的灰盖鬼伞过氧化物酶为标准绘制标准曲线，利用此标准曲线估计每毫升的过氧化物酶单位(POXU)。1POXU定义为在30℃下，每分钟催化0.88mM H2O2、1.67mM ABTS、0.1M磷酸盐pH7.0发生1.0μmole转变所需的酶量。利用上述同样的平板，在相同的条件下，通过孢子划线，挑选独立菌落，从而对4个具最高表达水平的转化体进行孢子纯化。
在摇瓶中，将每种转化体约5×106个孢子接种于25ml MY25培养基中，进行最终分析。MY25培养基含有1％酵母提取物，2.5％麦芽糖，0.2％尿素，以及1×MY盐溶液，pH6.5。每升1×MY盐溶液含有2gMgSO4-7H2O，2g K2HPO4、10g KH2PO4，2g柠檬酸，0.5ml痕量金属溶液，以及1ml10％CaCl2-2H2O。每升痕量金属溶液含有13.9gFeSO4-7H2O，8.5g MnSO4-H2O，14.28g ZnSO4-7H2O，1.63g CuSO4，0.24g NiCl2-6H2O，以及3.0g柠檬酸。将在50mM NaOH中新鲜制备的氯高铁血红素(hemin)10mg/ml储存液加入摇瓶中至终浓度0.01mg/ml。将摇瓶于34℃、200rpm保温7-8天。将能生产最大量过氧化物酶的转化体命名为JRoC50.3.18A。
实施例8：利用pSE31转化米曲霉JRoC50.3.18A菌株
利用pSE31转化米曲霉JRoC50.3.18A菌株以测定hemA基因的过量表达是否会提高过氧化物酶产量。
转化反应使用浓度为2×107个/ml的原生质体。在34℃，将100μl原生质体与10μg DNA和200μl 60％PEG4000-10mM HEPES-10mMCaCl2溶液一起保温30分钟。加入3ml SPTC(40％PEG4000，0.8M山梨醇，0.05M Tris pH8.0，0.05M CaCl2)，立即将原生质体平铺于COVE转化板(每升含有：0.52g KCl，0.52g MgSO4-7H2O，1.52g KH2PO4，1ml实施例7所述的痕量金属溶液，342.3g蔗糖，25g Noble琼脂，10ml 1M乙酰胺，以及10ml 3M CsCl)中以进行amdS转化。将平板于34℃保温5-7天。再将转化体转移至含有同样培养基的平板上，于34℃保温3-5天。然后利用这些板，在同样的条件下通过孢子划线、挑出独立菌落从而对转化体进行纯化。
实施例9：hemA转化体中过氧化物酶的生产
在24孔微滴定板的各个孔中以约1×105个孢子/孔的接种量分别接种实施例8来源的转化体，这些孔中含有1ml四分之一强度的MY25培养基和1×MY盐(参见实施例7)，所述四分之一强度的MY25培养基中含有0.25％酵母提取物，0.63％麦芽糖及0.05％尿素，pH6.5。在湿润摇床中，于34℃、100rpm将微滴定板保温5天。
利用实施例7所述的酶测定法测定过氧化物酶生产水平。微滴定板测试结果表明，hemA转化体的平均POXU/ml比仅转化载体的载化子平均水平高1.4倍，而最好的hemA转化体的过氧化物酶生产量提高了1.6倍。
小部分hemA转化体(39％)与大部分仅含载体的对照具有相似的过氧化物酶水平。利用按实施例1所述方法从各个转化体中分离的基因组DNA50ng，按实施例2所述方法进行PCR。与实施例2所述方法不同之处在于，此处使用引物hemA3′(见实施例4)和引物5′-TCTCTTCCTTCCTGAATCCTC-3′(SEQ ID No：17)。此分析结果表明hemA转化体中含有该表达盒。
在摇瓶中培养以上获得的11个最好的hemA转化体，以便更好地分析对过氧化物酶产量的影响。为了进行摇瓶分析，在25ml MY25培养基中接种每种转化体约5×106个孢子。所述MY25培养基中含有1％酵母提取物，2.5％麦芽糖，0.2％尿素以及1×MY盐溶液pH6.5(见实施例7)。将摇瓶在34℃、200rpm保温7-8天。按照前面所述方法进行过氧化物酶分析。
结果表明，5个转化体：SE01-15、SE01-20、SE01-26、SE01-28和SE01-32产生的过氧化物酶水平高于仅含载体的对照菌株，其中3个转化体表达的过氧化物酶水平比对照的过氧化物酶平均水平高1.9倍。剩下的6个hemA转化体的过氧化物酶水平与对照水平相当。
以高水平麦芽糖浆作碳源，利用标准的分批补料方法，在2升发酵液中培养转化体SE01-28和对照菌株SE05-18(单独pBANe6载体的转化体)。在批料和补料中添加FeCl3至约0.4mM。在两种培养物中维持正溶解氧压，并在第3-8天以每小时约2g糖化物/升的速率添加补料。在第2和3天后以逐步的方式达到此水平。发酵期间两种培养物的生物量大致相等。
据观察，SE01-28的过氧化物酶活性比对照菌株SE05-18高2倍，SE01-28的多肽水平也比对照菌株SE05-18高2倍。
所有结果表明hemA基因过量表达能提高过氧化物酶产量约2倍，这些数据进一步说明hemA可能在丝状真菌的血红素生物合成中代表一个关键的调控点，在缺乏氯高铁血红素补给时，hemA在遗传调控的水平上能提高血红素蛋白的产量。
实施例10：通过PCR制备基因组hemB探针
依据米曲霉126bp hemB片段的侧翼氨基酸序列(Jesper Vind，1994，博士论言，哥本哈根大学，哥本哈根，丹麦)和酵母及人hemB克隆的同源区(Myers等，1987，生物化学杂志，262：16822-16829；Wetmur等，1986，美国国家科学院院报，83：7703-7707)，设计简并性PCR引物。利用Applied Biosystems 394型DNA/RNA合成仪合成寡核苷酸引物。利用有义引物5′-GT(AGCT)GC(AGCT)CC(AGCT)(AT)(CG)(AGCT)GA(CT)ATGATGGA-3′(SEQ ID No：18)和反义引物5′-GC(AG)TC(AGCT)CG/T(AG)AA(AGCT)CC(AG)TA-3′(SEQ ID No：19)，将pJVi60(Vind，1994，出处同上)用作模板PCR扩增hemB片段。PCR反应体系(50μl含有10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％W/V明胶，各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，500ng pJVi60，以及上述PCR引物每种各50pmol。将反应物在95℃保温3分钟，再冷至80℃，然后加入5单位的Taq聚合酶。将反应物置于Perkin-Elmer 9600热循环仪中，反应程序设置为35个循环，每个循环是95℃30秒、45℃1分钟和72℃1分钟。最后一个循环后，将反应物在72℃保温5分钟。将预期的126bp hemB PCR产物克隆于pCRII载体中，得到质粒pAJ005-1(图11)。
实施例11：米曲霉A1560菌株DNA文库及胆色素原合成酶基因(hemB)克隆的鉴定
按照实施例3所述构建米曲霉A1560菌株基因组DNA文库。
将大约8×104个噬斑的噬菌体DNA转移至双层圆形Nytran Plus膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上，并利用32P标记的PCR产物进行探测，该PCR产物是按照Mertz和Rashtchian(1994，分析生物化学，221：160-165)所述方法扩增pAJ005-1(参见实施例10)的hemB片段而得到。扩增反应物(50μl)含有10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(W/V)明胶，各0.04mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，5μl32P-dCTP(3000Ci/mmole，3.3μM；Amersham，Arlington Heights，IL)，以及各50pmole的有义引物5′-GTGGCTCCGAGTGATAT-3′(SEQ ID No：20)和反义引物5′-GCATCGCGAAAAGGACCG-3′(SEQ ID No：21)。反应物在95℃加热3分钟，随后添加5单位Taq聚合酶。然后将反应物置于Perkin-Elmer热循环仪中，反应程序设置为30个循环，每个循环是95℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟。将反应溶液过Sephadex G50柱(Pharmacia，Alameda，CA)以除去未掺入的核苷酸，然后变性该反应溶液并加入到杂交缓冲液中。将变性探针(106cpm/ml)加入杂交缓冲液中，并与已经预杂交的膜一起保温过夜。预杂交和杂交是在42℃下，5×SSC，50mM磷酸钠pH7，5×Denhardt′s溶液，0.1％(W/V)SDS，5mM EDTA pH8，10μg/ml变性鲑精DNA，以及50％甲酰胺中进行的。将膜在42℃，0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤4次，每次15分钟。按照生产商说明(Bethesda Research Laboratories，Inc.，Bethesda，MD)，对产生阳性信号的初始噬斑再次筛选并纯化。按照生产商说明，将产生阳性信号的10个基因组克隆从作为pZL衍生物的λZipLox载体中切出，并按照Hattori和Sakaki(1986，分析生物化学，512：232-237)的方法进行测序。这些pZL衍生物被命名为pAJ007-1直至pAJ007-10。根据限制性作图分析，克隆E.coli DH52 pAJ007-6含有3.7kb基因组片段，对该克隆进一步分析。
实施例12：胆色素原合成酶(hemB)基因的表征
按照实施例11所述的方法，对实施例11所述的E.coli DH5αpAJ007-6进行DNA测序。
如图12(SEQ ID No：3)所示，克隆的米曲霉A1560 hemB基因的核苷酸序列表明其中含有一个具1308个核苷酸的开放阅读框，该开放阅读框编码如图12(SEQ ID No：4)所示、推断分子量为40kDa的含374个氨基酸的一个多肽。该核苷酸序列含有一个48bp的推测内含子，该内含子侧翼是剪接位点共有序列，并含有由(Unkles，1992，丝状真菌应用分子遗传学，第2章，J.R.Kinghorn和G.Turner编，Blackie Academic andProfessional Publications)所推测的内部共有序列。3′剪接位点(TAG)位于Met下游254bp处，5′剪接位点(GTCCGC)位于3′剪接位点上游46bp处，内部共有序列(TCTAAC)位于5′剪接位点下游30bp处。5′非翻译区在-377和-233位含有两个CAAT基元，可能在转录调控中具有重要作用(Gurr等，1987，出处同前)。另外，在3′非翻译区还发现了数个推测的TATA样盒(-117，-208，-650)。正如所预期的那样，由于hemB在除植物外的其它生物内是细胞质性的(Bottemley和Muller-Eberhard，1988，血液学讨论，25：282-302)，它似乎在N-末端不含有前导序列。
米曲霉hemB基因(SEQ ID No：4与其它hemB基因的氨基酸比较示于图13。相对于米曲霉hemB的氨基酸序列，来源于酵母(SEQ IDNo：31；Myers等，1987，出处同前)、人(SEQ ID No：27，Wetmur等，1986，出处同前)、大鼠(SEQ ID No：29；Bishop等，1989，核酸研究，14：10115)和大肠杆菌(SEQ ID No：26；Li等，1989，基因，75：177-184)的推断hemB氨基酸序列有63％、55％、55％和40％相同。来源于豌豆(SEQ ID No：28；Bsese等，1991，生物化学杂志，266：17060-17066)、枯草芽孢杆菌(SEQ ID No：25；Hansson等，1991，细菌学杂志，173：2590-2599)和菠菜(SEQ ID No：30；Scharmburg和Schneider-Poetsch，1991，EMBL数据库)的推断hemB氨基酸序列相似性更低一些(分别为40％、39％和33％相同)。然而，由于豌豆和菠菜hemB的氨基酸序列都含有N-末端叶绿体信号序列，因此，若以成熟多肽进行比较，它们与米曲霉hemB的相似性可能会明显提高。根据这些比较，米曲霉hemB的活性赖氨酸位点位于第299位氨基酸(Jaffe，1995，生物能与生物膜杂志，27：169-179)，按照Berg(1986，自然，319：264-265)推测的保守锌指样结构域位于第166-180位氨基酸。估计此锌指可通过结合Zn2+而避免活性位点的巯基氧化(Jaffe，1995，出处同前)。推测植物hemB中相应的结构域结合Mg2+而非Zn2+(Bsese等，1991，出处同前)。有意思的是，hemB指结构域的第一个残基是Thr(位于第166位)，该残基在植物金属结合性结构域的此位置是保守的。然而，hemB锌指结构域的其余位置是保守的。
实施例13：pAJ023的构建
通过PCR扩增米曲霉hemB编码区并将其亚克隆至米曲霉表达载体pBANE6，构建成质粒pAJ023(图14)。扩增产物设计为含有5′SwaI和3′PacI限制性位点以便于克隆至pBANe6中。扩增反应物(50μl)含有下述组分：10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(W/V)明胶，各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，200ngpAJ007-6 DNA，以及各50pmol的下述PCR引物：PBG10(有义)：5’-GCA TATTTAAATGATGTCCTTTTCTAATCTCGT-3，(SEQ IDNo：38)PBG11A(反义)：5’-ATA TTAATTAATCCATCTAGCTAAATCATT-3’(SEQ IDNo：39)。PBG10和PBG11A的下划线区分别含有克隆限制性序列SwaI和PacI。将反应物置于95℃保温3分钟，再将其冷至80℃。加入5单位PWO(BM)聚合酶。将反应物置于Perkin-Elmer 9600热循环仪中，反应程序设置于30个循环，每个循环为95℃30秒，57℃1分钟，和72℃1分钟。最后一个循环后，将反应物于72℃保温5分钟。最终PCR产物经凝胶纯化、SwaI和PacI消化，并连接到已经SwaI和PacI消化的载体pBANe6中，形成pAJ023。
实施例14：利用pAJ023转化米曲霉JRoC50.3.18A
利用pAJ023转化米曲霉JRoC50.3.18A菌株以测定米曲霉hemB基因过量表达是否会提高过氧化物酶的产量。作为对照，也使用pBANe6转化米曲霉JRoC50.3.18A。转化反应使用的原生质体浓度为2×107个/ml。将100μl原生质体与10μg DNA置于冰上30分钟。加入1mlSPTC，并将原生质体置于34℃20分钟。将0.25ml的转化反应等分液加入到15ml COVE琼脂上层(参见实施例8)中，再平铺于COVE转化平板上。将平板置于室温培养5-7天。将转化体转移到含有相同培养基的平板上，于37℃培养3-5天。
实施例15：hemB原始转化体的过氧化物酶产量
在24孔板上培养20个米曲霉hemB转化体和42个对照转化体(利用无米曲霉hemB的米曲霉表达载体获得的JRoC50.3.18A的转化体)，并按实施例7所述的方法检测过氧化物酶的产量。
过氧化物酶测定结果表明，相比于对照转化体，能产生更高水平过氧化物酶活性的转化体数目并无增加。
实施例16：pSE37和pSE38的构建
按照生产商说明，将米曲霉A1560的hemA开放阅读框的PCR扩增区连接到pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)中，构建成pSE7t1(图15)。从pSE17(实施例3)，利用实施例4所述的引物hemA5′(SEQ ID No：7)和hemA3′(SEQ ID No：8)经PCR扩增hemA开放阅读框，PCR条件与实施例6所述的条件相同，只是每种dNTP的浓度为50μM。通过将pSE7t1来源的含有hemA编码区的1940bp SwaI-PacI片段连接至经SwaI-PacI切割的pSE39(图17)中，构建成质粒pSE37(图16)。
将pM1612(图18)来源的平末端化2033bp HindIII-EcoRI片段连接至pBANe13(图19)的平末端化NsiI片段，构建成pSE39，该pBANe13中由bar选择标记取代了pyrG选择标记，因而赋予了对Basta的抗性。将pAJ23(图14)来源的含有hemB开放阅读框的1137bp SwaI-PacI片段连接至经SwaI-PacI切割的pSE39(图17)中，获得质粒pSE38(图20)。
实施例17：hemA和hemB共过量表达对灰盖鬼伞过氧化物酶产量的作用效果
按照实施例8所述的方法，利用pSE38转化实施例9所述的米曲霉SE01-28菌株以产生命名为米曲霉SE27的新转化体，不同之处在于此处使用Basta抗性进行筛选，并且直接从反应物中取2-8μg经NdeI消化的pSE38加入每个转化反应中，以使转化混合物中含有约5U的酶。用于Basta筛选的培养基含有20ml COVE盐，1M蔗糖，25g/L Noble琼脂，10mM尿素，以及5mg/ml Basta(Hoechst Schering，Rodovre，Denmark)用于转化，或10mg/ml Basta用于维持转化体。该COVE盐是每升去离子水中含有26g KCl，26g MgSO4-7H2O，76g KH2PO4，以及50ml COVE痕量元素。所说的COVE痕量元素是每升去离子水中含有0.04g Na2B4O7-10H2O，0.4g CuSO4-5H2O，1.2g FeSO4-7H2O，0.7gMnSO4-H2O，0.8g Na2MoO2-H2O，10g ZnSO4-7H2O。必要时加入麦芽糖至终浓度为2.5％。Basta筛选用上层培养基与上述相同，只是Basta是在使用前加入的。
利用与上述相同的方法，也构建了两个对照组，一组是hemA过量表达组(经pSE39转化的米曲霉SE01-28＝米曲霉SE28菌株)，另一组是载体转化组(经pSE39转化的米曲霉JRoC50.3.18A＝米曲霉SE22菌株)。
然后按大约1×105个孢子/孔的接种量，将每种转化体分别接种到24孔微滴定板的各个孔中，这些孔中已含有1ml四分之一强度的MY25培养基。在湿润摇床中，于34℃、100rpm下，将微滴定板培养5天。利用实施例7所述的酶测定法测定过氧化物酶产量。
结果表明，与两个对照组——米曲霉SE28菌株(hemA过量表达组)和米曲霉SE22菌株(载体转化组)相比，米曲霉SE27菌株组的过氧化物酶活性分布向更高水平有惊人的偏移。hemA/hemB共过量表达菌株比未加工菌株(SE22)平均大约提高4倍，比hemA过量表达菌株(SE28)平均提高1.8倍。
然后在摇瓶中培养几个具有最高过氧化物酶生产水平的转化体——米曲霉转化体SE27-3，SE27-8，SE27-12和SE27-13。将大约5×106个孢子接种于25ml MY25培养基中，并在34℃、200rpm培养5天。或者，将一个菌丝体塞子接种于含有25ml MY25培养基和0.002％Novozyme 234的锥形瓶中，并在34℃、200rpm培养2天。利用4ml该培养物接种到三份含有25ml MY25培养基的摇瓶中，于34℃、200rpm培养5天。然后回收样品，再在过氧化物酶活性测定前，经Miracloth过滤以除去菌丝片段。
对米曲霉转化体SE27-3、SE27-8、SE27-12和SE27-13摇瓶培养物的过氧化物酶测定结果表明：与对照菌株米曲霉SE22和SE28相比，上述转化体均产生较高过氧化物酶活性。菌株SE27-12和SE27-8比对照菌株SE22高4倍，比对照菌株SE28高2倍。
利用含有高浓度麦芽糖浆作碳源的标准补料分批方法，在2升发酵液中，加入或不加血红素蛋白的条件下，培养米曲霉SE27-12和作为对照的米曲霉SE22。批料和饲料中补加FeCl3至大约0.4mM。维持两种培养物中的正溶解氧压，在第3-8天，按大约2g糖类/升/小时的速率加入饲料。在第2-3天后以分段方式达到这个水平。在整个发酵过程中两种培养物内的生物量大致相等。同时也在血红素蛋白存在的情况下进行发酵。加入血红素蛋白至批料培养基中终浓度为30mg/ml。
结果表明，经192小时发酵后，过氧化物酶的产量比SE22要高6倍。当发酵培养基中加入了血红素蛋白时，SE27-12的过氧化物酶产量比SE22还要再高3倍。与不加血红素蛋白的未加工菌株相比，利用在血红素蛋白存在的情况下培养的hemA/hemB加工菌株所得到的过氧化物酶产量总提高10倍。
这些结果表明，hemA和hemB的过量表达可协同地提高过氧化物酶产量。
实施例18：hemA/hemB共过量表达对Scytalidium thermophilum过氧化氢酶产量的作用效果
对含有Scytalidium thermophilum过氧化氢酶基因(WO96/34962)并命名为DLM14.24的米曲霉HowB411菌株进行加工，以过量表达hemA和hemB，从而测定共过量表达是否会提高过氧化氢酶产量。在与实施例17中所述的相同条件下，利用各10μg的pSE37和pSE38共转化米曲霉DLM14.24菌株，构建成命名为米曲霉SE32的转化体。在与实施例17中所述的相同条件下，利用pSE39转化米曲霉DLM14.24，构建成命名为米曲霉SE24的对照菌株。
以大约1×105个孢子/孔的接种量将SE32转化体和对照菌株接种于24孔微滴定板的各个孔中，这些孔中已含有1ml M400Da pH6.0培养基，每升该培养基含有50g麦芽糊精，2g MgSO4-7H2O，2g KH2PO4，4g柠檬酸，8g酵母提取物，2g尿素，0.5g CaCl2-2H2O，以及1ml痕量元素。每升所说的痕量金属溶液含有13.9g FeSO4-7H2O，8.5gMnSO4-H2O，14.28g ZnSO4-7H2O，1.63g CuSO4，0.24g NiCl2-6H2O，和3.0g柠檬酸。在湿润摇床中，于34℃、100rpm将微滴定板培养5天。利用WO96/34962所述的酶测定方法确定过氧化氢酶生产水平。1CIU定义为在25℃下，12mM过氧化氢-50mM磷酸钾pH7.0缓冲液中，以1μmole/min的速率降解过氧化氢所需的过氧化氢酶量。
初始分析的米曲霉SE32 hemA/hemB共转化体组的过氧化氢酶分布向更高过氧化氢酶产量稍微偏移。其转化体组的平均CIU/ml比对照组的平均CIU/ml高1.3倍。
随后在含有25ml M400Da培养基的摇瓶中，于34℃、200rpm将几个最好的米曲霉共转化体SE32-3a、SE32-4a、SE32-6b和SE32-32a培养6天，并按照前述方法测定过氧化氢酶活性。
与对照菌株相比，最好的菌株——米曲霉SE32-32a的过氧化氢酶产量提高了1.8倍。
实施例19：米曲霉HowB430的构建
构建含有TAKA/NA2-tpi前导序列杂合启动子、LipolaseTM基因、AMG终止子及用作选择标记的全长构巢曲霉amdS基因的pBANe8。LipolaseTM(Novo Nordisk A/S，Bagsvard，Denmark)是来源于Humicolalanuginosus的脂肪酶。
按照生产商说明，利用在Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成仪上合成的下述引物1-4，通过PCR***所需的限制性位点：引物1：5’-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3’(SEQ ID NO：32)引物2：5’-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3’(SEQ ID NO：33)引物3：5’-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3’(SEQ ID NO：34)引物4：5’-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3’(SEQ IDNO：35)
利用约0.2μg的下述质粒之一作为模板制备扩增反应物(100μl)：将pToC90质粒DNA(Christensen等，1988，生物技术，6：1419-1422)用作模板与引物1和2一起将NsiI侧翼位点插到全长amdS基因上；将pJaL292质粒DNA(图21)用作模板与引物3和4一起将EcoRI位点***NA2-tpi前导序列杂合启动子的5′末端，将SwaI位点***NA2-tpi前导序列杂合启动子的3′末端。每个反应物含有下述组分：0.2μg质粒DNA，48.4pmol正向引物，48.4pmol反向引物，各1μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1×Taq聚合酶缓冲液，以及2.5U Taq聚合酶。将反应物置于Ericomp热循环仪中，程序设置为95℃5分钟进行1个循环，随后在95℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟进行30个循环。
随后，利用TA克隆试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)按照生产商说明，将PCR产物亚克隆至pCRII中。然后，利用QIA well-8质粒试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)，按照生产商说明，通过从转化体中提取质粒DNA，限制性消化质粒DNA以确证正确大小的片段的存在，并按下述方法对DNA进行测序以验证PCR产物，从而对转化体进行筛选。DNA测序是在Applied Biosystems 373A型自动DNA测序仪中，利用下列引物，通过引物步行技术和染料-终止剂化学(Giesecke等，1992，出处同前)对两条链进行的：M13反向引物(-48)、M13正向引物(-20)(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和待测序DNA的特异性引物。随后，利用预先设计好的限制性酶消化正确转化体来源的质粒，将其在1％琼脂糖凝胶中分离，再利用FMC SpinBind试剂盒(FMC，Rockland，ME)按照生产商说明对质粒进行纯化。
从pJaL292(图21)，经PCR扩增在末端添加了EcoRI和SwaI限制性位点的NA2-tpi前导序列。将含有TAKA启动子、多接头、AMG终止子和构巢曲霉pyrG基因的pKS6(图22)经EcoRI和SwaI消化以除去TAKA启动子区。用该NA2-tpi PCR产物取代该区构建成pBANe13(图19)。
经PCR扩增在两末端均添加了NsiI位点的全长amdS基因。利用NsiI消化pBANe13以除去构巢曲霉pyrG基因。再用该全长amdS基因取代该区构建成pBANe6(图6)。
利用Applied Biosystems 394型DNA/RNA合成仪，按照生产商说明，合成如下所示的寡核苷酸引物5和6，以通过PCR扩增将限制性位点插到脂肪酶基因的两侧：引物5：5’-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3’(SEQ ID NO：36)引物6：5’-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3’(SEQ ID NO：37)
利用0.2mg的pMHan37(图23)作为模板，以及引物5和6，制备扩增反应物(100μl)。反应物含有下述组分：0.2μg pMHan37，48.4pmol引物5，48.4pmol引物6，各1μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1×Taq聚合酶缓冲液，以及2.5U Taq聚合酶。将反应物置于Ericomp热循环仪中，程序设置为95℃5分钟进行1个循环，随后在95℃1分钟、55℃1分钟和72℃2分钟进行30个循环。取2ml反应物在琼脂糖凝胶上电泳，以证实扩增的脂肪酶基因产物大约900bp。
通过利用TA克隆试剂盒，按照生产商说明，将经PCR扩增的脂肪酶基因亚克隆至pCRII中。然后利用QIAwell-8质粒试剂盒按照生产商说明，从转化体中提取质粒DNA，限制性消化该质粒DNA，并按照上述方法对DNA进行测序以验证PCR产物，从而对转化体进行筛选。
通过用SwaI和PacI消化，从pCRII中切下脂肪酶基因，然后亚克隆至pBANe6中得到pBANe8(图24)。利用QIAwell-8质粒试剂盒，按照生产商说明，从转化体中提取质粒DNA，限制性消化该质粒DNA，并按照上述方法对DNA进行测序以验证产物，从而对转化体进行筛选。
利用含有NA2-tpi启动子/LipolaseTM基因/AMG终止子并命名为pBANe8的线性片段转化米曲霉HowB425，得到米曲霉HowB430。经PmeI消化pBANe8，通过制备性琼脂糖电泳，利用40mM Tris-乙酸盐-1mM乙二胺四乙酸二钠盐(TAE)缓冲液分离该线性表达盒。
利用浓度为2×107个原生质体/ml的原生质体，对米曲霉HowB425转化amdS。将10μg DNA加入100μl原生质体中，然后加入250μl PEG(60％PEG4000-10mM CaCl2-10mM Tris-HCl pH8.0)，将混合物置于37℃30分钟。加入3ml STC培养基，将混合物平铺于补加了10mM尿苷用于筛选amdS的COVE平板上。将平板置于34℃培养7-10天。将转化体转移到含有同样培养基的平板上，于37℃培养3-5天。利用含有相同培养基(无蔗糖)的同样平板，在相同的条件下，通过划线分离孢子、挑出独立菌落而对转化体进行纯化。
实施例20：hemA/hemB共过量表达对细胞色素蛋白生产的影响特异性
由于血红素参与提供细胞生长和代谢所需的能量，若能证实血红素蛋白产量提高是由于可获得更多的血红素用于结合脱辅基酶，而不是由于强化细胞代谢和生长所引起的简单的脱辅基蛋白产量提高这一点，将会有重要的意义。检测此学说的一个间接方法是在生产非血红素蛋白的异源酶——即脂肪酶的菌株中共过量表达hemA和hemB。若血红素蛋白产量的提高是由于可获得更多的能量，那么对脂肪酶的表达也能得到相似的结果。相反，如果血红素蛋白产量的提高特异地是由于可获得更多的血红素用于成熟酶装配，那么对脂肪酶的表达应无多大影响。
按照实施例18所述，利用pSE37和pSE38共转化实施例19所述的米曲霉HowB430菌株，获得非血红素蛋白hemA/hemB共过量表达菌株——米曲霉SE33菌株。同样利用pSE39转化同一菌株获得对照转化体，被命名为SE34。
按1×105个孢子/孔的接种量，将转化体接种于24孔微滴定板的各个孔中，这些孔中已含有1ml四分之一强度的MY25培养基。在湿润摇床中，34℃、100rpm下，将微滴定板培养4天。按照下述方法，相对于LipolaseTM标准(Novo Nordisk A/S，BagSvard，Denmark)测定脂肪酶生产水平。在使用前按1∶50稀释比例，利用MC缓冲液(4mM CaCl2-100mM MOPS pH7.5)稀释底物母液(21μl对硝基苯丁酸/ml DMSO)从而制备测定底物，配好后立即使用。制备LipolaseTM标准液，使其在含有0.02％α-烯属磺酸酯(alpha olefin sulfonate，AOS)去污剂的MC缓冲液中浓度为40LU/ml，将该标准液贮于4℃，使用前在MC缓冲液中1/20稀释，稀释后立即使用。肉汤样品均稀释于含有0.02％AOS去污剂的MC缓冲液中，将20μl等分样品加到96孔板的各个孔中，随后加入200ml已稀释好的底物。利用平板读数仪记录405nm处的吸收值，两次读数之间间隔大约1分钟。相对于LipolaseTM标准计算出脂肪酶单位/毫升(LU/ml)。
脂肪酶测定结果表明，hemA/hemB共转化体作为一组，比对照转化体组的脂肪酶产量要提高1.25倍。hemA/hemB共过量表达组与对照组之间脂肪酶的微小但显著的差异可能归因于血红素可获得性提高对细胞生长和代谢有较小效果。
实施例21：hemA/hemB共过量表达对血红素途径中间物质累积的影响
实施例17所述的培养于24孔板上的大部分米曲霉SE27菌株的菌丝体和培养物肉汤均呈现粉红或红色。利用Centricon 10号柱(Amicon，Beverly，MA)过滤米曲霉SE27菌株培养肉汤，结果红色保留在滤过液中，表明此颜色是由一种小分子引起的。该滤过液可吸收波长为405nm的光，这一点与卟啉是一致的。
为证实米曲霉SE27培养肉汤中的红色是由于存在一个或多个参与血红素生物合成的卟啉，按照C.A.Brutis和E.R.Ashwood(编)，the TietzTextbook of Clinical Chemistry，1994，第38章所述的方法，通过HPLC对培养物肉汤进行分析。HPLC分析结果表明培养物肉汤中含有更高水平的与尿卟啉(uro)、三-、四-和五-羧基化卟啉及粪卟啉(copro)有相同停留时间的化合物。对照菌株米曲霉SE37(经pSE39转化的米曲霉)的肉汤中很少有这些中间物的累积。在所有hemA/hemB共过量表达菌株中，尿卟啉化合物与粪卟啉的比例至少为3∶1。
每株hemA/hemB共过量表达菌株均具有高水平的原卟啉化合物荧光特性，而对照菌株却无荧光。SE27-3菌株菌丝体的荧光显微结果(420-450激发，滤栅520)显示有明显的荧光小块和颗粒，而对照菌株SE28-1或22-1中无此现象。这些结果表明hemA/hemB共过量表达菌株产生了大量尿卟啉。
这些中间物的累积可能是由于尿卟啉原III脱羧酶(UroD)成为血红素生物合成中的限速步骤而造成的。
实施例22：米曲霉SE27和SE32菌株的Southern分析
对米曲霉SE27和SE32菌株进行Southern分析以确定血红素蛋白生产菌株产生红色是否需hemA和hemB表达盒的多个拷贝。
按实施例1所述方法制备各个菌株的总细胞DNA，再通过Southern杂交(Maniatis等，1982，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)对DNA进行分析。将每种DNA样品约10μg经PstI或PvuI消化，在1％琼脂糖凝胶上进行大小分离。在短波长紫外光下对凝胶照相，再将其浸泡于0.25N HCl中30分钟，随后浸泡于0.4N NaOH中30分钟。利用Turbo印迹装置(Schleicher & Schleicher，Keane，NH)，按照生产商说明，在0.4N NaOH中通过毛细管印迹将凝胶中的DNA转移到Hybond N杂交膜(Amersham，Arlington Heights，1L)上。将膜进行UV交联，并按实施例4所述方法预杂交，不同之处在于此处采用5％VistraLiquid阻断试剂(Amersham，Arlington Heights，IL)。利用Vistra试剂盒(Amersham，Arlington Heights，IL)，通过对实施例3所述的DNA片段进行随机引发制备荧光标记探针。按实施例4所述方法进行杂交和洗涤各步骤。利用vistra试剂盒，按照生产商说明，对荧光探针信号进行放大。在Storm Imaging System(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)上经扫描测定荧光。
米曲霉SE27和SE32菌株的Southern印迹分析结果表明菌株中pSE37、pSE38两种表达质粒均存在多拷贝，红颜色的产生必需两种表达盒的存在。
                     微生物保藏
如下菌株已按照布达佩斯条约保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心(NRRL)，北方地区研究实验室，1815 University Street，Peoria，IIlinois 61604，USA。
菌株                   保藏号       保藏日期E.coli DH5α(pSE17)     NRRL B-21563  1996年4月22日E.coli DH5α(pAJ007-6)  NRRL B-21564  1996年4月22日
此菌株已在一定条件下被保藏，能确保在此专利申请未决期间由专利和商标官员决定根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授予可获得所述菌株之权利的人可得到所述菌株。该保藏物代表每种保藏菌株基本上纯的培养物提交本申请的副本或其子申请时，如外国专利法需要，也可得到该保藏物。然而，应理解保藏物的可获得性在由政府行为授予的专利权的部分废除时不构成对操作本发明的许可。
本文所述和要求权利的发明并不局限于本文所公开的具体的实施方案的范围，因为这些实施方案只想阐明本发明的几个方面。任何等价的实施方案都在本发明的范围之内。实际上，根据前文的描述，除了本文所示和所述的以外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员而言都是显而易见的，这种修饰也欲包括在所附权利要求书的范围内。
本文提及很多参考文献，它们所公开内容都全文列入本文作为参考。
              序列表(1)一般信息(i)申请人：
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(C)城市：Davis
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(G)电话：(916)757-8100
(H)传真：(916)758-0317(ii)发明名称：提高丝状真菌中血红素蛋白产量的方法(iii)序列数：39(iv)联系地址：
(A)联系人：Novo Nordisk of North America，Inc.
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(ix)电信资料
(A)电话：212-878-9652
(B)传真：212-878-9655
(C)电传：(2)SEQ ID No：1信息：
(i)序列特征：
(A)长度：4157个碱基对
(B)类型：核酸
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(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID No：1：ACCATTGACT CTCAAGCTAT GGATCGTGCT CACCGTCTCG GCCAGACAAG ACAGGTCACG       60GTGTATCGCC TGATTACTCG CGGCACCATT GAGGAGCGTA TTCGCAAGCG AGCTTTGCAG      120AAGGAGGAAG TGCAGCGTGT CGTCATCTCA GGTGGCGCAG CTGGTGGGGT TGACTTCAAT      180ACTCGCAACC GCGAGAGCCG AACCAAGGAC ATCGCCATGT GGCTGGCAGA TGATGAACAG      240GCGGAGCTTA TTGAGCAAAA GGAGAAGGAA GCGCTGGACC GAGGCGAAGT GTTTGGCGCT      300AGTAAAGGCG GGAAGAAGGC TGCTCAGAAG AGAAAGAGAG ATATCACGCT GGATGATATG      360TATCATGAAG GTATGTGAAT CTGATCAAAG CTCTTCGTTC CGGGGAGGCT TCTGGAAATA      420GTACTAACCG CGTCAATCTA TAGGCGAAGG GAACTTTGAC GATGCCAGTG CAAAGCCATC      480AGGAGCGGCC ACTCCTGTGT CGACTGCAGA GAATTTAGGC ACCCCATCCT CCACGCCAGT      540TCCTAAACGA GGACGTGGAA GGGGGACAGG AAAGGGCACG TCTAAAAGAG CCAAAACTAC      600CAAGGAGAGA TTACGTCTCA TTGATGGCGA CGGAGGCTTA GGGCCTAGTT GATTTAATCG      660ATCTGTGCCT CAATAATGGA CACGGCTGGT TATGGTCATG GCGTTCAGAG ATTGCATTTC      720TTTCCCACCC TTTATCTTTC TTTCTTTCCT CTTAAACCCC TCTTTTTTGT TTTTCTTTTT      780ATCGGACTTT ACTTGTGGGC AGCTTACGTT CTGCCTTGTA TTAACAGCAT ATATTCCTGA      840TTCCTGATGT ACGAAGCGAT TTAAGAGTCA TTGAAGACGA AGGATGAAAC CCGTGGTAAT      900CAGCCGATAA TGGCAAAGAG AAGGAGAAGA AAAAAATCAA GTGCGAGTTT TGAAATTGAT      960GGCAAGATAG ACATTGTATC CTGTACCTGT TCTTGGGCTG TGACGGGGGG GGTGAAATTG     1020ACGGTCATCA CCCGGCTATT ATTACTATTG TTGTACTGTA CATCCGGATC CTGCTGGTCT     1080GTATCTAGTT AGGGCAATAT TCCCCGTCGC CAGGCCTCTT GGGTTATGAA TGATTTCATA     1140GGTGAAGTTT CGTATCCGTA CGCACCGAGA GATTTCTTAG TATTACTTGT ATTATGAAAA     1200TGCACTTGCC GAGTTAAGTC CGCCGGCCAA TCACGGCGGA GGATATGGTA AGCCGAAAAG     1260TCTCGCCGAA GTCCCCGACT TACTCTTACT GGAAGTGGCT TAGTGCCCTC AGCGCCCCCT     1320CGCCCTCAGT CCATCAGCCA GATTGACTCT TATTTCTCTC TCCTCTTCGC CGCGGGTGAC     1380ATATCCCTCT CCTTCTCCCT CTCCCTCTTG ACAACATTTC ATCTTCGCTT CCTTTTGTGA     1440TATAGTCAGT TTCGCTATCC ATTGAAGCAT CACTCATGGA GTCTCTTCTC CAGCAGTCCC     1500GGGCGATGTG CCCGTTCCTT AAGCGCACAT CTCCATCTTC TCTGCGTACG CTGGCAACCG     1560CGACTCGACC TAGCACTAGT TCCGGTGGAG GCACTATGTC TAATCTCCAG GTCATTGCCC     1620GTCGCTGCCC TGTCATGAGC AAGGCTCTGG CCGTGCAGAG CGCTCGCATG GCCGGTACCA     1680AAAGATTCAC CTCATGTGCT GCCGGCATCA CCGGTCTCGG CAACAAGCAT TGCCGTGCTC     1740CTACTGGGAA GAGAACCCTG CACTCCACCT CCGGTAACGG CGCCAATGTG AGCGCAGAGA     1800TCTACAAGAA CACCCAGCGA GATCCCGCCG GTTTCTCGAA GATCAAGACC CCTGCCAATG     1860CTACCGCCGC TGCCGCTACG TCTGGCCCTC GTCCAGAGGC TCCCGTGGCG AAGCCTTTCA     1920ACTACAATTC TTTCTACAAC ACCGAATTGG AAAAGAAACA CAAGGACAAG TCGTATCGCT     1980ATTTCAACAA CATCAATCGT CTCGCTCAGG AGTTTCCCCG GGCTCACACC ACATCTGCCG     2040AGGAACGTGT GACGGTCTGG TGCTCGAACG ATTATCTCGG CATGGGCCGC AACCCCGAGG     2100TTCTGGCCAC CATGCATAAG ACATTGGACA CCTACGGAGC CGGTGCGGGA GGTACTCGCA     2160ACATTTCAGG TCACAATCAA CATGCCGTGA GCCTGGAGAA CACCCTGGCC AAATTGCACG     2220GCAAGGAGGC GGCATTAGTC TTCAGCTCAT GCTTCGTGGC TAACGATGCC ACCCTCGCAA     2280CCCTGGGTAG CAAGTTGCCC GACTGTGTTA TTCTGTCCGA TAGCCTGAAT CATGCATCGA     2340TGATTCAGGG TATTCGCCAT TCAGGCGCCA AGAAAATGGT TTTCAAGCAT AATGATCTGG     2400TCGACCTTGA GGCCAAGTTG GCAGCTCTAC CTCTTCATGT CCCCAAGATT ATTGCATTCG     2460AATCAGTTTA TAGCATGTGC GGATCTATTG CCCCAATTGA GAAGATCTGT GATCTTGCAG    2520ACAAGTACGG TGCCATTACT TTCCTGGATG AAGTCCACGC TGTGGGAATG TACGGACCTC    2580ACGGAGCAGG TGTGGCAGAG CACCTTGACT ATGACATCTA TGCTTCCCAA GATACGGTCA    2640ACCCGCGCAG TACTAAGGGA ACCGTGATGG ACCGAATCGA TATTATCACC GGTACTCTGG    2700GCAAGGCCTA CGGATGTGTC GGGGGCTACA TTGCTGGATC CGCTGCGATG GTTGACACCA    2760TCCGCTCCCT CGCCCCTGGC TTCATCTTCA CCACGTCCTT GCCGCCCGCC ACCATGGCTG    2820GTGCAGACAC TGCTATCCAG TACCAGGCTC GTCACCAGGG CGACCGCGTC CTGCAGCAGT    2880TGCACACCCG CGCGGTCAAA GCAGCTTTCA AGGAGTTGGA TATTCCTGTA ATTCCCAACC    2940CCTCCCATAT CATTCCGCTC CTGGTTGGGG ATGCCGAGGT TGCTAAGAAG GCCTCGGACA    3000AGCTTCTGGA GGAGCATGGA ATTTATGTAC AAGCCATCAA CTACCCAACC GTGCCTCGGG    3060GTGAAGAGCG GCTTCGTATC ACGCCCACCC CGGGACATAT CAAGGAGCAC CGCGACCACC    3120TGGTGCAAGC CGTCCAAACA GTCTGGAACG AACTGGGCAT CAAACGCACC AGCGATTGGG    3180AAGCGCAAGG CGGCTTCGTC GGCGTGGGTG TCGATGGCGC CGAGGCTGAG AACCAGCCGA    3240TTTGGAATGA TGTGCAGCTG GGGCTGAAGG AAAACGAAGC CATTGAGGCT GCTGTGGAAC    3300GCGAGTTTGC CGAGGCCCCC ATGCGGACCG CCACCCGTCC TGCCGCGGCT GCTGCTTCGT    3360CAATCCCGGT GGGTGTGGCT GCCTGAAGTG GCTGCCCGCA TGTGAGCTGA AATCGACGTG    3420GAATTCTATA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA    3480CACACACACA CACACACACT AACACACACT ATGTTATAAA TTCCACATCC ACTCCTTTGT    3540CCCTTGTTGG ACGTAATTGG TATTTGGACT ATTAGTTAGA ACCAGTCAGT CGTTACCATG    3600TGTTTCGGTT CGACTCGAAA TCTGACATGT TGTCTGCCCC CATGCCACTT CATCTCCTCC    3660GTAACCGCAG GGCTTCAAAT ACACTGCCCA GTAATTGTAG TCAATATAGC AGTTAACTAA    3720CCTTCACCAA TTTCCTAATA ACAATAGAAG GGGCCATACA CGCAGTACCA AAGATCACCT    3780ACCTCCGATC AATATCCGAA CCTCAGGCTA CATACATCAA GTCGCATTAA TCGATTCCGA    3840CCTCTGTTTA TCCCTGAAAA TAACTAAGAT CATGATCTAC GTTTGGTAAG TGGGACACCT    3900ACCTACACTG GGAGGTATTG AATAAAGGCA TCATTCATAT AGTCACAAGA TGCCAGGGCC    3960AATTCATGAT ATGGATAGCT ACTTCCAAAC ATAATTCAGA GGTATCATTC TGCTCTTCAG    4020ACAGTTCTTC TCGAAGATCA GTAGGAGCCA GTTTTGACCA TTA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(i)序列特征：
(A)长度：636个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID No：2：Met Glu Ser Leu Leu Gln Gln Ser Arg Ala Met Cys Pro Phe Leu Lys1               5                  10                  15Arg Thr Ser Pro Ser Ser Leu Arg Thr Leu Ala Thr Ala Thr Arg Pro
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130                 135                 140Ala Lys Pro Phe Asn Tyr Asn Ser Phe Tyr Asn Thr Glu Leu Glu Lys145                 150                 155                 160Lys His Lys Asp Lys Ser Tyr Arg Tyr Phe Asn Asn Ile Asn Arg Leu
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    195                 200                 205Val Leu Ala Thr Met His Lys Thr Leu Asp Thr Tyr Gly Ala Gly Ala
210                 215                 220Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly His Asn Gln His Ala Val Ser Leu225                 230                 235                 240Glu Asn Thr Leu Ala Lys Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe
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290                 295                 300His Asn Asp Leu Val Asp Leu Glu Ala Lys Leu Ala Ala Leu Pro Leu305                 310                 315                 320His Val Pro Lys Ile Ile Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Cys Gly
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    355                 360                 365His Gly Ala Gly Val Ala Glu His Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Ala Ser
370                 375                 380Gln Asp Thr Val Asn Pro Arg Ser Thr Lys Gly Thr Val Met Asp Arg385                 390                 395                 400Ile Asp Ile Ile Thr Gly Thr Leu Gly Lys Ala Tyr Gly Cys Val Gly
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450                 455                 460Val Leu Gln Gln Leu His Thr Arg Ala Val Lys Ala Ala Phe Lys Glu465                 470                 475                 480Leu Asp Ile Pro Val Ile Pro Asn Pro Ser His Ile Ile Pro Leu Leu
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    515                 520                 525Gly Glu Glu Arg Leu Arg Ile Thr Pro Thr Pro Gly His Ile Lys Glu
530                 535                 540His Arg Asp His Leu Val Gln Ala Val Gln Thr Val Trp Asn Glu Leu545                 550                 555                 560Gly Ile Lys Arg Thr Ser Asp Trp Glu Ala Gln Gly Gly Phe Val Gly
            565                 570                 575Val Gly Val Asp Gly Ala Glu Ala Glu Asn Gln Pro Ile Trp Asn Asp
        580                 585                 590Val Gln Leu Gly Leu Lys Glu Asn Glu Ala Ile Glu Ala Ala Val Glu
    595                 600                 605Arg Glu Phe Ala Glu Ala Pro Met Arg Thr Ala Thr Arg Pro Ala Ala
610                 615                 620Ala Ala Ala Ser Ser Ile Pro Val Gly Val Ala Ala625                 630                 635(2)SEQ ID No：3信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1807个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID No：3：CTGGACCAAT GGTAACCCTC CGTAATTGCC TTACAGATTT AGCCCAGGGG GGTTATGGTA       60TCCTTGGGTA TTGAGGCCTG GAAATTTTTT TAGCCACCAG TTTACAGCCA GTTTCCGTTT      120GTAAATATTT CACATCCCCC GACCCTGTCC CAATACAATA ATTTTTTCGC TATATATAAC      180GCCCCTAGCG TTGTTTTATG ATCCTTAAAT CCTTACTTGT ACCTGAAAAT TGCAACAAAT      240GTACTGACCT GGATCGCTGG CCATTTATAT CATTGCCCTG CGAAGTCGTA TTCTGCCAGT      300GGCACAGGCG CTATTCTCTT TTCTTCCCTC CACCGCGTTT CTATCTTCCA TAGCACCCCA      360CTTGCTTGCC GCTCCTGTCA TTATGTCCTT TTCTAATCTC GTCTCTGACC TCGCCTTCAG      420AGATTCTCAT GATGACCGAA GTTCTCAGAT ATCTCAGGTA CAATCGCAAG CCACTGCACG      480ATCGTATACA AGCACAGCTG CCACAAGCGT CAGCATATCT GGCGACATCT CAAGCCAGCT      540TCATTCCGGT TACAGCCATC CACTGAGCCG ATCATGGCAG GCTGAAAGAC AGTTGACTAA      600AGTCCGCATT TTCTTTTGTA TTTACTGAGC TGCTCTAACC CCGAGATAGG AAATGCTTAT      660TTATCCTCTC TTCATCACCG ATAATCCCGA TGAGGAGACT CCTATCCCGT CTCTCCCTGG      720ACAGTATCGT CGAGGATTAA ACCGTCTAGT TCCTTTCATC AAACCACTTG CCCACAAGGG      780GCTACGCTCA GTCATCCTGT TTGGCGTCCC ACTACACCCC TCTGCGAAGG ATGCACTAGG      840TACCGCTGCA GACGATCCAT CTGGACCGGT AATTCAAGCT ATTCGCTTGC TTAGGTCGCG      900GTTTCCTCAA CTTTATATCG TGACAGATGT GTGCCTTTGC GAGTATACTT CGCATGGCCA      960CTGTGGGATA CTGCGAGAAG ATGGGACTCT TGATAATACA CAGTCTGTGG ATCGGATTTC     1020GGATGTTGCT CTGGCTTATG CTGCCGCCGG AGCCCATTGT GTCGCTCCGT CTGATATGAA     1080TGATGGGCGA GTGCGTGCTA TAAAACTGAA GCTTATTGAA GCCGGGATGG CCCACCGTGT     1140CCTACTGATG TCCTACAGCG CCAAATTTAG CGGTTGTTTG TACGGCCCTT TCCGTGATGC     1200AGCGGGGTCC TGCCCATCAT TCGGGGATCG CAGATGCTAC CAGTTACCAC CCGGAGGCCG     1260TGGACTTGCT CGGCGCGCTA TACAGAGAGA TATAGGCGAA GGGGCAGACA TCATAATGGT     1320AAAGCCGGCG AGCAGCTACC TGGACATTAT CAGAGACGCA AAAGAAATTG CCAAAGACAT     1380TCCCATTGCT GCTTACCAGG TCAGCGGTGA GTATGCTATG ATACATGCTG GTGCCAAGGC     1440GGGCGTATTT GACTTGAAAT CCATGGCCTT TGAAAGTACT GAAGGGATTA TAAGGGCTGG     1500TGCTGGGATT ATAGTAAGCT ATTTCGTGCC TGATTTTCTA GATTGGCTTT CGAAATGATT     1560TAGCTAGATG GAGCGTGATG AAAGCATCCA CCAGATAAAT AGCAGTGACG ATCGCGTTTG     1620AATCATACCT ATTGGAGTAG AAGTCTCGGT ATCTCGTTGG GGATTCTCTA GGTTGCTTAT     1680TTAACGTAAT GCCACGCCAT GTGTTATATA TTGCCTAAAT ACTTTTATAA AAGATACACC     1740AAGCTGATGG TGCCAAGTGA CCACTTCTAA TAAATACAAT TATACCAATT CCTCCGAAAT     1800ATGCGGG                                                               1807(2)SEQ ID No：4信息：
(i)序列特征：
(A)长度：375个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质(v)片段类型：内部的(xi)序列描述：SEQ ID No：4：Met Ser Phe Ser Asn Leu Val Ser Asp Leu Ala Phe Arg Asp Ser His1               5                  10                  15Asp Asp Arg Ser Ser Gln Ile Ser Gln Val Gln Ser Gln Ala Thr Ala
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            85                  90                  95Gly Gln Tyr Arg Arg Gly Leu Asn Arg Leu Val Pro Phe Ile Lys Pro
        100                 105                 110Leu Ala His Lys Gly Leu Arg Ser Val Ile Leu Phe Gly Val Pro Leu
    115                 120                 125His Pro Ser Ala Lys Asp Ala Leu Gly Thr Ala Ala Asp Asp Pro Ser
130                 135                 140Gly Pro Val Ile Gln Ala Ile Arg Leu Leu Arg Ser Arg Phe Pro Gln145                 150                 155                 160Leu Tyr Ile Val Thr Asp Val Cys Leu Cys Glu Tyr Thr Sar His Gly
            165                 170                 175His Cys Gly Ile Leu Arg Glu Asp Gly Thr Leu Asp Asn Thr Gln Ser
        180                 185                 190Val Asp Arg Ile Ser Asp Val Ala Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Ala
    195                 200                 205His Cys Val Ala Pro Ser Asp Met Asn Asp Gly Arg Val Arg Ala Ile
210                 215                 220Lys Leu Lys Leu Ile Glu Ala Gly Met Ala His Arg Val Leu Leu Met225                 230                 235                 240Ser Tyr Ser Ala Lys Phe Ser Gly Cys Leu Tyr Gly Pro Phe Arg Asp
            245                 250                 255Ala Ala Gly Ser Cys Pro Ser Phe Gly Asp Arg Arg Cys Tyr Gln Leu
        260                 265                 270Pro Pro Gly Gly Arg Gly Leu Ala Arg Arg Ala Ile Gln Arg Asp Ile
    275                 280                 285Gly Glu Gly Ala Asp Ile Ile Met Val Lys Pro Ala Ser Ser Tyr Leu
290                 295                 300Asp Ile Ile Arg Asp Ala Lys Glu Ile Ala Lys Asp Ile Pro Ile Ala305                 310                 315                 320Ala Tyr Gln Val Ser Gly Glu Tyr Ala Met Ile His Ala Gly Ala Lys
            325                 330                 335Ala Gly Val Phe Asp Leu Lys Ser Met Ala Phe Glu Ser Thr Glu Gly
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370                 375(2)SEQ ID No：5信息：
(i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
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(C)链型：单链
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(xi)序列描述：SEQ ID No：5：TTTATGATGG AGGCCCTTCT CCAGCAGTCT C                        31(2)SEQ ID No：6信息：
(i)序列特征：
(A)长度：29个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：22：Met Glu Ala Leu Leu Gln Gln Ser Arg Ala Met Cys Pro Phe Leu Lys1               5                  10                  15Arg Ser Ser Pro Asn Thr Leu Arg Ser Leu Ala Thr Ala Thr Arg Pro
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            85                  90                  95Ala Leu His Ser Thr Gly Gly Asn Gly Ala Asn Met Ser Thr Glu Phe
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130                 135                 140Pro Val Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Asp Ala Phe Tyr Asn Ala Glu Leu145                 150                 155                 160Gln Lys Lys His Gln Asp Lys Ser Tyr Arg Tyr Phe Asn Asn Ile Asn
            165                 170                 175Arg Leu Ala Gln Glu Phe Pro Arg Ala His Thr Ala Ser Lys Asp Glu
        180                 185                 190Lys Val Thr Val Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Arg Asn
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370                 375                 380Ala Ser Gln Asp Thr Ala Asn Pro Leu Ser Thr Lys Gly Thr Val Met385                 390                 395                 400Asp Arg Ile Asn Ile Ile Thr Gly Thr Leu Gly Lys Ala Tyr Gly Cys
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    595                 600                 605Val Glu Arg Glu Phe Gln Ala Ala Val Pro Gly Met Lys Ala Gly Gly
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            645(2)SEQ ID No：23信息：
(i)序列特征：
(A)长度：548个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：23：Met Gln Arg Ser Ile Phe Ala Arg Phe Gly Asn Ser Ser Ala Ala Val1               5                  10                  15Ser Thr Leu Asn Arg Leu Ser Thr Thr Ala Ala Pro His Ala Lys Asn
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            165                 170                 175Leu Val Phe Ser Ser Cys Tyr Val Ala Asn Asp Ala Val Leu Ser Leu
        180                 185                 190Leu Gly Gln Lys Met Lys Asp Leu Val Ile Phe Ser Asp Glu Leu Asn
    195                 200                 205His Ala Ser Met Ile Val Gly Ile Lys His Ala Asn Val Lys Lys His
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290                 295                 300His Arg Ala Ser Gly Ile Ala Thr Pro Lys Thr Asn Asp Lys Gly Gly305                 310                 315                 320Ala Lys Thr Val Met Asp Arg Val Asp Met Ile Thr Gly Thr Leu Gly
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        420                 425                 430Ala Ser Asp Ile Leu Ile Asn Lys His Gln Ile Tyr Val Gln Ala Ile
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        500                 505                 510Ser Asn Leu Trp Thr Ser Ser Gln Leu Ser Leu Thr Asn Asp Asp Leu
    515                 520                 525Asn Pro Asn Val Arg Asp Pro Ile Val Lys Gln Leu Glu Val Ser Ser
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(A)长度：587个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：24：Met Val Thr Ala Ala Met Leu Leu Gln Cys Cys Pro Val Leu Ala Arg1               5                  10                  15Gly Pro Thr Ser Leu Leu Gly Lys Val Val Lys Thr His Gln Phe Leu
        20                  25                  30Phe Gly Ile Gly Arg Cys Pro Ile Leu Ala Thr Gln Gly Pro Asn Cys
    35                  40                  45Ser Gln Ile His Leu Lys Ala Thr Lys Ala Gly Gly Asp Ser Pro Ser
50                  55                  60Trp Ala Lys Gly His Cys Pro Phe Met Leu Ser Glu Leu Gln Asp Gly65                  70                  75                  80Lys Ser Lys Ile Val Gln Lys Ala Ala Pro Glu Val Gln Glu Asp Val
            85                  90                  95Lys Ala Phe Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Leu Val Ser Val Ser Leu
        100                 105                 110Arg Lys Pro Phe Ser Gly Pro Gln Glu Gln Glu Gln Ile Ser Gly Lys
    115                 120                 125Val Thr His Leu Ile Gln Asn Asn Met Pro Gly Asn Tyr Val Phe Ser
130                 135                 140Tyr Asp Gln Phe Phe Arg Asp Lys Ile Met Glu Lys Lys Gln Asp His145                 150                 155                 160Thr Tyr Arg Val Phe Lys Thr Val Asn Arg Trp Ala Asp Ala Tyr Pro
            165                 170                 175Phe Ala Gln His Phe Phe Glu Ala Ser Val Ala Ser Lys Asp Val Ser
        180                 185                 190Val Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Ser Arg His Pro Gln Val
    195                 200                 205Leu Gln Ala Thr Gln Glu Thr Leu Gln Arg His Gly Ala Gly Ala Gly
210                 215                 220Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Ser Lys Phe His Val Glu Leu Glu225                 230                 235                 240Gln Glu Leu Ala Glu Leu His Gln Lys Asp Ser Ala Leu Leu Phe Ser
            245                 250                 255Ser Cys Phe Val Ala Asn Asp Ser Thr Leu Phe Thr Leu Ala Lys Ile
        260                 265                 270Leu Pro Gly Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Ala Gly Asn His Ala Ser Met
    275                 280                 285Ile Gln Gly Ile Arg Asn Ser Gly Ala Ala Lys Phe Val Phe Arg His
290                 295                 300Asn Asp Pro Asp His Leu Lys Lys Leu Leu Glu Lys Ser Asn Pro Lys305                 310                 315                 320Ile Pro Lys Ile Val Ala Phe Glu Thr Val His Ser Met Asp Gly Ala
            325                 330                 335Ile Cys Pro Leu Glu Glu Leu Cys Asp Val Ser His Gln Tyr Gly Ala
        340                 345                 350Leu Thr Phe Val Asp Glu Val His Ala Val Gly Leu Tyr Gly Ser Arg
    355                 360                 365Gly Ala Gly Ile Gly Glu Arg Asp Gly Ile Met His Lys Ile Asp Ile
370                 375                 380Ile Ser Gly Thr Leu Gly Lys Ala Phe Gly Cys Val Gly Gly Tyr Ile385                 390                 395                 400Ala Ser Thr Arg Asp Leu Val Asp Met Val Arg Ser Tyr Ala Ala Gly
            405                 410                 415Phe Ile Phe Thr Thr Ser Leu Pro Pro Met Val Leu Ser Gly Ala Leu
        420                 425                 430Glu Ser Val Arg Leu Leu Lys Gly Glu Glu Gly Gln Ala Leu Arg Arg
    435                 440                 445Ala His Gln Arg Asn Val Lys His Met Arg Gln Leu Leu Met Asp Arg
450                 455                 460Gly Leu Pro Val Ile Pro Cys Pro Ser His Ile Ile Pro Ile Arg Val465                 470                 475                 480Gly Asn Ala Ala Leu Asn Ser Lys Leu Cys Asp Leu Leu Leu Ser Lys
            485                 490                 495His Gly Ile Tyr Val Gln Ala Ile Asn Tyr Pro Thr Val Pro Arg Gly
        500                 505                 510Glu Glu Leu Leu Arg Leu Ala Pro Ser Pro His His Ser Pro Gln Met
    515                 520                 525Met Glu Asp Phe Val Glu Lys Leu Leu Leu Ala Trp Thr Ala Val Gly
530                 535                 540Leu Pro Leu Gln Asp Val Ser Val Ala Ala Cys Asn Phe Cys Arg Arg545                 550                 555                 560Pro Val His Phe Glu Leu Met Ser Glu Trp Glu Arg Ser Tyr Phe Gly
            565                 570                 575Asn Met Gly Pro Gln Tyr Val Thr Thr Tyr Ala
        580                 585(2)SEQ ID No：25信息：(i)序列特征：
(A)长度：342个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：25：Met His Thr Ala Glu Phe Leu Glu Thr Glu Pro Thr Glu Ile Ser Ser1               5                  10                  15Val Leu Ala Gly Gly Tyr Asn His Pro Leu Leu Arg Gln Trp Gln Ser
        20                  25                  30Glu Arg Gln Leu Thr Lys Asn Met Leu Ile Phe Pro Leu Phe Ile Ser
    35                  40                  45Asp Asn Pro Asp Asp Phe Thr Glu Ile Asp Ser Leu Pro Asn Ile Asn
50                  55                  60Arg Ile Gly Val Asn Arg Leu Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Leu Val Ala65                  70                  75                  80Lys Gly Leu Arg Ser Val Ile Leu Phe Gly Val Pro Leu Ile Pro Gly
            85                  90                  95Thr Lys Asp Pro Val Gly Thr Ala Ala Asp Asp Pro Ala Gly Pro Val
        100                 105                 110Ile Gln Gly Ile Lys Phe Ile Arg Glu Tyr Phe Pro Glu Leu Tyr Ile
    115                 120                 125Ile Cys Asp Val Cys Leu Cys Glu Tyr Thr Ser His Gly His Cys Gly
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            165                 170                 175Ala Pro Ser Asp Met Ile Asp Gly Arg Ile Arg Asp Ile Lys Arg Gly
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            325                 330                 335Trp Leu Asp Glu Glu Asn
        340(2)SEQ ID No：26信息：(i)序列特征：
(A)长度：330个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：26：Met Gln Pro Gln Ser Val Leu His Ser Gly Tyr Phe His Pro Leu Leu1               5                  10                  15Arg Ala Trp Gln Thr Ala Thr Thr Thr Leu Asn Ala Ser Asn Leu Ile
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        260                 265                 270Leu Ala Val Tyr His Val Ser Gly Glu Phe Ala Met Leu Trp His Gly
    275                 280                 285Ala Gln Ala Gly Ala Phe Asp Leu Lys Ala Ala Val Leu Glu Ala Met
290                 295                 300Thr Ala Phe Arg Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Ile Thr Tyr Tyr Thr305                 310                 315                 320Pro Gln Leu Leu Gln Trp Leu Lys Glu Glu
            325                 320(2)SEQ ID No：27信息：(i)序列特征：
(A)长度：330个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：27：Met His His Gln Ser Val Leu His Ser Gly Tyr Phe His Pro Leu Leu1               5                  10                  15Arg Ala Trp Gln Thr Thr Pro Ser Thr Val Ser Ala Thr Asn Leu Ile
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            165                 170                 175Ala Ile Lys Ala Ala Leu Leu Lys His Gly Leu Gly Asn Arg Val Ser
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290                 295                 300Thr Ala Phe Arg Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Ile Thr Tyr Phe Ala305                 310                 315                 320Pro Gln Leu Leu Lys Trp Leu Lys Glu Glu
            325                 330(2)SEQ ID No：28信息：(i)序列特征：
(A)长度：323个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：28：Thr Asp Leu Ile Gln Arg Pro Arg Arg Leu Arg Lys Ser Pro Ala Leu1               5                  10                  15Pro Arg Met Phe Glu Glu Thr Thr Leu Ser Leu Asn Asp Leu Val Leu
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50                  55                  60Glu Arg Ile Ala Asn Ala Gly Ile Arg Ser Val Met Thr Phe Gly Ile65                  70                  75                  80Ser His His Thr Asp Glu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Arg Glu Asp Gly
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130                 135                 140Asn Leu Gly Lys Gln Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Phe145                 150                 155                 160Ile Ala Pro Ser Ala Ala Met Asp Gly Gln Val Gln Ala Ile Arg Gln
            165                 170                 175Ala Leu Asp Ala Ala Gly Phe Lys Asp Thr Ala Ile Met Ser Tyr Ser
        180                 185                 190Thr Lys Phe Ala Ser Ser Phe Tyr Gly Pro Phe Arg Glu Ala Ala Gly
    195                 200                 205Ser Ala Leu Lys Gly Asp Arg Lys Ser Tyr Gln Met Asn Pro Met Asn
210                 215                 220Arg Ala Glu Gly Ile Ala Glu Tyr Leu Leu Asp Glu Ala Gln Gly Ala225                 230                 235                 240Asp Cys Leu Met Val Lys Pro Ala Gly Ala Tyr Leu Asp Ile Val Arg
            245                 250                 255Glu Leu Arg Glu Arg Thr Glu Leu Pro Ile Gly Ala Tyr Gln Val Ser
        260                 265                 270Gly Glu Tyr Ala Met Ile Lys Phe Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Asp
    275                 280                 285Glu Glu Lys Val Val Leu Glu Ser Leu Gly Ser Ile Lys Arg Ala Gly
290                 295                 300Ala Asp Leu Ile Phe Ser Tyr Phe Ala Leu Asp Leu Ala Glu Lys Lys305                 310                 315                 320Ile Leu Arg(2)SEQ ID No：29信息：
(i)序列特征：(A)长度：398个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：29：His Thr Phe Val Asp Leu Lys Ser Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Leu1               5                  10                  15Ser Phe Ser Ser Ser Lys Arg Arg Gln Pro Pro Ser Leu Phe Thr Val
        20                  25                  30Arg Ala Ser Asp Ser Asp Phe Glu Ala Ala Val Val Ala Gly Lys Val
    35                  40                  45Pro Glu Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Ala Gly Thr
50                  55                  60Pro Val Val Pro Ser Leu Pro Ile Gln Arg Arg Pro Arg Arg Asn Arg65                  70                  75                  80Arg Ser Pro Ala Leu Arg Ser Ala Phe Gln Glu Thr Thr Leu Ser Pro
            85                  90                  95Ala Asn Phe Val Tyr Pro Leu Phe Ile His Glu Gly Glu Glu Asp Thr
        100                 105                 110Pro Ile Gly Ala Met Pro Gly Cys Tyr Arg Leu Gly Trp Arg His Gly
    115                 120                 125Leu Leu Glu Glu Val Ala Lys Ala Arg Asp Val Gly Val Asn Ser Val
130                 135                 140Val Leu Phe Pro Lys Ile Pro Asp Ala Leu Lys Thr Pro Thr Gly Asp145                 150                 155                 160Glu Ala Tyr Asn Glu Asp Gly Leu Val Pro Arg Ser Ile Arg Leu Leu
            165                 170                 175Lys Asp Lys Tyr Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Thr Asp Val Ala Leu Asp
        180                 185                 190Pro Tyr Ser Ser Asp Gly His Asp Gly Ile Val Arg Glu Asp Gly Val
    195                 200                 205Ile Met Asn Asp Glu Thr Val His Gln Leu Cys Lys Gln Ala Val Ala
210                 215                 220Gln Ala Arg Ala Gly Ala Asp Val Val Ser Pro Ser Asp Met Met Asp225                 230                 235                 240Gly Arg Val Gly Ala Met Arg Val Ala Leu Asp Ala Glu Gly Phe Gln
            245                 250                 255His Val Ser Ile Met Ser Tyr Thr Ala Lys Tyr Ala Ser Ser Phe Tyr
        260                 265                 270Gly Pro Phe Arg Glu Ala Leu Asp Ser Asn Pro Arg Phe Gly Asp Lys
    275                 280                 285Lys Thr Tyr Gln Met Asn Pro Ala Asn Tyr Arg Glu Ala Leu Thr Glu
290                 295                 300Met Arg Glu Asp Glu Ser Glu Gly Ala Asp Ile Leu Leu Val Lys Pro305                 310                 315                 320Gly Leu Pro Tyr Leu Asp Ile Ile Arg Leu Leu Arg Asp Asn Ser Pro
            325                 330                 335Leu Pro Ile Ala Ala Tyr Gln Val Ser Gly Glu Tyr Ser Met Ile Lys
        340                 345                 350Ala Gly Gly Ala Leu Lys Met Ile Asp Glu Glu Lys Val Met Met Glu
    355                 360                 365Ser Leu Leu Cys Leu Arg Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Leu Thr Tyr
370                 375                 380Phe Ala Leu Gln Ala Ala Arg Thr Leu Cys Gly Glu Lys Arg385                 390                 395(2)SEQ ID No：30信息：(i)序列特征：
(A)长度：323个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：30：Met Ser Gln Ser Phe Asn Arg His Arg Arg Leu Arg Thr Ser Lys Ala1               5                  10                  15Met Arg Glu Met Val Lys Glu Thr Arg Leu His Pro Ser Asp Phe Ile
        20                  25                  30Tyr Pro Ile Phe Val Val Glu Gly Leu Glu Gly Lys Lys Ala Val Pro
    35                  40                  45Ser Met Pro Asp Val His His Val Ser Leu Asp Leu Leu Lys Asp Glu
50                  55                  60Val Ala Glu Leu Val Lys Leu Gly Ile Gln Ser Val Ile Val Phe GIy65                  70                  75                  80Ile Pro Glu Glu Lys Asp Asp Cys Gly Thr Gln Ala Tyr His Asp His
            85                  90                  95Gly Ile Val Gln Lys Ala Ile Thr Glu Ile Lys Glu His Phe Pro Glu
        100                 105                 110Met Val Val Val Ala Asp Thr Cys Leu Cys Glu Tyr Thr Asp His Gly
    115                 120                 125His Cys Gly Leu Val Lys Asp Gly Val Ile Leu Asn Asp Glu Ser Leu
130                 135                 140Glu Leu Leu Ala Gln Thr Ala Val Ser Gln Ala Lys Ala Gly Ala Asp145                 150                 155                 160Ile Ile Ala Pro Ser Asn Met Met Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Arg
            165                 170                 175Glu Ala Leu Asp Lys Glu Gly Phe Val Asn Ile Pro Ile Met Ser Tyr
        180                 185                 190Ala Val Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Tyr Gly Pro Phe Arg Asp Ala Ala
    195                 200                 205Asn Ser Thr Pro Gln Phe Gly Asp Arg Lys Thr Tyr Gln Met Asp Pro
210                 215                 220Ala Asn Arg Met Glu Ala Leu Arg Glu Ala Gln Ser Asp Val Glu Glu225                 230                 235                 240Gly Ala Asp Phe Leu Ile Val Lys Pro Ser Leu Ser Tyr Met Asp Ile
            245                 250                 255Met Arg Asp Val Lys Asn Glu Phe Thr Leu Pro Leu Val Ala Tyr Val
        260                 265                 270Ser Gly Glu Tyr Ser Met Val Lys Ala Ala Ala Gln Asn Gly Trp Ile
    275                 280                 285Lys Glu Lys Glu Ile Val Leu Glu Ile Leu Thr Ser Met Lys Arg Ala
290                 295                 300Gly Ala Asp Leu Ile Ile Thr Tyr His Ala Lys Asp Ala Ala Lys Trp305                 310                 315                 320Leu Ala Glu(2)SEQ ID No：31信息：(i)序列特征：
(A)长度：424个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：无(xi)序列描述：SEQ ID No：31：Met Met Ala Ser Thr Phe Asn Ile Pro Cys Asn Ala Gly Thr Ile Lys1               5                  10                  15Asn Phe Asn Asn Ser Gln Arg Asn Leu Gly Phe Ser Ser Asn Leu Gly
        20                  25                  30Ile Asn Phe Ala Lys Thr Arg Phe Ser Asn Cys Gly Asp Ser Gly Arg
    35                  40                  45Ile Pro Ser Gln Leu Val Val Arg Ala Ser Glu Arg Arg Asp Asn Leu
50                  55                  60Thr Gln Gln Lys Thr Gly Leu Ser Ile Glu Glu Cys Glu Ala Ala Val65                  70                  75                  80Val Ala Gly Asn Ala Pro Ser Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Pro Lys
            85                  90                  95Ala Pro Ser Gly Thr Pro Ser Val Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Arg
        100                 105                 110Pro Arg Arg Asn Arg Thr Ser Pro Val Phe Arg Ala Ala Phe Gln Glu
    115                 120                 125Thr Thr Leu Ser Pro Ala Asn Val Val Tyr Pro Leu Phe Ile His Glu
130                 135                 140Gly Glu Glu Asp Thr Pro Ile Gly Ala Met Pro Gly Cys Tyr Arg Leu145                 150                 155                 160Gly Trp Arg His Gly Leu Val Glu Glu Val Ala Lys Ala Arg Asp Val
            165                 170                 175Val Val Asn Ser Ile Val Val Phe Pro Lys Pro Asp Ala Leu Lys Ser
        180                 185                 190Pro Thr Gly Asp Glu Ala Tyr Asn Glu Asn Gly Leu Val Pro Arg Thr
    195                 200                 205Ile Arg Met Leu Lys Asp Lys Phe Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Thr Asp
210                 215                 220Val Ala Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Asp Gly His Asp Gly Ile Val Thr225                 230                 235                 240Gln His Gly Val Ile Met Asn Asp Glu Thr Val His Gln Leu Cys Lys
            245                 250                 255Gln Ala Val Ala Gln Ala Arg Ala Gly Ala Asp Val Val Ser Pro Ser
        260                 265                 270Asp Met Met Asp Gly Arg Val Gly Ala Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala
    275                 280                 285Glu Gly Tyr Ser Asn Val Ser Ile Met Ser Tyr Thr Ala Lys Tyr Ala
290                 295                 300Ser Ser Phe Tyr Pro Arg Phe Gly Asp Lys Lys Thr Tyr Gln Met Asn305                 310                 315                 320Pro Ala Asn Tyr Arg Glu Ala Leu Ile Glu Thr Gln Glu Asp Glu Ser
            325                 330                 335Glu Gly Ala Asp Ile Leu Leu Val Lys Pro Gly Leu Pro Tyr Leu Asp
        340                 345                 350Ile Ile Arg Leu Leu Arg Asp Asn Ser Asp Leu Pro Ile Ala Ala Tyr
    355                 360                 365Gln Val Ser Gly Glu Tyr Ser Met Ile Lys Ala Gly Gly Val Leu Lys
370                 375                 380Met Ile Asp Glu Glu Lys Val Met Leu Glu Ser Leu Leu Cys Leu Arg385                 390                 395                 400Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Leu Thr Tyr Phe Ala Leu Gln Ala Ala
            405                 410                 415Arg Cys Leu Cys Gly Glu Lys Arg
        420(2)SEQ ID No：32信息：(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：32：ATGCATCTGG AAACGCAACC CTGA                                           24(2)SEQ ID No：33信息：(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：33：ATGCATTCTA CGCCAGGACC GAGC                                           24(2)SEQ ID No：34信息：(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：34：TGGTGTACAG GGGCATAAAA T                                            21(2)SEQ ID No：35信息：(i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：35：ATTTAAATCC AGTTGTGTAT ATAGAGGATT GTGG                             34(2)SEQ ID No：36信息：(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：36：ATTTAAATGA TGAGGAGCTC CCTTGTGCTG                                  30(2)SEQ ID No：37信息：(i)序列特征：
(A)长度：29个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：37：TTAATTAACT AGAGTCGACC CAGCCGCGC                           29(2)SEQ ID No：38信息：(i)序列特征：
(A)长度：62个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：38：GCATATTTAA ATGATGTCCT TTTCTAATCT CGT                      33(2)SEQ ID No：39信息：(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID No：39：ATATTAATTA ATCCATCTAG CTAAATCATT                          30

Claims (42)

1.一种生产血红素蛋白的方法，包括：
(a)将下述序列导入丝状真菌细胞中：
(i)可指导由丝状真菌细胞内源第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的一个或多个第一种控制序列，其中所述一个或多个第一种控制序列与所述第一种核酸序列有效相连；和/或
(ii)一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝；
(b)在适于产生血红素蛋白和血红素生物合成酶的营养培养基中培养该丝状真菌细胞；以及
(c)从该丝状真菌细胞的营养培养基中回收血红素蛋白。
2.按照权利要求1的方法，其中仅将一个或多个第一种控制序列导入该丝状真菌细胞中。
3.按照权利要求2的方法，其中第一种控制序列选自下列序列：前导序列，聚腺苷酸化序列，启动子，肽原编码区，信号肽编码区和转录终止子。
4.按照权利要求2的方法，其中所述一个或多个第一种控制序列得自丝状真菌菌株。
5.按照权利要求1的方法，其中仅将一个或多个第二种核酸序列的一或多拷贝导入丝状真菌细胞中。
6.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列与可指导第二种核酸序列表达的一个或多个第二种控制序列有效相连。
7.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列得自丝状真菌细胞。
8.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码5-氨基-γ-酮戊酸合成酶。
9.按照权利要求8的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码具有SEQ ID No：2所示氨基酸序列的5-氨基-γ-酮戊酸合成酶。
10.按照权利要求9的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列具有SEQ ID No：1所示的核酸序列。
11.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码胆色素原合成酶。
12.按照权利要求11的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码具有SEQ ID No：4所示氨基酸序列的胆色素原合成酶。
13.按照权利要求12的方法，其中所述胆色素原合成酶具有SEQ IDNo：3所示的核酸序列。
14.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码胆色素原脱氨基酶。
15.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码尿卟啉原合成酶。
16.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码尿卟啉原脱羧酶。
17.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码粪卟啉原氧化酶。
18.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码原卟啉原氧化酶。
19.按照权利要求5的方法，其中所述一个或多个第二种核酸序列编码亚铁螯合酶。
20.按照权利要求1的方法，其中将控制序列的一或多拷贝与第二种核酸序列的一或多拷贝导入丝状真菌细胞中。
21.按照权利要求1的方法，其中还包括在步骤a或步骤b之前将编码血红素蛋白的第三种核酸序列的一或多拷贝导入丝状真菌细胞中。
22.按照权利要求1的方法，其中还包括将血红素或血红素类似物源导入营养培养基中。
23.按照权利要求1的方法，其中还包括将铁源导入营养培养基中。
24.按照权利要求1的方法，其中该血红素蛋白是氧化还原酶。
25.按照权利要求24的方法，其中所述氧化还原酶是过氧化氢酶、氧化酶、加氧酶、卤素过氧化物酶，或过氧化物酶。
26.按照权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是过氧化氢酶。
27.按照权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是氧化酶。
28.按照权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是加氧酶。
29.按照权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是卤素过氧化物酶。
30.按照权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是过氧化物酶。
31.按照权利要求30的方法，其中所述过氧化物酶得自鬼伞属、Arthromyces属或Phanerochaete属种。
32.按照权利要求31的方法，其中所述过氧化物酶得自鬼伞属菌株。
33.按照权利要求32的方法，其中所述过氧化物酶得自灰盖鬼伞菌株。
34.按照权利要求32的方法，其中所述过氧化物酶得自长根鬼伞菌株。
35.按照权利要求1的方法，其中所述血红素蛋白是丝状真菌细胞的天然蛋白。
36.按照权利要求1的方法，其中所述血红素蛋白是丝状真菌细胞的外源蛋白。
37.按照权利要求1的方法，其中所述丝状真菌细胞是枝顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢霉属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium属或木霉属种的细胞。
38.按照权利要求37的方法，其中所述丝状真菌细胞是曲霉属细胞。
39.按照权利要求38的方法，其中所述曲霉属细胞是米曲霉细胞。
40.按照权利要求38的方法，其中所述米曲霉细胞是黑曲霉细胞。
41.能生产血红素蛋白的重组型丝状真菌细胞，其含有：
(i)一个或多个能指导由该丝状真菌细胞内源的第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的第一种控制序列，其中所述一个或多个第一种控制序列与第一种核酸序列有效相连；和/或
(ii)一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝。
42.一种生产重组型丝状真菌细胞的方法，其包括将下述序列导入重组型丝状真菌细胞：
(i)一个或多个能指导由该丝状真菌细胞内源的第一种核酸序列所编码的血红素生物合成酶表达的第一种控制序列，其中所述一个或多个第一种控制序列与第一种核酸序列有效相连；和/或
(ii)一个或多个编码血红素生物合成酶的第二种核酸序列的一或多拷贝。
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