CN1219971A - 丝状真菌的形态突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从丝状真菌亲代细胞获得突变细胞的方法,该方法包括:(a)获得亲代细胞的突变细胞;(b)鉴定表现出比亲代细胞再受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝的突变细胞;以及(c)鉴定突变细胞,当该突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时,该突变细胞比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。

Description

丝状真菌的形态突变体
本发明涉及具有改进的分泌重组多肽的能力的新真菌，以及改进这种分泌的方法。
丝状真菌已被确认为生产重组多肽的广泛应用的宿主细胞***。然而，在很多情况下，具有所需的易转化性和异源多肽表达性状的真菌不一定具有最希望的成功发酵的特征。例如，发酵时的生长形态可能不是最佳的，因为当生物量增加时很多培养物变得十分粘稠。增大的粘度限制了使发酵培养物混合和通气的能力，导致菌丝体缺乏氧和营养，它反过来变得不能存活和非生产性的，限制目的多肽产率。另一方面，根据生产的酶量评价，显示良好发酵形态的丝状真菌菌株不一定是最好的生产菌株。因此，为了商用目的，需要这类丝状真菌宿主，即它们将表达工业量的重组多肽的能力与令人满意的生长特性(如迅速生长和低粘度)相结合，于是增强发酵时的生产能力。
筛选具有改进发酵形态的大量突变体相当困难，且形态突变菌株通常是基于固体培养基上的异常菌落形态而分离的。传统上，形态突变体一直是在含异源基因的多个拷贝的已转化菌株中分离的。然后分析突变体的发酵生长特性和异源基因表达。虽然该方法可能适用于鉴定改进的表达菌株，但任意特定的真菌生长形态与菌株生产大量分泌性多肽的能力之间的关系尚待确定。形态突变体有时也在已转化菌株的诱变之后在多肽表达改进筛选中回收，但对这些菌株的研究仍然未导致任何有关形态控制的有意义的认识。此外，含异源基因表达盒、亲代菌株的形态上“改进的”菌株不适合作一般的表达宿主，因为它们不能用于专门表达其它异源多肽。
本发明的一个目的是提供生产和鉴定用于异源多肽生产的有用形态突变体的方法。
本发明涉及从丝状真菌亲代细胞获得突变细胞的方法，该方法包括：(a)获得亲代细胞的突变细胞；(b)鉴定表现出比亲代细胞更受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝的突变细胞；以及(c)鉴定突变细胞，当该突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时，该突变细胞比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。
本发明还涉及按本发明的方法生产的突变丝状真菌细胞。
本发明还涉及生产异源多肽的方法，该方法包括：(a)培养包括编码该异源多肽的核酸序列的、本发明的突变细胞；以及(b)回收该异源多肽。
图1示出pJeRS23的限制图。
图2示出对照菌株HowB425和菌落突变体JeRS316在PDA+尿苷固体培养基上的菌落生长。
图3示出在HowB425(对照物)和JeRS316(突变体)转化体中脂肪酶表达的分布示意图。
图4示出在HowB425(对照物)和JeRS317(突变体)转化体中脂肪酶表达的分布示意图。
图5示出对照菌株与突变菌株发酵时异源脂肪酶生产期的比较。
图6示出pCaHj418的限制图。
图7示出pDM148的限制图。
图8示出pDM149的限制图。
图9示出pJaL154的限制图。
图10示出pMT1612的限制图。
图11示出pJRoy30的限制图。
本发明涉及从丝状真菌亲代细胞获得突变细胞的方法，该方法包括：(a)获得亲代细胞的突变细胞；(b)鉴定表现出比亲代细胞更受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝的突变细胞；以及(c)鉴定突变细胞，当该突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时，该突变细胞比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。
亲代细胞可用本领域已知方法诱变。例如，可通过辐射达到亲代细胞的诱变，如用UV、X射线或γ射线辐射亲代细胞。此外，可用化学诱变剂如亚硝酸、亚硝胺、甲基亚硝基胍，以及碱基类似物如5-溴尿嘧啶处理而达到诱变。最方便的方法是对亲代菌株的孢子应用诱变剂，并将存活的孢子铺在固体培养基上生长。还应懂得，突变体也可以是不存在特定的诱变方法时在群体中自然出现的变体，通过选择、筛选，或结合选择和筛选。例如参见，Wiebe等，1992，真菌学研究(MycologicalResearch)96:555-562以及Wiebe等，1991，真菌学研究95:1284-1288分离镰孢属(Fusarium)菌株A3/5的形态突变体。因此，本发明中的术语“突变体”还包括未有意应用诱变剂时的天然产生的变体或突变体，即自发突变体。
该丝状真菌亲代细胞可以是任意丝状真菌细胞。丝状真菌包括真菌门和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等在‘Ainsworth和Bisby真菌辞典’(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi),8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定义的)。丝状真菌的特征在于，营养菌丝体由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖以及其它复合多糖组成。营养生长是通过菌丝的伸长进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。
本发明的丝状真菌亲代细胞可以是但不限于下列物种的细胞：支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属、腐质霉属(Humicola)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium以及木霉属(Trichoderma)或其有性型或同义物。曲霉属的已知有性型包括散囊菌属(Eurotium)、Neosartorya和Emericella。曲霉属及其有性型的菌株在例如下列一些培养物保藏机构中易于被公众获得：美国典型培养物保藏中心(ATCC)，德国微生物保藏中心(DSM)，真菌菌种保藏中心(CBS)，以及农业研究机构保藏中心(NRRL)。变色部(Section Discolor)镰孢属的已知有性型包括Gibberella gordonii、蓝色赤霉(Gibberella cyanea)、虱状赤霉(Gubberella pulicaris)和玉蜀赤霉(Gibberella zeae)。
在一个优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是曲霉属细胞。在另一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是支顶孢属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是镰孢属细胞，如Elegans部或变色部的镰孢属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是腐质霉属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是毁丝霉属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是毛霉属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是脉孢菌属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是青霉属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是梭孢壳属细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是Tolypocladium细胞。在又一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是木霉属细胞。在一个更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或日本曲霉(Aspergillus japonicus)细胞。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是变色部(也称为镰孢属部)的镰孢属菌株。例如，丝状真菌亲代细胞可以是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarumsarcochroum)、Fusarium sulphureum或Fusarium trichothecioides细胞。在另一优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是Elegans部的镰孢属菌株，如尖镰孢(Fusarium oxysporum)。在另一更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是Humicola insolens或Humicola lanuginosa细胞。在又一更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是Myceliophthorathermophilum细胞。在又一更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是米黑毛霉(Mucor miehei)细胞。在又一更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)细胞。在又一更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是产紫青霉(Penicillium purpurogenum)细胞。在又一更优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是Thielavia terrestris细胞。在又一更优选的实施方案中，木霉属细胞是Trichoderma reesei、绿色木霉(Trichoderma viride)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma harzianum或康宁木霉(Trichoderma koningii)细胞。
然后从第一步中生产的突变细胞中筛选这类突变细胞，即(a)表现出比亲代细胞更受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝；以及(b)当突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时，比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。在一个优选的实施方案中，首先检查该突变细胞是否有更受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝，更优选地，首先检查是否有更受限的菌落表型接着检查是否有延伸更多的菌丝分枝。
当与亲代细胞在相同的固体培养基上生长时，本发明的突变细胞可能具有比亲代细胞更受限的菌落表型。具有“更受限的菌落表型”的突变细胞在本文被定义为：当该突变细胞与亲代细胞在固体培养基上生长时，突变细胞比亲代细胞具有更小的径向延伸率(radial extensionrate)。优选地，突变细胞的菌落表型比亲代细胞更受限至少约10％，更优选至少约20％，且最优选至少约30％。
本发明的突变细胞还可比亲代细胞具有延伸更多的菌丝分枝。具有“延伸更多的菌丝分枝”的突变细胞在本文被定义为：菌丝生长单位长度比亲代细胞的菌丝生长单位长度至少小10％的突变细胞。优选地，突变细胞的菌丝分枝比亲代细胞至少约多20％，更优选至少约多30％。菌丝生长单位长度的测定可按Trinci等在1973，微生物学杂志(Archivfiir Mikrobiologie)91:127-136中描述的方法进行。进行该测定的一个方法是测量真菌菌丝分枝之间的平均距离(例如参见，Withers等，1994，真菌学研究98:95-100)。
当该突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时，本发明的突变细胞比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。按本发明的方法获得的突变体可具有发酵时改进的生长特性，此时突变体形态使发酵罐中的粘度更低，反过来导致更容易的混合，更好的通气性，更好的生长，于是最终使突变菌株比亲代菌株生产异源多肽的产率更高。在一个优选的实施方案中，改进的性能选自如下性能：(a)提高的异源多肽产率；(b)改进的生长情况，(c)更低的粘度，以及(d)更好的分泌作用。在一个最优选的实施方案中，改进的性能是提高的异源多肽产率。在另一最优选的实施方案中，改进的性能是改进的生长情况。在又一最优选的实施方案中，改进的性能是更低的粘度。在又一最优选的实施方案中，改进的性能是更好的分泌作用。
为了确定突变细胞是否比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能，例如通过转化将包括编码该目的异源多肽的核酸序列的核酸构建物导入亲代菌株和该形态突变体。“核酸构建物”在本文被定义为单链或双链的核酸分子，它是从天然存在的基因分离的或已被修饰以包含核酸的区段，这些核酸区段以自然界中未存在的方式组合或邻接。优选用包括该核酸构建物的载体转化突变细胞，接着将该载体整合入宿主染色体。“转化”指将核酸构建物导入宿主细胞使该构建物作为染色体整合体保持。通常认为整合是个好办法，因为编码异源多肽的核酸序列更可能稳定地保持在细胞中。载体被整合入宿主染色体是通过同源重组或非同源重组进行的。转化是应用适合所用真菌宿主的那些方法实现的，其中有很多方法是本领域公知的。转化曲霉属细胞的合适方法描述于EP238023,Christensen等，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422，以及Yelton等，1984，美国国家科学院院报(Proceedingsof the National Academy of Sciences USA)81:1470-1474。转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等描述于1989，基因(Gene)78:147-156或共同未决的US序列号08/269,449。
在用含编码异源多肽的基因的载体转化突变细胞和亲代细胞之后，将从突变体和亲代收集的孢子用于接种液体培养基。在适当的生长期后，测试上清液的多肽活性。
当形成改进的性能后，比较突变体菌株和亲代菌株之间异源多肽的表达水平。这样，应延长突变体发酵的生产期。在一个优选的实施方案中，当各菌株在相同条件下培养时，形态突变体比亲代菌株产生至少多约10％的异源多肽。更优选地，突变体产生至少多20％、且最优选至少多30％的异源多肽。在某些情况下，突变体可产生高达多50％-100％的多肽或甚至更高。因为希望在所有培养物中可观察到一系列表达水平，所以应懂得该数值可代表在转化体菌株种群中表达的平均的、适中的或最高的水平。
当改进的性能是减小的粘度时，粘度可用本领域已知的任意方法测定，例如Brookfield旋转测粘法(规定的或未限定的剪切距离和任意类别的锭子结构)，运动粘度管(流经管)，落球式粘度计或杯式粘度计。本发明优选的宿主细胞与亲代细胞在相同的发酵条件下，前者表现的粘度约为后者的90％或更小，优选约80％或更小，更优选约50％或更小。
本形态突变体可被用于表达任何目的原核或真核异源肽或多肽，并优选被用于表达真核肽或多肽。这些物种特别受关注的是它们在表达异源多肽、特别是真菌多肽、尤其是真菌酶方面的应用。该形态突变体可被用于表达酶如水解酶、氧化还原酶、异构酶、连接酶、裂合酶或转移酶。更优选地，该酶是氨基肽酶、淀粉酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶(mutanase)、氧化酶、溶果胶酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、蛋白酶、核糖核酸酶、木聚糖酶或木糖异构酶。本领域技术人员应懂得，术语“真菌酶”不但包括天然真菌酶还包括已通过氨基酸取代、缺失、添加或其它修饰方法修饰的真菌酶，修饰可使之提高活性、热稳定性、pH耐受性等等。可被表达的其它多肽包括但不限于哺乳动物多肽如胰岛素、胰岛素变体、受体蛋白及其部分、以及抗体及其部分。
该突变体还可用于重组生产对宿主细胞来说是天然的多肽。这种应用的实例包括但不限于，将编码该多肽的基因置于不同的启动子控制之下以增强该多肽的表达，应用信号序列加快目的天然多肽输出细胞，或增大编码该蛋白质(通常是由受实验的宿主细胞生产的)的基因拷贝数。因此，本发明在术语“异源多肽”的范围内还包括这种同源多肽的重组生产，其程度为这种表达包括该宿主细胞非天然的遗传因子的应用，或天然因子(这些天然因子已***作至以宿主细胞中不常见的方式起作用)的应用。
在本发明中，核酸构建物与一个或多个控制序列操作性地连接，这些控制序列能在适于控制序列的条件下在突变细胞中指导编码序列的表达。术语“编码序列”在本文定义为这种序列，即在控制序列的控制下它被转录成mRNA并被翻译成本发明的多肽。编码序列的边界通常由5＇端的翻译起始密码子ATG和3＇端的翻译终止密码子确定的。编码序列可包括但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“控制序列”在本文被定义为包括对表达该核酸序列的编码序列来说必需的或有益的所有成分。每个控制序列可以是对编码该多肽的核酸序列天然的或外源的。这类控制序列包括但不限于：前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。在最低限度，该控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。可给控制序列提供接头，目的是引入特异性限制位点以便于控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接。
控制序列可以是合适的启动子序列，即被表达该核酸序列的宿主细胞识别的一种核酸序列。该启动子序列包含介导多肽的表达的转录和翻译控制序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中表现转录活性的任意核酸序列，且可得自编码该宿主细胞的同源性或异源性胞外多肽或胞内多肽的基因。在丝状真菌细胞中指导本发明的核酸构建物转录的适当启动子实例有得自编码下列酶的基因的启动子：即米曲霉TAKA淀粉酶(如美国专利申请系列No.08/208,092中所述，其内容并入本文作参考)、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(如美国专利No.4,288,627中所述，它被并入本文作参考)，及其杂交体。用于丝状真菌细胞中的特别优选的启动子有：TAKA淀粉酶启动子，NA2-tpi(得自编码黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子杂交体)，以及glaA启动子。
该控制序列还可以是适当的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。该终止子序列可***作性地连接到编码该多肽的核酸序列的3＇端。在选择的宿主细胞中起作用的任何终止子都可用于本发明。丝状真菌细胞的优选的终止子得自编码下列酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨茴酸合酶(anthranilatesynthase)、黑曲霉α葡糖苷酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
该控制序列也可以是适当的前导序列，即对宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导序列***作性地连接至编码该多肽的核酸序列5＇端。在选择的宿主细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。
该控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即操作性地连接至该核酸序列的3＇端的序列，而且当转录时它被宿主细胞作为信号识别以将聚腺苷残基加到转录的mRNA上。在选择的宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本发明。丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列得自编码下列酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨茴酸合酶、以及黑曲霉α葡糖苷酶。
该控制序列也可以是信号肽编码区，它编码与该多肽的氨基端连接的氨基酸序列，它可将已表达的多肽引导入细胞的分泌途径。核酸序列的编码序列的5＇端本身可包括信号肽编码区，后者在翻译读框内天然地与编码分泌性多肽的编码区的区段连接。或者，该编码序列的5＇端可包括对编码分泌性多肽的编码序列的那部分呈外源性的信号肽编码区。在编码序列不正常包括信号肽编码区的情况下，可能需要外源信号肽编码区。或者，外源信号肽编码区可简单地置换天然信号肽编码区以获得比通常与编码序列相关的天然信号肽编码区更强的多肽分泌作用。信号肽编码区可得自下列基因，即曲霉属物种的葡糖淀粉酶基因或淀粉酶基因，Rhizomucor物种的脂肪酶基因或蛋白酶基因，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子的基因，芽孢杆菌属(Bacillus)物种的淀粉酶基因或蛋白酶基因，或小牛前凝乳酶原(preprochymosin)基因。不过，能将已表达的多肽引导入选择的宿主细胞的分泌途径的任意信号肽编码区都可用于本发明。丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自下列基因的信号肽编码区，即米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicolalanuginosa纤维素酶基因、Rhizomucor miehei脂肪酶基因。
该控制序列也可以是前肽编码区，它编码处于多肽氨基端的氨基酸序列。产生的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或者在某些情况下称为酶原(zymogen))。多肽原通常是惰性的，可通过催化或自动催化裂解多肽原的前肽而转化成成熟的活性多肽。前肽编码区可得自：枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽胞杆菌中性蛋白酶基因(nprE)、酿酒酵母c因子基因或Myceliophthora thermophilum漆酶基因(WO95/33836)。
该载体可以是能方便地进行重组DNA操作并能促使编码该多肽的核酸序列表达的任意载体。载体的选择一般依赖于该载体与(待将该载体引入其中的)宿主细胞的相容性。该载体可以是线型或封闭的环形质粒。该载体***可以是单一的载体或质粒或者是两种或多种一起包含待引入宿主细胞的基因组的全部DNA的载体或质粒。本发明的载体优选包含允许载体稳定整合入宿主细胞基因组的元件。至于整合，该载体可依赖于编码多肽的核酸序列或该载体的任何其它元件，该元件适合于通过同源的或非同源的重组将载体稳定整合入基因组。或者，该载体可包含适合于通过同源重组而指导整合入宿主细胞基因组的其它核酸序列。该其它的核酸序列使载体能被整合入宿主细胞基因组中染色体内的准确位置上。为了增大准确位置上整合的可能性，整合元件应优选包含足够数量的核酸，如100～1,500个碱基对，优选为400～1,500个碱基对，最优选为800～1,500个碱基对，它与相应的靶序列具有高度同源性以增大同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任意序列。此外，整合元件可以是非编码核酸序列或编码核酸序列。另一方面，该载体可通过非同源重组被整合入宿主细胞的基因组。
该载体优选包含一个或多个能轻易选择已转化细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，它的产物可提供抗生剂抗性、抗重金属、至营养缺陷体的原养型(prototrophy)等等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可选自包括但不限于下列的组：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰基转移酶)、bar(phosphinothricin acetyltransferase)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5＇-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤基转移酶)、trpC(氨茴酸合酶)、和glufosinate抗性标记，以及其它物种的等同物。用于曲霉属细胞的优选标记有：构巢曲霉或米曲霉的amdS标记和pyrG标记以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。此外，可通过共转化进行选择，例如描述于WO91/17243中的方法，此处的选择性标记是在单独的载体上。
按本发明一个优选的实施方案，宿主是用单一DNA载体转化的，该载体包括选择标记和待引入的其余异源DNA，它包括启动子、所需多肽的基因和转录终止子以及聚腺苷酸化序列。
本领域技术人员熟知用于连接上述元件以构建核酸构建物和载体的方法(例如参见，Sambrook等，1989，分子克隆：实验手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,New york,1989，同上)。
本发明还涉及生产异源多肽的方法，该方法包括：(a)培养包括编码异源多肽的核酸序列的、本发明的突变细胞；以及(b)回收异源多肽。
应用本领域已知方法在适于生产多肽的营养培养基中培养这些细胞。例如，可通过如下方法培养细胞：摇瓶培养，在允许多肽被表达和/或分离的条件下、在实验发酵罐或工业发酵罐内合适的培养基中进行小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、分批进料的或固态发酵)。是应用本领域已知方法，在包括碳源、氮源和无机盐的适当营养培养基中进行培养的(例如参见细菌和酵母方面的文献资料；Bennett,J.W.和LaSure,L.编，真菌中更多的基因操作(More Gene Manipulations inFungi),Academic Press,CA,1991)。合适的培养基可商购或按公开的组成(例如美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该多肽被分泌入营养培养基，则可直接从培养基回收该多肽。如果该多肽未分泌，就从细胞裂解物回收它。
可应用本领域已知的专用于多肽的方法检测这些多肽。这些检测方法可包括：特异性抗体的应用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可应用酶分析来测定该多肽的活性。测定酶活性的方法是本领域熟知的。
生成的多肽可用本领域已知方法回收。例如，可应用包括但不限于下列惯常方法从营养培养基回收该多肽：离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后可通过各种色谱法进一步纯化回收的多肽，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲合色谱法等。
本发明的多肽可通过包括但不限于下列的各种方法纯化：色谱法(例如离子交换、亲合、疏水的、色谱聚焦和大小排阻)，电泳法(例如制备等电点聚焦)，差示溶解性(例如硫酸铵沉淀)，或提取(例如参见，蛋白质纯化(Protein Purification),J.C.Janson和Lars Ryden编，VCHPublishers,New York,1989)。
实施例
菌株和培养基
起始菌株是α淀粉酶缺损的、pyrG阴性米曲霉HowB425和镰孢属A3/5。称为CC1-3、CC2-3和MC3-5的、镰孢属A3/5的形态突变体(Wiebe等，1992，真菌学研究96:555-562；Wiebe等，1991，真菌学研究95:1284-1288；Wiebe等，1991，真菌学研究96:555-562)是高度分枝的菌落变体。
除非另外说明，PDA板包含39g/l马铃薯葡糖琼脂(Difco)并用10mM尿苷补充pyrG营养缺陷体。
每升MY50N培养基由下列物质组成：62.5gNutriose、2.0gMgSO4·7H2O、2.0gKH2PO4、4.0g柠檬酸、8.0g酵母提取物、2.0g脲、0.1gCaCl2和0.5ml痕量金属溶液(pH6.0)。用玻璃瓶蒸馏的水将MY50N摇瓶培养基稀释成1∶100以供用于微量滴定生长实验(MY50N/100)。培养物是在28～37℃下生长的。
每升基本培养基板包括：6.0gNaNO3、0.52gKCl、1.52gKH2PO4、1.0ml痕量金属溶液、20gNobel Agar(Difco)、20ml50％葡萄糖、20ml蛋氨酸(50g/l)、20ml生物素(200mg/l)、2.5ml20％MgSO4·7H2O以及1.0mlmg/ml的链霉素。在高压灭菌前将琼脂培养基调节至pH6.5，然后将葡萄糖、蛋氨酸、生物素、MgSO4·7H2O和链霉素的无菌溶液加入已冷却的高压灭菌后的培养基中，再将培养基倾入板中。
每升痕量金属溶液(1000X)包括：22gZnSO4·7H2O、11gH3BO3、5gMnCl2·4H2O、5gFeSO4·7H2O、1.6gCoCl2·5H2O、1.6g(NH4)6Mo7O24和50gNa4EDTA。
每升COVE板包括：343.3g蔗糖、20mlCOVE盐溶液、10ml1M乙酰胺、10ml3MCsCl和25gNobel琼脂。COVE盐(50X)溶液包括：26gKCl、26gMgSO4·7H2O、76gKH2PO4和50mlCOVE痕量金属溶液。每升COVE痕量金属溶液包括：0.04gNaB4O7·10H2O、0.040gCuSO4·5H2O、0.70gFeSO4·H2O、0.80gNa2MoO2·2H2O和10gZnSO4。
每升M400Da培养基包括：50g麦芽糖糊精、2.0gMgSO4·7H2O、2.0gKH2PO4、4.0g柠檬酸、8.0g酵母提取物、2.0g脲和0.5ml痕量金属溶液。用5N NaOH将培养基调节至pH6.0。每升痕量金属溶液包括：14.3gZnSO4·7H2O、2.5gCuSO4·5H2O、0.5gNiCl2·6H2O、13.8gFeSO4·7H2O、8.5gMnSO4·H2O和3.0g柠檬酸。
实施例1：米曲霉菌株HowB425的诱变
从固体培养基收获米曲霉菌株HowB425孢子并将其悬浮于0.01％吐温80至浓度为2.2×107/ml。将5ml孢子悬浮液吸移入90mm塑料培养皿中，用紫外光对孢子照射1分钟至约5％存活。将诱变后的孢子置于暗处保存1小时，然后涂到PDA+50mg/l尿苷板上。
得自该诱变处理的孢子颜色突变体的频率为8.8×10-5(形成白色孢子的突变体)和5.9×10-5(形成黄色孢子的突变体)。对总共约34,000个活菌落(每板250～800个)目视筛选受限的菌落表型。选出88个受限的菌落表型。在显微镜(200X)下对生长在板上的受限菌落边缘检查高度菌丝分枝的表型。从接受选择的菌落表型中选出36个比米曲霉HowB425对照菌株具有更多菌丝分枝的表型，并通过在PDA+尿苷板上重新划线孢子来进行纯化。在生长并形成孢子后，再用类似方式纯化菌株。对36个突变体再次检查菌落表型和高度分枝的表型。在这36个再测试的突变体中有12个在如上两种分析中呈阳性，选出它们进行异源多肽表达分析。回收的突变体频率为12/34,000或约3.5×10-4。通过检查它们的菌丝分枝表型对菌落突变体分类(表Ⅰ)。对照菌株和突变体之一在PDA+尿苷固体培养基上的菌落形态示于图2。
          表Ⅰ-形态突变体的表型
表型 菌株
野生型生长和低度分枝 HowB425(对照物)
菌落生长和中度分枝 JeRS306JeRS307JeRS314JeRS316JeRS318
菌落生长和高度分枝 JeRS303JeRS304JeRS315JeRS320
菌落生长和极高度分枝 JeRS313
菌落生长和高度分枝的短菌丝 JeRS317
菌落生长和高度分枝的很短菌丝 JeRS305
实施例2：脂肪酶表达质粒
脂肪酶表达质粒pJeRS23的图示于图1。pJeRS23包括：得自构巢曲霉的碱基-118～2191的amdS基因(相对于ATG起始密码子)、来自pMHan37的pTAKA-TPI/Lipolase/AMGt脂肪酶表达盒、米曲霉pyrG基因、以及pUC19序列。
实施例3：米曲霉转化
在37℃和搅拌下使待转化的培养物在20ml的1％酵母提取物-2％蛋白胨(Difco)-2.5％葡萄糖中生长16-20小时。将各培养物与10ml1.2MMgSO4混合，通过在Miracloth(CalBiochem,LaJolla,CA)上过滤或通过离心回收菌丝体，用1.2MMgSO4洗涤，然后重悬浮于10ml的5mg/mlNOVOZYM234(Novo Nordisk A/S,Bagsvrd,Denmark)的1.2MMgSO4溶液中。在37℃缓慢搅拌下将该悬浮液培养约1小时而产生原生质体。通过一层无菌的Miracloth过滤除去未消化的菌丝体。在3600×g下离心回收原生质体。然后用10mlST(1M山梨糖醇-10mM Tris pH7.5)洗涤，离心，用10mlSTC(1M山梨糖醇-10mM Tris pH7.5-10mM CaCl2)洗涤，离心，接着重悬浮于1.0ml STC。测定原生质体的浓度，再用STC将最终浓度调节至2×106～1×107/ml。取0.1ml原生质体的等分样与5μlpJeRS23 DNA(约5μg)在Falcon2059聚丙烯管内混合后于室温下培养20分钟。添加1ml SPTC(0.8M山梨糖醇-40％聚乙二醇4000-50mMCaCl2-50mMTrispH8)，轻轻摇荡混合该悬浮液。在室温下将该悬浮液培养20分钟，然后添加7ml熔化的涂覆层琼脂(1X COVE盐，0.8M蔗糖，1％低熔点琼脂糖)，再将该悬浮液倾到COVE板上。在37℃下培养这些板。
实施例4：脂肪酶分析
分析底物的制备为：恰在应用前将储备底物(10μl丁酸对硝基苯基酯/mlDMSO)以1∶5稀释MC缓冲液(3mM CaCl2-0.1MMOPS pH7.5)。标准的Lipolase含1000LU/ml50％甘油-0.66mMCaCl2-33mMTris pH7.5，在-20℃下贮存。恰在使用前用MC缓冲液将标准Lipolase稀释至1/100。用MC缓冲液稀释发酵液样本，将已稀释的发酵液样本100μl等分样吸移入96孔微量滴定皿，接着吸移100μl已稀释的底物。记录在nm处的吸光度作为时间的函数。相对于Lipolase标准计算发酵液脂肪酶单位数/ml(LU/ml)。
实施例5：Lipolase表达
将12个突变体的每一个用实施例2中所述的Lipolase表达质粒pJeRS23转化，再通过它们对尿苷的原养型和利用乙酰胺作唯一氮源的能力选择转化体。对亲代菌株米曲霉HowB425进行类似的转化。分生孢子化的转化体对COVE板再划线一次，用得自个体菌落的孢子接种90mmCOVE板。形成孢子后，在0.01％吐温80中收获孢子。各孢子悬浮液的10μl等分样用于接种含1mlMY50N/100液体培养基的24孔微量滴定板中的一孔。在不同的两天开始实验，每天包括用整批米曲霉HowB425对照转化体进行实验(实验A和B)。微量滴定板的培养物在37℃、100rpm搅拌下生长3～5天，按实施例4中所述方法对培养物上清液分析脂肪酶活性。
结果示于表Ⅱ。两种突变体的说明性示意图示于图3和4。虽然将DNA表达质粒引入任意给定的米曲霉宿主而得到的各个转化体生产和分泌异源多肽的能力通常各不相同而且各突变体菌株中的转化体数相当少，但突变体JeRS316(图3)和JeRS317(图4)的表达分布图与对照物相比看来进一步移向更高的脂肪酶表达水平。
     表Ⅱ-形态突变体中Lipolase表达
                                   实验A
   菌株  转化体数    平均值(LU/ml)   标准偏差(LU/ml)     中值(LU/ml)     最大值(LU/ml)
 HowB425     12     6.49     3.28     5.47     12.10
 JeRS305     8     2.11     2.64     0.62     6.61
 JeRS306     12     7.44     5.49     6.57     15.40
 JeRS307     10     8.31     6.49     6.74     24.00
 JeRS313     5     4.54     3.84     2.40     8.98
 JeRS315     6     8.96     8.60     7.27     25.80
 JeRS317     9     12.20     6.85     10.97     28.00
 JeRS318     9     1.53     3.68     0.00     11.20
 JeRS320     9     9.47     7.97     5.11     22.56
                                   实验B
 HowB425     12     12.10     4.04     11.40     20.00
 JeRS303     12     7.51     9.55     4.34     31.70
 JeRS304     10     12.90     11.30     9.60     36.50
 JeRS314     12     11.40      5.89     12.20     21.60
 JeRS316     12     18.00     15.00     13.40     44.50
实施例6：米曲霉突变体JeRS316的发酵
为测定形态突变体是否表现比亲代野生型形态菌株更优的发酵性能，使亲代菌株米曲霉HowB425和用质粒pJeRS23转化的突变茵株JeRS316的一种转化体在发酵条件下生长于发酵罐中。
发酵结束时对照培养物的形态对在这些条件下生长的米曲霉来说有代表性。该培养物很粘稠，具有稠密、多粒状缓慢混合的外观。罐中可见到大气泡。反之，JeRS316转化体表现为低粘性、丝状、易混合的形态，发酵期间形成粒子的程度小。罐内日常看不到大气泡。检查了异源脂肪酶的表达，结果示于图5。如果发酵时突变体优于亲代，则可预期该突变体的发酵生产期(productivephase)将会延长。结果以[在时间(×)时培养液中的脂肪酶滴度]/[(42小时)时脂肪酶滴度]的比表示。该分析使表达数据归一化，因为事实上并不是所有转化体的表达绝对水平都相等。正如对改进的形态突变体所料，菌株JeRS316的异源多肽发酵生产期明显比对照物的延长了。形态突变体培养物在培养液中脂肪酶的最终表达滴度比对照物约高5倍。
实施例7：镰孢属表达载体pJRoy30的构建
将pJRoy20的尖镰孢胰蛋白酶基因启动子中-15处的EcoRV位点(Royer等，1995，生物/技术(Bio/Technology)13:1479-1483)和CAREZYMETM(Novo Nordisk A/S,Bagsvrd,Denmark)纤维素酶编码区中+243处存在的NcoI位点用于形成尖镰孢胰蛋白酶基因启动子与CAREZYMETM纤维素酶基因之间的准确融合体。应用下列引物从CAREZYMETM载体pCaHj418(见图6)产生一种PCR片断，该片断含有尖镰孢胰蛋白酶基因启动子的-18～-1、其后直接连接CAREZYMETM纤维素酶基因的-1～+294:
正向
EcoRⅤ5’ctcttggatatctatctcttcaccATGCGTTCCTCCCCCCTCCT3’(序列号：5)
反向
5’CAATAGAGGTGGCAGCAAAA3’(序列号：6)
正向引物中小写字母是尖镰孢胰蛋白酶基因启动子的bp-24～-1，而大写字母是CAREZYMETM的bp1～20。
应用的PCR条件是95℃下5分钟，接着是30次循环，每次是在95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分钟。应用Invitrogen的TA克隆试剂盒(Invitrogen,La Jolla,CA)将产生的0.32kb片段克隆入载体pCRⅡ得pDM148(见图7)。从pDM148分离出0.26kbEcoRⅤ/NcoⅠ片段，将其连接到pCaHj418的0.69kb NcoⅠ/BglⅡ片段上，克隆入EcoRⅤ/BamHⅠ消化的pJRoy20而产生pDM149(见图8)。
pMT1612是通过将含pBIT的bar基因(Straubinger等，1992，真菌遗传学简讯(Fungal Genetics Newsletter)39:82-83)的575bp BamH1 BamH1片段引入用BamHⅠ/BglⅡ切割的pIC19H(Marsh等，1984，基因(Gene)32:481-485)而构建的。然后作为BamH1-XhoⅠ片段分离该bar基因并***BamHⅠ-XhoⅠ切割的pJaL154(图9)而产生pMT1612(见图10)。将3.2kbEcoR1 CAREZYMETM纤维素酶表达盒从pDM149转入EcoR1切割的basta标记pMT1612而产生pJRoy30(图11)。
实施例8：镰孢属的转化
镰孢属菌株A3/5(ATCC20334)和镰孢属菌株A3/5高度分枝的形态突变体CC1-3、CC1-8、CC2-3和MC3-5(Wiebe等，1992，真菌学研究96:555-562)在25℃下在加1.5％葡萄糖和琼脂的Vogels培养基(Vogel,1964，美国自然杂志(Am.Nature)98:435-446)的10×15mm平板上生长3周。应用接种环使分生孢子和/或菌丝体片段(每块板约108)沉积于10ml无菌水中，并通过4层干酪包布以及最后通过1层Miracloth过滤而纯化。分生孢子和/或菌丝体悬浮液通过离心浓缩。用108分生孢子和/或菌丝体片段接种50ml含1％酵母提取物、2％细菌胨(bactopeptone)和2％葡萄糖的YPG培养基，再在24℃、150rpm下培养14小时。生成的菌丝被阻挡在无菌的0.4μm滤膜上，相继用无菌的蒸馏水和1.0M MgSO4洗涤。将菌丝重悬浮于10ml NOVOZYM 234TM溶液(2-10mg/ml，于1.0M MgSO4中)，在34℃、80rpm搅拌下消化15-30分钟。通过相继滤过4层干酪包布和滤过Miracloth从生成的原生质体悬浮液除去未消化的菌丝物质。使20ml 1M山梨糖醇流过该干酪包布和Miracloth，与原生质体溶液合并。混合后，通过离心使原生质体(约5×108)粒化，相继通过在20ml 1M山梨糖醇和20ml STC中的重悬浮和离心来洗涤。洗涤后的原生质体以1-2×108/ml的浓度重悬浮于4份STC和1份SPTC中。将100μl原生质体悬浮液加入含5μg pJRoy30和5μl肝素(5mg/ml，于STC中)的聚丙烯管(17×100mm)内，在冰上培养30分钟。使1ml SPTC缓慢地混入原生质体悬浮液，继续在室温下培养20分钟。将25ml熔化后的溶液[其中包括COVE盐、25mM NaNO3、0.8M蔗糖和1％低熔点琼脂糖(Sigma化学公司，St.Louis,MO)](冷却至40℃)与该原生质体混合，然后涂在空的150mm平板上。在室温下继续培养10～14天。当在室温下培养24小时后，将25ml相同的培养基加basta(5mg/ml)覆盖在该平板上。Basta得自AgrEvo(Hoechst Schering,Rodovre,Denmark)，且在使用前用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)萃取2次，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取1次。
实施例9：纤维素酶活性的表达
将镰孢属A3/5、CC1-3、CC2-3和MC3-5的转化体在微量滴定板和摇瓶中的M400Da培养基上于37℃下培养7天。镰孢属A3/5、CC1-3、CC2-3和MC3-5中每一个的一个转化体置于发酵罐内含典型碳源和氮源以及天然盐和痕量金属的培养基中在适当的发酵条件下培养。
用下列方法测定纤维素酶活性。将一组5μl不同稀释度的纤维素酶标准物和1-5μl样本吸移入96孔板中。用100mM MOPS(pH7.0)将纤维素酶标准物(CAREZYMETM,Novo Nordisk A/S.Bagsvrd,Denmark)稀释成150、100、50、25、12.5和6.25ECU/ml。底物的制备为：将偶氮-羧甲基纤维素(偶氮-CMC)溶于100mM MOPS(pH7.0)成2％w/v并在80℃下搅拌10分钟。将一组65微升的偶氮-CMC底物溶液吸移入各样本孔中并混合。将96孔板在45℃的水浴中培养30分钟，再在冰上放置2分钟。在各孔中加入一组175微升的终止剂并充分混合。终止剂的制备为：将0.2g ZnCl2悬浮于20ml 0.25MMOPS(pH7.0)，再将该悬浮液加入80ml酸化乙醇(每升乙醇含1.1ml浓HCl)中。在Sorval RT6000B离心机中、3000rpm下离心该96孔板达10分钟。离心完毕，各取50μl上清液转入每孔含50μl水的新96孔板中。测定600nm处的吸光度。
微量滴定板、摇瓶和发酵罐各培养物的结果示于表Ⅲ，其中最大纤维素酶产率被归一化成1.0。在微量滴定板培养物中，CC2-3和MC3-5转化体产生的纤维素酶量分别比亲代菌株高22％和46％。在摇瓶培养物中，CC1-3、CC2-35和MC3-5转化体产生的纤维素酶量分别比亲代菌株高85％、54％和7％。在发酵罐中，CC1-3、CC2-35和MC3-5转化体产生的纤维素酶量分别比亲代菌株高136％、3％和8％。
表Ⅲ．由野生型菌株(A3/5)和形态突变体(CC1-3、CC2-3和MC3-5)生产的纤维素酶。
   微量滴定板             摇瓶           发酵罐宿主    最大值°   n* 最大值      n    最大值      nA3/5     1.0       5    1.0        6     1.0        1CC1-3    0.29      4    1.85       2     2.36       1CC2-3    1.22      1    1.54       1     1.03       1MC3-5    1.46      2    1.07       2     1.08       1
°对在各组生长条件下观察到的最高活性将镰孢属A3/5亲代菌株的最大纤维素酶产率归一化成1.0。
n*表示分析的转化体数。

Claims (16)

1．从丝状真菌亲代细胞获得突变细胞的方法，该方法包括：
(a)获得亲代细胞的突变细胞；
(b)鉴定表现出比亲代细胞更受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝的突变细胞；以及
(c)鉴定突变细胞，当该突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时，该突变细胞比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。
2．权利要求1的方法，其中改进的性能选自如下性能：(a)提高的异源多肽产率，(b)改进的生长情况，(c)更低的粘度，和(d)更好的分泌作用。
3．权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，突变细胞表现出比亲代细胞更受限的菌落表型和延伸更多的菌丝分枝。
4．权利要求3的方法，其中表现出更受限的菌落表型的突变细胞的鉴定先于比亲代细胞具有延伸更多的菌丝分枝的突变细胞。
5．权利要求1的方法，其中步骤(c)是在步骤(b)之后进行。
6．权利要求1的方法，其中该突变细胞是通过辐照亲代细胞而获得的。
7．权利要求1的方法，其中该突变细胞是通过亲代细胞的化学诱变而获得的。
8．权利要求1的方法，其中该突变细胞是亲代细胞的自发突变体。
9．权利要求1的方法，其中该突变细胞的菌落表型比亲代细胞至少更受限约10％。
10．权利要求1的方法，其中该突变细胞的菌丝分枝比亲代细胞至少多约10％。
11．权利要求1的方法，其中该亲代细胞是下列物种的细胞：曲霉属、木霉属、梭孢壳属、镰孢属、脉孢菌属、支顶孢属、Tolypocladium、腐质霉属、Scytalidium、毁丝霉属或毛霉属或其有性型或同义物。
12．权利要求2的方法，其中该突变细胞产生的粘度不大于亲代细胞所产生的粘度的约90％。
13．权利要求2的方法，其中该突变细胞产生的异源多肽比亲代细胞至少多约10％。
14．生产异源多肽的方法，该方法包括：
(a)培养按权利要求1的方法获得的突变细胞，其中该突变细胞还包括编码该异源多肽的核酸序列；以及
(b)回收该异源多肽。
15．按权利要求14的方法生产的多肽。
16．包括编码异源多肽的核酸序列的丝状真菌细胞的突变细胞，其中该突变细胞比亲代细胞具有更受限的菌落表型、延伸更多的菌丝分枝以及改进的生产异源多肽的性能。
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