CN1217570C

CN1217570C - 松茸混菌发酵培养方法及其培养基

Info

Publication number: CN1217570C
Application number: CN 02136484
Authority: CN
Inventors: 王淑珍; 白晨
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2002-08-14
Filing date: 2002-08-14
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2022-08-14
Also published as: CN1475101A

Abstract

本发明公开了一种用于松茸混菌发酵的培养基，它含有0.01-50mg/kg钴元素；还公开了一种混菌发酵法，该方法包括步骤：(a)分别制备松茸和共酵菌株的发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的松茸和共酵菌株的发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50mg/kg钴元素的适合混菌生长的条件下，混菌深层培养松茸和共酵菌株。本发明还通过了从混菌发酵获得的多糖等活性基料，以及含有活性基料的组合物。

Description

松茸混菌发酵培养方法及其培养基

技术领域

本发明涉及混菌发酵领域，尤其是以松茸为共酵菌改变产品生物活性和感官性状的方法。

背景技术

松茸[Tricholoma matsutake(s Ito.et Imai)sing]，称作‘菇中之王’的珍稀大型野生食用真菌，口感独特，香气浓郁。虽然，曾有研究报道其多糖类物质对小白鼠肉瘤S-180的抑瘤率可达91.8％，对艾氏腹水癌抑瘤率为70％，具有极有效的抗癌作用，在27种具有抗癌作用的担子菌中位居第二，是重要的抗癌药物筛选对象，能提高非特异性免疫和特异性免疫功能及抗应激作用(傅伟杰，许广波，许周源等，山东农业大学学报，1999，30(增)：230-233)。

但目前对其研究主要集中在实现人工栽培技术上，有关其生物活性功能物质(多糖、糖蛋白等)结构及功能的研究报道甚少。

由于在世界范围内松茸是数量最少、最稀有、分布最狭窄的树木活体共外生菌根菌，半个多世纪研究子实体的人工栽培至今尚未实现，随着国际市场需求量不断增加，由于过量采收致使世界天然松茸产量逐年下降，频临灭绝，导致价格昂贵，日本市场零售价格高达1275美元/Kg。

研究发现用两种或两种以上的真菌混菌发酵，产生的混合真菌多糖的种类、结构、生物活性，例如抗癌抑癌作用，提高免疫功能等，与单一真菌有所差别，也不等同两种真菌单独发酵产物的简单叠加。原因是由于活性物质间的协同，增效，互补，及产生了新的生物活性物质，其生理功能效果优于原来的单独产物。目前，对真菌的混菌发酵研究尚少，没有以松茸为共酵菌，利用混菌发酵技术改变真菌活性成分的报道。

因此，通过微生物工程技术获得松茸产品的工业化生产力在必行。对使用松茸作为共酵菌，获得提高和改变生物活性和感官性状的产品有迫切需要。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种混菌发酵的方法，其中通过与松茸混菌发酵改变了两种单菌的单独产物，改进了其生物活性和产品的感官性状。

本发明的另一个目的是提供一种专用于上述松茸混菌发酵方法的培养基。

本发明的另一个目的是提供由上述发酵方法获得的发酵产物，其中含有高分枝度的多糖和具有多元醇基团和β-(1→3)主链相连的结构的多糖。

本发明的另一个目的是提供上述发酵产物制备生物活性基料和药品、保健品、食品中的用途。

在本发明的一个方面，提供了一种用于松茸发酵的培养基，该培养基含有0.01-50mg/kg，优选0.1-5mg/kg钴元素。在一个优选例中，本发明的培养基中还含有浓度为0.005-0.5wt％的延胡索酸。

在本发明的另一个方面，提供了一种松茸发酵法，该方法包括步骤：

(a)制备松茸发酵种子液；和

(b)将步骤(a)中制得的松茸发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50mg/kg钴元素的条件下，培养松茸。

在本发明的另一个方面，提供了一种混菌发酵法，该方法包括步骤：

(a)分别制备松茸和共酵菌株的发酵种子液；和

(b)将步骤(a)中制得的松茸和共酵菌株的发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50mg/kg钴元素的混菌生长的条件下，混菌深层培养松茸和共酵菌株。

在一个优选例中，该培养基中含有0.1-5mg/kg钴元素，且所述适合混菌生长条件还包括浓度为0.005-0.5wt％的延胡索酸。

在另一个优选例中，另一种共酵菌株选自云芝、灵芝或其组合。

在还有一个优选例中，发酵温度是25-37℃，pH是4.5-5.5，培养时间是12小时-10天。

在另一个优选例中，该方法还包括步骤：

(c)提取菌丝中的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。

本发明的另一个方面提供了一种多糖，该多糖是松茸混菌发酵的胞内多糖和/或胞外多糖，且具有含量占发酵得到的胞外多糖和胞内多糖总量20％以上的高分枝度和多元醇基团及β-(1→3)主链相连的结构的多糖；该多糖是通过以下步骤制备的：

(a)分别制备松茸和共酵菌株的发酵种子液；

(b)将步骤(a)中制得的松茸和共酵菌株的发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50mg/kg钴元素的适合混菌生长的条件下，混菌深层培养松茸和共酵菌株；

(c)提取菌丝中的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。

本发明的另一个方面还提供了一种组合物，其特征在于，该组合物含有载体和选自下组的活性基料：松茸混菌发酵的混菌菌丝体、混菌发酵液、纯混合真菌多糖、纯混合真菌糖蛋白，或其混合物。

附图简述

图1是流程图，显示了实施例1所述的灵芝/云芝、松茸菌种单独发酵和混菌共酵，以及其各产物制备产品进行实验的流程图。

具体实施方式

发酵培养基工艺、配方是松茸混菌发酵生产技术的关键所在。根据本发明人的多年野外考察，从各地生长松茸的环境进行采样研究，发现在生长松茸的环境中生长前后钴离子的含量都大大降低。在经过实验室培养条件探索后，发现钴离子是松茸菌丝体生长的必需因子。通过添加一定浓度的钴离子，可使松茸在单独发酵或混合发酵中快速繁殖生长，累积多糖。

本发明的松茸培养基(如深层发酵培养基)除了含有碳源，氮源和微量元素等常规成分外，还含有钴元素，其含量是约0.01-50mg/kg，优选是约0.1-5mg/kg。在该浓度下松茸种子(松茸菌丝体)和共酵真菌能快速繁殖生长。钴离子可以各种形式加入，较佳地以钴盐形式加入培养基中，例如六水合硝酸钴等。

在培养基中还可以含有延胡索酸。延胡索酸在松茸的生长中可起生长促进作用，其浓度范围通常为约0.005-0.5wt％，较佳地为0.01-0.1wt％，按培养基总重量计。

至于本发明的培养基中含有的其它常规成分，例如碳源，氮源和微量元素，没有特别限制。可以采用常规的培养基中相应成分及用量，例如3％麦芽糖，0.2％KH₂PO₄，0.1％Mg₂SO₄·7H₂O及微量元素。这些成分可用本领域技术人员熟知的其它成分替代。本领域的技术人员不难确定其含量。

本发明的混菌发酵方法对于使用的松茸菌株没有特别限制，可用任何市售的松茸菌株(可从例如上海农科院等处购得)，或者用常规方法分离得到的松茸的菌株。

与其混合发酵的真菌也没有特别限制，可用例如云芝、灵芝等，或其他具同等功能的真菌组合。灵芝、云芝的菌株可以是任何市售的菌株(可从例如中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)等处购得)，或者用常规方法分离得到的菌株。

在本发明的混菌发酵方法中，除了必需加入钴元素外，与常规的发酵方法没有区别。发酵可以是间歇式或连续式发酵。在间歇式混菌发酵生产过程中，可以采用常见的二步法，即先培养各菌种获得种子液，然后将种子液接种至大的发酵罐，进行大规模发酵。

发酵温度可以是约25-37℃，pH是4.5-5.5，培养时间是12小时-10天。优选发酵温度为约30℃，pH5.0，培养时间为48小时-5天。

在大规模发酵后，按常规方法获得菌丝体和发酵液，并进行加工处理。例如，先过滤浓缩发酵液，用95％乙醇醇析获得沉淀物，用75％乙醇洗涤数次，冻干，获得胞外多糖。通过粉碎菌丝体，水煮抽提，然后浓缩，同样用醇沉淀和透析、，可获得胞内多糖。

发酵产物中除了松茸和共酵菌本身的多糖外，还产生了高分枝度的多糖和具有多元醇基团和β-(1→3)主链相连的结构的多糖，其含量占发酵得到的胞外多糖和胞内多糖总量的约20％以上。说明该混菌发酵方法不同程度改变了多糖的组成和结构。通过实验证明多糖的药理活性和单糖间的糖苷键结合方式有关，与多糖的分枝度有关。

用该混菌发酵法制备的产物，包括混菌菌丝体、混菌发酵液、纯混合真菌多糖和纯混合真菌糖蛋白。它们都可作为生物活性基料用于制备药物、食品、保健品等产品。产品可以是各种形式，例如药物以片剂、酏剂、糖浆等形式，保健品以菌丝体含片形式，口服液等形式，食品如混菌菌丝体面包、饼干、糕点等形式，混菌发酵液以饮料形式存在。

本发明的发酵方法及其产品主要有以下优点：

(1)本发明的方法首次实现了松茸菌丝体的混菌发酵培养，实现了大规模生产松茸菌丝体及其获得其发酵产品；

(2)成本低：用常规的发酵方法进行，比天然生长的松茸价格大大降低；

(3)培养基配方简单，使用方便。在本发明的培养基中，使用的均为易于获得的常规成分。配制方便，不需要经过特殊处理。而且通常在发酵过程中，不必对pH进行调节。

(4)发酵产物的种类多，结构比单一真菌复杂，其生物活性经实验证明也比单一真菌大大提高。由于存在松茸的成分，用其制备的产品的感官感受，例如香气，口感等都大大提高。

下文的实施例进一步说明了本发明，但需要注意它们不是为了特别限定。

实施例

实施例1

松茸与云芝、灵芝的混菌发酵培养

根据图1的流程，用相同的培养基和条件进行松茸和云芝/灵芝单独、松茸和云芝/灵芝混菌发酵的培养。

实施例1a灵芝与松茸CS992菌株的混菌发酵培养

1.菌种：

(一)、灵芝[Ganoderma lucidum (Fr.)Karst]：⁶⁰Co-γ射线与紫外线交替累积诱变菌株CJL990(1999年经中国科学院北京微生物研究所鉴定)比目前灵芝菌种生长速度快2-4天。

(二)、云芝[Polyporus versicolorL.：Fr](购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)

(三)、松茸[Tricholoma matsutake(s Ito.et Imai)sing]：吉林延边天佛指山野生松茸子实体经常规分离得到的松茸菌株CS992。

该菌株为真松茸菌丝体的证明：

1、通过对该菌株的繁殖研究发现只有菌丝的自身生长，未观察到有性和无性繁殖(菌丝无锁状联合)特征，证明该菌株不可能经纯培养产生子实体；

2、用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析，该菌株RAPD指纹图谱与松茸子实体的RAPD指纹图谱相似系数为0.932，说明该菌株与松茸具有很高的亲菌(缘)关系。

3、对松茸子实体和该菌株CS992的菌丝体进行同功酶分析：同工酶酶谱主要是由编码各条酶带的基因所直接决定的，同工酶分析是从蛋白质分子水平上研究生物群体遗传分化的重要手段之一，目前已被应用于多种大型食用菌菌株鉴别的研究。酶蛋白是基因表达的第一产物，而食用菌不同菌种的同工酶谱一般不同。

对松茸子实体和该菌株CS992的菌丝体进行酯酶同工酶与过氧化物同工酶分析其同工酶相似值(S)分别为0.908和0.887，二者同工酶谱非常相近(因为松茸子实体并非是菌株CS992组织分离的出发子实体，否则相似值(S)会更相近)。

以上均证明菌株CS992为真松茸菌株。

二、混菌深层共酵培养基

(wt％)麦芽糖 3、豆粕粉0.5、CaCO₃ 0.05、KH₂PO₄ 0.2、MgSO₄·7H₂O0.1、Na₂CO₃ 0.056、酒石酸0.1、延胡索酸0.066、K₂HPO₄ 0.36；

(mg/Kg)FeSO₄7H₂O 495、CuSO₄5H₂O 8、V_C 6.2、MnSO₄·H₂O 440、Co(NO₃)₂.6H₂O 5(按钴离子计，浓度为1.066)、生长因子VB₁ 6

三、发酵工艺(2T发酵罐)

接种量∶种子液，配比为2∶1，共计5％；共酵培养基酸碱度：PH4.5-5.5；温度：30℃；通气量：1∶0.5-0.8(V/V/min)；时间：36h。

四、生物积累量(36h、干g/100ml)(2T发酵罐)

灵芝：4.22；松茸：6.15；混菌：5.87

五.钴元素浓度与延胡索酸浓度的影响

重复上述培养，不同点在于用云芝替换灵芝菌株，0、0.01、0.5、2mg/kg钴元素浓度替换1.066mg/kg的钴元素浓度，以及0.01、0.1、0.5wt％浓度的延胡索酸替换0.066wt％的延胡索酸。

结果表明，在上述钴离子浓度下均能成功的进行松茸和灵芝或云芝的深层混菌发酵，而在不存在钴离子的条件下，松茸单独培养几乎不能获得产物，且混菌生长的效果也大大降低。此外，上述浓度的延胡索酸均对松茸和灵芝或云芝在深层混菌发酵下的生长有促进作用。

实施例1b

用购自上海农科院食用菌研究所的松茸菌株替代松茸CS992菌株，在相同的条件下培养，获得结果如下：

生物积累量(36h、干g/100ml)(2T发酵罐)

灵芝：4.3；松茸：6.0；混菌：5.6

实施例2发酵产物的提取

1.胞外多糖的提取

将100毫升发酵液经过纱布过滤，将滤液在70℃真空浓缩至原体积的1/4，加入等体积的95％乙醇，醇析20小时。用75％乙醇洗涤沉淀物5-6次，至无还原糖，再用无水乙醇洗涤5-6次，真空冷冻干燥，得到粗胞外多糖。将其置于试管中，加5ml热水溶解，定容到10毫升。取1毫升在另一试管中，加入2N HCl，水浴加热水解5小时，获得胞外纯多糖。

2.胞内多糖的提取：

粉碎菌丝体，过筛(80-90目)，水煮，提取3-4次，合并抽提液，70℃真空浓缩至原体积1/4，以下与提取胞外多糖相同，获得纯胞内多糖。

3.活性成分初步分析(以活性多糖为例，Biostat-MD型10L全自动发酵罐)

(一)、多糖积累

表1单独发酵和混菌发酵的多糖累积

胞内多糖(％)

云芝菌丝体(发酵3天) 14.90

松茸菌丝体(发酵3天) 4.95

混菌菌丝体(发酵3天) 14.90

胞外多糖(g/l)

云芝菌丝体(发酵3天) 13.15

松茸菌丝体(发酵3天) 5.15

混菌菌丝体(发酵3天) 12.18

(二)、活性多糖种类与结构的初步分析

1)发酵液中胞外多糖的分析方法：通过乙醇分级沉淀脱蛋白、脱脂、脱色、脱盐进行纯化，以DEAE纤维素柱进行分离，获得胞外多糖，采用凝胶色谱进一步进行分级分离，以高压液相、红外色谱及核磁共振仪器测定多糖的相对分子量、官能团、各种糖苷和糖苷键。

2)菌丝体中胞内多糖的分析方法：菌丝体热水提取、醇析、透析、SephadexG-75柱层析纯化，仍采用凝胶色谱进一步进行分级分离，以高压液相、红外色谱及核磁共振仪器测定多糖的相对分子量、官能团、各种糖苷和糖苷键。

3)分析结果：

云芝[Polyporus versicolorL.：Fr]活性多糖种类与结构的初步分析：

主要是多糖-蛋白质的复合物及具有β-(1→3)、β-(1→4)、β-(1→6)糖苷键及分枝的多聚糖。

松茸[Tricholoma matsutake(s Ito.et Imai)sing]活性多糖种类与结构的初步分析：

主要是GLSP₂ GLSP₃等活性多糖，分子量12790-14200，含β-(1→3)β-(1→6)和β-(1→4)β-(1→6)糖苷键

混菌(云芝[Polyporus versicolorL.：Fr]-松茸[Tricholoma matsutake(s Ito.etImai)sing])活性多糖种类与结构的初步分析：

除云芝、松茸的部分活性多糖外，发现存在高分枝度的多糖和具有多元醇基团和β-(1→3)主链相连的结构，其含量大于约20％。

分析结果初步认为：

1)各类菌丝体和发酵液中的活性多糖，结构上基本相同，只是相对分子量和糖苷的部分差异。

2)以松茸为共酵菌的混菌发酵不同程度改变多糖的组成和结构。

3)多糖的药理活性与单糖间苷键的结合方式有关。

4)多糖的药理活性与多糖的分枝度有关。

实施例3-5说明了混菌发酵产品的生物活性和免疫作用的增强效果。

实施例3

混合胞外活性多糖的抑癌效果

通过对体外培养人肝癌SMMC-7721细胞抑制实验结果证明，混合胞外多糖，抑癌率(95.17％)与单一菌胞外多糖抑癌率(云芝80.32％，松茸80.91)比较，P＜0.05。

(一)、方法

将对数期生长的人肝癌SMMC-7721细胞→0.25％胰酶消化→10％小牛血清(FCS)的RPMI-1640培养液悬浮、计数→细胞浓度1-5×10⁵/ml→接种24孔培养板(每孔2ml)→37℃ 5％CO₂培养24h→弃培养液→RPMI-1640洗涤量次→分别加入胞外多糖(300μg/ml)(每种胞外多糖设四个孔，设无胞外多糖的RPMI-1640培养液四个孔，无胞外多糖5％FCS RPMI-1640培养液四个孔为对照)→培养24h→每孔加入³H-TdR74KBq→4h后终止培养→除上清液→0.25％胰酶消化→细胞分别收集49型滤纸上→三氯乙酸、无水乙醇处理→纸片烘干→入闪烁杯中→加闪烁液→双道液体闪烁计数仪计数脉冲数/min(cpm值)。

(二)、结果

1、三种胞外多糖(云芝-松茸混菌、云芝、松茸)cpm值与对照组RPMI-1640培养液cpm值均有极显著差异P＜0.01。

表2胞外多糖对SMMC-7721细胞的3H-TdR74KBq掺入量的影响

处理 5％FCS RPMI- 300μg混 300μg云 300μg松茸

1640 菌胞外多芝胞外多胞外多糖

糖糖

CPM 3304±209 4316±398 2021 ± 2345 ± 2302±39^**

43^** 56^**

显著性水平(p) P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01

2、云芝-松茸混菌胞外多糖分别与云芝胞外多糖、松茸胞外多糖cpm值呈显著差异P＜0.05。

(三)结论

1.说明云芝-松茸混菌、云芝、松茸三种胞外多糖均具有明显抑制体外培养人肝癌SMMC-7721细胞的³H-TdR掺入，具抗癌作用。

2.同时说明云芝-松茸混菌胞外多糖的抑癌效果显著(P＜0.05)高于单菌的云芝胞外多糖、松茸胞外多糖。

3.对多糖的种类、结构、比例的分析测试，从分子水平揭示以松茸为共酵菌的云芝-松茸混菌胞外多糖中新产生的高分枝度的多糖和具有多元醇基团和β-(1→3)主链相连的结构的多糖是抑癌效果增强的原因之一。

4.抑癌效果增强的原因之二是活性物质间增效、互补、协同作用结果。

5.从细胞生物学与分子生物学的深度阐明以松茸为共酵菌改变产品生物活性功能及感官性状的机理。

实施例4灵芝-松茸混菌共酵的保健饮料免疫调节功能

灵芝-松茸混菌共酵的保健饮料口感清新，香气宜人，适应广泛人群，饮用不限量，完全具备食品的标准与特征。通过上海医科大学食品毒理与保健食品功能检测中心的检测结果证明：

1)对小鼠脏器/体重比值的影响与对照组比较P＜0.05。

2)对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化的影响与对照组比较P＜0.05。

3)对NK细胞活性的影响与对照组比较P＜0.05。

4)对血清溶血素的影响与对照组比较P＜0.05。

5)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验与对照组比较P＜0.05。

实验结果表明灵芝-松茸混菌共酵的保健饮料对实验组小鼠淋巴细胞转化能力、NK细胞活性、血清溶血素水平、及腹腔巨噬细胞吞噬百分数和吞噬指数均明显升高。根据“保健食品功能学评价程序和检验方法”中所规定的评价标准灵芝-松茸混菌共酵的保健饮料具有非常好的免疫调节作用。

(一)、方法

应用保健食品的功能学评价程序和检验方法

1、脏器/体重比值测定：实验结束时，宰杀动物，取出脏器，剔除***后称重，计算脏器/体重比。

2、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验：选用“保健食品功能学评价程序和方法”中的MTT法。

3、NK细胞活性测定：选用“保健食品功能学评价程序和方法”中同位素³HTdR测定法。

4、血清溶血素的测定：选用“保健食品功能学评价程序和方法”中的血凝法。

5、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：按“保健食品功能学评价程序和方法”中规定的方法。

(二)、结果

1、灵芝-松茸功能饮料对小鼠脏器/体重比值的影响

表3灵芝-松茸功能饮料对小鼠脾脏、胸腺/体重比值的影响(X±SD)

剂量(ml/Kg.bw) 动物数(只) 脾脏/体重比胸腺/体重比

对照组 10 7.85±2.20 1.93±0.09

低剂量组 25.0 10 5.45±1.28 1.96±0.07

中剂量组 83.3 10 7.87±2.55 1.93±0.07

高剂量组 250.0 10 12.12±3.82^* 2.03±0.13

^*与对照组比较，p＜0.05

经方差分析及统计学处理，由表1可见高剂量组脾脏/体重比，有明显统计学差异p＜0.05。

2.灵芝-松茸功能饮料对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

表4灵芝-松茸功能饮料对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响(X±SD)

剂量(ml/Kg.bw) 动物数(只) 淋巴细胞增殖能力(OD)

对照组 10 0.295±0.018

低剂量组 25.0 10 0.296±0.036

中剂量组 83.3 10 0.325±0.013^*

高剂量组 250.0 10 0.429±0.036^*

^*与对照组比较，p＜0.05。

各组动物经ConA诱导的淋巴细胞增殖反应以光密度值表示，结果显示灵芝-松茸功能饮p＜0.05。说明灵芝-松茸功能饮料对小鼠的淋巴细胞增殖有促进功能。

3、灵芝-松茸功能饮料对NK细胞活性的影响

表5灵芝-松茸功能饮料对NK细胞活性的影响(X±SD)

剂量(ml/Kg.bw) 动物数(只) NK细胞活性(0/0)

对照组 10 48.2±15.1

低剂量组 25.0 10 53.6±9.0

中剂量组 83.3 10 66.7±8.1^*

高剂量组 250.0 10 68.2±10.7^*

^*与对照组比较，p＜0.05

表5可见高、中剂量组小鼠的NK细胞活性比对照组高，差别有显著性，说明灵芝-松茸功能饮料具有提高小鼠NK细胞活性的功能。

4、灵芝-松茸功能饮料对血清溶血素的影响

表6灵芝-松茸功能饮料对血清溶血素的影响(X±SD)

剂量(ml/Kg.bw) 动物数(只) 抗体积数

对照组 10 94.8±9.2

低剂量组 25.0 10 103.4±20.1

中剂量组 83.3 10 111.4±22.3

高剂量组 250.0 10 126.4±14.5^*

^*与对照组比较，p＜0.05

小鼠经致敏后血清溶血素的水平可以通过羊细胞凝聚程度来检验，其抗体效价的高低可部分反映机体体液免疫能力。对各剂量组小鼠血清溶血素测定中发现，各剂量组的血清溶血素均高于对照组且随剂量增加而逐渐升高，经方差分析及统计学处理，高剂量组的抗体积数明显高于对照组、p＜0.05，说明灵芝-松茸功能饮料能够明显增强机体的体液免疫功能。

5、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

表7各组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数(X±SD)

剂量(ml/Kg.bw) 动物数(只) 吞噬率(％) 吞噬指数

对照组 10 16.9±2.0 0.25±0.03

低剂量组 25.0 10 32.1±2.9^* 0.51±0.05^*

中剂量组 83.3 10 49.3±9.4^* 0.66±0.10^*

高剂量组 250.0 10 66.8±11.7^* 0.79±0.108^*

^*与对照组比较，p＜0.05。

表7可见灵芝-松茸功能饮料低、中、高剂量组，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数均明显高于对照组P＜0.05。功能饮料显著地提高了小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，说明灵芝-松茸功能饮料可增强机体非特异性免疫功能。

(三)结论

1、根据《保健食品的功能学评价程序和检验方法》的结果判定原则：在细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞及NK细胞功能检测中，如有两个以上(含两个)功能检测结果阳性，即可判定该受试物具有免疫调节作用。灵芝-松茸功能饮料在本研究，功能检测中，以上四项均呈阳性，所以可以认为具有免疫调节作用。

2、巨噬细胞的吞噬功能不仅具有非特异性免疫功能，而且还能吞噬、裂解体内衰老、死亡细胞和异常细胞，即具有清除体内垃圾、延缓衰老作用。灵芝-松茸功能饮料低、中、高剂量组，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数均明显高于对照组P＜0.05，且随剂量增加而吞噬能力逐渐增大。说明灵芝-松茸功能饮料只要饮用低剂量即可以明显提高巨噬细胞吞噬能力。

3、NK细胞称自然杀伤细胞是直接来自骨髓并具有天然杀伤性的淋巴细胞，不仅具有免疫功能而且能杀伤肿瘤细胞，在体内起重要的免疫监视作用，所以可以初步认为灵芝-松茸功能饮料具有预防肿瘤作用。

实施例5：混菌菌丝粉***片抗疲劳作用

混菌菌丝粉***片爽口，清香，老、少皆宜。

以混菌菌丝粉为活性功能成分的***片，进行耐缺氧、抗疲劳作用测定。结果表明，混菌菌丝粉***片可显著延长小鼠游泳时间和在缺氧条件下的存活时间。小鼠耐缺氧试验死亡时间与对照组比较P＜0.01，差异极显著；小鼠游泳试验死亡时间与对照组比较，P＜0.01，差异极显著；提高机体的有氧代谢能力，降低小鼠剧烈运动后血乳酸，与对照组比较P＜0.01，差异极显著；血尿素氮增量与对照组比较，P＜0.01，差异极显著；减少肝糖原的消耗，与对照组比较P＜0.01，差异极显著。说明混菌菌丝粉***片具有提高机体机能，增强机体耐缺氧、抗疲劳的作用。

(一)、方法

1.受试动物

清洁级SD纯系小鼠，18-22g，雄性，中科院上海实验动物中心提供

2、供试样品

只含该产品的主料部分、尚未加入其他糖类，真菌多糖含量达878.7mg/L。

3、基础饲料

由中科院上海实验动物中心提供

4、试验动物分组

小鼠经2天适应期后，随机分成4组，每组10只，其中两组为对照组，基础饲料喂养，自由饮用纯净水，另两组为实验组，混菌菌丝粉***片喂养，自由饮用纯净水。实验期为30天，进行耐缺氧、抗疲劳的测试。

5、耐缺氧试验：“保健食品功能学评价程序和检验方法”中规定的方法

6、抗疲劳试验：“保健食品功能学评价程序和检验方法”中规定的方法

7、血乳酸测定：对羟基联苯比色法

8、血清尿素氮测定：二乙酰-肟法

9、肝糖原测定：蒽酮法

(二)、结果

1、小鼠食用混菌菌丝粉***片与基础饲料量的比较

表8小鼠食用混菌菌丝粉***片与基础饲料量的比较(x±s)

组别动物数(只) 时间(天) 日平均值摄取量

对照组 10 30 32.9±1.32

实验组 10 30 37.4±2.01^*

^*P＜0.05差异显著。

表8可见，小鼠食用混菌菌丝粉***片与基础饲料量有明显差异。这可能是由于混菌菌丝粉***片口感适宜，食后舒适。

2、混菌菌丝粉***片对小鼠体重的影响

表9混菌菌丝粉***片对小鼠体重的影响(x±s)

组别动物数(只) 实验时间(天) 始重(克) 末重(克) 平均增重(克)

对照组 10 30 18.24±0.6 128.7±0.88 10.47±0.69

实验组 10 30 18.33±0.65 30.03±0.3 11.70±0.83

表9可见饮用L-S功能饮料的小鼠体重增加与对照组比较有差异，但无明显差异。

3、混菌菌丝粉***片对小鼠耐缺氧能力的影响

表10小鼠耐缺氧试验死亡时间比较

组别动物数(只) 实验时间(天) 死亡时间(秒)

对照组 10 30 16.33±1.46

实验组 10 30 22.83±1.10^**

^**P＜0.01，差异极显著

缺氧对机体是一种劣性刺激，影响机体各种代谢，表10可见，实验组小鼠耐缺氧能力与对照组相比，差异极显著(P＜0.01)。表明混菌菌丝粉***片能提高小鼠的耐缺氧能力。

4、混菌菌丝粉***片对小鼠抗疲劳能力的影响

1)计时游泳

表11小鼠游泳试验死亡时间比较

组别动物数(只) 实验时间(天) 死亡时间(分)

对照组 10 30 115.00±9.04

实验组 10 30 126.60±4.99^**

^**P＜0.01，差异极显著。

混菌菌丝粉***片能延长小鼠的游泳死亡时间，说明对机体具有抗疲劳能力功能。

5、混菌菌丝粉***片对小鼠血乳酸的影响

表12小鼠血乳酸的比较

组别动物数(只) 实验时间(天) 血乳酸(mg/100ml)

对照组 10 30 222.52±13.43

实验组 10 30 196.67±12.16^**

^**P＜0.01，差异极显著。

血乳酸的含量说明在无氧条件下体内糖酵解的程度，是评价抗疲劳常用的生化指标。由表12可见，实验组小鼠在游泳后，体内血乳酸的积累量明显低于对照组。P＜0.01，差异极显著。这说明混菌菌丝粉***片可增加机体有氧代谢的能力。

6、混菌菌丝粉***片对小鼠血清尿素氮的影响

表13小鼠血清尿素氮的比较

组别动物数(只) 实验时间(天) 血清尿素氮(mg/100ml)

对照组 10 30 84.70±4.46

实验组 10 30 73.78±4.73^**

^**P＜0.01，差异极显著。

血清尿素氮的含量可说明体内含氮物质分解代谢状况，也是评价机体在特殊条件下体力劳动负荷承受能力的一个较灵敏的指标。本实验结果，实验组血清尿素氮明显低于对照组。(P＜0.01)，说明混菌菌丝粉***片能减缓特殊体力劳动后含氮物质的分解。

7、混菌菌丝粉***片对小鼠肝糖原的影响

表14小鼠肝糖原的比较

组别动物数(只) 实验时间(天) 肝糖原(mg/100g)

对照组 10 30 177.42±8.85

实验组 10 30 205.27±8.51^**

^**P＜0.01，差异极显著。

从表14可见，实验组小鼠在游泳后，体内肝糖原明显高于对照组(P＜0.01)，提示混菌菌丝粉***片可增加肝糖原的储备量，降低剧烈体力劳动后糖原的消耗，从而具有增进体能，增强耐力、抗疲劳的作用。

(三)、结论

1、缺氧对机体是一种劣性刺激，影响机体各种代谢，特别影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺、氧供能不足而死亡。由表10可见，实验组小鼠耐缺氧能力与对照组相比，死亡时间差异极显著(P＜0.01)。说明L-S功能饮料能提高小鼠的耐缺氧能力，能增强机体抵御缺氧这种不良环境的功能。

2、体能是机体对体力活动和运动的适应能力。体力活动对机体的影响主要反应在两个基本生理、生化过程中，即能量代谢消耗及机体各***生理功能的调节和适应。就能量而言，肌肉活动时主要靠肌细胞中的ATP迅速分解提供能量，而ATP的补充主要靠糖原、葡萄糖的无氧酵解生成乳酸过程中释放能量合成ATP和有氧情况下线粒体内糖、脂肪酸及氨基酸氧化分解产生能量合成ATP，另外肌肉中CP分解合成ATP。因为体力活动时主要靠糖原酵解来获得能量。当糖原被大量消耗时，机体活动能力就降低，糖酵解的产物-乳酸的堆积会引起疲劳。在消耗肌糖原的同时从血液中摄取血糖，后者可由肝糖原分解，加以补充维持血糖水平。一旦肌、肝糖原大量被消耗，则血糖下降可导致中枢神经***供能不足，从而导致全身性疲劳的发生，体能下降。

由表11～表14可见，在一系列抗疲劳实验中，结果皆为阳性，且差异极显著(P＜0.01)。由表12可见，实验组小鼠在游泳后，体内血乳酸的积累量明显低于对照组。方差分析结果P＜0.01，差异极显著。说明L-S功能饮料能增加有氧代谢能力，促进乳酸代谢。从表14可见，实验组小鼠在游泳后，体内肝糖原明显高于对照组(P＜0.01)，提示混菌菌丝粉***片可增加肝糖原的储备量，肝糖原贮备的增加可维持较长时间的血糖水平，为机体提供更多的能量，减少剧烈体力劳动后糖原的消耗，从而具有增进体能，增强耐力、抗疲劳的作用。

3、实验结果根据(保健食品的功能学评价程序和检验方法)的结果判定原则：耐缺氧实验阳性说明该受试物具有耐缺氧作用，抗疲劳作用中、若一项以上(含一项)运动试验和两项以上(含两项)生化指标为阳性、即可判断该受试物具有抗疲劳作用。在本研究功能检测中，混菌菌丝粉***片耐缺氧实验呈阳性(P＜0.01)差异极显著，抗疲劳试验中两项运动试验和三项生化指标均呈阳性，所以混菌菌丝粉***片具有耐缺氧、抗疲劳功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用于松茸发酵的培养基，其特征在于，该培养基含有0.01-50mg/kg钴元素。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，该培养基中含有0.1-5mg/kg钴元素。

3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，该培养基中还含有浓度为0.005-0.5wt％的延胡索酸。

4.一种混菌发酵法，其特征在于，该方法包括步骤：

(a)分别制备松茸和共酵菌株的发酵种子液；和

(b)将步骤(a)中制得的松茸和共酵菌株的发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50mg/kg钴元素的适合混菌生长的条件下，混菌深层培养松茸和共酵菌株。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基中含有0.1-5mg/kg钴元素，且所述适合混菌生长条件还包括浓度为0.005-0.5wt％的延胡索酸。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述另一种共酵菌株选自云芝、灵芝或其组合。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵温度是25-37℃，pH是4.5-5.5，培养时间是12小时-10天。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤：

(c)提取菌丝中的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。